Автореферат и диссертация по медицине (14.00.17) на тему:Функциональная организация и адаптивная регуляция процессов пищеваренияу рыб в различных экологических условиях

Р Г Б ОД

17 ОКТ 19.96

На правах рукописи

\

Неваленный Александр Николаевич

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И АДАПТИВНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ПРОЦЕССОВ ПИЩЕВАРЕНИЯ У РЫБ В РАЗЛИЧНЫХ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ

14.00.17 - нормальная физиология 03.00.18 - гидробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва, 1996

Работа выполнена на кафедре Ихтиологии и гидробиологии Астраханского государственного технического университета

Научный консультант:

академик РАМН Н.А. Агадканян

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН

доктор биологических наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Ведущая организация:

ИНСТИТУТ ПРОБЛЕМ ЭКОЛОГИИ И ЭВОЛЮЦИИ РАН

Защита диссертации состоится "А* " 1996 г. в _

часов на заседании диссертационного совета Д 053.22.04 в Российском Университете дружбы народов (117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8).

С диссертацией можно ознакомиться в научной бибилиотеке в Российском Университете дружбы народов (117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6).

Автореферат разослан "_"_ 1996 года.

В.Т.Ивашкин

В.А.Абакумов

В.Д.Власов

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук.

доцент Н. В.Ермакова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Исследование совершенства приспособляемости специфических функций клеток, тканей, органов и систем и координации этих функций на уровне организма в условиях постоянно меняющихся факторов среды обитания является одним из наиболее важных направлений развития современной биологии. При этом необходимо выявление как видовых, так и индивидуальных особенностей течения адаптивного процесса. Видовая адаптация стала основой эволюции, потому что ее достижения закреплены генетически и передаются по наследству. Комплекс видовых наследственных признаков является базисом адаптации приобретаемой в ходе индивидуальной жизни организма. Эта адаптация формируется в процессе взаимодействия особи с окружающей средой и обеспечивается глубокими структурными и функциональными изменениями организма (Физиология адаптационных процессов. 1986).

В отличие от теплокровных животных, у которых ход биохимических реакций относительно стабилен, благодаря поддержанию температуры тела на постоянном уровне, у холоднокровных, в том числе и у рыб, процессы метаболизма в значительной степени обусловлены факторами среды обитания. В связи с этим, особое внимание многих исследователей направлено на выявление механизмов биохимической адаптации организма рыб в целом к экологическим Факторам и их влияние на реализации функций составляющих его систем (обзоры: П.Хочачка. Д.Сомеро, 1988; А.М.Уголев. В.В.Кузьмина, 1993 и мн. др.). Наиболее удобной и сравнительно доступной моделью для решения фундаментальных проблем биологии, в том числе проблемы адаптации, является пищеварительная система. Это связано с тем, что кишечник является центральным органом, который реализует не только ферментативно-транспортные процессы, но и регулирование метаболизма посредством мощной кишечной гормональной системы, а также обеспечивает поддержание гомеостаза внутренней среды организма (обзоры: Мембранный гидролиз и транспорт____ 1986; Адаптационно-компенсаторные процессы____ 1991 и др.).

В результате проведенных в течение последних десятилетий исследований для рыб описаны все известные в настоящее время типы пищеварения, подробно изучены закономерности мембранного гидроли-

- г -

за пищи, достигнут значительный прогресс в изучении процессов индуцированного аутолиза и участия микрофлоры в реализации функции пищеварения (обзор: А.М.Уголев, В.В. Кузьмина. 1993). Полученные данные свидетельствуют о том, что пищеварительной системе рыС свойственна структурно-функциональная организация, которая характеризуется как наличием общих принципов, так и целым рядом особенностей. присущих только холоднокровным животным.

Следует однако отметить необходимость разработки комплексного подхода к проблеме адаптации пищеварительной системы рыб. предполагающего рассмотрение адаптивной реакции целостной систем1 не как простой суммы относительно независимых адаптивных изменений, происходящих на различных уровнях ее организации, а учитывающей существование функциональной взаимосвязи. В связи с этим i данной работе предпринята попытка охарактеризовать адаптивную регуляцию процесса пищеварения у рыб различных таксономически: групп в изменяющихся экологических условиях.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было изуче^ ние закономерностей циркадианных, температурных и нутритивны: адаптация пищеварительной функции у рыб. В связи с этим в процес се работы предстояло решить следующие задачи:

1. Изучить адаптационно-ритмическую организацию пищевари тельной функции организма рыб при различном его функционально: состоянии.

2. Исследовать видовые и индивидуальные адаптации к влияни температуры среды обитания на уровне ,мембранного пищеварения : пойкилотермных организмов.

3. - Установить возможности влияния температуры на зффектив ность функционирования транспортных систем кишечника рыб.

4. Охарактеризовать процессы полисубстратного пищеварения кишечнике рыб в условиях In vitro.

5. Проанализировать влияние изменения основных пищевых ком понентов в корме на эффективность Функционирования гидролитичес ких цепей кишечника рыб.

6. Оценить возможность влияния витаминно-минеральных добаво в корма на уровень активности пищеварительных ферментов рыб.

?. Исследовать становление пищеварительной функции у рыб н ранних этапах постэмбрионального развития при использовании раз

ЛИЧ1-.1 ТЬПОЗ K0'V:03.

Теоретическая значимость и научная новизна. Принципиально новым является комплексное исследование циркадианной ритмики активности пищеварительных ферментов кишечника рыб. осуществляющих деградацию белковых и углеводных компонентов пищи. Установлена циркадианная ритмика активности пищеварительных ферментов слизистой кишечника рыб, которая носит эндогенный характер, характеризуясь отсутствием проксимо-дистальных особенностей. При этом, изменение активности карбогидразной ферментативной цепи в течение суток связано с варьированием уровня активности собственнокишеч-ных ферментов. Выявлено, что факторы среды способны влиять на ре- _ ализацию гидролиза компонентов пищи в течение суток.

Комплексный анализ результатов, касающихся исследования влияния температуры на структурно-функциональную организацию кишечника рыб как органа в целом позволил установить, что при снижении температуры среды увеличивается количество энтероцитов за счет возрастания массы слизистой оболочки кишечника, в то время как функциональных изменений ферментных и транспортных систем не наблюдается, следовательно, индивидуальные температурные адаптации для мембранносвязанных пищеварительных ферментов отсутствуют. Совокупность этих данных и анализ результатов полученных ранее (обзор: А.М.Уголев и др.. 1986) показывает, что адаптивные реакции пищеварительной системы в процессе акклимации рыб к температуре коренным образом отличаются от адаптивных изменений в процессе эволюции.'

При исследовании полисубстратного пищеварения выявлено, что эффекты триеубстратных взаимодействий основных пищевых веществ не являются суммой бисубстратных эффектов, при этом во всех случаях триеубстратных взаимодействий продемонстрирован только стимулирующий эффект. Полученные данные можно с большой долей вероятности экстраполировать на процессы пищеварения, осуществляемые в кишечнике рыб в реальных условиях.

Полученные нами результаты существенным образом дополняют представление о характере направленности перестроек гидролитических цепей при изменении доли соответствующих субстратов в пище рыб и свидетельствуют о достаточно тонкой адаптации пищеварительной функции к составу потребляемых кормов.

Полученные данные подтверждают важность механизма индуцированного аутолиза; особенно в процессе гидролиза субстратов белко-

вой природы, за счет ферментных систем трофических партнеров рыб, который наиболее значим на ранних этапах онтогенетического развития.

Установленные в работе факты четко разграничивают два временных уровня индивидуальной адаптации пищеварительной функции у рыб к изменению экологических условий - циркадианный, осуществляющийся в течение коротких интервалов времени (несколько часов), и циркануальный, более медленный, уровень адаптации, который реализуется при многократном воздействии в течение нескольких суток факторов среда.

Результаты работы позволяют заключить, что пищеварительная система рыб обладает широкой адаптационной пластичностью, что достигается за счет приспособительных реакций на различных уровнях организации живой материи, которые взаимосодействуют и обеспечивают четкую координацию пищеварительной функции организма рыб в различных экологических условиях.

Практическая и методическая значимость работы. Результаты исследований представляют значительный практический интерес. Установлено, что режимы и нормы кормления при индустриальном выращивании рыб должны корректироваться с учетом выявленных циркади-анных и циркануальных особенностей течения гидролитического процесса.

На основании полученных результатов, свидетельствующих об относительной независимости суммарного эффекта мембранного гидролиза и интенсивности транспорта от температуры акклимации рыб, предложена регуляция процесса усвоения пищи на начальных этапах гидролиза. Это позволяет использовать два способа повышения эффективности кормления выращиваемых по индустриальной технологии видов рыб при понижении температуры воды. При первом, необходимо увеличение количества частично гидролизованных пищевых компонентов в рецептуре корма, при втором - включать добавки некоторых ферментов, осуществляющих начальные этапы ассимиляции пищи.

Полученные в работе результаты позволяют сделать вывод о том, что введение в комбикорма для выращиваемых видов рыб как минеральных. так и витаминных микрокомпонентов оказывает значительное влияние на процесс усвоения пищи, что необходимо принимать во внимание при создании новых рецептур кормосмесей. Учитывая важность процесса индуцированного аутолиза в реализации пищеварения

у рыб необходимо обратить внимание на технологию приготовления кормов, которая должна исключать возможность денатурации собственных ферментов пищевых продуктов.

Особо следует отметить методическое значение выявленной в результате работы биоритмической организации пищеварительного процесса у рыб. Это свидетельствует о необходимости строгого соблюдения времени отбора проб при оценке активности пищеварительных ферментов для решения любых научных и прикладных вопросов, что крайне важно для последующего адекватного сопоставления полученных результатов.

Научные разработки были использованы при разработке как стартовых комбикормов для молоди осетровых рыб ОСТ-4 и для личинок и мальков растительноядных рыб СТРАС-2.

Результаты работы включены в курсы лекций по экологии и трофологии гидробионтов. читаемых в ряде университетов.

Апробация работы. Материалы диссертации представлялись' на 4 Всесоюзной конференции по раннему онтогенезу (Москва. 1988). 1 Всесоюзной конференции по рыбохозяйственной токсикологии (Рига.

1989). 7 и 8 Всесоюзных конференциях по экологической физиологии и биохимии рыб (Ярославль. 1989: Петрозаводск, 1992). 4 Всесоюзном симпозиуме "Мембрана щеточной каймы" (Рига. 1990), Всесоюзной конференции "Оценка состояния, охрана и рациональное использование биологических ресурсов водных экосистем в условиях антропогенного воздействия" (Ростов-на-Дону, 1990), Международной конференции "Optymalizacja gospodarkl wodnej 1 chowu ryb w warunkach pogarszaja cego sie stanu srodowlska przyrodnlczego" (Szcecln,

1990), IV Всесоюзной конференции по рыбохозяйственному использованию теплых вод (Курчатов, 1990), 2 Всесоюзной конференции по рыбохозяйственной токсикологии (С.-Петербург, 1991), 1 Международной конференции "Биологические ресурсы-Каспийского моря" (Астрахань, 1992), Международной конференции "Каспий - настоящее и будущее" (Астрахань, 1995), Second World Fisheries Congress (Brisbane. 1996). научно-методических конференциях профессорско-преподавательского состава АГТУ.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 33 работы.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 261 странице машинописного текста, состоит из введения, 5 глав, общего заключения, выводов, указателя цитируемой литературы, включающего

452 работы, в том числе 287 отечественных и 165 иностранных, и иллюстрирована 33 рисунками и 10 таблицами.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Прудовые и аквариальные исследования выполнены в течение 1984-1996 годов на базе кафедры "Ихтиологии и гидробиологии" Астраханского государственного технического университета и рыбоводных предприятий Астраханской области. В качестве объекта исследования использовали личинок белого Hypophtalmichtys molitrix (Val.), пестрого толстолобиков Aristlchthys nobllls (Richardson) и сибирского осетра Aclpenser baerl Brandt, сеголеток и годовиков карпа Cyprlnus carpió L., белого амура Ctenopharyngodon idella (Val), белого толстолобика, сибирского осетра, белуги Huso huso (L.) и половозрелых леще Abramis brama (L.), плотве Rutilus rutl-lus (L.), щуке Esox luclus L.. а также иссык-кульском чебачке Le-uclscus bergl Kaschkarov.

Для изучения активности и свойств ферментов, обеспечивающих процесс пищеварения использовали различные препараты - гомогенаты слизистой оболочки или всей ткани кишечника, а в некоторых случаях тела личинок рыб. При оценки интенсивности транспортных процессов применяли метод прошитых полосок (Г.М.Рощина, 1981; Л.Ф.Смирнова, 1981).

В зависимости от цели исследований определялась суммарная карбогидразная активность - по приросту гексоз при гидролизе растворимого крахмала (20 г/л) методом Н.Нельсона в модификации А.М.Уголева и Н.Н.Иезуитовой (1969), активность мальтазы (КФ 3.2.1.20) - по приросту глюкозы при гидролизе мальтозы (20 иг/л) глкжозооксидазным методом (A.Dahlqvist. 1964), а-амилазы (КФ 3.2.1.1) - по убыли крахмала (1 г/л) (А.М.Уголев и совт., 1969), нейтральной и щелочной протеазы - модифицированным методом Лоури (Т.Л.Алейникова. Г.В.Рубцова, 1988) по приросту тирозина при гидролизе казеина (1%), приготовленного на фосфатном буфере (pH -7.4 и 9.0), щелочной фосфатазы (КФ 3.1.3.1) определяли с использованием п-нитрофенилфосфата На (0.6 мМ) в качестве субстрата.

Интенсивность аккумуляции кишечными препаратами глюкозы и гексоз определяли глюкозооксидазным методом В.К.Городецкого и методом Н.Нельсона в модификации А.М.Уголева и H.H.Иезуитовой

(1969) соответственно. В качестве субстратов использовали глюкозу (ЮмМ), мальтозу (10 мМ), сахарозу (50 мМ), крахмал (18 г/л).

Активность фермента выражали в мг или мкмоль продуктов гидролиза. образующихся за 1 минуту инкубации в расчете на 1 г влажного веса ткани (мг или мкмоль/г*мин). Концентрация накопленных углеводов в ткани кишечника за 60 мин выражали в мМ в расчете на 100 мг влажного веса ткани. Энергию активации расчитывали графически методом Аррениуса.

Определение суточных рационов основывалось на количественном • учете содержимого пищеварительного тракта у рыб через равные периоды наблюдений в течение суток (М.А.Щербина и др., 1987).

Морфометрические измерения проводили по стандартным методикам, принятым в ихтиологии ( В.П.Правдин. 1966). Полученные результаты обрабатывали статистически, достоверность различий определяли с помощью критериев Стыодента и Манна-Уитни (Н.Бейли. 1962; Л.Закс. 1976; Г.Ф.Лакин. 1990).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ЦИРКАДИАННАЯ РИТМИКА АКТИВНОСТИ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ РЫБ

Для исследования циркадианной ритмики активности пищеварительных ферментов рыб был проведен ряд аквариальных экспериментов, что позволило создать строго контролируемые условия среды и, соответственно, устраненить многочисленные факторы, которые так или иначе влияют на реализацию процессов пищеварения.

Исследования были проведены на сеголетках карпа и белого амура. Для устранения влияния на результаты эксперимента ранее съеденной пищи рыба выдерживалась без кормления в течение одной недели. Затем рыб разделили на две группы и поместили в аквариумы. Опытная группа получала корм, а контрольная - содержалась без кормления. Длительность эксперимента составила четыре недели.

Результаты^ описывающие циркадианную ритмику суммарной кар-богидразной активности в слизистой оболочке кишечника контрольной и опытной групп карпа представлены в табл. 1.

Анализ полученных данных свидетельствует о различном характере изменения суммарной карбогидразной активности слизистой ки-

Таблица 1

Суточная динамика суммарной карбогидразной активности в слизистой кишечника карпа, мкмоль/г*мин.

1 г 1 1 1 1 1 и Время суток. часы 1

1 г 1 Вариант | 1 опыта | 1 | 1 9 I 1 1 13 1 1 I 17 I I 1 1 1 21 I 1 1 1 1 I 1 1 5 I

1 1 IКонтроль! ! М 1 1±га 1 1 1 I 1 5.94 | 0.29 | 1 7.10 0.32 1 1 1 I I 5.94| 1 0.37 | 1 1 1 1 5.85 | 0.35 | 1 1 1 5.39 I 0.37 I 1 4.51 I 0.13 I

1 1 |0пыт | 1 м | 1+ш I 1 1 1 1 10.23 | 0.54 I 1 8.50 0.55 1 1 1 1 1 7.83 | 1 0.41 | 1 1 1 1 7.99 | 0.59 | .......... 1 1 I 11.30 1 0.56 Г 1 8.02 1 0.45 I 1

шечника у голодавшего и питавшегося карпа. Так в контроле четко прослеживается только один максимум активности, приходящийся на 13.00, тогда как в опыте хорошо обозначены два пика активности -в 9.00 и в 1.00.

Учитывая тот факт, что как в контроле, так и в опыте на объект исследования в равной мере воздействовал комплекс абиотических и биотических факторов, а различие состояло в наличии субстратной нагрузки на гидролитическую систему, то разницу в характере суточной ритмики суммарной карбогидразной активности можно объяснить только кормлением рыбы в опыте.

Результаты, описывающие циркадианную активность нейтральной протеазы, функционирующей в слизистой оболочке кишечника контрольной и опытной груш карпа представлены в табл. 2.

Как видно из таблицы, характер циркадианной ритмики нейтральной протеазы в слизистой кишечника карпа как в опыте, так и в контроле сходен. Это свидетельствует о том, что присутствие субстратной нагрузки практически не оказывает влияния на характер суточной динамики активности нейтральной протеазы слизистой оболочки кишечника карпа.

Таблица 2

Суточная динамика нейтральнопротеазной активности в слизистой кишечника карпа, мкмоль/г*мин.

1 1 1 1 1 1_ Время суток. часы 1

1 Г^ 1Вариант | 1 опыта | 1 1 9 I 1 1 13 ) 1 1 17 1 1 1 1 | 21 1 1 1 1 1 1 1 1 5 I

1 i 1 Контроль! 1 М 1 lim I 1 1 1 1 0.23 I 0.05 I 1 0.10 0.03 1 1 1 1 1 0.05 I 1 0.01 | | | [ I 0.09 | 0.03 I t 0. 0. 1 1 11 1 02 | 1 0.08 I 0.02 |

1 1 I Опыт I 1 М 1 !±m I | • 1 1 3.28 | 0.73 1 г 0.86 0.23 1 1 1 0.60 I 1 0.09 | 1 1 1 1 0.42 | 0.10 1 г 1. 0. 1 1 48 I 26 | . ... 1 1.34 I 0.35 | 1

Рассматривая соотношение измененгЯ . активности исследуемых ферментов в слизистой кишечника рыб контрольной группы можно отметить значительные различия в характере суточной динамики гидролиза белковых и углеводных компонентов шпци. Отсутствие взаимообусловленности активности исследуемых ферментов подтверждается результатами корреляционного анализа (коэффициент корреляции г = 0.16 при р < 0.7).

Напротив, данные, характеризующие суточную динамику исследованных ферментов в слизистой кишечника опытной группы рыб. свидетельствуют. что характер циркадианной ритмики активности комплекса карбогидраз и нейтральной протеазы з кишечнике карпа весьма сходен (коэффициент корреляции г=0.63 при р<0.05 свидетельствует о наличии значительной положительной связи между исследуемыми признаками). Уравнение регрессии, связызавщее активность нейтральной протеазы. принятой за независимый признак, и суммарную карбогидразную активность, в данном случае имеет следующий вид:

у = 7.82 + 0.88 * х. где

у - суммарная карбогидргзная активность, х - активность нейтральной протеазы.

Полученные результаты позволяют утверждать, что наличие пищи оказывает влияние не только на характер суточной ритмики суммарной карбогидразной активности и активности нейтральной протеазы слизистой оболочки кишечника карпа, но и на степень обусловленности одного признака другим. Так, отсутствие субстратной нагрузки ведет к ослаблению линейной связи между активность комплекса карбогидраз и нейтральной протеазой, и, напротив, наличие корма приводит к возрастанию тесноты этой связи.

Исследования циркадианной ритмики пищеварительной, функции карпа показало значительную обусловленность активности комплекса карбогидраз слизистой оболочки кишечника временем суток.• Однако, осталось неизвестным какие ферменты карбогидразного пула обеспечивают степень варьирования уровня общей амилолитической активности (панкреатические или собственнокишечные). Кроме того, определенный интерес представляет выявление проксимо-дистальных различий характера течения гидролитического процесса на протяжении суток. В связи с этим, были проведены одновременные исследования циркадианной ритмики а-амилазной, мальтазной и суммарной карбогидразной активности слизистой оболочки проксимального, медиального и дистального отделов кишечника у белого амура, пища которого в естественных условиях состоит в основном из углеводов (табл.3).

Результаты проведенных исследований, свидетельствуют о неравноценном вкладе собственнокишечного (мальтаза) и панкреатического (а-амилаза) ферментов в обеспечение уровня суммарной карбогидразной активности слизистой кишечника белого амура. Нами установлено, что суммарная карбогидразная активность изменяется одновременно с активностью мальтазы во всех отделах кишечника, в то время, как уровень активности панкреатической а-амилазы характеризуется относительной стабильностью. Кроме того, важно подчеркнуть однотипное изменение активности пищеварительных ферментов в слизистой оболочке исследованных отделов кишечника белого амура в течение суток.

Полученные результаты позволяют говорить о наличии адаптации пищеварительной функции к времени суток вне зависимости от наличия пищи. Иными словами, суточная ритмика активности ферментов существует как самостоятельный процесс, на течение которого могут накладывать отпечаток воздействия тех или иных факторов среды.

Таблица 3

Уровень активности пищеварительных ферментов слизистой оболочки различных отделов кишечника белого амура в течение суток. мкмоль/г*мин.

~Г

|Фер-|мент I

N

отдела

Время суток, часы

14

20

IКомплекс Iкарбо-Iгидраз I

I

43.07+5.99

61.28+6.38

169.11±23.92

102.72+12.58

II

81.08+14.14

63.50+6.22

222. 78+28.06

185.22+20.64

III

67.53+6.96

68.37±11.85

174.61+31.29

158.45±37.63

|Маль-|таза

0.69+0.22

0.93+0.06

2.26+0.39

1.95+0.33

II

0.79+0.27

1. 02±0.15

2. 74±0.51

2.63+0.49

III

0.72+0. 29

0.76+0.10

2.11+0.26

1.94+0.32

I сс-ами-|лаза

58.91+8.69

45.37+4.65

58.61+4.56

58.13+7.60

II

81.75+11.45

58.74+10.39

60.81+5.65

64.12±7.52

III а_I

79.10+8.51

51.50+11.29

59.86+3.26

60.01+8.57

При этом, наличие субстратной нагрузки, по-видимому, является важнейшим фактором, который оказывает влияние не только на характер циркадианной ритмики активности комплекса карбогидраз и нейтральной протеазы, но и приводит к четко выраженной взаимообусловленности гидролиза белковых и углеводных компонентов пищи.

Таким образом, проведение аквариальных экспериментов позволило выявить наличие временной организации течения гидролитического процесса, которая носит эндогенный характер и обеспечивается

преимущественно собственнокишечными ферментами, характеризуясь отсутствием проксимо-дистальных особенностей.

В реальных же условиях действует целый комплекс абиотических и биотических факторов среды, которые оказывают непосредственное или опосредованное влияние на организм рыб. В связи с этим, нами была предпринята попытка изучить циркадианную ритмику суммарной карбогидразной и протеазной активностей в кишечнике .карпа в прудовых условиях на протяжении сезона выращивания (24.06 - до начала кормления комбикормом, 16.07, 06.08, 27.08 - в период кормления комбикормом).

Данные, полученные в результате проведенных экспериментов, свидетельствуют о том, что характер изменения активности комплекса кишечных карбогидраз и протеаз в течение суток у рыб в различные периоды выращивания варьирует (таблицы 4, 5).

При сравнении динамики активности суммарной карбогидразы и' нейтральной протеазы в первом отлове обращает на себя внимание следующий факт: изменение суммарной карбогидразной активности в какую-либо сторону сопровождается изменением активности нейтральной протеазы в противоположную сторону. Проведенный корреляционный анализ позволил выявить наличие значительной обратной связи (г = -0.5. р<0.05) между исследуемыми ферментами. Во втором отлове характер связи коренным образом изменился на значительную положительную (г > 0.6, р<0.05) и сохранился до конца периода выращивания, что может быть связано с изменением характера потребляемой пищи (Егоров, 1995).

Таким образом, исследование циркадианной ритмики активности ферментов слизистой кишечника карпа, выращиваемого в прудовых условиях показало подверженность характера реализации пищеварительной функции существенному влиянию комплекса факторов окружающей среды, который способен скрыть эндогенную природу ритма исследуемой функции.

ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА ПИЩЕВАРИТЕЛЬНО-ТРАНСПОРТНУЮ ФУНКЦИЮ КИШЕЧНИКА РЫБ

Понимание механизмов эволюционных и адаптивных перестроек пищеварительной системы рыб возможно лишь при тщательном изучении

Таблица 4

Суточная динамика суммарной карбогидразной активности слизистой оболочки кишечника карпа, выращиваемого в прудовых условиях. мкмоль/г*мин.

1 I Дата I отлова 1 Время суток, часы 1

9 13 1 1 1 17 I 21 I 1 1 5 I

124.06 М ±ш 126. 1 2. 94 99 26.24 1.99 | 32.701 I 2.391 1 25.91 | .3.12 | 1 26. 2. 30 75 25. 3. 20 | 90 |

¡16.07 м ±га |15. 1 з. 88 27 8.61 1.60 1 5.05 | 1 1.54 | 1 9.76 | 1.96 | 1 14. 2. 44 08 И. 3. 35 | 25 |

106.08 м ±ш 117. 1 1- 43 05 22.45 1.25 I 22.73 | 1 1.56 | 1 28.65 | 2.30 | 1 19. 1. 97 47 28. 2. 18 | 72 |

127.08 1 м ±ш 134. 1 3. 1 71 35 34.19 3.01 | 26.05 | 1 1.65 | | | 1 41.66 | 5.49 | I 33. 2. 23 78 35. 3 .. 07 | 00 |

Таблица 5

Суточная динамика активности нейтральной протеазы слизистой оболочки кишечника карпа, выращиваемого в прудовых условиях, мкмоль/г*мин.

1 1 Дата I отлова Время суток, часы 1

1 9 I 1 13 \ 1 1 17 I 1 | 21 I 1 1 1 I 5 I

124.06 М ±т 1 5.161 0.90| 1 2.89 0.57 1 1 1 2.16 | 1 0.44 | 1 | 1 3.21 | 0.58 | 1 2. 0. 43 | 36 1 4.55 I 0.77 |

116.07 М ±т 1 6.73 | 1.81 | 1 4.24 0. 56 1 1 ! 1.83 | 1 0.39 | 1 1 1 3.94 | 0.83 | 1 3. 0. 30 I 25 | 3.84 I 0.52 I

106.08 М ±т 1 6.10 | 0.77 | I 6.59 0.55 1 1 I 9.50 | 1 0.78 | 1 | 1 6.32 | 0.57 | 1 9. 1. 02 I 15 | 7.421 0.661

¡27.08 1 М ±т 1 6.57 | 0.46 | 1 6.43 0. 60 1 1 1 5.04 ! I 0.60 | ' | 1 7.30 I 0.95 I г 7. 0. 81 I 52 I I 9.02 I 0.61 | |

влияния на функционирование этой системы как биотических, так и абиотических факторов среды. Наряду с фотопериодизмом, одним из важнейших факторов среды, который непосредственно влияет на скорость биохимических реакций является температура. В связи с этим, нами исследовано влияние температуры не только на гидролитическую, но и транспортную функцию кишечника рыб в условиях как In vivo, так и In vitro.

При исследовании влияния температуры инкубации на уровень активности а-амилазы и мальтазы кишечника карповых рыб (рис.1.2) установлено, что такие характеристики, как температурный оптимум, относительная активность при низких и высоких температурах инкубации максимально различаются у иссык-кульского чебачка и белого толстолобика, коррелируя с экологическими особенностями этих видов. Так, например, температурный оптимум мальтазы кишечника карпа и белого толстолобика соответствует 65°С, у иссык-кульского чебачка 60°С. Для фермента кишечника белого толстолобика отмечена довольно узкая зона оптимальных значений температуры и значительное снижение уровня активности в зоне постмаксимальных температур инкубации (до 75% от максимальной). Для мальтазы кишечника карпа и иссык-кульского чебачка отмечена более широкая зона оптимальных значений температуры инкубации, а относительная активность фермента при температуре, превышающей оптимальную на 5°С составляет 90 и 93% соответственно. Важно отметать," что в зоне физиологических температур инкубации (0-30°С) относительная активность мальтазы кишечника иссык-кульского чебачка несколько выше, чем у карпа и белого толстолобика.

Полученные результаты свидетельствуют о значительной адапти-рованности ферментных систем к условиям функционирования и подтверждают предположение, высказанное В.В.Егоровой и соавторами (1974) о том, что в процессе эволюции могут отбираться в качестве полезного признака соответствия между температурными условиями среды обитания видов и наиболее эффективной конформацией фермента.

Особый интерес представляет способность пищеварительной системы рыб к адаптации в условиях резкого изменения температуры среды обитания (рис.3). Как видно из рисунка быстрое понижение температуры среды содержания белого толстолобика (в течение 1 ча-

А Б

Рисунок 1. Влияние температуры инкубации на активность маль-тазы слизистой кишечника различны! еиЭое карповых рыб: 1 - ис-сык-кульский чебачок, 2 - карп. 3 - белый толстолобик.

Обозначение: по горизонтали - температура, „С, по еертикали-скорость реакции, на А в /тюль/г*шн. на Б - в % от максимальной, принятой за 100.

Рисунок 2. Влияние температуры инкубации на активность а-атлазы слизистой кишечника различных видов карповых рыб: 1 -иссык-кульский чебачок. 2 - карп. 3 - белый толстолобик.

Обозначение: по горизонтали - тетература. 0 С. по вертикали скорость реакции, на А левая ось У для иссык-кульского чебачка и карпа, правая ось У для белого толстолобика в мг/г*тн. на Б - в % от максимальной, принятой за 100.

в

7

Л

в

5

4

3

г

О 3 Б 912 15 182124

Рисунок 3. Изменение уровня суммарной карбогидразной активности слизистой кишечника белого толстолобика в течение первых 24 часов после снижения температури среди содержания от 21 до 14°С.

Обозначение: по горизонтали - время с момента понижения температуры, ч. по вертикали - скорость реакции, мкмоль/г*шн.

са) от 21 до 14°С приводит первоначально к возрастанию активности кишечных карбогидраз в 1.5 раза, а затем к резкому, приблизительно трехкратному ее падению и повышению до первоначального уровня через 24 часа после изменения температуры. Таким образом, нами установлено, что уровень суммарной карбогидразной активности кишечника белого толстолобика, акклимированного в течение 24 часов к температуре 14°С, близок к значениям идентифицированным для рыб, акклимированных к температуре 21°С. Это может свидетельствовать об отсутствии влияния температуры среды содержания на уровень активности пищеварительных ферментов. Наблюдаемые существенные изменения ферментативной активности слизистой кишечника в течение первых 24 часов после понижения температуры среды содержания рыб может быть вызвано как стресс-реакцией на резкое изменение температуры среды содержания, так и суточной ритмикой изменения активности пищеварительных ферментов, установленной нами.

Изучение уровней активности фермента, как правило, не позволяет определить изменяется ли количество функционирующих молекул или изменяются их свойства.Адаптивные изменения свойств ферментов можно обнаружить по изменениям температурных оптимумов. теплоустойчивости. активности в области низких температур, Еакт и т.д. В

связи с этим, нами были исследованы некоторые температурные характеристики мальтазы кишечника карпа и белого толстолобика, акк-лимированного к различным температурам среды (10 и 20°С) в течение двух недель. При этом было продемонстрировано, что зависимость скорости реакции от температуры инкубации для мальтазы кишечника 'карповых видов рыб. выдержанных в течение 14 суток при различных температурах, имеет сходный характер. Изменений Еакт процесса при снижении температуры содержания рыб мы также не обнаружили. Эти данные могут свидетельствовать о том, что какие-либо модификации свойств мальтазы кишечника карповых видов рыб при изменении температуры среды обитания отсутствуют, этот вывод кажется достаточно убедительным, так как подобные результаты были получены ранее в экспериментах на питающихся карпах (С. Г. Коросте-лев, В.В.Егорова. 1989. 1990; А.Н.Неваленный и соавт., 1990). По-видимому, адаптации пищеварительной функции у рыб к температуре среды осуществляются на более высоком системном уровне, чем на молекулярном.

Высказанное предположение подтвердилось при определении такой морфологической характеристики пищеварительной системы, как масса слизистой поверхности кишечника рыб, содержавшихся при различных температурах - при понижении температуры среды она увеличивается. а при повышении - уменьшается. В частности, относительная масса слизистой оболочки кишечника у карпа и белого толстолобика, акклимированных к температуре 10°С в 1.4 раза выше, чем этот показатель у рыб, акклимированных к температуре 20°С.

Анализируя полученные результаты, касающиеся исследования влияния температуры акклимации на структурно-функциональную организацию кишечника рыб как органа в целом, можно сделать вывод, что при изменении температуры среды варьирует количество энтеро-цитов в слизистой поверхности кишечника, в то время как качественных и количественных изменений связанных с ними ферментов не наблюдается.

Таким образом, в зоне физиологических для рыб температур наблюдается относительная независимость гидролитических процессов на уровне мембранного пищеварения от влияний температуры среды обитания. Действительно, если при понижении температуры среды активность ферментов на единицу массы слизистой снижается, а при

повышении - возрастает (имеется в виду реальная активность ферментов. т.е. определенная при температуре инкубации, равной температуре среда содержания рыб), тогда как масса последней, напротив, увеличивается при понижении температуры и уменьшается при увеличении, то достигается гомеостатирующий эффект. По-видимому, в процессе эволюции подобный механизм оказался наиболее целесообразным, поскольку он не сопровождается сложными процессами, связанными с адаптивным синтезом молекул пищеварительных ферментов с новыми свойствами при многократных изменениях температуры среды обитания рыб.

При исследовании транспортных процессов было установлено достоверное повышение аккумуляции глюкозы и продуктов гидролиза крахмала, сахарозы и мальтозы в кишечнике карповых видов рыб при понижении температуры окружающей среды. Так, например, понижение температуры акклимации от 20 до 5°С (при температуре инкубационной среды 25°С) вызывает возрастание уровня аккумуляции глюкозы и продуктов гидролиза мальтозы кишечными препаратами карпа в 1.7 и 1.5 раза соответственно. Аналогичные результаты были получены рядом авторов при исследовании влияния температуры акклимации на интенсивность всасывания в кишечнике рыб некоторых аминокислот (М.И.БтШ1. 1983; Б. Е.КПсМп. О.Могг1з, 1971). Кроме того, ранее нами (А.Н.Неваленный, 1985, 1987) было установлено, что в зимний период аккумуляция, углеводов кишечными препаратами леща выше, чем в другие сезоны года.

Механизм усиления всасывания углеводов в кишечнике рыб при воздействии низких температур не вполне ясен. Однако, увеличение массы слизистой кишечника, которое мы наблюдали при понижении температуры содержания рыб, позволяет достаточно убедительно объяснить этот феномен. Действительно, если скорость транспортных процессов выражена на единицу массы отрезка кишки, то при увеличении массы слизистой поверхности и неизменной массе мышечной оболочки (в случае понижения температуры среды акклимации) уровень аккумуляции глюкозы будет возрастать. Как известно интенсивность аккумуляции продуктов гидролиза в кишечнике рыб зависит от эффективности функционирования транспортных систем энтероцитов. Следовательно, при выражении интенсивности транспорта на единицу массы слизистой оболочки, а не на массу отрезка кишечника рыб.

акклимированных к различным температурам, эта величина будет постоянной.

Одновременно установлено, что аккумуляция глюкозы, а также продуктов гидролиза поли- и дисахаридов в кишечнике рыб при изменении температуры инкубации меняется незначительно (коэффициент Qiо процесса близок 1). Следовательно, можно предположить, что. по крайней мере у карповых видов рыб, процессы пищеварения при изменении температуры среды обитания лимитируются, по всей вероятности. не на заключительных этапах гидролиза и начальных этапах всасывания, а на стадиях, расщепления биополимеров,' связанных с полостными ферментами.

Результаты нашей работы свидетельствуют о том. что индивидуальные температурные адаптации для мембранносвязанных пищеварительных ферментов отсутствуют. При этом не вызывают сомнения результаты многочисленных исследований (обзоры: В.Б.Ушаков, 1984; П.Хочачка, Д.Сомеро, 1988; А.М.Уголев. В.В.Кузьмина. 1993) и полученные нами данные о том. что ферментативноактивные белки организмов. различающиеся температурными условиями существования, обладают значительной адаптированностью к условиям жизнедеятельности. Совокупность этих данных демонстрирует, что адаптивные реакции в процессе акклимации рыб коренным образом отличаются от адаптивных изменений ферментов (белков) в процессе эволюции.

НУТРИТИВНЫЕ АДАПТАЦИИ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ РЫБ

JL Полисубстратное пищеварение у рыб в условиях In vitro

В реально протекающем гидролитическом процессе одновременно перевариваются белки, жиры и углеводы, которые определенным образом влияют друг на друга, что было достаточно подробно исследовано на высших позвоночных животных (обзоры: А.М.Уголев, 1972; Р.И.Кушак. 1983). Имеются отдельные сведения и о взаимодействии пищевых веществ в процессе гидролиза в кишечнике рыб (А.М.Уголев, В.В.Кузьмина. 1993).

При исследовании полисубстратного пищеварения, как правило, пользуются простейшей моделью одновременного переваривания двух различных пищевых веществ. Для того, чтобы усложнить модель, нами была предпринята попытка исследовать не только бисубстратные, но

и трисубстратные взаимодействия. Сопоставляли интенсивность гидролиза гомогенатами кишечной слизистой карпа и сибирского осетра биополимеров (растворимый крахмал 2%. казеин 1%) и эфира фосфорной кислоты (п-нитрофенилфосфат Na) по отдельности и в присутствии одного или двух веществ, являющихся субстратами при оценке активности карбогидраз, протеаз и щелочной фосфатазы (рис.4-6).

Как видно из рисунка, при исследовании ферментативноактивных препаратов слизистой кишечника карпа и сибирского осетра выявлены процессы взаимодействия субстратов ферментативных реакций в условиях in vitro для всех исследованных групп веществ. При этом важно отметить, что одно и то же вещество может служить одновременно активатором для одного ферментативного процесса и ингибитором для другого. Однако наиболее интересен тот факт, что эффекты трисубс-тратного пищеварения не являются суммой бисубстратных эффектов, более того они могут иметь противоположную направленность.

Важно также подчеркнуть, что в наших экспериментах во всех случаях трисубстратных взаимодействий при исследовании слизистой кишечника обоих видов рыб обнаружен только активирующий эффект. При этом нами исследовалась общая протеазная и карбогидразная активности слизистой кишечника рыб. а не отдельные ферменты проте-азной и карбогидразной цепи. В связи с этим, полученные данные можно с большой долей вероятности экстраполировать на процессы пищеварения, осуществляемые в кишечнике рыб в условиях in vivo.

Установленные нами у рыб процессы ди- и трисубстратные взаимодействия имеют чрезвычайное значение для понимания механизма реализации пищеварительной функции у рыб. Они обеспечивают тесное сопряжение работы различных ферментативных цепей в кишечнике рыб, чем достигается определенный автоматизм в работе пищеварительной системы и настройка ее на соответствующий вид пищи. Следовательно, путем регуляции на уровне активности пищеварительных ферментов осуществляется определенная последовательность в обработке пищи и, по-видимому, интеграция пищеварительных и транспортных процессов.

2. Влияние изменения композиции диеты на процесс пищеварения у рыб В настоящее время убедительно показано, что изменение качественного состава пищи приводит к существенным перестройкам на

- 21

Рисунок 4. Уровень активности щелочной фосфатзы слизистой кишечника карпа (А) и сибирского осетра (Б) в присутствии 1 - казеина, 2 - крахмала, 3 - казеина и крахмала. Обозначение: по вертикали -скорость реакции в % от контроля, принятого за 100.

Рисунок 5. Уровень суммарной карбогидразной активности слизистой кишечника карпа (А) и сибирского осетра (Б) в присутствии 1 -п-тапрофенилфосфата На, 2 - казеина, 3 - казеина и п-нитрофенил-фосфата На. Обозначение, как на рисунке 4.

Рисунок 6. Уровень активности протеази слизистой кишечника карпа (А) и сибирского осетра (Б) в присутствии 1 - п-нитрофенилфосфата N0, 2 - крахмала,- 3 - крахмала и п-нитрофенилфосфата На. Обозначение, как на рисунке 4.

Б

1»

во

А

уровне активности ферментов, участвующих в гидролизе нутриентоЕ (А.М.Уголев. 1972), при этом в ответ на изменение композиции диеты приспособление в одних случаях достигается за счет репрессии, в других - индукции синтеза различных ферментов. Установлено, что активность одних гидролаз изменяется быстрее, других - медленнее, а у третьих отличается стабильностью.

В связи с этим, нами были проведены следующие эксперименты:

1. Выращивание молоди сибирского осетра при использовании диет с различным содержанием белковых и углеводных компонентов. Подращивание молоди осетра после перехода на активное питание проводили в бассейнах в течение трех недель. Рыбы были разделены на три группы, которые получали специализированные диеты: первая состояла преимущественно из белка животного происхождения, вторая содержала 75% белка и 25% углеводов , а третья 50% белка. 35% углеводов и 15% жиров. Активности ферментов в кишечнике осетра определяли на 3 сутки после перехода на активное питание, а также через 14 и 21 день после кормления специализированными диетами.

2. Кормление в течение двух недель сеголеток карпа в аквариальных условиях кормами с различным содержанием белков. Рыбы были разделены на две группы, первая из которых служила в качестве контроля и получала стандартный корм ВБС-РЖ-81, вторая, опытная - тот же корм с увеличенным на 10% количеством белка за счет добавки высушенного подпрессового бульона, являющегося продуктом рыбопереработки и представляющим легкорастворимую фракцию белка животного происхождения.

3. Выращивание молоди белуги на живых кормах и рыбном фарше. Активности ферментов в кишечнике белуге определяли через три недели кормления специализированными диетами.

4. Влияние витаминно-минеральных добавок к кормам на пищеварительную функцию у карпа и белуги.

Полученные результаты, касающиеся выращивания в течение трех недель молоди сибирского осетра на качественно различных диетах (табл.6), существенным образом дополняют представления о характере направленности ферментативных перестроек гидролитических цепей при изменении доли соответствующих субстратов в пище рыб. Действительно, анализируя полученные результаты можно отметить, что в случае выращивания молоди сибирского осетра на преимущественно

Таблица 6

Уровень активности пищеварительных ферментов в кишечнике сибирского осетра (мкмоль/г*мин) при выращивании на различных рационах (М±ш)

1 I Возраст, 1 1 IN раци- Нейтральная 1 Суммарная 1 1 Мальтаза |

I сутки. 1 она. протеаза карбогидраза |

! 3 | 0.06±0.02 0.82+0.08 1 1 10+0.15 1

1 1 0.12+0.0Г 1.17+0.06* ! 1 59+0.10* |

1 17 1 2 0.18±0.01'* 0.79+0.14 1 1 04±0.10 I

1 3 0.27±0.04*' 0.86Ю.13 I 1 14+0.04 I

I- 1 0.10+0.02 0.68+0.08 I 1 16+0.09 1

1 24 1 2 0.14+0. 03* 0.67±0.21 I 1 23±0. 10 I

1 . 1 3 1 ! 0.30+0.03*** 0.84+0.14 1 1 1 13+0.17 I 1

Примечания. Здесь и далее звездочками в таблиие отмечены данные, достоверно отличающиеся от соответствующих значений в начале опыта (3-й сутки после перехода на активное питание, до использования специализированных диет): ' - р<0.05; " - р<0.01: - р< 0.001.

белковой диете требуется незначительное напряжение протеазной гидролитической цепи - уровень активности нейтральных протеаз в кишечнике рыб в течение эксперимента изменяется в наименьшей степени и на 3-й неделе подращивания возвращается к исходному уровню.

Изменение субстратной нагрузки в сторону уменьшения белковой составляющей до 75 и 50% приводит к усилению напряжения протеазной ферментативной цепи, выраженного в трех и пятикратном увеличении скорости гидролиза белкового субстрата и сохранению несколько повышенной активности нейтральной протеазы даже через 3 недели.

Соответственно, углеводная гидролитическая цепь при преимущественно белковой диете характеризовалась наиболее сильным нап-

ряжением по сравнению с диетами, содержащими 25-35% углеводов, что свидетельствует о своеобразной компенсаторной реакции на отсутствие соответствующего субстрата в пище сибирского осетра.

Обращает на себя внимание и тот факт, что увеличение активности ферментов карбогидразной и мальтазной цепи на 17 сутки выращивания молоди сибирского осетра на преимущественно белковой диете, нивелируется к окончанию выращивания, тогда как увеличение активности протеазной гидролитической цепи сохраняется в течение всего периода использования диеты с пониженным содержанием белка. Эти результаты свидетельствуют о тем, что перестройки ферментных систем гидролиза углеводов в ответ ка изменение композиции диета происходят достаточно медленно - в течение одной недели, а возникающее увеличение активности Ферментной цепи при отсутствии соответствующего субстрата имеет обратимый характер.

Определение суммарной карбогидразной активности слизистой кишечника карпа не позволяет зыявить статистически значимых различий этого показателя при увеличении доли белка в корме (18.3±0.10 и 17.1±0.12 мкмоль/г*мин у контрольной и опытной групп соответственно). В то же время наблюдается достоверное превышение (на 24%) уровня активности протеолитических ферментов в слизистой кишечника карпа при возрастании доли белковой составляющей корма (1.89+0.10 и 2.48±0.11 мкмоль/г*мин соответственно).

Сопоставление результатов, полученных при исследовании влияния изменения композиции диеты на активность карбогидразной и протеазной ферментативных цепей в кишечнике рыб. свидетельствует о том. что на изменение состава диеты наиболее чутко реагирует цепь гидролиза тех компонентов, которые находятся в дефиците. Так, недостаток углеводной составляющей в корме приводит к значительному изменению ферментов карбогидразного пула, тогда как уменьшение количества белка и. соответственно, увеличение углеводной составляющей приводит к значительному изменению активности протеолитических ферментов. При этомб характер изменения активности непосредственным образом зависит от доминирующего компонента в характерной для вида диете.

Анализ адаптации ферментных систем, особенно цепи протеаз. у рыб на организменном уровне недостаточен и должен учитывать наличие собственных ферментных систем жертвы, которые также могут

участвовать в реализации пищеварительной функции (А.М.Уголев. В.В.Кузьмина. 1993).Исследование активности нейтральных протеаз. функционирующих в кишечнике молоди белуги (табл.7) показало, что скорость гидролиза белковых компонентов пищи при использовании рыбного фарша более, чем в два раза ниже по сравнению со значением этого показателя в кишечнике рыб, получавших живые корма. Полученные данные возможно объяснить только результатом увеличения протеолитической активности кишечника молоди белуги за счет собственных протеолитических ферментных систем зоопланктона.

Таблица 7

Уровень активности пищеварительных ферментов в кишечнике белуги (мкмоль/г*мин) при выращивании на различных рационах (М+т)

1 |Тип корма 1 1 Нейтральная I 1 Суммарная 1 а -амилаза 1

1 1 1 протеаза 1 1 карбогидраза

1 1 Живой корм 1 1 0. 27+0. 03 1 3. 64±0.67 8.53±2.07 |

1 Рыбный фарш ( I 0.12+0.02" г I 4.27±0.26 1 11.08+0.92 |

Одной из важнейших проблем современного интенсивного рыбоводства является создание искусственных кормов, обогащенных комплексом микроэлементов и витаминсодержащими препаратами, максимально отвечающими пищевым потребностям рыб. При исследовании влияния как витаминных, так и минеральных добавок к комбикормам выявлено существенное влияние этих компонентов корма на уровень активности пищеварительных ферментов кишечника. При этом показано, что характер этого влияния зависит от качественного состава добавки, от вида анализируемой ферментной цепи, а также изменяется с возрастом рыб.

Полученные результаты безусловно имеют определенный практический интерес. Выявленные особенности перестроек гидролитических систем при выращивании молоди осетровых и карповых видов рыб на диетах с различным содержанием основных групп пищевых веществ позволяют подойти к решению проблемы создания наиболее физиологичных стартовых кормов, используя такой биохимический тест, как уровень активности пищеварительных ферментов.

3. Становление пищеварительной Функции у растительноядных видов рыб на ранних этапах постэмбрионального развития при использования различных типов кормов

В процессе онтогенетического развития рыб активность пищеварительных ферментов претерпевает значительные изменения, причем наиболее существенное увеличение уровня ферментативной активности приходится на личиночный период (А.Н.Неваленный и соавт., 1988. 1989, 1990; А.М.Уголев, В.В.Кузьмина. 1993; И.В.Волкова. А.Н.Неваленный. 1996 и др.).

. Анализируя-результаты, отражающие возрастную динамику активности пищеварительных ферментов, следует обратить внимание на то, что скорость гидролиза белковых компонентов пищи у различных видов рыб достаточно низка по сравнению с уровнем суммарной карбо-гидразной активности, при этом уровень протеолитической активности в течение первого месяца жизни у личинок рыб близок нулю. По-видимому, пищеварительный аппарат рыб на ранних этапах онтогенетического развития не продуцирует необходимое количество ферментов протеазной цепи, а гидролиз белков осуществляется в основном за счет собственных гидролаз потребленного зоопланктона путем автолиза последнего. Этим же можно объяснить и более- высокие значения активности протеаз у личинок пестрого толстолобика при питании естественной кормовой базой по сравнению с выращиваемыми на искусственном корме. В то же время, у личинок белого толстолобика активность протеаз выше при выращивании на искусственном корме, что. возможно, свидетельствует о меньшем значении механизма индуцированного аутолиза у данного вида рыб, так как уже на ранних этапах постэмбрионального развития основную часть его естественной пищи составляет фитопланктон.

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Адаптируемость к условиям функционирования является одним из фундаментальных свойств биологических систем.

Общепринятым считается представление об относительной стабильности гащеварительно-транспортной функции кишечника гетеротрофных организмов, что связано с достаточно медленным (в течение 2-6 суток) обновлением популяции энтероцитов (обзоры: J.S.Trier. J.L.Madara. 1981; J.L.Madara, J.S.Trier, 1987). Действительно,

при исследовании адаптации пищеварительной системы рыб к качественному составу корма нами продемонстрировано, что перестройки ферментных систем, реализующих мембранный гидролиз белковых и углеводных компонентов пищи, осуществляются в течении достаточно длительного времени (1-2 недель) и имеют обратимый характер. По-видимому, стимул, возникающий при изменении композиции диеты, должен быть неоднократно повторен для перехода на качественно новый уровень ферментативной активности.

Однако несомненно и то, что в реализации реально протекающего пищеварительного процесса огромное значение имеет регуляция на уровне активности имеющегося пула ферментов энтероцитов. возможность которой была продемонстрирована нами при исследовании основных ферментных систем кишечника рыб в присутствии модификаторов различной природы. Подобная регуляция, как уже указывалось нами ранее, может осуществляться практически мгновенно за счет изменения активности ферментов в результате связывания с тормозящими или стимулирующими модификаторами.

Вместе с тем, анализируя данные, касающиеся влияния основных абиотических факторов среды (фотопериодизм, температура окружающей среды) на пищеварительную функцию у рыб можно выделить два уровня индивидуальной адаптации в конкретных экологических условиях. Действительно, продемонстрированные в данной работе факты позволяют утверждать, что изменение активности ферментов в течение суток необходимо относить именно к разряду так называемых "быстрых" адаптация (П.Хочачка, Д.Сомеро. 1977, 1988: Адаптационно-компенсаторные процессы. .. , 1991), которые осуществляются на клеточном уровне за счет изменения интенсивности синтеза и транслокации мембранных ферментов. Другой, более медленный, выработался как приспособление организма к сезонным изменениям абиотических условий, главным из которых является температура, и осуществляется посредством изменения массы слизистой оболочки кишечника на фоне неизменных характеристик фермент-мембранных комплексов. Последний механизм необходимо относить к следующему, органному, уровню адаптации. Видимо, в процессе эволюции подобная реакция на изменение температуры оказалась предпочтительнее, поскольку она не сопровождается сложными процессами, связанны?« с адаптивным синтезом молекул пищеварительных ферментов с новыми свойствами, а осуществляется посредством варьирования неизменных Функциональных

блоков (энтероцитов), что подтверждает развиваемую в последние годы концепцию универсальности функциональных блоков (обзоры: A.M.Уголев, 1983. 1985, 1987, 1990: А.М.Уголев и соавт., 1992).

Анализ реально протекающего пищеварительного процесса не был бы достаточно полным без учета механизма индуцированного аутоли-за. особенно в процессах гидролиза субстратов белковой природы, осуществляемого за счет ферментных систем трофических партнеров, что наиболее важно на ранних стадиях онтогенетического развития рыб. Действительно, этот механизм позволяет существенно увеличивать мощность пула пищеварительных ферментов, участвующих в ассимиляции компонентов пищи и его необходимо рассматривать в качестве надорганизменного уровня реализации пищеварительной функции у рыб.

Таким образом, пищеварительная система рыб демонстрирует широкую адаптационную пластичность, которая достигается за счет приспособительных реакций на молекулярном, клеточном, органном, организменном, видовом и биоценотическом уровнях организации живой материи, которые взаимосодействуют и обеспечивают четкую координацию пищеварительной функции организма рыб. характеризующихся разнообразием условий среды обитания.

ВЫВОДЫ

1. С целью характеристики эволюционного развития нормальных физиологических функций организма, в частности, филогенеза функции пищеварения, охарактеризованы временная организация, зависимость от абиотических и биотических факторов среды обитания процессов пищеварения у пойкилотермных животных на примере рыб различных экологических групп. Установлено взаимосодействие адаптационных реакций пищеварительной системы, обеспечивающее реализацию пищеварительной функции в конкретных экологических условиях.

2. Выявлены основные закономерности суточной динамики активности пищеварительных ферментов в слизистой кишечника рыб. Продемонстрировано, что циркадианная ритмика активности карбогидраз и протеаз носит эндогенный характер и обеспечивается преимущественно собственнокишечными ферментами, характеризуясь отсутствием проксимо-дистальных особенностей.

3. Активности карбогидразной и протеазной ферментативной це-

пей кишечника карпа в течение суток коррелируют отрицательно при питании естественной пищей (г=-0.5. р<0.05). а переход на питание комбикормом изменяет характер связи на положительный (г>0.6, р<0.05). Отсутствие субстратной нагрузки ведет к ослаблению связи между активностью комплекса карбогидраз и протеаз (г=0.16. р<0.07) и. напротив, наличие корма приводит к ее возрастанию (г=0.63, р<0.05). Уравнение регрессии, связывающее активность нейтральной протеазы. принятой за независимый признак, и суммарную карбогидразную активность, в данном случае имеет следующий вид:

у = 7-82 + 0.88 * х

4. Колебания уровня суммарной карбогидразной активности в слизистой кишечника белого толстолобика в течение суток после быстрого снижения температуры акклимации обусловлены суточной ритмикой пищеварительной функции, так как при исследовании рыб, акклимированных в течение двух недель к различным температурам, не выявлено адаптивных перестроек активности и свойств мембран-носвязанных пищеварительных ферментов.

5. Температура инкубационного раствора не оказывает значительного влияния на интенсивность транспорта углеводов кишечными препаратами различных видов рыб. Однако, снижение температуры акклимации приводит к достоверному усилению в 1.5-1.7 раза интенсивности аккумуляции моно- и продуктов гидролиза да- и полисахаридов.

6. Свойства пищеварительных ферментов слизистой кишечника карповых рыб связаны с их экологическими особенностями, в частности. с температурой среды обитания. Не выявлено адаптивных изменений ферментативных й транспортных систем при изменении температуры акклимации. а установлен приспособительный характер варьирования массы слизистой оболочки рыб, обеспечивающий гомеостаз ■ пищеварительной функции при колебаниях температуры среды. Следовательно адаптивные реакции пищеварительной системы в процессе акклимации к температуре осуществляются иным образом, чем адаптивные изменения в ходе эзолвционного процесса.

7. Выявлены процессы взаимодействия субстратов ферментативных реакций (крахмал, казеин и п-нитрофенилфосфат Иа) при исследовании ферментативноактивных препаратов слизистой кишечника рыб. Продемонстрировано, что одно и то же вещество может служить од-

новременно активатором для одного ферментативного процесса и ингибитором для другого. Показано, что эффекты трисубстратного пищеварения у рыб не являются суммой бисубстратных эффектов, при этом во всех случаях трисубстратных взаимодействий обнаружен только активирующий эффект (до 123%).

8. Основные ферментные системы (протеазные и карбогидраз-ные). обеспечивающие пищеварительную функцию у рыб тонко адаптированы к составу потребляемой пищи. Изменение доли характерного для данного вида рыб компонента пищи сопровождается относительной стабильностью активности соответствующей группы пищеварительных ферментов в слизистой кишечника рыб и варьированием уровня активности не специфичной для данного субстрата группы ферментов.

9. Введение в комбикорма для выращиваемых видов рыб как минеральных. так и витаминных добавок оказывает значительное влияние на уровень активности пищеварительных ферментов кишечника. При этом характер этого влияния зависит от качественного состава добавки и от вида анализируемой ферментной цепи.

10. Установлено, что активность пищеварительных ферментов в процессе онтогенеза личинок растительноядных рыб претерпевает значительные изменения. После перехода на активное питание активность карбогидраз закономерно возрастает в 5-6 раз. а протеаз в 6-9 раз в течение только первых семи суток. В дальнейшем, на протяжении личиночного периода происходят перестройки процесса реализации пищеварительной функции, обусловленные переходом на тип питания, характерный для взрослых рыб.

11. Анализ полученных данных позволяет выделить два временных уровня адаптации пищеварительной функции у рыб. Первый - цир-кадианный, отражает реакцию организма рыб на ежесуточные изменения экологических условий, является мобильным средством поддержания гомеостаза внутренней среды и осуществляется в течение коротких интервалов времени за счет изменения интенсивности синтеза и транслокации мембранных ферментов. Второй - циркануальный, более медленный уровень адаптации основан на количественных и качественных изменениях популяции энтероцитов в ответ на сезонные колебания основных абиотических и биотических факторов среды и реализуется в течение нескольких суток при многократном воздействии фактора. Одновременно с этим важную роль в реализации пищеварительной функции у рыб в конкретных экологических условиях играет

регуляция на уровне активности пищеварительных ферментов и механизм индуцированного аутолиза.

12. Полученные результаты свидетельствуют о том. что эволюция специализированных систем, в том числе желудочно-кишечного тракта, связана с рекомбинацией и перераспределением функциональных блоков, выполняющих элементарные функции, которые близки или идентичны у организмов, стоящих на разных уровнях эволюционной лестницы, подтверждая теорию о блоковом строении различных биологических структур и функций.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние температуры акклимации на интенсивность всасывания углеводов в кишечнике леща //Журн. эволюц. биох. физиол. - 1984.- Т. 20. N4. - С. 448-449.

2. Влияние температуры на интенсивность всасывания углеводов в кишечнике леща в различные сезоны года //Биол. внутр. вод. Инф. бюл. - 1985.- N67. - С. 55-58.

3. Видовые и индивидуальные адаптации гидролитических и транспортных функций кишечника рыб //Экологическая физиология и биохимия рыб. Тез. докл. Всес. конф. Вильнюс, 1985. - С. 529-530 /А.М.Уголев, В.В.Кузьмина, И.Л.Голованова.

4. Температурные адаптации //Физиология адаптационных процессов. Руководство по физиологии. М.: Наука, 1986. - С. 394-403 /В.В.Кузьмина.

5. Механизм влияния температуры на транспортные процессы в кишечнике рыб //Изучение, рациональное использование и охрана природных ресурсов. Тез. докл. - Рига, 1987. - С. 178-179.

6. Активность а-амилазы в кишечнике некоторых видов рыб в районе проведения гидромеханизированных работ //Изучение, рациональное использование и охрана природных ресурсов. Тез. докл. -Рига. 1987. - С. 180-181 /С.Г.Коростелев.

7. Активность а-амилазы у личинок белого и пестрого толстолобиков при выращивании на различных кормах //7 Всес. конф. по раннему онтогенезу рыб. Тез. докл. - Москва, 1988.- Ч. 2. - С. 25-27 /С.Г.Коростелев. Пак Ун Ен.

8. Влияние различных кормов на активность пищеварительных ферментов растительноядных рыб //Тез. докл. на секции рыбных био-

ресурсов и экологии гидробионтов научной конференции НПО по рыбоводству и ВЗИПП. - Москва. 1989. - С. 68-70 /В.Ф.Зайцев. Пак Ун Ен. С.Н.Егоров.

9. Влияние концентрации водородных ионов в воде на активность некоторых карбогидраз кишечника карпа //Тез. докл. 1 Всес. конф. по рыбохозяйственной токсикологии. - Рига, 1989.- 4.2. - С. 51-52 /С.Г.Коростелев. М.И.Карпюк.

10. Характеристика активности некоторых пищеварительных ферментов у молоди ленского осетра, выращиваемой на различных рационах //Экологическая физиология и биохимия рыб. Тез. докл. Всес. конф. - Ярославль. 1989.- 4.2. - С. 165-166 /З.А.Сухова. А.А.Попова. С.Г.Коростелев. И.Б.Жарков.

11. Суточная динамика уровня активности некоторых карбогидраз кишечника карпа //Мембрана щеточной каймы. Тез. докл. 4 Всес. симпозиума. -Рига. 1990. - С. 92-93 /С.Г.Коростелев, С.Н.Егоров.

12. Влияние некоторых биостимуляторов на мембранный гидролиз углеводов в кишечнике карпа //Мембрана щеточной каймы. Тез.докл. 4 Всес.симпозиума. -Рига, 1990. - С. 94-95 /С.Г.Коростелев, В. Ф. Зайцев.

13.Влияние различных кормовых добавок на активность некоторых пищеварительных ферментов кишечника карпа //Оценка состояния, охрана и рациональное использование биологических ресурсов водных экосистем в условиях антропогенного воздействия. Тез. докл. -Ростов-на-Дону, 1990. - С. 111-112 /С.Г.Коростелев.

14.Действие различных рационов пищи на активность некоторых ферментов у молоди ленского осетра //Оценка состояния, охрана и рациональное использование биологических ресурсов водных экосистем в условиях антропогенного воздействия. Тез. докл. -Ростов-на-Дону, 1990. - С. 112-114 /С.Г.Коростелев. З.А.Сухова.

15.Wplyw рогу roku 1 temperatury aklimacjl na stoplen akumu-lacji weglowodanow w przewodzle pokarmowym ryb //Optymalizacja gospodarkl wodnej 1 chowu ryb w warunkach pogarszaja cegó sie stanu srodowlska przyrodnlczego. Materlaly konferencylne. -Szcecln. 1990. - P. 68.

16.Влияние комбикормов на активность карбогидраз кишечника карпа //Водные биоресурсы и экология гидробионтов. Сб. науч. тр. -М.: ВНИИПРХ, 1990.-Вып.59. - С. 117-118 /В.Ф.Зайцев. С.Г.Коростелев. С.Н.Егоров.

17. Влияние температуры на пищеварительно-транспортную Функцию кишечника рыб // Всес.совещ. по рыбохоз. использованию теплых вод. Тез. докл. -М., 1990. - С. 155-156 /С.Г.Коростелев, В.Ф.Зайцев.

18.Влияние температуры на мембранный гидролиз и транспорт у рыб //Изв. АН СССР, сер. биологическая. - 1990,- N1. - С. 30-39 /А.М.Уголев, В.В.Кузьмина, Г.М.Рощина. Л.Ф.Смирнова, А.А.Груздков.

19.Некоторые морфофизиологические характеристики сеголеток карпа при выращивании на кормах с микроэлементными премиксами //Биохимия экто- и эндотермных организмов в норме и при патологии. -Петрозаводск. 1990. - С. 157-163 /В.Ф.Зайцев, И.О.Колобова, С.Г.Коростелев.

20. Динамика уровня активности карбогидраз в кишечнике белого толстолобика при изменении температуры //Вопросы экологии гидро-бионтов. Сб. науч. тр. -М.: ВНИИПРХ. 1991.- Вып. 64. - С. 69-70 /В. Ф. Зайцев, С. Г. Коростелев.

21. Суточная динамика активности некоторых кишечных ферментов карпа //Комбикорма и обмен веществ у рыб. Сб. науч. тр. -Калининград, 1991. - С. 53-60 /С.Н.Егоров. С.Г.Коростелев, В.Ф.Зайцев.

22. Влияние ионов тяжелых металлов на функционирование некоторых ферментов кишечных микроворсинок карася //Тез. докл. 2 Всес. конф. по рыбохозяйственной токсикологии, посвящ. 100-летию проблемы качества воды в России.- С.-Петербург, 1991.- Т. 2. - С. 68-69 /В.Ф.Зайцев, С.Н.Егоров, А.Е.Минеев.

23. Effect of water рН different values on activity of some digestive enzymes in carp (Cyprinus carpió L.) //Acta lchthyolo-glca et piscatoria, 1991,- V. XXI, N1. - P. 59-63 /V. F. Zaitsev, S. N. Yegorov, s. G. Korostelyov.

24. Суточная динамика активности кишечных карбогидраз белого амура //8 науч. конф. по экол. физиол. и биохимии рыб. Тез. докл. -Петрозаводск, 1992.- Т.2. - С. 19-20 /С.Н.Егоров, В.Ф.Зайцев, В. И. Егорова.

25. Влияние температуры на весовые и линейные характеристики кишечника карпа //Водные биоресурсы, воспроизводство и экология гидробионтов. Сб. науч. тр. - М.: ВНИИПРХ. 1992.- Вып. 66. - С. 18-20 /С.Г.Коростелев. В.Ф.Зайцев, С.Н.Егоров.

26. Влияние ионов меди на активность а-амилазы, адсорбированной на гликокаликсе кишечника карпа и карася //Биологические ресурсы Каспийского моря. Тез. докл. 1 Международной конф. - Астрахань. 1992. - С. 282-283 /С.Н.Егоров, Мохамед Сайд Ахмет.

27. Активность некоторых пищеварительных ферментов рыб ильменя Горчичный //Вестник Астрыбвтуза. - М.. 1993.- N1. - С. 91-93 /С.Г.Коростелев. С.Н.Егоров.

28. Исследование температурных характеристик кишечной а-ами-лазы иссык-кульского чебачка //Вестник АГТУ-- 1994.- N1. - С. 58-60 /С.Г.Коростелев. С.Н.Егоров.

29. Влияние использования спирулины в рационе на некоторые морфо-физиологические характеристики пищеварительной системы //Вестник АГТУ.- 1994.- N1. - С. 70-73 /В.Ф.Зайцев. В.И.Егорова. И.С.Дзержинская. С.Н.Егоров.

30. Суточная ритмика изменения карбогидразной активности кишечника карпа, выращиваемого в прудовых условиях //Вопросы ихтиологии.- 1995,- Т. 35. N4. - С. 549-552 /С.Н.Егоров.

31. Экологические аспекты адаптации мембранного пищеварения на примере рыб Волго-Каспийского региона //Каспий - настоящее и будущее. Тез. докл. Международной конф. - Астрахань. 1995. - С. 164-165 /В.Ф.Зайцев.

32. Взаимодействие пищевых веществ в процессе пищеварения у рыб на примере карпа //Журн. эволюц. биох. фйзиол. - 1996.-Т.32, N2. - С. 156-159 / С.Г.Коростелев. С.Н.Егоров.

33. Активность а-амилазы и мальтазы растительноядных рыб на ранних этапах постэмбрионального развития // Вестник АГТУ,-1996.- N27- С.61-64 / В.Ф.Зайцев, И.В.Волкова. В.И.Егорова.

Неваленный Александр Николаевич (Россия)

"Функциональная организация и адаптивная регуляция процессов пищеварения у рыб в различных экологических условиях"

В работе изучены закономерности циркадианных, температурных и нутритивных адаптации пищеварительной функции у рыб. Установленные в работе факты четко разграничивают два временных уровня индивидуальной адаптации пищеварительной функции у рыб

к изменению экологических условий - циркадианный, осуществляющийся в течение коротких интервалов времени (несколько часов), и циркануальный, более медленный, уровень адаптации, который реализуется при многократном воздействии в течение нескольких суток различных факторов среды.

Результаты работы позволяют заключить, что пищеварительная система рыб обладает широкой адаптационной пластичностью, что достигается за счет приспособительных реакций на различных уровнях организации живой материи, которые взаимосодействуют и обеспечивают четкую координацию пищеварительной функции организма рыб в различных экологических условиях.

Hevalonny Alexander Nikolaevich (Russia)

"The functional organization and adaptive regulation of the fish's digestion processes at different ecological conditions"

The main points of cyrcadlann temperaturative and nutritive adaptations of dlgestlonal functions of fish are studied In this work.

Ascertained facts exactly underline two temporal levels of individual adaptation of dlgestlonal function of fish depending on change of ecological conditions - cyrcadlann. which is operating during short intervals of time (during some hours) and cyrcanual, which Is realising during some days, under various factors of environment.

The results of this work allow to have such a conclusion: the dlgestlonal system of fish has a wlrd adaptive plasticity, which has been reached thanks to adjustabllltlve reactions at the different levels oi the organization of alive matter which are co-acting with each other and give the exact coorglnatlon of the dlgestlonal function of fish at different environmental conditions.