Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Фоновые и предраковые изменения железистого эпителия шейки матки



На правах рукописи

Данилова Наталья Владимировна

ФОНОВЫЕ И ПРЕДРАКОВЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ЖЕЛЕЗИСТОГО ЭПИТЕЛИЯ ШЕЙКИ МАТКИ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

14.03.02 - патологическая анатомия 14.01.12 — онкология

1 4 ПАР 2013

Москва-2013

005050532

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» Факультет фундаментальной медицины

Научные руководители:

доктор медицинских наук Мальков Павел Георгиевич

доктор медицинских наук Андреева Юлия Юрьевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, зав. лабораторией клинической морфологии ФГБУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека» РАМН

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник гинекологического отделения Московского научно-исследова-тельского онкологического института им. П.А. Герцена Минздрава России

Михалева Людмила Михайловна

Антипов Виталий Александрович

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова Минздрава России (117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1).

Защита диссертации состоится 28 марта 2013 г. в 12:00 часов на заседании диссертационного совета Д 001.004.01 при ФГБУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека» РАМН (117418 Москва, ул. Цюрупы, Д. 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека» РАМН.

Автореферат разослан февраля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Михайлова Лилия Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Проблема рака шейки матки остается актуальной, что связано не только с устойчиво высокой заболеваемостью, но и с увеличением доли аде-ногенного рака, результаты ранней диагностики и лечения которого по сравнению с плоскоклеточным остаются неудовлетворительными (Azodi М., Chambers S.K. et al., 1999; Kurman R.J., Ronnett B.M., Sherman M.E., Wilkinson E.J., 2010).

Увеличение заболеваемости аденокарциномой шейки матки, активное внедрение в практику врачей-гинекологов браш-биопсии и других методов получения материала привело к увеличению объема исследуемого пато-морфологами материала, и, следовательно, к более тщательному и детальному изучению патологии эндоцервикса. Активно изучается экспрессия различных иммуногистохимических маркеров, однако требуется детальный анализ этого массива данных для разработки надежных диагностических алгоритмов (Milde-Langosch К., Riethdorf S. et al., 2001; Kim Y.T. and Zhao M., 2005; Mikami Y., Kojima,A.,et al., 2009). В последние 10 лет появилось множество публикаций, посвященных вопросам классификации и дифференциальной диагностики опухолевых, предопухолевых и фоновых изменений железистого эпителия. Весьма актуальной остается проблема фоновых состояний и предраковых изменений эпителия шейки матки.

Вместе с тем сохраняется множество разногласий по поводу того, какие доброкачественные процессы эндоцервикса обладают наиболее высоким потенциалом малигнизации. Так некоторые исследователи настаивают, что трубная метаплазия и гиперплазия незаращенных остатков мезонефроса являются облигатным предраком и подлежат хирургическому лечению (Robboy S.J., Anderson М.С. et al., 2002; Park K.J. and Soslow R.A., 2009).

С развитием и совершенствованием современных методов иммуно-гистохимии и молекулярной биологии появились новые возможности оценки морфогенеза новообразований, пролиферативной и секреторной активности клеток. Зарубежные патологи пытаются ответить на ряд вопросов, относительно фоновых и предраковых изменений эпителия шейки матки. При этом большинство работ посвящено описанию отдельных наблюдений редких морфологических форм или касается клинико-морфологического исследования небольших групп больных (Ferry S.T. and Scully R. E., 1990; Jones R., Young R. H. et al., 1991; Goldstein N.S., Ahmad M. et al., 1998; Ishii K.H. et al., 2000; Kondo T.A., Hashi S.I. et al., 2005). Для определения биологического потенциала фоновых и предраковых изменений эпителия в зарубежных исследованиях используются иммуногистохимические методы с применением моноклональных антител к белкам-регуляторам клеточного цикла (р53, р16), раковому эмбриональному антигену, белку регулятору апоптоза (bcl-2), од-

нако результаты оценки экспрессии данных маркеров противоречивы. В отечественной литературе подобные публикации крайне немногочисленны. Явно недостаточное внимание уделяется изучению преинвазивных изменений железистого эпителия. Отсутствуют работы по изучению маркеров стро-мальной инвазии и матриксных белков, в частности CD44, тенасцина, Е-кадгерина, Д-катенина и ламиниа при фоновых и предраковых изменениях железистого эпителия шейки матки. Нет сведений о возможности использования этих маркеров для дифференциальной диагностики предраковых изменений и рака шейки матки.

Существует проблема распознавания ранней стромальной инвазии при предраковых изменениях железистого эпителия шейки матки, т.к. различить между собой вовлечение в неопластический процесс предсуществую-щих железистых крипт и комплексы высокодифференцированной аденокар-циномы в строме по формальным морфологическим признакам порой невозможно (Kurman R.J., Ronnett В.М., Sherman М.Е., Wilkinson E.J., 2010).

He изучена роль в патогенезе предраковых изменений эпителия и аденокарциномы таких белков как рецептор эпидермального фактора роста человека (EGFR) и фактора роста опухолей (TGFP), имеющих большое значение для выбора тактики лечения при многих других видах новообразований (например, раке легкого).

Классификация предраковых изменений эпителия шейки матки на сегодняшний день является чрезвычайно громоздкой и трудно воспроизводимой, поскольку включает в себя дисплазию трех степеней и аденокарци-ному in situ. Критерии диагностики данных категорий расплывчаты, особенно дисплазии 3 степени и аденокарциномы in situ.

Цель исследования:

Изучение морфологии и иммунофенотипа фоновых и предраковых изменений железистого эпителия шейки матки, совершенствование морфологических методов их оценки и разработка алгоритма дифференциальной диагностики.

Задачи исследования:

1. Изучить структурные особенности фоновых и предраковых изменений железистого эпителия шейки матки.

2. Изучить иммуногистохимические характеристики фоновых и предраковых изменений железистого эпителия шейки матки.

3. Разработать алгоритм морфологической дифференциальной диагностики фоновых и предраковых изменений железистого эпителия шейки матки.

4. Обосновать уточнения к классификации фоновых и предраковых изменений железистого эпителия шейки матки.

Научная новизна

В работе впервые изучены и подробно описаны морфологические особенности фоновых и предраковых состояний железистого эпителия шейки матки, что ранее не выполнялось. Проведено сопоставление фоновых и предраковых изменений с наиболее часто встречающимися вариантами цер-викального аденогенного рака. Изучены иммуногистохимические характеристики фоновых и предраковых изменений.

Показано, что при дисплазии железистого эпителия III степени и аденокарциноме in situ уровень экспрессии белка-регулятора клеточного цикла р 16 и маркера пролиферативной активности ki67 статистически значимо превышает таковой при дисплазии I и II степени.

Впервые выявлены статистически значимые различия в уровне экспрессии маркера апоптоза bcl-2 при тубо-эндометриоидной метаплазии и предраковых изменениях железистого эпителия шейки матки, позволяющие проводить дифференциальную диагностику между тубоэндометриоидной метаплазией и дисплазией эпителия шейки матки.

Впервые при фоновых и предраковых изменениях железистого эпителия изучен характер экспрессии белков регуляторов клеточного цикла р21, р27 и фактора роста опухолей TGFß и показано увеличение их экспрессии с нарастанием степени дисплазии эпителия.

Показаны статистически значимые различия в экспрессии неспецифической молекулы адгезии CD44 и белка межклеточного матрикса тенасци-на при предраковых процессах и аденокарциноме шейки матки, что вносит значительный вклад в развитие новых подходов к дифференциальной диагностике инвазивных и неинвазивных поражений шейки матки.

Проведенное комплексное морфологическое исследование с применением иммуногистохимии позволило обосновать предлагаемые уточнения к существующей классификации фоновых и предраковых изменений железистого эпителия шейки матки.

Разработан алгоритм морфологической дифференциальной диагностики фоновых и предраковых состояний железистого эпителия шейки матки.

Научно-практическая значимость

В работе развиваются теоретические аспекты терминологии, классификации, формальной морфологии и иммуногистохимии фоновых и предраковых изменений железистого эпителия шейки матки.

Полученные результаты способствуют улучшению патоморфологи-ческой диагностики, дают новые возможности для дифференциальной диагностики предопухолевых и фоновых изменений эпителия шейки матки на основе данных формальной морфологии и иммуногистохимического исследования.

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты исследования внедрены в практическую работу патологоанато-мического отделения МНИОИ им. П.А.Герцена, централизованной окружной лаборатории патоморфологии и цитологии ГУЗ Консультативно-диагностический центр №6 Москвы, курса патологической анатомии кафедры физиологии и общей патологии факультета фундаментальной медицины ГБОУ ВПО МГУ имени М.В.Ломоносова.

Апробация работы

Результаты исследования доложены на VIII Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2010), 28th Congress of the International Academy of Pathology (Sao Paulo, 2010), 23rd European Congress of Pathology (Helsinki, 2011), Международном молодежном научном форуме «JIOMOHOCOB-2012» (Москва, 2012), Всероссийской научной конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» (Москва, 2012), XI Московской Ассамблее «Здоровье столицы» (Москва, 2012).

Публикации

Основные положения диссертации отражены в 12 публикациях, из них -6 статей в ведущих периодических изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Объем рукописи составляет 155 страниц, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 3 глав собственных исследований, выводов и практических рекомендаций. Библиографический аппарат работы представлен 166 источниками литературы, в том числе 153 на иностранных языках. Работа иллюстрирована 34 таблицами и 57 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Исследование проводилось на архивном материале патологоанато-мического отделения Московского научно-исследовательского онкологического института им. П.А. Герцена. В работе использован операционный и биопсийный материал от 118 больных аденокарциномой шейки матки, получавших лечение в Московском научно-исследовательском онкологическом институте им. П.А. Герцена с 1999 по 2011 годы. Возраст пациенток варьировал от 21 до 86 лет (средний - 44 года). В каждом случае проводилась оценка наличия и характера фоновых и предраковых изменений железистого эпителия шейки матки и сопоставление с типом имеющейся аденокарциномы. В исследование не входил материал от больных, получавших в предоперационном периоде химиотерапию или лучевое лечение. Распределение по характеру фоновых и предраковых изменений эпителия представлено в таблице 1.

Таблица 1

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ МАТЕРИАЛА ПО ХАРАКТЕРУ ФОНОВЫХ И ПРЕДРАКОВЫХ ИЗМЕНЕНИЙ

Виды фоновых и предраковых изменений железистого эпителия шейки матки Количество наблюдений

Дисплазия 1 степени 37

Дисплазия 2 степени 57

Дисплазия 3 степени 45

Аденокарцинома in situ 45

Тубо-эндометриоидная метаплазия 54

Туннельные кластеры типа А 11

Туннельные кластеры типа В 8

Незаращенные остатки мезонефрального протока 1

Гиперплазия незаращенных остатков мезонефрального протока 3

Микрогландулярная гиперплазия 17

Эндометриоз 11

Резервно-клеточная гиперплазия 16

Реактивные изменения 12

Эндоцервикоз 35

Кишечная метаплазия 12

Диффузная ламинарная эндоцервикальная железистая гиперплазия (DLEGH) 1

Пилорическая метаплазия 1

Для проведения иммуногистохимического исследования использовалась широкая панель моноклональных антител к белкам-регуляторам клеточного цикла (р16, р53, р21, р27, циклин D1), белку-регулятору апоптоза (bcl-2), маркеру пролиферативной активности (Ki-67), молекулам адгезии и стро-мальным белкам (CD44, ламинин, тенасцин, Е-кадгерин, ß-катенин), факторам роста (EGFR, TGF-ß).

С отобранных архивных блоков изготавливали срезы толщиной 3-4 мкм, которые монтировали на высокоадгезивные стекла (Polysine Slides, Menzel GmbH&Co KG; Germany). Депарафинирование, регидратацию и демаскировку антигенов проводили при помощи специализированной системы EnVision Flex (Dako, Denmark) при температуре 95-98 °С, pH 9,0 в течение 20 минут в модуле предобработки к автостейнеру (PT-Module). ИГХ-реакции проводили в автоматизированном режиме с помощью автостейнера Dako.

В качестве системы детекции применяли систему EnVision Flex (Dako, Denmark) с DAB-хромогеном. В каждой серии препаратов использовались соответствующие положительные и отрицательные контроли. Препараты изучали под световым микроскопом Leica DM 4000 с использованием системы Leica Application Suite 8.0 и цифровой камеры высокого разрешения Progrès С14.

Оценку реакции маркеров, экспрессирующихся в ядрах клеток (р53, р21, р27, Ki-67, циклин D1) производили путем подсчета количества окрашенных ядер на 100 ядер препарата в 3 полях зрения (увеличение х40), выражая полученные результаты в процентах. Далее все случаи были разделены на три группы:

• Отрицательная экспрессия - менее 10% клеток.

• Слабая экспрессия - 10-50% клеток.

• Выраженная экспрессия - более 50% клеток.

Исключение составил маркер Ki67. При его оценке мы использовали

более дифференцированную систему градации, с выделением слабой экспрессии (1-5% клеток), умеренной (6-20%), выраженной (20-60% клеток) и сильно выраженной (более 60%). Схема оценки представлена в таблице 2.

Таблица 2

МЕТОДИКА ПОЛУКОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ ЭКСПРЕССИИ KI-67 (по de Boer С. J., 1999 и Feng W., 2007 с изменениями)

Уровень экспрессии Доля клеток, экспрессирующих маркер

Отсутствует 0%

Слабая 1 - 5%

Умеренная 6-20%

Выраженная 20 - 60%

Сильно выраженная 60- 100%

Оценку реакции с pió производили по системе, предлагаемой фирмой производителем набора:

• «-» (отрицательная реакция) - полное отсутствие продукта реакции или выявление его в цитоплазме и ядрах менее 5% клеток эпителиального пласта.

• «+» (слабая реакция) - выявление продукта реакции в цитоплазме и ядрах от 5 до 80% клеток, распределенного фокально или диффузно.

• «++» (выраженная реакция) - выявление продукта реакциц в цитоплазме и ядрах более 80% клеток, распределенного диффузно.

Оценка экспрессии остальных маркеров производилась полуколичественным методом: отрицательная реакция (0), слабая (+), умеренная (++), выраженная (+++).

Анализ результатов проводили при помощи пакета программ STATISTICA 6.0, используя U-тест Mann-Whitney для двух независимых групп данных. Уровень значимости (р) принимали равным 0,05.

Результаты исследования

Морфологические особенности фоновых и предраковых изменений железистого эпителия шейки матки. Многие авторы придерживаются мнения, что рак развивается не на «пустом месте», и его возникновению предшествуют определенные процессы гиперпластического, метапластиче-ского и диспластического характера (Давыдовский И.В., 1969; Краевский H.A., Смольянников A.B. и др., 1986; Соколова Н.В., 1990; Marques Т., Andrade L.A., et al. 1996; Минкина Г.Н., Манухин И.Б. и др. 2001; McCluggage W.G., 2003). В нашем исследовании из 118 наблюдений адено-карцином шейки матки в 113 (95,7%) были выявлены сочетанные изменения, в виде наличия двух и более фоновых и/или предраковых изменений.

Общепринято, что облигатным предраком шейки матки считается тяжелая дисплазия и карцинома in situ. В нашем исследовании дисплазия железистого эпителия выявлена в 87 из 118 случаев (73,7%). Сочетание диспла-зии разных степеней и аденокарциномы in situ (AIS) наблюдалось в 61 из 87 (70,1%). Таким образом, у подавляющего большинства пациенток удается проследить предраковые изменения при аденокарциноме шейки матки и у половины из них наблюдается сочетание дисплазии разной степени и AIS, как последовательных этапов канцерогенеза.

Полагаем, что диспластические изменения различной степени являются последовательными ступенями канцерогенеза хотя некоторые авторы считают, что выраженность дисплазии не имеет значения (Tavassoli F.A. and Devilee P., 2003; Kurman R.J., Ronnett B.M., Sherman M.E., Wilkinson E.J., 2010). По нашему мнению, определение степени дисплазии необходимо, по-

скольку это влияет на тактику дальнейшего лечения пациенток и определяет необходимость наблюдения в каждом конкретном случае. Дисплазии, в зависимости от степени, имеют разный риск прогрессии в рак. Это положение подтверждается и некоторыми результатами проведенного нами ИГХ-исследования.

При оценке распределения предраковых состояний по гистологическим вариантам аденокарциномы были выявлены определенные закономерности. Диспластические изменения наблюдались преимущественно при аде-нокарциномах цервикального типа, эндометриоидного типа и аденоплоско-клеточном раке. Кроме того, при высокодифференцированных карциномах диспластические изменения встречались в 2-3 раза чаще, чем при умеренно и низкодифференцированных. При отдельных гистологических типах адено-карцином предраковые изменения выявлены не были. К ним относятся стекловидно-клеточная аденокарцинома, мезонефральная, аденоидная базальная и светлоклеточная. Преимущественно эти опухоли являются чрезвычайно агрессивными и, вероятно, развиваются без каких-либо предшествующих предопухолевых процессов. Вероятно, это также связано с наличием разных генетических нарушений в данных опухолях, быстрым делением клеток, преимущественно эндофитной формой роста и, как следствие, - поздним выявлением со значительной распространенностью процесса. Возможно, фоновые изменения просто не удается проследить, поскольку большая часть тканей шейки матки оказывается замещена опухолью. При этом статистически значимой зависимости степени дифференцировки или гистологического типа опухоли от степени тяжести дисплазии выявлено не было.

Тубо-эндометриоидная метаплазия в нашей серии наблюдений являлась наиболее распространенной формой доброкачественных фоновых поражений шейки матки, что составило 14,5% (рис. 1). Вероятно, это связано с тем, что при аденокарциномах распространение на влагалищную часть шейки матки происходит раньше, чем на цервикальный канал (Kurman R.J., Ronnett В.М., Sherman М.Е., Wilkinson E.J., 2010), где по нашим данным чаще всего и локализуется тубо-эндометриоидная метаплазия. Таким образом, ее удается проследить в большинстве наблюдений. Она выявлена при всех исследованных типах аденокарцином, кроме светлоклеточной. Наиболее часто тубо-эндометриоидная метаплазия сочеталась с мезонефральной и серозной аде-нокарциномами. Возможно, это связано с малым числом наблюдений.

Активно изучаются туннельные кластеры типов А и В, представляющие собой скопления тубул, объединенных в дольки или узелки со сложной структурой. Главной задачей исследователей является обнаружение их возможной связи со злокачественной аденомой. Simionescu С. сообщает о частом сочетании злокачественной аденомы с туннельными кластерами типа В (6 из 11 наблюдений) (Simionescu С., Georgescu C.V. et al., 2006). Несмотря на то, что автор не рассматривает туннельные кластеры в качестве возможного предракового процесса, он, тем не менее, отмечает связь между кластерами и

злокачественной аденомой и считает, что при обнаружении туннельных кластеров типа В в шейке матки резко возрастает вероятность обнаружения злокачественной аденомы. Однако в нашей серии наблюдений эта связь не была подтверждена, туннельные кластеры типа В наиболее часто сочетались с эн-дометриоидной аденокарциномой разной степени дифференцировки, а также с аденоплоскоклеточным раком и аденокарциномой цервикального типа.

□ Дисплазия

□ Тубо-эндометриоидная метаплазия

□ Туннельные кластеры типа В

■ Гиперплазия остатков мезонефроса

■ Эндометриоз

□ Реактивные изменения

□ Кишечная метаплазия

□ Пилорическая метаплазия

□ Аденокарцинома in situ

□ Туннельные кластеры типа А

□ Незаращенные остатки мезонефроса

□ Микрогландулярная гиперплазия И Резервноклеточная гиперплазия

□ Эндоцервикоз ■ DLEGH

Рис.1. Структура фоновых и предраковых изменений железистого эпителия шейки матки. ОЬЕСН - диффузная ламинарная эндоцервикаль-ная железистая гиперплазия.

Злокачественная аденома сочеталась преимущественно с диспласти-ческими изменениями, а также с диффузной ламинарной эндоцервикальной железистой гиперплазией.

Большое внимание в зарубежной литературе уделяется гиперплазии незаращенных протоков мезонефроса, так как ряд исследователей относит ее к предраку (Jones М.А., Andrews J. et al., 1993; Clement P.B. and Young R.H., 2008). Seidman J.D. с соавторами провели анализ большой серии (51 случай) и считают, что диффузный тип мезонефральной гиперплазии должен расцениваться как злокачественная аденома и обязательно подвергаться оперативному лечению (Seidman J.D. and Tavassoli,F.A., 1995). К сожалению, мы располагаем недостаточным числом наблюдений для того, чтобы делать категорические выводы. В нашем исследовании незаращенные остатки мезонефро-

са наблюдались в сочетании с высокодифференцированным аденоплоскокле-точным раком, умеренно дифференцированной аденокарциномой цервикаль-ного типа. А гиперплазия незаращенных остатков мезонефроса наблюдалась как фоновый процесс при малодифференцированной эндометриоидной аде-нокарциноме. В некоторых участках опухолевые железы располагались рядом с гиперплазированными мезонефральными дольками, однако очагов перехода в рак или метаплазии не наблюдалось. Ввиду того, что в нашем распоряжении был только один случай гиперплазии незаращеных остатков мезонефроса, невозможно судить о роли этого процесса в канцерогенезе.

Микрогландулярная гиперплазия выявлена нами в 14,4% случаев, что несколько меньше, чем по данным литературы (Zamecnik М., Skalova А. et al„ 2003; Witkiewicz А.К., Hecht,J.L.,et al„ 2005). Более половины случаев микрогландулярной гиперплазии сочеталось с резервно-клеточной гиперплазией. Наиболее часто микрогландулярная гиперплазия сопровождала серозную аденокарциному, а также карциномы цервикального и эндометриоидно-го типов.

Эндометриоз шейки матки в исследованных образах сочетался с аде-ноплоскоклеточным раком, эндометриоидной аденокарциномой и злокачественной аденомой. Во всех наблюдениях в очагах эндометриоза не наблюдалось диспластических изменений эпителия, позволяющих предположить возможную роль эндометриоза в развитии эндометриоидной аденокарцино-мы шейки матки. Вероятно, для таких выводов необходимо исследование большого массива наблюдений.

Кишечная метаплазия выявлена в 12 наблюдениях. Термин «метаплазия» в нашем исследовании использован как общеупотребимый в отечественной и зарубежной литературе, когда речь идет о подобном процессе в железистом эпителии шейки матки. Кишечная метаплазия как фоновый процесс выявлялась при аденоплоскоклеточном раке с железистым компонентом эндоцервикального типа, аденокарциномах эндоцервикального типа различной степени дифференцировки, а также при злокачественной аденоме. Интересно, что аденокарциномы эндоцервикального типа относят к группе муци-нозных, также как и аденокарциномы шейки матки кишечного типа. И, возможно, частое сочетание кишечной метаплазии с аденокарциномами эндоцервикального типа закономерно. Однако мы полагаем, что не следует рассматривать ее в качестве предракового процесса, поскольку наряду с метаплазией во всех перечисленных случаях наблюдались и диспластические изменения эпителия желез.

Эндоцервикоз является наиболее часто встречающейся формой доброкачественных поражений шейки матки по данным литературы (Heatley M.K. and Russell P., 2001; McCluggage W.G., Price J.H. et al., 2001), однако на нашем материале это не показано. Возможность его злокачественного перерождения крайне сомнительна, хотя в литературе имеются единичные сообщения о вероятности возникновения первичной аденокарциномы шейки мат-

ки в очагах эндоцервикоза (McCluggage, W.G., Price, J.H., et al. 2001). Возможно, при сочетании с папилломавирусной инфекцией, возрастает вероятность возникновения диспластических изменений, а следовательно, увеличивается риск развития опухоли. В нашем исследовании эндоцервикоз диа-гносцирован у 29,7% пациенток. Низкий процент выявления эндоцервикоза по сравнению с данными литературы (Kurman R.J., Ronnett В.М., Sherman М.Е., Wilkinson E.J., 2010), вероятно, связан с обширным поражением влагалищной части шейки матки. Эндоцервикоз наиболее часто сочетался с эндо-метриоидной аденокарциномой, аденоплоскоклеточным раком и аденокар-циномой цервикального типа.

Мы наблюдали и чрезвычайно редкие фоновые состояния, такие как диффузная ламинарная эндоцервикальная железистая гиперплазия (1 случай). Она сочеталась со злокачественной аденомой. Некоторые авторы предполагают, что диффузная ламинарная эндоцервикальная железистая гиперплазия является основой для развития злокачественной аденомы (Anderson М.С., Robboy S J. et al., 2002), однако мы не можем подтвердить это мнение ввиду малого количества наблюдений.

Пилорическая метаплазия также была выявлена только в одном случае. Она сопровождала высокодифференцированную аденокарциному цервикального типа. В некоторых исследованиях, однако, отмечают, что пилорическая метаплазия преимущественно сопутствует злокачественной аденоме (Nucci M.R., Clement P.B. et al., 1999).

При иммуногистохимическом исследовании в диффузной ламинарной эндоцервикальной железистой гиперплазии и в пилорической метаплазии реакции со всеми исследованными маркерами отсутствовали. Отрицательные результаты можно объяснить, во-первых, единичными наблюдениями, а, во-вторых, по данным литературы, в этих видах поражений обычно экспрессируются маркеры, характерные для кишечного эпителия, такие как CDX-2 и MUC, не включенные нами в панель исследуемых антител (Kondo Т., Hashi А. et al., 2005; Nishio S., Tsuda H. et al., 2009). Реакции с pl6, Ki67 в этих поражениях отсутствовали, что косвенно свидетельствует о низком потенциале малигнизации.

При оценке распределения фоновых состояний по гистологическим вариантам аденокарциномы были выявлены некоторые закономерности. По нашим данным, аденокарцинома цервикального типа развивалась преимущественно на фоне эндоцервикоза, тубоэндометриоидной и кишечной метаплазии и сопровождалась диспластическими изменениями, чаще всего в виде сочетания дисплазии разных степеней. Для эндометриоидной аденокарциномы наиболее частыми фоновыми состояниями были эндоцервикоз, тубо-эндометриоидная метаплазия, туннельные кластеры и эндометриоз, а также выявлялась дисплазия эпителия. При аденоплоскоклеточной раке обнаружены диспластические изменения как плоского, так и железистого эпителия, представленные в равных пропорциях, а также эндоцервикоз, туннельные

кластеры типа А, резервно-клеточная гиперплазия. Серозные аденокарцино-мы чаще всего сочетались с дисплазией и микрогландулярной гиперплазией. Отличительной особенностью редких видов аденокарцином (стекловидно-клеточной, аденоидной базальной, мезонефральной и светлоклеточной) был относительно малый спектр фоновых изменений и полное отсутствие дисплазии железистого эпителия. Злокачественная аденома сочеталась, преимущественно, с диспластическими изменениями, а также с диффузной ламинарной эндоцервикальной железистой гиперплазией.

Рис. 2.

Выраженная экспрессия р16 при аденокарциноме in situ.

Иммуногистохи-мическая реакция с антителами к р16, х400.

□ Отрицательная □ Слабо выраженная ■ Сильно выраженная

Рис. 3.

Экспрессия р 16 при предраковых изменениях железистого эпителия шейки матки.

Иммуиогистохимические особенности фоновых и предраковых изменений железистого эпителия шейки матки. Проведенное иммуноги-стохимическое исследование помогло в некоторой степени прояснить вопросы гистогенеза, биологической сущности, прогностической значимости, дифференциальной диагностики предраковых и фоновых изменений железистого эпителия шейки матки. При дисплазии железистого эпителия шейки

матки была выявлена экспрессия р16, р53, р21, р27, циклина Dl, Ki67, TGF(3, CD 44, Е-кадгерина и Р-катеиина. Среди всех вышеперечисленных маркеров особый интерес представляют р 16 и Ki67.

Экспрессия ингибитора циклин-зависимой киназы р16 выявлялась в цитоплазме и ядрах клеток и нарастала с увеличением степени дисплазии, что соответствует данным литературы (Kim Y.T. and Zhao M., 2005; Smedts F., Ramaekers F.С. et al., 2008). При сравнении уровня экспрессии р16 между группами предраковых изменений выявлено, что при дисплазии 1 степени, дисплазии 2 степени он не различается. При дисплазии 3 и AIS выявлено увеличение уровня экспрессии р16 (рис. 2), однако при поочередном сравнении групп статистически значимых различий не обнаружено. С другой стороны, при дополнительной группировке и сравнении дисплазии 1-2 степени и дисплазии 3/ AIS статистическое различие обнаруживается (рис. 3). Полагаем, что это может свидетельствовать об общности характеристик дисплазии 1-2 степени, а также о низком злокачественном потенциале и риске прогрессии этих процессов. Это соответствует современным представлениям, поскольку р16 считается предиктором злокачественной трансформации (Wright Т.С., Kurman R.J. et al., 2002).

Следует отметить, что экспрессия маркера не во всех случаях свидетельствует о неопластическом характере процесса. Так среди доброкачественных изменений железистого эпителия р16 выявлялся в тубо-эндометриоидной метаплазии и туннельных кластерах типа А и В. Таким образом, само наличие маркера р16 не является определяющим, следует обращать особое внимание на интенсивность окрашивания и его характер (фокальное/диффузное), то есть на уровень экспрессии. Статистических различий в экспрессии белка р16 между перечисленными группами доброкачественных изменений обнаружено не было. Отсутствие экспрессии маркера подтверждает нашу гипотезу о том, что гиперплазия незаращенных остатков мезонефроса, а также кишечная метаплазия не могут быть отнесены к предраковым изменениям.

Экспрессия белка-регулятора клеточного цикла р53 выявлялась в ядрах и при предраковых изменениях имела тенденцию к увеличению с повышением степени дисплазии, однако статистически значимых различий между исследованными группами обнаружено не было. Интересно, что р53 в AIS выявлялся в тех случаях, где структуры инвазивной аденокарциномы демонстрировали высокую ядерную экспрессию этого белка. Такой характер экспрессии может свидетельствовать о том, что р53 играет лишь второстепенную роль в развитии предраковых изменений железистого эпителия шейки матки и включается в канцерогенез не всегда. Многими исследователями показано, что в различных инвазивных опухолях, в том числе и при адено-карциномах шейки матки р53 является маркером агрессивности опухоли (Lie А.К., Skarsvag S. et al., 1999; Huang L.W., Chou Y.Y. et al., 2001; Ichimura T., Koizumi T. et al., 2001).

В нашей работе высокая экспрессия р53 чаще фиксировалась в аде-нокарциномах с агрессивным клиническим поведением, таких как серозная, низкодифференцированная аденоплоскоклеточная и низкодифференцирован-ная эндометриоидная аденокарцинома. Вероятно, следует обратить более пристальное внимание на AIS с гиперэкспрессией р53 в связи с возможным более высоким риском их прогрессии в инвазивную аденокарциному, тем более что данных в литературе на этот счет также недостаточно и данный вопрос требует дальнейшего подробного изучения.

Возможный механизм гиперэкспрессии р53 связан с онкопротеинами папилломавируса человека (HPV). В норме р53 легко деградирует вследствие образования комплекса с онкопротеином MDM-2. Активность р53 регулируется белком р14, который находясь в активном состоянии, блокирует образование комплекса MDM2 и р53 и сохраняет активность р53. При AIS происходит увеличение экспрессии маркера. Возможно, это связано с тем, что при развитии опухолевого процесса с участием HPV блокируется белок pRb, в результате происходит активация транскрипционного фактора E2F, который вызывает повышение экспрессии р14. р14, как сказано выше, препятствует деградации р53 и способствует его накоплению в клетке. Также существует предположение, что при связывании с белком Е6 р53 стабилизируется, не подвергается деградации, что тоже может быть причиной его гиперэкспрессии (Kim Y.T. and Zhao М., 2005).

При доброкачественных изменениях эпителия экспрессия р53 наблюдалась в единичных случаях тубо-эндометриоидной метаплазии и при реактивных изменениях эпителия. При статистическом сравнении не было выявлено значимых отличий в группах. Однако, наличие высокого уровня экспрессии (>50%) может свидетельствовать о предопухолевом или опухолевом характере процесса, и, кроме того, указывать на значительную биологическую агрессивность выявленных изменений. В связи с отсутствием статистически значимых различий между экспрессией р53 при доброкачественных и предраковых изменениях железистого эпителия, мы не рекомендуем использовать этот маркер в целях дифференциальной диагностики.

Реакция с р21 чаще выявлялась при повышении степени дисплазии (рис. 4), однако между группами не было обнаружено статистически значимой разницы. Повышение экспрессии маркера может быть связано с функцией, которую данный белок выполняет в ходе клеточного цикла. Поскольку р21 является р53-индуцируемым протеином (Kim Y.T. and Zhao M., 2005), то его экспрессия должна снижаться при блокировании р53. Однако, экспрессия р53 возрастает вследствие включения механизмов отрицательной обратной связи при воздействии Е6 HPV 16 (Lu X., Toki Т. et al., 1998). Увеличение экспрессии р53, по-видимому, является стимулом к нарастанию синтеза р21. Обсуждается и другой механизм увеличения содержания р21. Оно, возможно, возрастает в попытке компенсировать ослабленную или отсутствующую функцию р27. При предраковых изменениях железистого эпителия шейки

матки его функция может быть ослаблена посредством инактивации р21 он-копротеином Е7 HPV 16 (Lu X., Toki Т. et al., 1998). P21 является потенциально ценным дифференциально диагностическим маркером, но в связи с отсутствием статистически значимых различий между его экспрессией при доброкачественных и предраковых изменениях железистого эпителия, мы не можем использовать его для дифференциальной диагностики.

Белок р27, наряду с р53 и р21, в нашем исследовании демонстрировал тенденцию к увеличению экспрессии при повышении степени дисплазии и выявлялся только в ядрах клеток (рис. 5). Однако, статистически значимых различий между группами не обнаружено. Выявленный нами факт весьма интересен, поскольку для предраковых изменений плоского эпителия шейки матки описана обратная тенденция - с повышением степени дисплазии плоского эпителия экспрессия маркера снижается (Sgambato A., Zannoni G.F. et al., 2004). Возможно, механизм повышения уровня экспрессии р27 сходен с повышением экспрессии р21, однако это явление требует дальнейшего изучения.

В большей части наблюдений доброкачественных изменений железистого эпителия обнаружена слабая ядерная реакция с циклином D1 или ее отсутствие. При предраковых изменениях отмечалась более выраженная экспрессия маркера, однако статистически значимых различий не обнаружено. Тенденции к повышению уровня экспрессии циклина D1 с нарастанием степени дисплазии не отмечалось. В литературе сообщается, что циклин D1 может быть полезен для дифференциальной диагностики тубо-эндометриоидной метаплазии и AIS (Little L. and Stewart С.J., 2010), однако в нашей работе мы не нашли подтверждения данному факту. В проведенном исследовании обе группы демонстрировали примерно одинаковый уровень экспрессии белка.

Рис. 4.

Выраженная экспрессия р21 в аде-нокарциноме in situ.

Иммуногистохи-мическая реакция с антителами к р21, х 200.

Маркер пролиферации Ki67 при аденокарциноме in situ железистого эпителия шейки матки выявлялся в 100% случаев, при этом в 39 наблюдени-

ях (84,8%) имела место выраженная и сильно выраженная ядерная экспрессия. При сравнении с дисплазией III степени значимых различий не обнаружено, тогда как при сравнении с дисплазией I и II степени выявлена статистически значимая разница (р<0.05).

Дисплазия I Дисплазия II Дисплазия III AIS Рак

б Отрицательная реакция □ Слабо выраженная реакция ■ Сильно выраженная реакция I

Рис. 5.

Экспрессия р27 при предраковых изменениях железистого эпителия шейки матки.

Таким образом, при дисплазии I и II степени уровень экспрессии KÍ67 значимо ниже, чем при дисплазии III степени и AIS. Также следует обратить внимание на поступательное увеличение пролиферативной активности при повышении степени дисплазии, что свидетельствует о постепенном накоплении генетических повреждений, ведущих к бесконтрольному делению клеток и подтверждает теорию о том, что диспластические изменения являются последовательными ступенями канцерогенеза аденокарцином шейки матки.

Индекс KÍ67 является важным прогностическим фактором, позволяющим оценить злокачественный потенциал предраковых изменений железистого эпителия шейки матки (Liang J., Mittal K.R. et al., 2007; Mikami Y., Kojima A. et al., 2009). Полученные нами данные свидетельствуют, что выраженная экспрессия KÍ67 при дисплазии III степени и AIS характеризует эти поражения как более агрессивные по сравнению с дисплазией I-II степени и свидетельствует о более высоком риске прогрессии в инвазивный рак.

Фактор роста TGFp выявлен в цитоплазме клеток при реактивных изменениях эпителия. Данный факт можно объяснить тем, что TGF(3 является цитокином и играет важную роль в процессах воспаления и, поэтому активно экспрессируется при реактивных изменениях эпителия. Также отмечалась тенденция к увеличению числа случаев с экспрессией TGFP при предраковых изменениях железистого эпителия по сравнению с доброкачественными и увеличение экспрессии с возрастанием степени дисплазии, однако статистически такая направленность не подтверждается. Эти данные важны в связи с тем, что при описанных патологических процессах до сих пор не изучались.

В статьях, посвященных доброкачественным изменениям эпителия, активно обсуждается значимость маркера bcl-2 для дифференциальной диагностики. Многими авторами показано, повышение экспрессии белка при тубо-эндометриоидной метаплазии (Anderson M.С., Robboy S.J. et al., 2002; McCluggage W.G. and Maxwell P., 2002; El-Ghobashy A.A., Shaaban A.M. et al., 2007). В нашем исследовании реакция с маркером при тубо-эндометриоидной метаплазии выявлена в 92,6% наблюдений в цитоплазме клеток и продемонстрировано, что в этой группе экспрессия bcl-2 статистически значимо превышает таковую во всех других группах (табл. 3, рис. 6). Положительная реакция с bcl-2 выявлялась также в части случаев при гиперплазии незаращен-ных остатков мезонефроса (66,7% наблюдений) и резервно-клеточной гиперплазии (50% наблюдений), однако носила менее интенсивный характер. Известно, что даже в нормальном эпителии маточной трубы выявляется высокий уровень экспрессии bcl-2. Интересно, что эта способность сохраняется даже в очагах метаплазии. Данный факт может косвенно свидетельствовать об отсутствии злокачественного потенциала у тубо-эндометриоидной метаплазии. При предраковых изменениях железистого эпителия реакция с bcl-2 была отрицательная во всех группах. При сравнении с тубо-эндометриоидной метаплазией выявлено статистически значимое различие в экспрессии маркера. Исходя из вышесказанного, данный белок элективно экспрессируется в очагах тубо-эндометриоидной метаплазии, это позволяет дифференцировать ее от предраковых изменений, что не всегда возможно при обзорном гистологическом исследовании. Таким образом, в отличие от данных литературы, где отмечена лишь тенденция к увеличению экспрессии bcl-2, в нашем исследовании показана статистически значимая разница, что позволяет рекомендовать этот маркер для использования в дифференциальной диагностике с предраковыми изменениями железистого эпителия.

В имеющихся публикациях отсутствуют сведения о роли белка CD44 при предраковых изменениях железистого эпителия. Нами показано, что мембранная экспрессия CD44 выявляется в 94,6% случаев дисплазии 1 степени, 87,7% случаев дисплазии 2 степени, 93,4% случаев дисплазии 3 степени и 87% наблюдений AIS (табл. 4). Статистически значимых отличий между этими группами не было обнаружено (р>0,05). Однако, мы обратили внимание, что при предраковых изменениях эпителия маркер экспрессировался в клетках и не обнаруживался в стромальных элементах. В аденокарциномах шейки матки, напротив, наблюдалось некоторое снижение клеточной экспрессии CD44 (отрицательная реакция в 70,3% наблюдений), а также большое число случаев с фокальной или гетерогенной экспрессией, что ограничивает его применение как прогностического маркера. Следует отметить, что наряду со снижением экспрессии CD44 в клетках инвазивной аденокарцино-мы, наблюдалось перераспределение белка в клетки стромы опухоли.

Таблица 3

ЭКСПРЕССИЯ МАРКЕРА ВСЬ-2 ПРИ ФОНОВЫХ ИЗМЕНЕНИЯХ ЖЕЛЕЗИСТОГО ЭПИТЕЛИЯ ШЕЙКИ МАТКИ

Виды фоновых изменений железистого эпителия Экспрессия ЬсГ2 Всего

Отрицательная Слабая Выраженная

Тубо-эндометриоидная метаплазия 2 (3,7%) 2 (3,7%) 50 (92,6%)* 54 (100%)

Туннельные кластеры типа А 12 (100%) 0 (0%) 0 (0%) 12 (100%)

Туннельные кластеры типа В 8 (100%) 0 (0%) 0 (0%) 8(100%)

Незаращеные остатки мезо-нефроса 1 (33,3%) 0 (0%) 2 (66,7%) 3 (100%)

Гиперплазия незаращенных остатков мезонефроса 1 (100%) 0 (0%) 0 (0%) 1 (100%)

Микрогландулярная гиперплазия 17 (100%) 0 (0%) 0 (0%) 17 (100%)

Эндометриоз 12(100%) 0 (0%) 0 (0%) 12 (100%)

Резервно-клеточная гиперплазия 5 (31,25%) 3 (18,75%) 8 (50%) 16 (100%)

Реактивные изменения 17(100%) 0 (0%) 0 (0%) 17 (100%)

Эндоцервикоз 35 (100%) 0 (0%) 0 (0%) 35 (100%)

Кишечная метаплазия 12(100%) 0 (0%) 0 (0%) 12 (100%)

Диффузная ламинарная эндоцервикальная железистая гиперплазия 1 (100%) 0 (0%) 0 (0%) 1 (100%)

Пилорическая метаплазия 1 (100%) 0 (0%) 0 (0%) 1 (100%)

* различия статистически значимы (р<0.05) по сравнению с другими группами фоновых изменений железистого эпителия.

Рис. 6.

Выраженная экспрессия Ьс1-2 в тубоэндо-метриоидной метаплазии.

Иммуногистохимиче-ская реакция с антителами к Ьс1-2, х 400.

Данный феномен также наблюдался в фокусах ранней стромальной инвазии (рис. 7). Полагаем, что высокая экспрессия СБ44 в строме при инва-зивных аденокарциномах шейки матки, вероятно, является следствием нарушения формирования и изменений свойств стромы рака и делает СБ44 ценным инструментом для идентификации ранней стромальной инвазии и верификации диагноза при высокодифференцированных инвазивных опухолях (таких как аденокарцинома цервикального типа и злокачественная аденома).

Таблица 4

ЭКСПРЕССИЯ СБ44 В КЛЕТКАХ СТРОМЫ ПРИ ПРЕДРАКОВЫХ ИЗМЕНЕНИЯХ ЖЕЛЕЗИСТОГО ЭПИТЕЛИЯ И АДЕНОКАРЦИНОМАХ

ШЕЙКИ МАТКИ

Экспрессия CD44 Предраковые изменения железистого эпителия Рак

Дисплазия I степени Дисплазия II степени Дисплазия III степени AIS

Отрицательная экспрессия 37 (100%) 57 (100%) 43 (95,6%) 42 (91,3%) 22(18,6%)

Положительная экспрессия 0 (0%) 0 (0%) 2 (4,4%) 4 (8,7%)* 96 (81,4%)

Всего 37 (100%) 57 (100%) 45 (100%) 46 (100%) 118 (100%)

* Экспрессия в очагах микроинвазии.

Данные об экспрессии Е-кадгерина при различных изменениях железистого эпителия шейки матки и аденокарциноме крайне скудны. Имеются сообщения о снижении экспрессии Е-кадгерина совместно с р-катенином в аденокарциноме шейки матки (Moon H.S., Park W.I. et al., 2003). В нашем исследовании Е-кадгерин и р-катенин экспрессировались на мембранах в подавляющем большинстве случаев во всех исследованных группах. Отмечалась гетерогенная по интенсивности экспрессия маркеров, статистически значимых различий не обнаружено. Перераспределения маркеров в цитоплазму и\или ядро при аденокарциномах шейки матки не наблюдалось. Мы полагаем, что характер экспрессии Е-кадгерина и р-катенина свидетельствует о том, что, в отличие от плоскоклеточной карциномы, изменения в Е-кадгерин/р-катенин/Wnt - сигнальном пути при аденокарцином шейки матки не происходят.

Экспрессия тенасцина выявлена исключительно в строме, что соответствует данным литературы (Yaldizl М., Hakverdi A.U. et al., 2005). Мы наблюдали умеренную реакцию в виде полоски, расположенной под нормальным цилиндрическим и плоским эпителием шейки матки, а также в сосудах. Подобные варианты также описаны в ряде публикаций при других опухолях (Франк Г.А., Завалишина Л.Э. и др., 2005; Андреева Ю.Ю., Зава-лишина Л.Э. и др., 2007). Интересно, что интенсивность реакции в аденокар-

циноме шейки матки была значимо выше, чем при доброкачественных и предраковых изменениях железистого эпителия. На основании полученных данных, полагаем, что данный маркер, наряду с CD44, может быть рекомендован для выявления ранней стромальной инвазии и для диагностики инва-зивного рака с очень высоко дифференцированными железистыми структурами.

Рис. 7.

Микроинвазивная аденокарцинома шейки матки, перераспределение CD44 из клеток в строму в зоне инвазии.

Иммуногистохими-ческая реакция с антителами к CD44, х 200.

Ламинин экспрессировался вдоль базальной мембраны эпителия нормальных желез, а также в доброкачественных и предраковых изменениях железистого эпителия, что не противоречит данным литературы (Negri G., Romano F. et al., 2006). При аденокарциномах шейки матки наблюдалось перераспределение маркера и накопление его в цитоплазме опухолевых клеток расположенных вдоль наиболее глубоко лежащих опухолевых комплексов. Подобная картина делает ламинин перспективным маркером для выявления стромальной инвазии, однако необходимы дальнейшие исследования его роли в данном процессе.

В соответствии с результатами анализа морфологических и иммуно-гистохимических характеристик диспластических изменений эпителия целесообразно уточнить и упростить существующую классификацию предраковых изменений железистого эпителия. Ввиду того, что различия между дис-плазией I и II степени определяются только степенью ядерной анаплазии, которую бывает иногда очень трудно оценить, особенно в тангенциальных срезах, а также принимая во внимание иммуногистохимические характеристики (низкая пролиферативная активность и низкая экспрессия р16) , подтверждающие низкий потенциал малигнизации, объединение их в одну классификационную группу вполне оправдано. Это мнение разделяют многие исследователи (Scully R.E., Bonfiglio Т.А. et al., 1994; Кондриков Н.И., 2008). Название данной объединенной группы может обсуждаться. Некоторые авторы предлагают термин "железистая атипия" (Kurman R.J., Ronnett В.М.,

Sherman M.E., Wilkinson E.J., 2010), однако мы считаем, что необходимо использовать термин «цервикальная гландулярная интраэпителиальная неопла-зия», поскольку он лучше отражает биологическую сущность процесса.

Мы также предлагаем объединить в одну категорию дисплазию железистого эпителия III степени и аденокарциному in situ. Данные поражения также имеют множество общих черт: высокую степень ядерной атипии, наличие большого количества митозов, в том числе и патологических, нарушение рядности эпителиального пласта. Одни авторы считают, что основным отличительным признаком является наличие сосочков в аденокарциноме in situ (Kurman R.J., Ronnett B.M., Sherman M.E., Wilkinson E.J., 2010), другие полагают что и при дисплазии III степени возможно формирование криброз-ных структур (Robboy S.J., Anderson М.С. et al., 2002; Кондриков Н.И., 2008). Таким образом, морфологические различия между этими двумя группами поражений размыты. С другой стороны они демонстрируют сходную экспрессию белков р16 и KÍ67, признанных большинством исследователей маркерами прогрессии в инвазивную карциному.

Объединение дисплазии I и II степени в одну группу (цервикальная гландулярная неоплазия low grade), а дисплазии III степени и AIS — в другую (цервикальная гландулярная неоплазия high grade), значительно упростит классификацию. При этом критерии оценки будут более четкими и лучше воспроизводимыми. Кроме того, это согласуется с принятой тактикой лечения (Минаев Н.И., 1993; Франк Г.А., 2008).

Исходя из полученных данных, считаем целесообразным предложить алгоритм дифференциальной диагностики доброкачественных и предраковых изменений железистого эпителия шейки матки. В основу алгоритма положены морфологические и иммуногистохимические особенности изучаемых изменений эпителия (рис. 8). В алгоритме использованы данные об экспрессии маркеров р 16, Ki67, bcl-2, CD44 и тенасцина. Для железистых поражений, не имеющих какого либо специфического иммуногистохимического профиля приведены основные морфологические характеристики, позволяющие дифференцировать их от других.

Таким образом, в результате проведенного исследования установлена значимо более высокая экспрессия р16 и KÍ67 при дисплазии III степени и AIS, тенденция к увеличению интенсивности реакции с р21 и р27 при повышении степени дисплазии, гиперэкспрессия bcl-2 в тубо-эндометриоидной метаплазии. Предложено использовать CD44 и тенасцин в качестве маркеров ранней стромальной инвазии. Уточнена классификация предраковых изменений железистого эпителия шейки матки, а также предложен алгоритм их дифференциальной диагностики.

Рис. 8. Алгоритм дифференциальной диагностики предопухолевых и фоновых изменений железистого эпителия шейки матки.

LEGH -дольковая эндоцервикальная железистая гиперплазия; CGIN low grade - цервикальная гландулярная интраэпителиальная неоплазия низкой степени; CGIN high grade - цервикальная гландулярная интраэпителиальная неоплазия высокой степени; ТЭМ - тубо-эндометриоидная метаплазия.

Выводы

1. На основании анализа морфологических характеристик и экспрессии белков р16 и ki67, к предраковым изменениям железистого эпителия шейки матки следует относить только дисплазию. Кишечная метаплазия, гиперплазия незаращенных остатков мезонефроса, микрогландулярная гиперплазия демонстрируют низкий уровень экспрессии белков р16 и ki67, поэтому являются доброкачественными изменениями и не относятся к предраковым.

2. Экспрессия маркера апоптоза bcl-2 статистически значимо выше при тубо-эндометриоидной метаплазии, что обуславливает его важность для дифференциальной диагностики с предраковыми изменениями железистого эпителия.

3. В 100% случаев ранней стромальной инвазии и в 81,4% наблюдений инфильтративных аденокарцином выявляется экспрессия тенасцина и CD44 в структурах стромы. Это позволяет использовать данные маркеры для диагностики инвазивного роста. При аденокарциноме in situ реакция с CD44 наблюдается только в клетках эпителия, а в клетках стромы - отсутствует.

4. Увеличение степени дисплазии железистого эпителия закономерно сочетается с увеличением экспрессии белков регуляторов клеточного цикла р21, р27 и фактора роста опухолей TGFp.

5. Разработанный алгоритм, включающий панель из следующих маркеров: р16, Ki67, bcl-2, тенасцин, CD44, позволяет формализовать и объективизировать процесс дифференциальной диагностики предраковых и фоновых изменений железистого эпителия шейки матки.

6. С учетом сходства морфологических и иммуногистохимических характеристик представляется целесообразным разделить предраковые изменения железистого эпителия на 2 группы: цервикальная гландулярная интра-эпителиальная неоплазия низкой степени (low grade) и цервикальная гландулярная интраэпителиальная неоплазия высокой степени (high grade), что позволит адекватно оценивать особенности клинического течения и прогноз, а также выбор оптимальной тактики лечения.

Практические рекомендации

1. Для дифференциальной диагностики фоновых и предраковых изменений железистого эпителия шейки матки необходимо проводить иммуногисто-химическое исследование:

a) С целью определения потенциала злокачественности предраковых изменений целесообразно применять белок-регулятор клеточного цикла р16 и маркер пролиферативной активности ki67.

b) Для дифференциальной диагностики тубо-эндометриоидной метаплазии и предраковых изменений эпителия — регулятор апоптоза bcl-2.

c) Для дифференциальной диагностики ранней стромальной инвазии и доброкачественных железистых гиперплазий от высокодифференци-рованных аденокарцином - молекулу адгезии CD44 и стромальный белок тенасцин.

2. Следует разделять предраковые изменения железистого эпителия на две группы: цервикальная гландулярная интраэпителиальная неоплазия низкой степени (low grade) и цервикальная гландулярная интраэпителиальная неоплазия высокой степени (high grade).

3. Для дифференциальной диагностики предраковых и фоновых изменений эпителия следует использовать предложенный алгоритм.

4. Иммуногистохимическое исследование нецелесообразно использовать при кишечной метаплазии микрогландулярной гиперплазии, незаращенных остатках мезонефрального протока, эндометриозе, эндоцервикозе, туннельных кластерах типа А и В, резервно-клеточной гиперплазии. При дифференциальной диагностике этих изменений следует опираться на формальные морфологические признаки.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Публикации в ведущих периодических изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Данилова Н.В., Андреева Ю.Ю., Мальков П.Г. Предраковые изменения эпителия шейки матки: терминология и принципы дифференциальной диагностики (обзор) // Архив патологии. - 2010. - №4. - С. 12-16.

2. Данилова Н.В., Андреева Ю.Ю., Мальков П.Г. Дифференциальная диагностика предопухолевых и регенераторных изменений эпителия шейки матки с использованием иммуногистохимического метода // Архив патологии. -2011. -№ 2. - С. 10-14.

3. Данилова Н.В., Андреева Ю.Ю., Мальков П.Г. Железистые поражения шейки матки // Архив патологии. — 2011. - № 6. - С. 52-58.

4. Данилова Н.В., Андреева Ю.Ю., Завалишина Л.Э., Мальков П.Г. Маркеры стромальной инвазии при фоновых и предраковых изменениях железистого эпителия и аденокарциноме шейки матки // Архив патологии. - 2012. - № 4. - С. 28-34.

5. Сазонова В.Ю., Федорова В.Е., Данилова Н.В. Алгоритм дифференциальной диагностики предраковых и регенераторных изменений эпителия шейки матки//Архив патологии. -2013. — № 1. - С. 42-47.

6. Данилова Н.В., Андреева Ю.Ю., Завалишина Л.Э., Мальков П.Г. Маркеры апоптоза и белки регуляторы клеточного цикла при фоновых и предраковых изменениях железистого эпителия шейки матки // Онкология. Журнал имени П.А.Герцена. - 2013. - № 1. — С. 12-16.

Публикации в виде руководств:

7. Опухоли шейки матки. Морфологическая диагностика и генетика: Руководство / Под ред., Ю.Ю. Андреевой, Г.А.Франка / Н.В. Данилова, Ю.Ю. Андреева, Л.Э. Завалишина, Т.В. Кекеева, П.Г.Мальков, Г.А. Франк / ФФМ МГУ. - М.: Практическая медицина, 2012,- 116 с.

Публикации в материалах конгрессов, съездов и конференций:

8. Данилова Н.В. Экспрессия регулятора клеточного цикла pl6INK4a при предопухолевых изменениях эпителия шейки матки // VIII Всероссийская конференция по патологии клетки. - Москва, 2010. - С. 88-90.

9. Danilova N. V., Malkov P.G. P16INK4a Expression in precancerous lesions of the cervix / 28th Congress of the International Academy of Pathology (Sao Paulo, 2010) // Histopathology. - 2010. - V.57. - Suppl.l. - P. 107.

10. Danilova N.V., Andreeva Y.Y., Malkov P.G., Zavalishina L.E., Frank G.A. CD44 expression in glandular lesions and adenocarcinoma of the uterine cervix / 23rd European Congress of Pathology (Helsinki, 2011) // Virchows Archiv. - 2011. - V.459. - Suppl.l. - P. 231-232.

11. Данилова Н.В. Иммуногистохимическая экспрессия белка-регулятора клеточного цикла р16 при диспластических изменениях эпителия шейки матки / Материалы Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2011» / Отв. ред. А.И. Андреев, А.В. Андрия-нов, Е.А. Антипов, М.В. Чистякова. [Электронное издание] — М.: МАКС Пресс, 2011 ISBN 978-5-317-04041-3.

12. Андреева Ю.Ю., Данилова Н.В. Предраковые изменения железистого эпителия шейки матки / XI Московская Ассамблея «Здоровье столицы». Тезисы докладов. - Москва, 2012. - С. 172-174.

Подписано в печать 08.02.13. Бумага офсетная. Формат 60x84/16. Гарнитура «Times New Roman» Печать офсетная. Усл. печ. 1,75 л. Тираж 100

«ИПО «У Никитских ворот». 121069, г. Москва, ул. Большая Никитская, д. 50/5, тел.: 690-67-19, www.uniki.ru

Проблема рака шейки матки остается актуальной, что связано не только с устойчиво высокой заболеваемостью, но и с увеличением доли аденогенного рака, результаты ранней диагностики и лечения которого по сравнению с плоскоклеточным остаются неудовлетворительными [8, 84].

Увеличение заболеваемости аденокарциномой шейки матки, активное внедрение в практику врачей-гинекологов браш-биопсии и других методов получения материала из шейки матки привело к увеличению объема исследуемого патоморфологами материала, и, следовательно, к более тщательному и детальному изучению патологии эндоцервикса. В последние 10 -лет появилось множество публикаций, посвященных вопросам классификации и дифференциальной диагностики опухолевых, предопухолевых и доброкачественных изменений железистого эпителия. Весьма актуальной остается проблема фоновых состояний и предраковых изменений эпителия шейки матки.

Имеется большое количество разногласий по поводу того, какие доброкачественные процессы эндоцервикса обладают наиболее высоким потенциалом малигнизации. Так некоторые исследователи настаивают, что трубная метаплазия и гиперплазия незаращенных остатков мезонефроса являются облигатным предраком и подлежат хирургическому лечению [116, 120]. Активно изучается экспрессия различных иммуногистохимических маркеров, однако требуется детальный анализ этого массива данных для выработки надежных диагностических алгоритмов [80, 104, 105].

С развитием и совершенствованием современных методов иммуногистохимии и молекулярной биологии появились новые возможности оценки морфогенеза новообразований, пролиферативной и секреторной активности клеток. Зарубежные патологи пытаются ответить на ряд вопросов, относительно фоновых и предраковых изменений эпителия шейки матки. При этом большинство работ посвящено описанию отдельных наблюдений редких морфологических форм или касается клинико-морфологического исследования небольших групп больных [43, 49, 70, 73, 81].

Для определения биологического потенциала фоновых и предраковых изменений эпителия в зарубежных исследованиях используются иммуногистохимические методы с применением моноклональных антител к белкам-регуляторам клеточного цикла (р53, р16), раковому эмбриональному антигену, белку регулятору апоптоза (Ьс1-2), однако результаты оценки экспрессии данных маркеров противоречивы. В отечественной литературе подобные публикации крайне немногочисленны. Явно недостаточное внимание уделяется изучению преинвазивных изменений железистого эпителия. Отсутствуют работы по изучению маркеров стромальной инвазии и матриксных белков, в частности СВ44, тенасцина, Е-кадгерина, Р-катенина и ламиниа при фоновых и предраковых изменениях железистого эпителия шейки матки. Нет сведений о возможности использования этих маркеров для дифференциальной диагностики предраковых изменений и рака шейки матки.

Существует проблема распознавания ранней стромальной инвазии при предраковых изменениях железистого эпителия шейки матки, т.к. различить между собой вовлечение в неопластический процесс предсуществующих железистых крипт и комплексы высокодифференцированной аденокарциномы в строме по формальным морфологическим признакам порой невозможно [84].

Не изучена роль в патогенезе предраковых изменений эпителия и аденокарциномы таких белков как ЕОБЯ и ТБвр, имеющих большое значение для выбора тактики лечения при многих других видах новообразований (например, раке легкого).

Классификация предраковых изменений эпителия шейки матки на сегодняшний день является чрезвычайно громоздкой и трудно воспроизводимой, поскольку включает в себя дисплазию трех степеней и аденокарциному in situ. Критерии диагностики данных категорий расплывчаты, особенно что касается дисплазии 3 степени и аденокарциномы in situ.

Целью настоящего исследования явилось изучение морфологии и иммунофенотипа фоновых и предраковых изменений железистого эпителия шейки матки, совершенствование морфологических методов их оценки и разработка алгоритма дифференциальной диагностики.

Для реализации цели исследования решались следующие задачи:

1. Изучить морфологические особенности фоновых и предраковых изменений железистого эпителия шейки матки.

2. Изучить иммуногистохимические характеристики фоновых и предраковых изменений железистого эпителия шейки матки.

3. Разработать алгоритм морфологической дифференциальной диагностики фоновых и предраковых изменений железистого эпителия шейки матки.

4. Обосновать уточнения к классификации фоновых и предраковых изменений железистого эпителия шейки матки.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

В работе впервые изучены и подробно описаны морфологические особенности фоновых и предраковых состояний железистого эпителия шейки матки, что ранее не выполнялось. Проведено сопоставление фоновых и предраковых изменений с наиболее часто встречающимися вариантами цервикального аденогенного рака. Изучены иммуногистохимические характеристики фоновых и предраковых изменений.

Показано, что при дисплазии железистого эпителия III степени и аденокарциноме in situ уровень экспрессии белка-регулятора клеточного цикла р16 и маркера пролиферативной активности ki67 статистически значимо превышает таковой при дисплазии I и II степени. ' I / I » , »" . 4 I (6 , . ' ' " 1 I Л Л' " .

Впервые выявлены статистически значимые различия в уровне экспрессии маркера апоптоза Ьс1-2 при тубо-эндометриоидной метаплазии и предраковых изменениях железистого эпителия шейки матки, позволяющие проводить дифференциальную диагностику между тубоэндометриоидной метаплазией и дисплазией эпителия шейки матки.

Впервые при фоновых и предраковых изменениях железистого эпителия изучен характер экспрессии белков регуляторов клеточного цикла р21, р27 и фактора роста опухолей ТОБр и показано увеличение их экспрессии с нарастанием степени дисплазии эпителия.

Показаны статистически значимые различия в экспрессии неспецифической молекулы адгезии СБ44 и белка межклеточного матрикса тенасцина при предраковых процессах и аденокарциноме шейки матки, что вносит значительный вклад в развитие новых подходов к дифференциальной диагностике инвазивных и неинвазивных поражений шейки матки.

Проведенное комплексное морфологическое исследование с применением иммуногистохимии позволило обосновать предлагаемые уточнения к существующей классификации фоновых и предраковых изменений железистого эпителия шейки матки.

Разработан алгоритм морфологической дифференциальной диагностики фоновых и предраковых состояний железистого эпителия шейки матки.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕКСАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

В работе развиваются теоретические аспекты терминологии, классификации, формальной морфологии и иммуногистохимии фоновых и предраковых изменений железистого эпителия шейки матки.

Полученные результаты способствуют улучшению патоморфологической диагностики, дают новые возможности для дифференциальной диагностики предопухолевых и фоновых изменений эпителия шейки матки на основе данных формальной морфологии и иммуногистохимического исследования.

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТЙКУ

Результаты исследования внедрены в практическую работу патологоанатомического отделения МНИОИ им. П.А.Герцена, централизованной окружной лаборатории патоморфологии и цитологии ГУЗ Консультативно-диагностический центр №6 Москвы, курса патологической анатомии кафедры физиологии и общей патологии ГОУ ВПО факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В.Ломоносова.

По теме диссертации с 2010 по 2012 гг. опубликовано 12 работ, в том числе - 6 в журналах, рекомендованных ВАК. Материалы исследования доложены на межрегионарных научно-практических конференциях: Результаты исследования доложены на конференции памяти Ю.Л. Перова (Москва, 2009), VIII Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2010), 28th Congress of the International Academy of Pathology (Sao Paulo, 2010), ¿23rd European Congress of Pathology (Helsinki, 2011), Международном молодежном научном форуме «ЛОМОНОСОВ-2012» (Москва, 2012), Всероссийской научной конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» (Москва, 2012), XI Московской Ассамблее «Здоровье столицы» (Москва, 2012).

V л I

Выводы

1. На основании анализа морфологических характеристик и экспрессии белков р16 и ki67, к предраковым изменениям железистого эпителия шейки матки следует относить только дисплазию. Кишечная метаплазия, гиперплазия незаращенных остатков мезонефроса, микрогландулярная гиперплазия демонстрируют низкий уровень экспрессии белков pió и ki67, г поэтому являются доброкачественными изменениями и не относятся к предраковым.

2. Экспрессия маркера апоптоза bcl-2 статистически значимо выше при тубо-эндометриоидной метаплазии, что обуславливает его важность для дифференциальной диагностики с предраковыми изменениями железистого эпителия.

3. В 100% случаев ранней стромальной инвазии и в 81,4% наблюдений инфильтративных аденокарцином выявляется экспрессия тенасцина и CD44 в структурах стромы. Это позволяет использовать данные маркеры для-диагностики инвазивного роста. При аденокарциноме in situ реакция с CD44 наблюдается только в клетках эпителия, а в клетках стромы - отсутствует.

4. Увеличение степени дисплазии железистого эпителия закономерно сочетается с увеличением экспрессии белков регуляторов клеточного цикла р21, р27 и фактора роста опухолей TGF(3.

5. Разработанный алгоритм, включающий панель из следующих маркеров: pió, Ki67, bcl-2, тенасцин, CD44, позволяет формализовать и объективизировать процесс дифференциальной диагностики предраковых и фоновых изменений железистого эпителия шейки матки.

6. С учетом сходства морфологических и иммуногистохимических характеристик представляется целесообразным разделить предраковые изменения железистого эпителия на 2 группы: цервикальная гландулярная интраэпителиальная неоплазия низкой степени (low grade) и цервикальная гландулярная интраэпителиальная неоплазия высокой степени (high grade), что позволит адекватно оценивать особенности клинического течения и прогноз, а также выбор оптимальной тактики лечения.

Практические рекомендации

1. Для дифференциальной диагностики фоновых и предраковых изменений железистого эпителия шейки матки необходимо проводить иммуногистохимическое исследование: a) С целью определения потенциала злокачественности предраковых изменений целесообразно применять белок-регулятор клеточного цикла р16 и маркер пролиферативной активности ki67. b) Для дифференциальной диагностики тубо-эндометриоидной метаплазии и предраковых изменений эпителия - регулятор апоптоза bcl-2. c) Для дифференциальной диагностики ранней стромальной инвазии и доброкачественных железистых гиперплазий от высокодифференцированных аденокарцином - молекулу адгезии CD44 и стромальный белок тенасцин.

2. Следует разделять предраковые изменения железистого эпителия на две группы: цервикальная гландулярная интраэпителиальная неоплазия низкой степени (low grade) и цервикальная гландулярная интраэпителиальная неоплазия высокой степени (high grade).

3. Для дифференциальной диагностики предраковых и фоновых изменений эпителия следует использовать предложенный алгоритм.

4. Иммуногистохимическое исследование нецелесообразно использовать при кишечной метаплазии микрогландулярной гиперплазии, незаращенных остатках мезонефрального протока, эндометриозе, эндоцервикозе, туннельных кластерах типа А и В, резервно-клеточной гиперплазии. При дифференциальной диагностике этих изменений следует опираться на формальные морфологические признаки.