Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Влияние Т-регуляторных клеток на киллерные свойства активированных лимфоцитов

На правах рукописи

ВЕЛИЖЕВА НАДЕЖДА ПАВЛОВНА

ВЛИЯНИЕ Т-РЕГУЛЯТОРНЫХ КЛЕТОК НА КИЛЛЕРНЫЕ СВОЙСТВА АКТИВИРОВАННЫХ ЛИМФОЦИТОВ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 7 ОКТ 2011

Москва-2011

4858040

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских иг Российском онкологическом научном центре им. Н. Н. Блохина РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Михаил Валентинович Киселевский

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Лев Вадимович Демидов

доктор медицинских наук, профессор Олег Витальевич Колюжин

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Российский национальнь исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирого Минздравсоцразвития России

на заседании диссертационного совета Российского онкологическо научного центра им. Н. Н. Блохина РАМН по адресу: 115478, г. Моею Каширское шоссе, д.23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российско онкологического научного центра им. Н. Н. Блохина РАМН

Автореферат разослан _ 2011 г.

чао

Ученый секретарь диссертационного со доктор медицинских наук, профессор

ТУАЛЫЮСТЬ ТЕМЫ

Несмотря на длительную историю и несомненные достижения, развитие годов адоптивной иммунотерапии остается приоритетными направлением в ;ологии. В основе применения метода лежит использование иммунотропных деств и активация врожденного и адаптивного звеньев иммунной системы

A. Rayner et al, 1985; Y. Т. Bryceson et al, 2006].

Основным преимуществом иммунотерапии является относительно низкая сичность [К. A. Margolin et al, 1989] и возможность достижения иивоопухолевого эффекта при формировании у пациентов лекарственной истентности. В данном случае стимуляция иммунной системы может [водить не только к лизису опухолевых клеток, но и повышать качество жизни ъных [S. A. Rosenberg, et al, 1987; М. И. Давыдов и соавт., 2000]. В настоящее время существуют два направления в иммунотерапии качественных новообразований. Первое основано на активации адаптивного на противоопухолевого иммунобиологического надзора посредством цания профилактических и лечебных вакцин на основе дендритных клеток ") и трансфецированных Т-лимфоцитов, экспрессирующих специфический неточный рецептор к поверхностным опухолевым антигенам. Второе равление связано с активацией эффекторов врожденного клеточного яунитета - натуральных киллеров (НК) [L. Ruggeri et al, 2005]. Активность НК кет быть существенно увеличена под воздействием таких цитокинов, как ерлейкина-2 (ИЛ-2) или интерферон-у (ИФН-у) [Y. Т. Bryceson et al, 2006]. Из [фоцитов периферической крови, селезенки или опухолевого экссудата гракорпорально в присутствии ИЛ-2 могут быть генерированы лимфокин-4вированные киллеры (ЛАК), обладающие высокой цитотоксичнотью по ошению к трансформированным клеткам. Механизм действия ЛАК точается в прямом цитотоксическом поражении аутологичных опухолевых гок, а также в способности синтезировать и высвобождать биологические 1вные вещества, например, цитокины, оказывающие регуляторное действие на других эффекторов противоопухолевого иммунитета

B. Киселевский, 2003].

Внедрение ИЛ-2/ЛАК-иммунотерапии в клиническую практику расширяет <тр возможностей противоопухолевого лечения. Однако, несмотря на еделенные успехи, которые были достигнуты в последние десятилетия

[H. Kimura et al, 1997; M. E. Dudley et al, 2002; X. B. Ren et al, 2007;], клинической практике остается проблема недостаточной эффективное! иммунотерапии, обусловленная формированием феномена периферическс толерантности [F. М. Marineóla et al, 2000; S. Sakaguchi, 200 N. Ralainirina, 2007]. Способность опухоли «ускользать» от иммунологическо] надзора (отсутствие специфических антигенов, высокая скорость делен! злокачественно трансформированных клеток, секреция супрессорных факторо и низкая биодоступность составляют ключевую проблему иммунотераш [J. Finke et al, 1999; R. F. Wang et al, 2008; M. Grimm et al, 2010].

Для повышения эффективности иммунотерапии необходимо активирова' эффекторные клетки (НК, хелперные и цитотоксические Т-лимфоцить предотвратить развитие процессов иммунологической толерантности и, nj необходимости, нивелировать состояние иммуносупрессии, развивающееся i фоне опухолевой прогрессии. Поэтому, для повышения цитотоксичности НК ЛАК целесообразно выделение обогащенных киллерных субпопуляций ш удаление супрессорных клеток. Для этого могут быть использован современные методы иммуномагнитной сепарации, клиническое применен] которых нуждается в экспериментальном обосновании.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оптимизация метода генерации активированных лимфоцитов использованием иммуномагнитной сепарации.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Исследовать морфофункциональные и иммунофенотипическ особенности ЛАК.

2. Оценить целесообразность выделения обогащенной субпопуляц НК из популяции ЛАК.

3. Провести сравнительный анализ эффективности методов выделен Т-регуляторных клеток из ЛАК.

4. Оценить целесообразность удаления субпопуляции Foxp Т-регуляторных клеток из популяции ЛАК, полученных из лимфоцитов кро больных и здоровых доноров, а также из злокачественных выпотов.

5. Определить уровень содержания Т-регуляторных клет< экспрессирующих транскрипционный фактор Foxp3, в периферической кро здоровых доноров и у пациентов с распространенными форма] злокачественных новообразований.

6. Изучить содержание С04+С025+Г-'охрЗ+Т-регуляторных клеток в качественных экссудатах больных с различными локализациями первичного гхолевого процесса.

7. Оценить влияние СБ4+СБ25+РохрЗ+ Т-регуляторных клеток на шерную активность ЛАК.

УЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые проведено комплексное исследование морфофункциональных и мунофенотипических характеристик ЛАК и определение соотношения в них личных субпопуляций лимфоцитов.

Впервые выполнена сравнительная оценка содержания С04+С025+РохрЗ+ 1егуляторных клеток в периферической крови здоровых доноров (1), у щентов (2) с распространенными формами злокачественных новообразований больных (3) со злокачественными выпотами.

Впервые выполнена оценка влияния С04+СЭ25+РохрЗ+ югуляторных клеток на функциональные и фенотипические особенности ивированных лимфоцитов.

Впервые проанализирована целесообразность и результативность различных >собов выделения НК и РохрЗ+ Т-регуляторных клеток из активированных лфоцитов.

Уточнены данные относительно источников получения и оптимальных жов генерации ЛАК для адоптивной иммунотерапии злокачественных зообразований.

АКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Полученные данные расширяют существующие представления о механизме токсичности и о роли различных субпопуляций лимфоцитов в реализации мерной активности эффекторов противоопухолевого иммунитета, гановлено, что супрессорная субпопуляция С04+С025+РохрЗ+ >егуляторных клеток обнаруживается, главным образом, в злокачественных потах и оказывает ингибирующее воздействие на активность эффекторов шденного иммунитета.

Результаты исследования позволяют оптимизировать режимы и сроки [ерации ЛАК из различных источников, которые могут использоваться для 1ей адоптивной иммунотерапии злокачественных новообразований. Показано, ) элиминация Т-регуляторных клеток с помощью метода иммуномагнитной

сепарации позволяет существенно повысить цитотоксичность активирован!, лимфоцитов по отношению к аутологичным опухолевым клетк злокачественных выпотов.

Результаты работы будут использоваться при проведении клиническ испытаний адоптивной иммунотерапии у пациентов со злокачественны! выпотами (опухолевыми плевритами, асцитами и перикардитами).

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. ЛАК, полученные из различных источников, обладают характерны] морфофункциональными особенностями и представлены субпопуляция! эффекторных и регуляторных лимфоцитов.

2. Лимфоциты злокачественных экссудатов пациентов содер» значительное количество СЭ4+С025+РохрЗ+ Т-регуляторных клеток подтвержденной супрессорной активностью.

3. При генерации ЛАК, полученных из мононуклеарных лейкоцит периферической крови и злокачественных экссудатов пациентов, с увеличени времени инкубации возрастает численность субпопуляции С04+СБ25+Рохр Т-регуляторных клеток, подавляющих пролиферативные, киллерные цитотоксические свойства активированных лимфоцитов.

4. Соотношение в культуре активированных лимфоцитов эффекторн] (НК, НКТ, Тх) и регуляторных субпопуляций СБ4+С025+РохрЗ+ Трег выраженными супрессорными свойствами определяет конечн} цитотоксичность ЛАК.

5. Обогащение активированных лимфоцитов эффекторными клетка! за счет элиминации СБ4+С025+РохрЗ+Т-регуляторных лимфоцитов использованием иммуномагнитной сепарации повышает киллерную активное ЛАК.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертационной работы представлены и обсуждены на VII и Всероссийских научно-практических конференциях с международным участи! - Отечественные противоопухолевые препараты, 17-19 марта, 2008, г. Москва 22 - 23 марта, 2011, г. Москва.

Апробация диссертации состоялась 5 апреля 2011 г. на объединен» научной конференции лабораторий НИИ ЭДиТО, НИИ Канцерогене:

также отделения биотерапии опухолей НИИ Клинической онкологии ЭНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН.

УБЛИКАЦИИ

По теме диссертационной работы в отечественных и зарубежных печатных даниях опубликовано 7 научных работ, в том числе 5 в журналах, :комендованных ВАК.

ГРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы работы изложены на 138 страницах компьютерного текста и стоят из введения, обзора литературы, глав «материалы и методы следований», «результаты собственных исследований», обсуждения, выводов, тактических рекомендаций, списка литературы, представленного 161 точником (4 отечественных и 157 зарубежных авторов). Диссертация люстрирована 13 таблицами и 25 рисунками.

АТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы. В ходе работы исследована периферическая кровь 20 здоровых норов и 25 первичных пациентов с различными формами злокачественных эолеваний. Также проанализированы образцы злокачественных экссудатов больных с различными локализациями первичного опухолевого процесса.

Клеточные линии. В работе были использованы НК-чувствительные еточные линии эритробластного лейкоза человека К-562, опухолевые еточные линии В-клеточного лейкоза Raji, немелкоклеточного рака легкого 549, рака яичника SKOV-3 и аутологичные опухолевые клетки, выделенные из разцов злокачественных экссудатов пациентов, клетки аллогенных [бробластов.

Мононуклеариые лейкоциты (МЛ) выделяли из стабилизированной тарином (25 Ед./мл) периферической крови здоровых доноров и кологических больных, а также из опухолевых экссудатов пациентов, еточные фракции разделяли центрифугированием при ЮООоб./мин, в течение мин. при комнатной температуре на одноступенчатом или двухступенчатом щиентах плотностью 1,077 г/см и 75% и 100% плотности Ficoll-Hystopaque, ггветственно.

Генерацию активированных лимфоцитов проводили из МЛ в

ьтурадьных пластиковых флаконах (Costar, Франция) в полной питательной

-5-

среде RPMI1640 в присутствии ИЛ-2 (Proleukine, Chiron, Голландия) в концентрации 1000 ME/мл в 4,5% атмосфере С02 в течение 3, 7, 10 и 20 суто при температуре 37°С. Исходное количество МЛ в культуре составлял 3,5(±1,0) х 10б кл./мл.

Оценку субпопуляционного состава лимфоцитов проводили методо проточной цитометрии с использованием моноклональных антител проти клеточных антигенов CD3, CD4, CD8, CD57, CD58, HLA-DR (Caltag Laboratorio, США); CD4, CD25, CD16, CD56 (BeckmanCoulter, США); NKG2d, NKp30 CD127 (Miltenyi Biotec Inc., Германия). Уровень экспрессии транскрипционног фактора Foxp3 определяли с помощью внутриклеточного окрашивани моноклональными антителами к Foxp3 (Miltenyi Biotec Inc., Германия Результаты учитывали на проточных цитометрах FacsCalibur и BDFacs Canto' (Becton Dickinson, США). Статистическая обработка материала выполнена использованием программного пакета WIN MDI 2.8.

Киллерную и цитотоксическую активности МЛ и активированны лимфоцитов определяли в цитотоксическом тесте (МТТ) [G. Zund et al., 1999] н линиях опухолевых клеток К-562, B-клеточного лейкоза Raji, немелкоклеточног рака легкого А-549, рака яичника SKOV-3, нормальных клетках легког эмбриона теленка VER, на фибробластах, полученных из фрагментов кож донора и на аутологичных опухолевых клетках, выделенных из опухолевы экссудатов больных.

Оценка пролиферативной активности ЛАК выполнена колориметрическом тесте с использованием витального красителя AlamarBlue условиях стерильного ламинарного бокса (JuanVFS 906) с горизонтальны потоком воздуха.

Определение спонтанной продукции цитокинов МЛ и активированным лимфоцитоами осуществляли методом твердофазного иммуноферментног анализа (ИФА) с использованием коммерческих тест-систем «Вектор-Бест) Россия в диапазоне определяемых концентраций от 10-20 до 1000-2000 пг/мл.

Иммуномагнитную сепарацию регуляторных лимфоцитов с фенотипо CD4+CD25+, CD4+CD25+CD127dim/" и CD25+CD49d- проводили использованием наборов Dynal® CD4+CD25+ Tieg Kit (Dynal Biotech, Норвегия CD4+CD25+CD127dim/* Regulatory T cell isolation Kit (Miltenyi Biotec Inc Германия), CD25+CD49d- Regulatory T cell isolation Kit (Miltenyi Biotec Inc Германия), соответственно, и системы для сепарации, состоящей из магнитног

лива и колонок различного диаметра MACS LD & MS Columns iltenyi Biotec Inc., Германия).

Выделение НК из культуры активированных лимфоцитов осуществляли годом отрицательной иммуномагнитной сепарации с применением набора nal® NK Cell Negative Isolation Kit (Dynal Biotech, Норвегия).

Морфологическое исследование MJI и ЛАК проводили после фиксации гериала в растворе Май-Грюнвальда с дальнейшим окрашиванием полученных 5ков эозин-азуром по Романовскому-Гимза, метиловым зеленым-пиронином по 1ше с контрольной обработкой РНК-азой, реактивом Шиффа по Шабадашу с ггролем амилазой на гликоген и гликозаминогликаны [Р. Лилли, 1969].

Прижизненную флюоресцентную микроскопию, фазово-контрастную кроскопию и фотографирование клеток выполняли с использованием минисцентного микроскопа Axioplan 2, а также цифровой системы истрации и анализа изображения AxioVision 4 (Carl Zeiss, Германия).

Статистический анализ полученных данных проводили с гользованием стандартного пакета статических программ Windows 2007 atSoft 6.0) с расчетом средних, стандартных отклонений, коэффициента феляции. Достоверность различий оценивали при помощи t-критерия ьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

ффологическая, иммунофенотипическая и функциональная >актеристика активированных лимфоцитов, генерированных из нонуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров

В результате изучения морфологических, иммунофенотипических и якциональных характеристик активированных лимфоцитов, генерированных мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров, показано, i активированные лимфоциты представлены различными субпопуляциями векторных клеток, среди которых достоверно можно выделить НК )16+CD56+), НКТ (CD3+/CD16+56+) и хелперные Т-лимфоциты M+CD25+) с высоким уровнем экспрессии костимулирующих поверхностных игенов (табл. I).

Среди активированных лимфоцитов определяется высокий уровень прессии молекулы адгезии CD58 и маркера CD8, что свидетельствует о ичии в данной культуре эффекторных клеток, способных осуществлять ^ацию в целевые очаги.

Таблица 1.

Экспрессия поверхностных антигенов МЛ и ЛАК после 3 суток культивирования с ИЛ-2, (%)

Дифференцировочные антигены лимфоцитов Уровень экспрессии поверхностного антигена лимфоцитов, %

Источник лимфоцитов МЛ ЛАК (3 сут)

СОЗ+ 67,2±21,8 52,6±14,5

С04+ 12,4±4,5 41,0±7,4*

СИ8+ 13,1±5,3 25,7±6,2*

С016+ 21,8±4,8 46,7±13,4*

С025+ 2,1 ±0,9 25,6±3,2

С057+ 3,4±1,1 14,8±5,9*

СБ58+ 42,4±10,2 80,4±18,7*

С037СШ6+56+ 7,2±3,8 59±22,1*

СЭ4+/С025+ 28±6,2 4,5±2,5

СЦ58+/С08+ 48,8±2,5 36,1±8,2

НЬА-ОЯ 42,9±12,5 71,6±23,2

СБ95+ 4,5±1,3 4,9±1,1

* — достоверные различия фенотипа ЛАК по сравнению с МЛ, (р<0,05)

Для изучения специфичности и степени цитотоксической активности ЛА1 генерированных из МЛ периферической крови здоровых доноров, в ходе работ проведен анализ цитотоксичности и киллерных свойств активированнь лимфоцитов на различных опухолевых линиях (рис. 1А, 1Б, 1В). Активированнь ИЛ-2 лимфоциты здоровых доноров обладают выраженной цитотоксичностыо отношении трансформированных клеток различного гистогенеза и неактивны отношении ^трансформированных клеточных линий, в том чиа эмбриональных (табл. 2). При этом уровень цитотоксической активности отношении различных опухолевых линий достоверно повышается п{ уменьшении соотношений клетка-мишень/клетка-эффектор и достига! максимальных значений в соотношении 1:5 - лизису при этом разведет подвергается 63-86% опухолевых клеток. Спонтанная цитотоксическ! активность исходных, не активированных МЛ при этом не превышает 68%.

В отличие от трансформированных клеточных линий цитотоксическ активность ЛАК к аллогенным нетрансформированным и ксеногеннь эмбриональным клеткам заметно снижается (табл. 3). При этом лизису п( воздействием ЛАК подвергается не более 15% от исходного числа нормальнь фибробластов и не более 28% нормальных эмбриональных клеток легкого теленка, 1 экспрессирующих МНС (рис. 2А, 2Б).

в

Рисунок 1. Трансформированные клеточные линии в культуре до (рисунок слева) и после (рисунок справа) взаимодействия с ЛАК. Соотношение клетка-мишень/клетки-эффекторы 1:5. А. А-549. Б. К-562. В. ЭКОУ-З.

Таблица 2.

Гибель трансформированных клеток под воздействием МЛ и ЛАК здоровых доноров (%),

потник эффекторных клеток % лизиса опухолевых клеток

, эотношение 1етка-мишень:клетка-эффектор 1:5 1:2 1:1

Немелкоклеточный рак легкого А-549

Л 58±9 55±6 44±3

\К 71±8 60±10 58±11

Эритробластиый лейкоз человека К 562

Л 61±8 41±13 33±9

\К 90*±2 60*±8 39*±11

Рак яичника ЗКОУ-З

Л 44±4 32±11 19±7

4К 51±10 41±6 33±5

В-клеточный лейкоз Кар

Л 50*±12 28*±7 15*±3

АК 67±13 59±11 40±18

— достоверность различий, р <0,05

Таблица. 3

Гибель ^трансформированных клеток под воздействием МЛ и ЛАК (%)

ип эффекторных _ леток

г:

Соотношение клетка-мишень/клетка-эффектор

1:5

1:2

Нормальные клетки легкого эмбриона теленка УЕЛ

АЛ

21±5*

13±2*

16±4

1АК

25±3*

15±б*

20±5

Фибробласты здорового донора

4Л 8±3* 10±5* 5±2*

1АК 13±2* 9±6* 7±3*

- достоверность различий по отношению к трансформированным клеточным линиям, р <0,05.

-9-

; ? 'АЛ Л ^ ¡ЙрШШ^й е ШШ ■■ - -.г - щр Щфщ? V Л'-;4 1 Mfti t, ЩШ ШШВШШ ми? te о' V má.¡lililí

А в

Рисунок 2. Нетрансформированные клеточные линии в культуре до (рисунок слева) и после (рисунок справа) взаимодействия с JIAK. Соотношение клетка-мишень/клетки-эффекгоры 1:2. А. Фибробласты здорового донора. Б. Нормальные эмбриональные клетки легкого теленка VER.

Активированные ИЛ-2 лимфоциты здорового донора обладают повышенными пролиферативными свойствами (табл. 4) и характеризуются интенсивной выработкой широкого спектра цитокинов (табл. 5). При этом пик их функциональной активности приходится на 3 сутки инкубации с ИЛ-2.

Таблица 4.

Пролиферативная активность исходных MJI и стимулированных ИЛ-2

Концентрация препарата (ИЛ-2), МЕ/мл 1000 10000

Общий пролиферативный ответ МЛ, культивированных в течение 3 сут в присутствии ИЛ-2, % 77(±0,9)* 80 (±1,4)**

Пролиферативная активность по отношению к МЛ, культивированным в бессывороточной среде ЯРМ1 1640, % 58 (±5,1)* 55 (±13,7)**

Спонтанная пролиферативная активность МЛ 24,4 (±3,97)%

* и ** - достоверность различий. р<0.05

Таблица 5.

Спонтанная продукция различных цитокинов в культурах МЛ и ЛАК

Тип клеток Продукция цитокинов, пт/мл

ИЛ-1 ИЛ-6 ИЛ-8 ИЛ-12 ФНОа ФНОР ИНФ ИЛ-10

МЛ 4.8 25,5 2,2 9,3 11,03 30,5 629,3 37,7

3 сутки ±0,2 ±4,5 ±0,1 ±0,1 ±5,7 ±12,8 ±72,6 ±13,2

ЛАК 24,3* 522,1* 16,5* 18,03* 162,8* 56,2* 514,3 155,4*

3 сутки ±5,8 ±123,7 ±2,6 ±8,5 ±26,7 ±13,9 ±86,5 ±36,1

ЛАК 14,04* 106,5* 9,8* 15,16* 119.24* 103,2* 14,1 79,5

5 сутки ±6,3 ±20,4 ±2,3 ±5.6 ±23,2 ±39,9 ±8,3 ±44,8

* - достоверные различия ЛАК по сравнению с МЛ, (р<0,05)

Установленная в ходе исследования повышенная продукция цитокинов [-6, ИЛ-8 и в особенности ИЛ-12) свидетельствует о высокой функциональной . явности ЛАК и может дополнительно усилить пролиферацию и созревание огенных НК, а также стимулировать их киллерную активность. Морфологически активированные ИЛ-2 лимфоциты имеют все признаки гок лимфоидного ряда (рис. ЗА, ЗБ, ЗВ), характеризуются как пролимфоциты л иммунобласты, имеют крупные размеры, большие ядра с преобладанием в ..... эухроматина и наличием многочисленных пиронинофильных ядрышек.

Б в

■т

• * Л ' Ш:, * * ъ т щ ъ » .Ф ^ т ь • £ # * • 4'' <4 я. 0

Рисунок 3. Активированные ИЛ-2 лимфоциты периферической крови здорового донора в -Угуре. Микрофотографии мононуклеарных лейкоцитов в мазке культуральной взвеси на 3 :и культивации при окраске: А. эозин-азуром по Романовскому-Гимза; Б. метиловым .ным-пиронином по Браше; В. реактивом Шиффа по Шабадашу.

Полученные результаты подтверждают целесообразность использования

К здорового донора, генерированных на 3 сутки инкубации, для адоптивной

дунотерапии злокачественных новообразований. Именно в эти сроки ЛАК

ивно продуцируют широкий спектр цитокинов, экспрессируют маркеры НК,

Г и хелперных Т-лимфоцитов, костимулирующие поверхностные антигены и

[екулы адгезии, обладают наиболее высоким уровнем пролиферативной,

: .отоксической и киллерной активности.

лвнительная характеристика иммунофенотипа ЛАК, генерированных из Л периферической крови здоровых доноров и пациентов с

I

пространенными формами злокачественных новообразований.

Проведение иммунофлюоресцентного анализа показало, что МЛ, :деленные из крови здоровых доноров и больных экспрессируют на своей мбране от 1% (1,35±0,3) до 3% (1,4±1,6) С04/С025 антигенов Т-регуляторных [фоцитов, соответственно, что, вероятно, не имеет клинической значимости, г не менее, экспрессия С04/СБ25 на активированных ИЛ-2 лимфоцитах личивается в зависимости от источника и сроков культивирования.

В ходе экспериментов получены данные, демонстрирующие, что при культивировании ЛАК из МЛ периферической крови больных распространенными формами злокачественных новообразований (рак прямой кишки, диссеминированный рак почки, метастатическая меланома) наряду с увеличением экспрессии активационных молекул с увеличением времени культивирования возрастает доля СБ4+С025+ Т-лимфоцитов с 3,15±0,85% до 18,65±1,15% (рис. 4). Одновременно у здоровых доноров среднее содержание популяции Т-клеток, экспрессирующих в культурах ЛАК С04/СБ25, оставалось практически без изменений (5,3±3,8%).

Рисунок 4. Динамика накопления С04+/С025+ Т-клеток в популяциях ЛАК зависимости от времени культивирования и источника мононуклеарных лейкоците _ (периферическая кровь больных или здоровых доноров).

Влияние С04+С025+ Т-клеток на функциональные свойстг активированных лимфоцитов оценивали в цитотоксическом тесте (МТТ) к НК-чувствительной линии эритробластного лейкоза человека К-562 и на лиш_ В-клеточного лейкоза Яа^. Результаты, представленные в табл. демонстрируют, что в отсутствии СГ)4+СТ)25+ Т-лимфоцитов ЛАК обладак высокой киллерной и цитотоксической активностью. При совместно культивировании с очищенными СБ4+С025+ Т-клетками цитотоксичнос^ активированных лимфоцитов снижается. Лизису под воздействием ЛА1 подвергается не более 39% и 27% трансформированных клеток от исходно] числа в культуре (при соотношении клетка-мишень/клетка-эффектор 1:5), чт: почти в два раза меньше спонтанной киллерной активности МЛ, выделенных г периферической крови здорового донора.

Таблица 6.

Влияние СЕ)4+/С025+ Т-клеток на цитотоксические свойства активированных лимфоцитов

Мишень+Эффектор Соотношение клетка-мишень/эффектор

1:5 1:2 1:1

Лизис клеток-мишеней, %

К-562+ЛАК 78±10 63,5±13,5 42±11

Ка]1 + ЛАК 79±8 5б±5,5 37±13

К-562+ ЛАК+ С04+/СБ25+ Т-кл. 28±11* 15±7 11±2

+ ЛАК+ С047С025" Т-кл. 19,5±7,5* 9±5 7±4

К-562+МЛ 53±10 31± 18 24±9

Яа^ + МЛ 47,5±12 29±7 15±4

* - достоверность различий, р<0,05

Несмотря на то, что исходно у ряда пациентов и доноров имеет место увеличение численности СБ4+СЭ25+ Т-клеток, на 3 сутки инкубации МЛ с ИЛ-2 эти изменения оказываются достаточно вариабельными (от 1% до 18%) и достоверно не отличаются от данного показателя у нестимулированных лимфоцитов. Значимое увеличение клеток, несущих одновременно маркеры С04/С025 в популяциях активированных лимфоцитов, регистрируется только при длительных сроках инкубации с ИЛ-2 - на 10 сутки культивирования ЛАК больных экспрессируют до 21% (16,3±4,75%) С04/СБ25, в то время как экспрессия маркеров Трег активированными лимфоцитами здоровых доноров не превышает 7% (4,8±2,2%). Здесь необходимо отметить, что рецепторная молекула СБ25 является маркером активации многих эффекторных клеток, в том числе и хелперных Т-лимфоцитов, поэтому, для выявления в культуре истинно регуляторных клеток необходимо проанализировать экспрессию более специфического маркера Трег, а именно транскрипционного фактора БохрЗ.

При исследовании уровня экспрессии транскрипционного фактора РохрЗ среди СБ4+С025+ МЛ, выделенных из крови здоровых доноров и онкологических больных, было установлено, что в периферической крови обеих групп обследованных доноров содержится не более 3% (2,1±0,9%) СБ4+СБ25+РохрЗ+ Т-лимфоцитов.

В эксперименте было показано, что при стандартном режиме (в течение 3-х суток) культивирования ЛАК из МЛ периферической крови онкологических больных и здоровых доноров статистически достоверного изменения численности С04+СБ25+РохрЗ+ Т-лимфоцитов не происходит (табл. 7),

Таблица 7.

Содержание С04-КЮ25+ РохрЗ+ Т-клеток в МЛ и ЛАК пациентов и здоровых доноров.

Тип клеток С04+С025+ Т-клетки в популяции лимфоцитов, % С04+С025+РохрЗ+ Т-клетки в популяции лимфоцитов, %

МЛ доноров,3 суток 5±2 1,6±0,5

ЛАК доноров, 3 суток 7±3 2±1

МЛ онкологических больных, 3 суток 6±3 2,1 ±0,9

ЛАК онкологических больных, 3 суток 8±3 1,8±0,6

ЛАК доноров, 10 суток 18±5* 3,2±1

ЛАК онкологических больных, 10 суток 20±6* 7,15±2,8*

* - достоверные изменения по сравнению с МЛ, р<0,05

Однако дальнейшее увеличение сроков культивирования лимфоцитов с ИЛ-2 приводит к значимому возрастанию субпопуляции СБ4+С025+РохрЗ+ Т-клеток преимущественно среди активированных лимфоцитов, выделенных из крови онкологических больных. У здоровых доноров содержание Т-клеток, экспрессирующих маркеры С04+С025+РохрЗ+ на 10 сутки инкубации хотя и возрастает, но остается на уровне, не превышающем 5% (3,2±1%), в то время, как процентное содержание Трег в культуре ЛАК, генерированных из МЛ периферической крови онкологических больных, возрастает до 10% (7,15±2,8%).

Таблица 8.

Цитотоксическая активность МЛ и ЛАК онкологических больных и здоровых доноров в

отношении линии клеток К-562, (%)

Тип клеток Время инкубации, сутки Соотношение эффектор/мишень

1:1 1:2 1:5

МНЛ доноров 3 42±2 58±4 70±8

ЛАК доноров 3 72±3 88±6 98±8

МНЛ онкологических больных 3 32±3 52±4 67±5

ЛАК онкологических больных 3 43±3 63±6 82±6

ЛАК доноров 10 24±5* 44±3* 52±5*

ЛАК онкологических больных 10 14±6* 31±3* 45±3*

* - достоверные изменения по сравнению с ЛАК на 3 сут. инкубации. р<0,05

Независимо от сроков инкубации МЛ и ЛАК доля РохрЗ+ клеток среди

СБ4+С025+ Т-лимфоцитов может достигать 50% и более, но только в тех

случаях, когда содержание данной С04+С025+ субпопуляции не превышает 6%.

При заметном численном увеличении рассматриваемой субпопуляции

лимфоцитов содержание в ней РохрЗ+ Т-клеток составляло лишь 5-6%.

- 14-

В поздние сроки культивирования ЛАК, наряду с увеличением -04+СБ25+РохрЗ+ Трег, отмечается снижение цитотоксической активности эмулированных лимфоцитов, в большей степени у онкологических больных габл. 8). Параллельно в культуре ЛАК происходит значительное, практически I порядок, уменьшение количества основной субпопуляции НК (С016+СБ56+) с 10±3% до 0,9±0,4% (рис. 6).

10е IО' '0; |0> Ю' IГ|"..... ,ry "W 111' " ИГ

CD16-F1TC CD16-FITC

(а) (0)

Рисунок 6. Содержание НК в ЛАК. А. Распределение флуоресценции лимфоцитов в ^ ординатах логарифма интенсивности флуоресценции красителей FITC (ось X), :нъюгированного с антителами к CD 16, и красителя РС5 (ось Y), конъюгированного с тителами к CD56 на 3 сутки культивации ЛАК. Б. Распределение флуоресценции /мфоцитов в координатах логарифма интенсивности флуоресценции красителей FITC (ось X) : РС5 (ось Y), конъюгированных с антителами к CD16 и к CD56, соответственно, на 14 сутки :,; льтивации ЛАК.

Полученные в ходе экспериментов данные свидетельствуют, что при ~андартных режимах (в течение 2-3 сут.) генерации ЛАК из МЛ риферической крови здоровых доноров и онкологических больных J /щественного нарастания Трег, экспрессирующих транскрипционный фактор ixp3, не наблюдается.

Несмотря на значительные колебания численности Foxp3+ клеток в , бпопуляции CD4+CD25+ Т-лимфоцитов, доля Трег, экспрессирующих тройной чркер CD4+CD25+Foxp3+ в популяции ЛАК и МЛ здоровых доноров остается фактически неизменной (от 1% до 4%), что не позволяет отнести их к строго прессорным. Вместе с тем, при длительных сроках генерации ЛАК среди _тивированных лимфоцитов происходит накопление субпопуляции JD4+CD25+Foxp3+ Трег. Поэтому, в качестве источника лимфоцитов для нерации ЛАК рекомендуется использовать преимущественно аллогенные МЛ, ; щеленные из крови здоровых доноров.

Кроме того, зафиксированное в ходе работы снижение цитотоксичности ЛАК при длительных сроках культивирования с ИЛ-2 (более 10 сут.) может бьп связано с сокращением численности НК, как результат негативного влияни РохрЗ+ Трег на пролиферативные способности эффекторных клеток.

В ходе работы проанализирован иммунофенотип Лимфоците злокачественных экссудатов больных. Также изучены фенотипическр характеристики опухоль-ассоциированных лимфоцитов, выделенных \ злокачественных выпотов пациентов в процессе иммунотерапии (после 5-внутриплевральных введений ИЛ-2 и ЛАК). Сравнительная характеристик иммунофенотипа МЛ, полученных из злокачественных выпотов больных р начала проведения и в конце курса иммунотерапии представлена в табл. ! Результаты исследований показывают, что после проведения иммунотерапии М. злокачественных экссудатов пациентов характеризуется повышенно экспрессией активационных антигенов (С025, НЬА-ОЯ) и молекул адгези (СБ58), а также экспрессируют антигены натуральных киллеров (СЭ16 и СБ56).

Таблица !

Иммунофенотип МЛ, выделенных из экссудата больных

Статус лечения Уровень экспрессии дифференцировочных антигенов лимфоцитов, °

СИЗ СБ8 СБ4 С025 СБ16 С056 СЭ58 НЬА-1

До начала 43,7 5,9 18,9 4.5 4.8 6,3 40,3 4,7

ИЛ-2/ЛАК ±6,4 ±1,4 ±2,3 ±0,5 ±1,4 ±3,5 ±3,5 ±1,4

иммунотерапии

В конце курса 71,1 6,6 21,8 11,6 12,7 17,9 56,5 28,8

ИЛ-2/ЛАК ±5,2* ±2,1 ±4,2 ±1,7* ±2,3* ±4,2* ±3,4 ±3,7*

иммунотерапии

*- достоверные изменения в группах при р<0,05

Дополнительно в ЛАК, генерированных на основе аутологичных опухол! ассоциированных лимфоцитов больных, проанализирован уровень экспресси поверхностных антигенов регуляторных СЭ4+С025+ Т-клеток и внутриядерног транскрипционного фактора РохрЗ (табл. 10).

В результате было обнаружено, что на 3-5 сутки инкубации с ИЛ-2 наряду увеличением экспрессии активационных молекул возрастает количеств СБ4+СЭ25+ клеток, экспрессирующих транскрипционный фактор РохрЗ, чт позволяет идентифицировать данную субпопуляцию как естественнь: Т-регуляторные клетки.

Повышенный уровень экспрессии в ЛАК маркеров С04/С025, с одной гороны, может быть следствием активации лимфоцитов под воздействием ИЛ-2. другой стороны, введение в плевральную полость высоких доз ИЛ-2 может гимулировать накопление и усиливать функциональную активность /бпопуляции естественных регуляторных СБ4+С025+РохрЗ+ Т-лимфоцитов, таствующих в формировании толерантности и подавляющих пролиферативную киллерную активность эффекторов противоопухолевого иммунитета.

Таблица 10.

Уровень экспрессии маркеров НК и Т-регуляторных клеток в опухоль-ассоциированных лимфоцитах экссудатов больных и в ЛАК

ип теток Уровень экспрессии ма ркеров, %

С04/СЭ25 С04/С025/ТохрЗ МШ2В/С056 ЖрЗОЛЖб СИ 127 С058

Ш «ссудат 10,1 ±3,45 11,4 ±2,2 16,7 ±2,3 18,3 ±1,7 2,3 ±1,4 40,3 ±3,5

АК «худат -5 сутки 34,2 ±22,0 18,25 ±15,2 н- .Я 11,05* ±5,04 2,87 ±0,9 78* ±4,2

- достоверность различий ЛАК по сравнению с МЛ, (р<0,05)

Таким образом, возможность применения опухоль-ассоциированных имфоцитов злокачественных экссудатов больных для генерации аутологичных [АК может быть ограничена. Нередко у ряда первичных больных концентрация пухолевых клеток в плевральном выпоте значительно превышает количество имфоцитов, что не позволяет выделить в чистом виде МЛ, пригодные для олучения ЛАК. Кроме того, численность опухоль-ассоциированных лимфоцитов аметно сокращается после предшествующей химиотерапии, когда в экссудате пациентов лимфоидные клетки немногочисленны или отсутствуют вовсе.

Получить в таких случаях необходимый клеточный материал из периферической крови больных далеко не всегда представляется возможным, так как для этого требуется забор больших объемов крови (до 100 мл) или проведение аппаратного лейкофереза.

Принимая во внимание, что в злокачественных экссудатах больных, как и в ЛАК, генерированных на основе опухоль-ассоциированных лимфоцитов, происходит накопление субпопуляции С1Э4+С025+РохрЗ+ Трег, а также учитывая способность Трег тормозить пролиферацию и угнетать киллерную

активность эффекторных лимфоцитов, для повышения цитотоксичности ЛАК предлагается рассматривать два основных направления.

Целесообразным представляется выделение из активированных лимфоцитов обогащенной субпопопуляции НК либо удаление из ЛАК субпопуляции регуляторных Т-клеток с фенотипом С04+С025+РохрЗ+ с применением метода иммуномагнитной сепарации.

Выделение отдельных субпопуляций лимфоцитов с использованием различных вариантов иммуномагнитной сепарации.

Для получения обогащенной субпопуляции НК опробован метод положительной иммуномагнитной сепарации. После проведения положительной селекции было получено незначительное количество клеток с фенотипом СБЗ+/СО!6+56+ (рис. 7).

3 ССЗ.С01в<СЯ.ЗХ

100 1С

Рисунок 7. Экспрессия СЭЗ и СБ 16/56 лимфоцитами, полученными из культуры ЛАК методом положительной иммуномагнитной сепарации НК. А. Распределение всех лимфоцитов на 3 сутки культивирования с ИЛ-2 в координатах прямого БЭС (ось х) и поперечного БЭС (ось у) светорассеяния. Ломанной кривой очерчен регион лимфоцитов. Б. Распределение флуоресценции клеток в координатах логарифма интенсивности флуоресценции красителей ИИС (ось х) и РЕ (ось у), конъюгированных с антителами СОЗ и С016/56 соответственно. Доля СБЗ+/СО16+56+ НК от общей популяции лимфоцитов составляет 3,0%.

Кроме того, были выделены функционально неактивные лимфоциты, с низким пролиферативным потенциалом, т.к. в процессе отделения от парамагнитных частиц лимфоидные клетки обрабатывали входящим в набор производителя буфером, осуществляющим ферментативное разделение клеток. В результате доля нежизнеспособных лимфоцитов по окрашиванию бромфеноловым синим превышала 30% на следующий день после выделения.

Таким образом, в результате гибели клеток, наступившей после обработки ферментативным буфером, и в отсутствии межклеточных взаимодействий

лщенная субпопуляция НК оказывается не способной к активной золиферации даже в присутствии ИЛ-2.

Для увеличения выхода целевой популяции НК был опробован метод грицательной иммуномагнитной сепарации. В ходе эксперимента было еделено достаточное количество жизнеспособных клеток с фенотипом 03+/СБ16+56+ (рис. 8).

Однако, при дальнейшем культивировании экспрессия маркеров НК эстепенно снижалась, что может быть обусловлено отсутствием в культуре :лперных Т-лимфоцитов за счет прямого связывания и удаления из :следуемого образца данной субпопуляции вместе с гранулоцитами, штроцитами, тромбоцитами, В-клетками и Т-лимфоцитами, несущими общий с К дифференцировочный маркер.

з

А. Б.

Рисунок 8. Анализ экспрессии СОЗ и СЭ16+56 лимфоцитами, полученньми из культуры АК методом отрицательной иммуномагнитной сепарации. А. Распределение светорассеяния АК донора на 3 сутки инкубации с ИЛ-2 в координатах прямого РБС (ось абсцисс) и зперечного БЭС светорассеяния (ось ординат). Ломанной линией очерчен регион шфоцитов. Б. Распределение интенсивности флуоресценции клеток в координатах СОЗ-Р1ТС сь абсцисс) и С016+56-РЕ (ось ординат). Доля С1)1б+/С056+ клеток от общей популяции шфоцитов - 95,4%,

На следующем этапе работы для обогащения популяции ЛАК <тивированными эффекторньтми клетками опробованы различные наборы, редназначенные для удаления Т-регуляторных лимфоцитов, проявляющих /прессорную активность.

Набор Оупа1 обеспечивал высокую очистку клеток С04+СБ25+ -лимфоцитов (93-97%). Однако существенным недостатком, ограничившим спользование данного набора, стало параллельное удаление наряду с 04+С025+Т-лимфоцитами С04-С025+Т-клеток, которые не являются

бственно регуляторными, но могут быть отнесены к субпопуляции хелперных

-19-

Т-лимфоцитов. Вместе с тем, при использовании данного набора не происходит обогащения клеток по экспресии транскрипционного фактора Foxp3, который является наиболее специфическим маркером Трег. Доля Foxp3+ клеток в очищенной субпопуляции CD4+CD25+ лимфоцитов составила лишь 4±0,5%, что сопоставимо с исходными популяциями ЛАК, в которых 5,5±0,5% CD4+CD25+ Т-клеток экспрессировали маркер Foxp3.

Процедура выделения клеток при помощи данного способа путем прямой положительной иммуномагнитной сепарации оказалась также весьма болезненной. Доля нежизнеспособных CD4+CD25+ Т-лимфоцитов после окрашивания бромфеноловым синим составляла от 15 до 30% на следующий день после выделения, что в дальнейшем оказывало негативное воздействие на их пролиферативные и цитотоксические свойства.

Далее в работе был опробован набор для выделения CD4+CD25+CD127dim/' регуляторных Т-клеток человека (Miltenyi Biotec, Германия). Преимущества данного набора заключаются, во-первых, в гораздо меньшем размере и в естественной деградации парамагнитных частиц, при помощи которых осуществляется выделение клеток. Кроме того, магнитные частицы со временем отделяются, высвобождая клеточные рецепторы, не требуя дополнительной процедуры их ферментативного удаления. Во-вторых, разработчики учли факт, что рецептор к ИЛ-7 (CD 127) регуляторные Т-клетки практически не экспрессируют, но он присутствует на поверхности активированных CD4+CD25+ хелперных Т-лимфоцитах [W. Liu et al, 2006; N. Seddiki et al, 2006].

Однако и в данном случае не удалось добиться обогащения конечной фракции по экспрессии Foxp3. В исходном образце донорских ЛАК 29±3% CD4+CD25+ клеток экспрессировали Foxp3. В очищенных CD4+CD25+ клетках доля клеток, экспрессирующих Foxp3 составила 27±1%. Большая часть CD4+CD25+ Т-лимфоцитов удалялась в ходе негативной сепарации CD127high клеток, которые не являются собственно Трег, но активированными хелперными лимфоцитами.

Для реализации поставленной в исследовании задачи был опробован очередной набор для выделения CD25+CD49d- регуляторных Т-клеток человека

(М1кепу1 Вю1ес, Германия). Среди выделенных из культуры ЛАК С025+СБ49с1-Т-клеток доля клеток, экспрессирующих транскрипционный фактор супрессии РохрЗ, достигала 81% (78,5±2,5%). В исходной культуре ЛАК доля клеток, экспрессирующих РохрЗ среди СБ4+СБ25+ лимфоцитов, не превышала 15%.

Таким образом, с помощью данного набора удалось достичь пятикратного увеличения доли РохрЗ+ лимфоцитов среди выделенных С025+С049с1-Т-клеток, что, по крайней мере, фенотипически позволяет отнести их к субпопуляции естественных Т-регуляторных клеток. Поскольку популяция егуляторных супрессорных лимфоцитов отличается значительной фенотипической гетерогенностью и вместе с тем не имеет строго специфических маркеров, наряду с определением фенотипа необходимо оценивать их функциональные свойства.

В ходе настоящей работы было изучено влияние очищенных СБ25+СГ)49с1-'-лимфоцитов на НК-активность аутологичных ЛАК, генерированных из МЛ опухолевых экссудатов больных, в отношении НК-чувствительной линии клеток "-562, а также на цитотоксические свойства в отношении аутологичных опухолевых клеток, выделенных из злокачественного экссудата больных. После ;одтверждения высокого уровня экспрессии РохрЗ выделенные СБ25+С049с1-'-регуляторные клетки объединяли в культуре с ЛАК.

Результаты эксперимента продемонстрировали, что очищенные С025+СБ49с1- Трег угнетают киллерные свойства и снижают цитотоксическую ктивность ЛАК. Следует отметить, что удаление СБ25+С049с1- Трег из юпуляции ЛАК не только восстанавливало их функциональную активность, но и способствовало ее усилению. При совместном культивировании С025+СВ49<]-рег и ЛАК в зависимости от соотношений отмечалось снижение [итотоксических свойств активированных лимфоцитов на 60-80% от исходных начений. При этом максимальный индекс ингибирования соответствовал азведению 1:1:1, при котором цитотоксичность снижалась на 76,85±2,25%, а изису подверглось не более 19% опухолевых клеток, в то время как после даления регуляторных СБ25+СБ49(1- Т-лимфоцитов из культуры ЛАК лизису одвергалось до 98% клеток-мишеней (таб. 11).

Таблица 11.

Влияние очищенной субпопуляции Т-регуляторных клеток, экспрессирующих транскрипционный фактор РохрЗ, на цитотоксичносгь активированных лимфоцитов экссудата.

Процент лизиса клеток мишеней, %

К-562 РЯ

1:5 1:2 1:1 1:5 1:2 1:1

ЛАК после удаления 91* 91* 86* 85* 72 68*

CD25+CD49d- Трег, 3 сут. ±7 ±3 ±3,5 ±8 ±7 ±4

ЛАК исходно, 3 сут. 69 64 52 67 62 35,5

±11 ±6 ±13 ±7 ±5 ±10

ЛАК, культивированные с 25* 19* 17* 23* 15* 18*

CD25+CD49d- Т per, 3 сут. ±2 ±4 ±2 ±5 ±4 ±2

* - достоверность различий по сравнению с исходной культурой ЛАК, (р<0,05) РЯ - аутологичные клетки рака яичника, выделенные из злокачественного экссудата

Таким образом, в серии экспериментов in vitro было подтверждено негативное воздействие Foxp3+Tper на функциональные свойства активированных лимфоцитов, а для повышения цитотоксической и киллерной активности JIAK, полученных из образцов злокачественных экссудатов больных целесообразно проводить иммуномагнитную сепарацию Foxp3+Tper с подтвержденными супрессорными свойствами.

Для выделения из культур активированных лимфоцитов Foxp3+Tper рекомендуется использовать набор для выделения CD25+CD49d- регуляторных Т-клеток человека. Выделенные с помощью данного набора CD25+CD49d- Трег активно экспрессируют транскрипционный фактор Foxp3 (78,5±2,5%) и достоверно угнетают цитотоксические свойства исходных ЛАК. Удаление из популяций активированных лимфоцитов CD25+CD49d- Трег способствует усилению их функциональных характеристик, а также достоверно (р<0,05) повышает цитотоксичность и киллерную активность с 67±7% до 85±8% и с 69±11% до 91±7%, соответственно.

Кроме того, в ходе работы установлено, что для повышения цитотоксичности активированных лимфоцитов выделение очищенной субпопуляции НК нецелесообразно, так как в отсутствии межклеточных взаимодействий НК не способны к активной пролиферации и по своей функциональной активности преимуществ перед исходными популяциями ЛАК не имеют.

лводы

1. ИЛ-2 позволяет получить из моноиуклеарных лейкоцитов фиферической крови здоровых доноров или опухоль-ассоциированных шфоцитов злокачественных экссудатов активированные лимфоциты с 1ллерными свойствами, избирательными в отношении трансформированных теток различного гистогенеза.

2. Активированные ИЛ-2 лимфоциты отличаются повышенной сспрессией активационных антигенов CD25, CD38 и HLA-DR, молекул адгезии D57, CD58 и сниженной экспрессией общих дифференцировочных антигенов шфоцитов CD3, CD4, CD8. Субпопуляция CD16+CD56+ НК характеризуется згсоким уровнем экспрессии молекул NKG2D и NKp30.

3. Обогащенная субпопуляция НК, полученная методом ммуномагнитной сепарации в отсутствие хелперных Т-лимфоцитов и вмененного рецепторного аппарата, характеризуется низкой пролиферативной живностью и обладает цитотоксичностью, идентичной исходной популяции АК.

4. Опухоль-ассоциированные лимфоциты злокачественных экссудатов, ^растеризуются высоким исходным содержанием Foxp3+ Т-регуляторных неток (11,4±2,2%), численность которых возрастает при дальнейшем ультивировании с ИЛ-2 на >30%.

5. Применение метода иммуномагнитной сепарации позволяет звлекать субпопуляцию Foxp3+CD25+CD49d- Т-регуляторных клеток с одтвержденной супрессорной активностью, что достоверно на 21% (91 ±7% ротив 69±11%, р<0,05) повышает цитотоксичность активированных ИЛ-2 пухоль-ассоциированных лимфоцитов.

6. Генерация ЛАК из мононуклеарных лейкоцитов здоровых доноров с спользованием ИЛ-2 не приводит к значимому увеличению содержания опуляции CD4+CD25+Foxp3+ Т-рег.

7. Иммуномагнитная сепарация Т-регуляторных клеток, гнерированных из опухоль-ассоциированных лимфоцитов, приводит к овышению цитотоксичности ЛАК в отношении аутологичных опухолевых леток.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лебединская О. В. Влияние препарата "Профеталь" i дифференцировку и функциональную активность мононуклеарных лейкоците человека / О. В. Лебединская, Н. П. Велижева, Ф. В. Доненко, В. А. Черешне С. Ю. Родионов, Н. К. Ахматова, И. Ж. Шубина, М. В. Киселевский Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2006. - № 2. - С. 108 - 116.

2. Lebedinskaya О. V. Effect of "Profetal" on differentiation and function activity of human mononuclear leukocytes / Lebedinskaya О. V., Lebedinskaya E. A Velizheva N. P., Donenko F. V, Akhmatova N. K., Shubina I. Zh, Kiselevskii M. V Chereshnev V. A., Rodionov S. Yu. // Bulletin Of Experimental Biology Ar Medicine. - 2006. - Vol. 141. - №4. _ p. 536-543.

3. Велижева H. П. Противоопухолевая цитотоксическая активное! лимфокин-активированных киллеров / Н. П. Велижева, О. С. Жуков О. В. Лебединская, И. Ж. Шубина, Е. А. Лебединская, М. В. Киселевский Сибирский онкологический журнал. - 2008. - Т. 25. - №1. - С. 39 - 44.

4. Чикилева И. О. Содержание Т-регуляторных лимфоците CD4+CD25+Foxp3+ в популяции лимфокин-активированных киллеров Чикилева И. О., Велижева Н. П., Шубина И. Ж., Титов К. С., Киселевский М. I // Вестник РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. - 2008. - Т. 19. - №3. - С. 16-25.

5. Велижева Н. П. CD4+/CD25+ Т - регуляторные клетки и адоптивна ИЛ-2/ЛАК-терапия злокачественных опухолей: Тез. докл. конф., Н. П. Велижев: И. Ж. Шубина, М. В. Киселевский // Российский Биотерапевтический Журнал. 2008.-Т. 7. -№1, -С. 4.

6. Velizheva N. P. CD4+/CD25+ Т regulatory cells / Mikhail V. Kiselevsk (ed.) // Atlas Effectors of Anti-Tumor Immunity. - Springer Science+Busines Media B. - 2008. - P. 65 - 73.

7. Лебединская О. В. Динамика накопления и морфология CD4+/CD25 Т-клеток в популяции лимфокин-активированных киллеров / Лебединская О. В Велижева Н. П., Чикилева И. О., Годовалов А. П., Киселевский М. В. , Морфологические ведомости. - 2010. - №3. - С. 24 - 29.

Подписано в печать 20.07.2011. Формат 60x84/16. Бумага офисная «SvetoCopy». Тираж 100 экз. Заказ № 848. Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, г. Москва, Каширское ш., 24

Актуальность работы

Несмотря на длительную историю и несомненные достижения, развитие методов адоптивной иммунотерапии остается приоритетными направлением в онкологии. В основе применения метода лежит использование иммунотропных веществ и активация врожденного и адаптивного звеньев иммунной системы [7, 10].

Основным-; преимуществом:. иммунотерапии является относительно низкая токсичность [16] и возможность достижения противоопухолевого эффекта при формировании у пациентов лекарственной резистентности: При этом! стимуляция? иммунитета; может приводить не только» к лизису опухолевых клеток, но и повышать качество жизни больных [19, 20, 44].

В настоящее время существуют два направления в иммунотерапии', злокачественных новообразований; Первое основано на; активации адаптивного звена противоопухолевого иммунобиологического надзора« посредством создания« профилактических и лечебных вакцин на основе дендритных клеток- (ДК) и трансфецированных Т- лимфоцитов; экспрессирутощих специфический Т-клеточный- рецептор, к поверхностным опухолевым антигенам. Второе направление — активация эффекторов врожденного клеточного противоопухолевогш иммунитета, натуральных киллеров (НК) [24]. Активность НК может быть существенно увеличена под воздействием цитокинов, таких как интерлейкина-2 (ИЛ-2) или интерферон-у, (ИФН-у) |7]. Из лимфоцитов периферической крови, селезенки или опухолевого? экссудата экстракорпорально, в присутствии ИЛ-2 могут быть генерированы лимфокин-активированные киллеры (ЛАК), обладающие высокой цитотоксичнотью по отношению к опухолевым клеткам. Механизм действия ЛАК состоит из прямого цитотоксического поражения аутологичных опухолевых клеток, а также их способности синтезировать и высвобождать биологические активные вещества, такие как цитокины, оказывающие регуляторное действие на другие эффекторы иммунной системы [45].

Внедрение ИЛ-2/ЛАК-иммунотерапии в клиническую практику расширяет спектр возможностей противоопухолевого лечения. Однако, несмотря на определенные успехи, которые были достигнуты в последние десятилетия [19, 22, 26, 31], в клинической практике остается-, проблема недостаточной эффективности иммунотерапии, обусловленная формированием феномена периферической толерантности' [52, 67]. Способность опухоли «ускользать» от иммунологического надзора* (отсутствие, специфических антигенов, высокая скорость деления» злокачественно трансформированных клеток, секреция супрессорных факторов) и низкая биодоступность составляют ключевую проблему иммунотерапии![¡53 - 55].

Для повышения^ эффективности иммунотерапии в онкологии необходимо , активировать эффекторные клетки; (ЦТЛ, НК, Тх), предотвратить.развитие процессов иммунологической, толерантности! и* нивелировать состояние иммуносупрессии, развивающееся на фоне опухолевой прогрессии. (

Стимуляция иммунной системы пациента может быть достигнута посредством'адоптивного'переноса ЛАК клеток, которые используются для иммунотерапии злокачественных новообразований с 1980-х годов. ЛАК характеризуются высокой' пролиферативной способностью, выраженной цитотоксичностью и хорошей переносимостью» при различных способах введения пациентам.

Ранее, адоптивная иммунотерапия с использованием ИЛ-2 или комбинации этого цитокина с ЛАК применялась, главным образом, для лечения иммуночувствительных распространенных форм злокачественных новообразований, таких как меланома, рак почки, и в ряде случаев исследователям удавалось достичь противоопухолевых эффектов [20, 23, 28, 29]. Расширенные рандомизированные исследования не показали высокой эффективности применения ИЛ-2 и JIAK при системном введении, что не позволило широко применять данный способ лечения [33].

В РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН в последние годы проводятся клинические исследования по оценке эффективности и безопасности ИЛ-2/ЛАК терапии при локальном и локорегиональном введении при лечении злокачественных плевритов, асцитов и перикардитов [44, 45]. Локальное (внутриполосное) введение ЛАК позволяет создать оптимальное соотношение опухолевых клеток и активирвоанных лимфоцитов для достижения цитотоксического эффекта. Сочетание ЛАК с ИЛ-2 позволяет стимулировать киллерную активнсоть лимфоцитов опухолевого экссудата [46]. Под воздействием ИЛ-2 происходит нарастание доли клеток, экспрессирующих а-субъединицу рецептора^ данного цитокина CD25, в том числе субпопуляции CD4+CD25+ клеток [49, 62, 71; 83]. В этих условиях существует вероятность стимуляции в культуре Т-регуляторных (CD4+CD25+Foxp3+)'клеток (Трег), с супрессорной актвинсотью [75, 87]. Однако до сих пор остается дискуссионным вопрос об' уровне" содержанияв популяции ЛАК подтипа- CD4+GD25+Foxp3+ Трег и их влиянии на цитотоксическую активность эффекторов противоопухолевого иммунитета [77, 90, 108]. В связи с этим одним из перспективных направлений повышения эффективности НК и ЛАК является выделение обогащенных киллерных субпопуляций или удаление супрессоров. Для этих целей могут быть использованы современные методы иммуномагнитной сепарации, клиническое применение которых нуждается в экспериментальном обосновании.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования является оптимизация метода генерации активированных лимфоцитов с использованием иммуномагнитной сепарации.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. исследовать морфофункциональные и иммунофенотипические особенности ЛАК;

2. оценить целесообразность выделения обогащенной субпопуляции НК из популяции ЛАК;

3. провести сравнительный анализ эффективности методов выделения Т-регуляторных клеток из ЛАК;

4. оценить целесообразность удаления субпопуляции БохрЗ+ Т-регуляторных клеток из популяции ЛАК, полученных из лимфоцитов крови больных и здоровых доноров, а также из злокачественных выпотов;

5. определить уровень содержания Т-регуляторных клеток, экспрессирующих транскрипционный фактор БохрЗ, в периферической крови здоровых доноров и у пациентов с распространенными формами злокачественных новообразований; I

6. изучить содержание СБ4+С025+РохрЗ+ Т-регуляторных клеток . в злокачественных экссудатах больных с различными локализациями первичного опухолевого процесса;

7. оценить влияние СВ4+СБ25+РохрЗ+ Т-регуляторных клеток на киллерную активность ЛАК. I I

Научная новизна

Впервые проведено комплексное исследования морфофункциональных и иммунофенотипических характеристик ЛАК и определения соотношения в них различных субпопуляций лимфоцитов

Впервые выполнена сравнительная оценка содержания;

Ш4+СШ)25+РохрЗ+ Т-регуляторных клеток в периферической крови ' " ■ г здоровых доноров (1)' пациентов (2) с распространенными формами; злокачественных новообразований и больных (3) со злокачественными! выпотами. .

Впервые выполнена оценка влияния : СВ4+С025+17охрЗ+ Т-регуляторных клеток на функциональные и фенотипические особенности; активированных лимфоцитов;

Впервые проанализирована целесообразность и результативность, различных: сжкюбов выделения ПК. и ЕохрЗЧ- Т-регуляторных клеток из активированных лимфоцитов:

Уточнены данные относительно источников;получения и оптимальных, сроках генерации; ЛАК. для* адоптивной иммунотерапии* злокачественных новообразований: , , . .•,

Научно-практическая значимость

Полученные данные расширяют существующие представления о механизме- цитоксичности и роли различных субпопуляций лимфоцитов в реализации киллерной активности эффекторов противоопухолевого иммунитета. Установлено, что; суирессорная субпопуляция . С©4СШ5+РохрЗ+ Т-регуляторных клеток обнаруживается; главным1 образом, в злокачественных выпотах и; оказывает ингибирующее воздействие: на активность эффекторов врожденного иммунитета.

Результаты исследования позволяют оптимизировать режимы и сроки генерации ЛАК из различных источников, которые могут использоваться для целей адоптивной- иммунотерапии- злокачественных новообразований. Показано, что элиминация; Т-регуляторных клеток с помощью метода; иммуномагнитной сепарации позволяет существенно повысить цитотоксичность активированных лимфоцитов по отношению к аутологичным опухолевым клеткам злокачественных выпотов.

Результаты работы будут использоваться при проведении клинических испытаний адоптивной иммунотерапии у пациентов со злокачественными выпотами (опухолевыми плевритами, асцитами и перикардитами).

Положения, выносимые на защиту

ЛАК, полученные из различных источников, обладают характерными морфофункциональными особенностями и представлены субпопуляциями эффекторных и регуляторных лимфоцитов.

Лимфоциты злокачественных экссудатов пациентов содержат значительное количество С04+СЭ25+РохрЗ+ Т-регуляторных клеток с подтвержденной супрессорной активностью.

При генерации ЛАК, полученных из мононуклеарных лейкоцитов периферической крови и злокачественных экссудатов пациентов, с увеличением времени инкубации возрастает численность субпопуляции

СБ4+С025+РохрЗ+ Т-регуляторных клеток, подавляющих пролиферативные, киллерные и цитотоксические свойства активированных лимфоцитов.

Соотношение в культуре активированных лимфоцитов эффекторных (НК, НКТ, Тх) и регуляторных субпопуляций С04+С025+РохрЗ+ Трег с выраженными супрессорными свойствами определяет конечную эффективность и цитотоксичность ЛАК.

Обогащение активированных лимфоцитов эффекторными клетками за счет элиминации СБ4+СВ25+РохрЗ+ Т-регуляторных лимфоцитов с использованием иммуномагнитной сепарации повышает киллерную активность ЛАК.

Публикации по теме диссертации

В отечественных и зарубежных печатных изданиях опубликовано 7 научных работ.

В журналах, рекомендованных В АК:

1. Лебединская О. В. Влияние препарата "Профеталь" на дифференцировку и функциональную активность мононуклеарных лейкоцитов человека / Лебединская О. В., Велижёва Н. П., Доненко Ф: В;, Черешнев В; А., Родионов С. Ю., Ахматова Н. К., Шубина И. Ж., Киселевский М. В. // Клеточные технологии, в биологии и медицине: — 2006: — № 2. — С 108 — 116. ; V

2. Eebedinskaya О. V. Effect of "Profetal" on differentiation and functional activity of human: mononuclear leukocytes / Lebedinskaya О. V., Lebedinskaya E. A., Velizheva N. P., Donenko F. V., Akhmatova N. K., Shubina I. Zh., Kiselevskii M. V., Ghereshnev V. A., Rodionov S; Yu: // Bulletin Of Experimental Biology And Medicine. - 2006. - Vol: 141. - №4. - P. 53 6-543.

3; , Велижева H. П. Противоопухолевая цитотоксическая. активность лимфокин-активированных киллеров . / Н. ГГ. Велижева, О. С. Жукова, О. В; Лебединская, И. Ж. Шубина, Е. А. Лебединская, М. Bi Киселевский // Сибирский онкологический журнал: - 2008. - Т. 25. — №1. - G. 39 - 44.

4. Чикилева И.О. Содержание Т-регуляторных лимфоцитов CD4+CD25+Eoxp3-b в популяции' лимфокин-активированных киллеров / Чикилева И.О., Велижева II. П., Шубина И. Ж., Титов К. С., Киселевский М. В. // Вестник РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. - 2008. -Т. 19. -№3. - С. 16-25. ' :

5. Тезисы доклада . И. П. Велижева, И. Ж. Шубина, М. В. Киселевский. CD4+/CD254- Т-регуляторные клетки и адоптивная ИЛ-2/ЛАК-терапия злокачественных опухолей // Российский Биотерапевтический Журнал. - 2008. - Т.7. -№1. - С. 4.

6. Глава «CD4+/CD25+ . Т regulatory cells» Irina Zh. Shubina, Nadezhda P. Velizheva, Mikhail V. Kisclevsky в Atlas Effectors of Anti-Tumor

Immunity. Mikhail V. Kiselevsky (ed.) // Springer Science+Business Media B-2008.-P. 65-73.

7. Лебединская О. В. Динамика накопления и морфология CD4+/CD25+T-KJieTOK в популяции лимфокин-активированных киллеров / Лебединская О. В., Велижева Н. П., Чикилева И. О., Годовалов А. П., Киселевский М. В. // Морфологические ведомости. — 2010. — №3. — С. 24 — 29.

Материалы диссертационной работы доложены на Всероссийских конференциях Отечественные противоопухолевые препараты 2008 и 2011.

выводы

X. ИЛ-2 позволяет получить из мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров или опухоль-ассоциированных лимфоцитов злокачественных экссудатов активированные лимфоциты. с киллерными свойствами, избирательными в отношении трансформированных клеток различного гистогенеза. 2. Активированные ИЛ-2 лимфоциты отличаются: повышенной' экспрессией активационных антигенов: CD25, OD38 и HLA-DR,' молекул адгезии CD57, CD58 и сниженной экспрессией общих дифференцировочных антигенов лимфоцитов GD3, CD4, CD8. Субпопуляция CD 16+/CD56+HK характеризуется высоким уровнем экспрессии молекул NKG2D и NKp30.

3. Обогащенная- субпопуляция.: НК, полученная методом иммуномагнитной сепарации в отсутствие- хелперных лимфоцитов и измененного . рецепторнош ' аппарата; характеризуется низкой, пролиферативной активностью и обладает цитотоксичностью, идентичной; исходной популяции ЛАК. ' : 1 ■ V

4. Опухоль-ассоциированные лимфоциты злокачественньк экссудатов, характеризуются "высоким , исходным' содержанием; Foxp3+ Т-регуляторных клеток (11,4±2,2%), .численность которых, возрастает при дальнейшем культивировании с ИЛ-2 на >30%.

5. Применение метода иммуномагнитной?: сепарации позволяет извлекать субпопуляцию Foxp3+CD25+CD49d-peryjni горных клеток с подтвержденной супрессорной активностью, что достоверно на 21% (91 ±7%) против 69±11%, р<0,05) повышает цитотоксичность. активированных ИЛ-2 опухоль-ассоциированных лимфоцитов. " ! 6. Генерация ЛАК из; мононуклеарных лейкоцитов здоровых доноров с использованием'; ИЛ-2 не приводит к значимому увеличению содержания супрессорной популяции CD4-l-CD25+Foxp3-i-Tper.

7. Иммуномагнитная сепарация Т-регуляторных клеток, генерированных' из опухоль-ассоциированных. лимфоцитов^ приводит к повышению цитотоксичности ЛАК в отношении аутологичных опухолевых клеток. '■ . , ;г . . . .

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Согласно полученным данным в случае повышенного содержания в злокачественных экссудатах больных CD4+CD25+Foxp3+ Т-регуляторных клеток, а также при повышенной распространенности данной субпопуляции лимфоцитов в культуре JIAK для усиления киллерной активности JIAK рекомендуется обогащение культуры активированных ex vivo лимфоцитов эффекторными клетками путем удаления субпопуляции Foxp3+ Трег, с применением метода иммуномагнитной сепарации.

Результаты проведенных исследований показали, что популяции аллогенных ЛАК не содержат значимого количества Трег. Поэтому включение в схему иммунотерапии аллогенных активированных лимфоцитов позволяет не только снизить количество ИЛ-2, необходимого для внутриплеврального или внутрибрюшного введения пациенту, но дополнительно уменьшает вероятность стимуляции регуляторных CD4+CD25+Foxp3+ Т-клеток, исходно повышенных в злокачественных выпотах пациентов.

В отсутствии аллогенных лимфоцитов для повышения противоопухолвой эффективности ИЛ-2/ЛАК терапии на основе опухоль-ассоциированных лимфоцитов больного из популяций ЛАК рекомендуется удаление Т-регуляторных клеток с фенотипом CD4+CD25+Foxp3+, обладающих выраженными супрессорными свойствами, которые вызывают торможение пролиферации, угнетение продукции цитокинов и снижение цитотоксической и киллерной активностей эффекторных клеток.

Внутриплевральная и внутрибрюшная адоптивная ИЛ-2/ЛАК терапия с использованием популяции обогащенных активированных лимфоцитов после проведения дополнительных исследований по изучению ее безопасности и клинической эффективности может быть рекомендована как один из этапов комбинированного и (или) комплексного лечения больных с диссеминированными злокачественными новообразованиями.