Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Флуоресцентная цистоскопия и локальная спектроскопия у больных поверхностным раком мочевого пузыря

На правах рукописи

УЛЬЯНОВ РОМАН ВАСИЛЬЕВИЧ

ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ ЦИСТОСКОПИЯ И

ЛОКАЛЬНАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ У БОЛЬНЫХ ПОВЕРХНОСТНЫМ РАКОМ МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ

14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА МЕДИЦИНСКИХ НАУК

Ч о ГЕН 2003

Москва - 2008

003447063

Работа выполнена в ФГУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П А Герцена» (Директор - академик РАМН, профессор В И Чиссов)

Научные руководители:

Доктор медицинских наук Теплов Александр Александрович

Кандидат физико-математических наук Булгакова Наталья Николаевна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Теодорович Олег Валентинович ГУО ДПО РМАПО

Доктор медицинских наук, профессор Бухаркин Борис Викторович ГУРОНЦим НН Блохина РАМН

Ведущее учреждение - ФГУ «Российский научный центр рентгенрадиологии»

Защита состоится 21 октября 2008 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 208 047 01 при ФГУ «МНИОИ им П А Герцена» по адресу 125284, Москва, 2-ой Боткинский проезд, 3

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ФГУ «МНИОИ им П А Герцена»

Автореферат разослан «_» сентября 2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета ФГУ «МНИОИ им. П.А. Герцена»

Доктор медицинских наук, профессор

Седых Сергей Анатольевич

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Рак мочевого пузыря (РМП) составляет 70% всех опухолей мочевого тракта и около 4% всех онкологических заболеваний С 1996г прирост показателя заболеваемости данной патологией составил 22,57% [Чиссов В И , 2008] В 2006 году заболеваемость злокачественными опухолями мочевого пузыря (МП) составила 8,93 человека на 100 тысяч населения Ежегодно в нашей стране регистрируется 13022 больных с впервые в жизни установленным диагнозом РМП На момент установления диагноза более чем у 2/3 больных (70-85%) выявляется поверхностный РМП, то есть рак с инвазией не глубже слизистого слоя - Та, Tis, Т1 [Матвеев БП, 2001]

Для РМП характерно частое рецидивирование Процент рецидивов при наблюдении за больными в сроки до 10-15 лет после проведенного лечения составляет 50-95% [Матвеев БП, 2001, Русаков И Г., 2003] Основным методом лечения поверхностного РМП остается трансуретральная резекция (ТУР) мочевого пузыря Рецидивирование заболевания после ТУР обусловлено мультицентричностью поражения слизистой мочевого пузыря, наличием не выявленных до операции очагов сг га situ, и возможностью имплантации опухолевых клеток во время ТУР [КудашевБВ ,2001]

Таким образом, основной проблемой является мультицентричный рост уротелиальных карцином Современные методы диагностики (обычная цистоскопия в белом свете, множественные слепые биопсии, цитология мочи) не позволяют выявить все поверхностные плоские опухолевые очаги слизистой мочевого пузыря

С целью определения адекватной тактики лечения РМП выделяют основные и дополнительные факторы прогноза Основными факторами прогноза при поверхностном РМП являются степень дифференцировки опухоли, количество опухолей к моменту лечения, размер опухолевого экзофита, Т-категория, время до возникновения рецидива после ТУР Опухоли с благоприятным прогнозом - это единичная опухоль Та высокой

степени дифференцировки менее 3 см в диаметре с отсутствием рецидива после ТУР в течение одного года

При диагностике поверхностного РМП ставятся следующие вопросы определение глубины инвазии, выявление очагов cr in situ, комплексное определение факторов прогноза. Для решения этих вопросов в большинстве клиник нашей страны используют рутинную цистоскопию с гистологическим исследованием и ультразвуковое трансректальное (трансвагинальное) исследование, что, как правило, не позволяет выявить cr in situ, а опухолям Та и Т1 не дает достаточно полной количественной и прогностической характеристик, в ряде случаев не позволяет определить истинные границы опухолевого поражения Неадекватная оценка опухолевого поражения слизистой МП при использовании обычной цистоскопии в белом свете приводит к частым рецидивам после ТУР и продолженному росту опухоли ввиду нерадикально проведенного лечения, что, в свою очередь, ведет к прогрессированию опухолевого процесса

В последнее десятилетие, как в нашей стране, так и за рубежом широко изучались возможности применения экзогенных опухолетропных фотосенсибилизаторов для флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии злокачественных опухолей основных локализаций, в том числе при РМП [Чиссов В И , 2003,, Baert et al, 1993, Nseyo et al, 1999] В настоящее время наибольшие перспективы флуоресцентной диагностики в выявлении поверхностных опухолей МП связаны с применением 5-аминолевулиновой кислоты (5-AJIK) 5-AJIK является эндогенным соединением, одним из промежуточных продуктов синтеза гема Ее избыточное введение в организм (или в ткани отдельных органов) приводит к ингибированию последнего этапа синтеза гема и накоплению его предшественника - эндогенного протопорфирина IX (ПП1Х) [Penq, 1997] При внутрипузырном введении экзогенной 5-AJIK в клетках переходноклеточного РМП синтезируется в 10 раз большее количество эндогенного ПП1Х, чем в нормальной слизистой МП [Datta et al, 1998]. 5-AJIK не является флуоресцирующим соединением, в то время как ПП1Х интенсивно флуоресцирует в красной области спектра Результатом его индукции в опухолевых клетках является возможность выявления

очагов РМП по специфической флуоресценции ПП1Х Данный феномен составляет основу метода 5-AJIK- индуцированной фотодинамической диагностики (ФДД) РМП [Stepp et al, 1999]

Как показали зарубежные клинические исследования, чувствительность метода ФДД достигает более 90%, что намного превышает максимальную чувствительность рутинной

цистоскопии (до 50%) [Zaak et al, 2001] Однако высокая чувствительность метода сопровождается существенно более низкой специфичностью (50-65%), что снижает его диагностическую точность. Для повышения специфичности метода разрабатываются различные подходы Изучалось сочетание 5-AJ1K-индуцированных и аутофлуоресцентных изображений очагов РМП [Fnmberger et al, 2001] Для контроля 5-АЛК-индуцированной флуоресценции был использован спектрально-флуоресцентный анализ биоптатов ex vivo [Кудашев Б.В. 2001] Эффективным направлением повышения специфичности оказалась модификация 5-AJ1K в гексиловый эфир [Marti et al, 2003]

В МНИОИ им П А Герцена совместно с ИОФ РАН им А М Прохорова для повышения эффективности флуоресцентной диагностики злокачественных опухолей различных локализаций разрабатывается методологический подход, в котором применяется сочетание флуоресцентной визуализации с локальной флуоресцентной спектроскопией (ЛФС) in vivo [Чиссов В И и соавт, 2003] Эффективность данного подхода показана, в частности, в диагностике начального центрального рака легкого с препаратом аласенс (5-AJ1K) [Соколов В В и соавт , 2005].

Цель исследования

Повышение эффективности диагностики поверхностного рака мочевого пузыря с препаратом аласенс на различных этапах хирургического и комплексного лечения больных поверхностным РМП

Задачи исследования

1 Разработать метод комплексного флуоресцентного исследования слизистой мочевого пузыря с использованием препарата аласенс, включающий цистоскопию в белом свете, флуоресцентную

цистоскопию и локальную флуоресцентную спектроскопию (ЛФС), с целью первичной и уточняющей диагностики поверхностного РМП и его рецидивов на этапах хирургического и комплексного лечения

2 Исследовать методом ЛФС лазер-индуцированную аутофлуоресценцию нормальной слизистой оболочки и очагов РМП и оценить возможности аутофлуоресцентной диагностики (АФД) поверхностного РМП

3. Изучить методом ЛФС распределение 5-АЛК-индуцированного ПП1Х после внутрипузырного введения препарата аласенс и определить величины пороговых значений спектрально-флуоресцентных диагностических параметров, характеризующих нормальную слизистую, очаги воспаления и очаги поверхностного РМП, с учетом локальной интенсивности аутофлуоресценции

4 Оценить эффективность разработанного метода комплексного флуоресцентного исследования слизистой мочевого пузыря, включающего цистоскопию в белом свете, флуоресцентную цистоскопию и ЛФС, в первичной и уточняющей диагностике поверхностного РМП с определением его специфичности и чувствительности.

5 Разработать показания к проведению комплексной флуоресцентной цистоскопии с ЛФС у больных поверхностным РМП.

Научная новизна исследования

1 Впервые проведено исследование лазер-индуцированной аутофлуоресценции опухолевых очагов у больных поверхностным РМП при возбуждении в синей (442 нм) и зеленой (532 нм) областях спектра, показавшее резкое падение интенсивности аутофлуоресценции в опухолевом очаге, что вносит существенный вклад в раскрытие механизмов аутофлуоресцентной диагностики РМП и может быть использовано в развитии метода фотодинамической диагностики

2. Впервые для ФДД с препаратом аласенс очагов поверхностного РМП применен метод ЛФС, позволяющий объективизировать данные флуоресцентного цистоскопического исследования

3 Впервые для ФДД с препаратом аласенс очагов поверхностного РМП был использован алгоритм расчета спектрально-флуоресцентных диагностических параметров, учитывающий как локальную интенсивность аутофлуоресценции слизистой оболочки МП, так и интенсивность 5-АЛК-индуцированного ПП IX

4 Впервые изучена корреляция результатов ЛФС с данными морфологического исследования Определены пороговые значения спектрально-флуоресцентных диагностических параметров, характеризующих нормальную слизистую, очаги воспаления и очаги поверхностного РМП после внутрипузырного введения аласенса.

5 Разработан метод комплексного флуоресцентного исследования слизистой мочевого пузыря, включающий цистоскопию в белом свете, флуоресцентную цистоскопию с in vivo ЛФС, в первичной и уточняющей диагностике поверхностного РМП, а также ранних рецидивов поверхностного РМП Разработаны показания к применению данного метода диагностики у больных поверхностным РМП

Практическая значимость работы

Разработанный метод комплексного флуоресцентного исследования слизистой МП, включающий цистоскопию в белом свете, флуоресцентную цистоскопию с ЛФС после внутрипузырного введения отечественного препарата аласенс, позволил увеличить эффективность первичной и уточняющей диагностики поверхностного РМП, а также ранних рецидивов поверхностного РМП на различных этапах хирургического и комплексного лечения

Выявлена корреляция результатов ЛФС с данными морфологического исследования Определены пороговые значения спектрально-флуоресцентных диагностических параметров, характеризующих нормальную слизистую мочевого пузыря, очаги воспаления слизистой и очаги поверхностного РМП

Проведенные исследования показали, что количественная оценка флуоресценции по разработанному алгоритму с учетом локальной интенсивности аутофлуоресценции уротелия повышает специфичность ФДД поверхностного РМП с препаратом аласенс

Мониторинг величины спектрально-флуоресцентного диагностического параметра в очагах визуальной 5-AJIK-индуцированной флуоресценции объективизирует данные флуоресцентной цистоскопии и повышает эффективность флуоресцентного диагностического исследования, что позволяет минимизировать число ложно-положительных результатов и уменьшить количество необходимых биопсий.

Положения, выносимые на защиту

1 Применение метода ЛФС в очагах визуальной флуоресценции ПП1Х после внутрипузырного введения препарата аласенс у больных поверхностным РМП позволило объективизировать результаты флуоресцентной цистоскопии и получить количественную оценку флуоресценции слизистой оболочки МП.

2. Разработанный метод комплексного флуоресцентного исследования слизистой мочевого пузыря, включающий цистоскопию в белом свете, флуоресцентную цистоскопию с in vivo локальной флуоресцентной спектроскопией после внутрипузырного введения отечественного препарата аласенс, позволил повысить специфичность флуоресцентной цистоскопии в первичной и уточняющей диагностике поверхностного РМП, а также его ранних рецидивов 3 Выявленные в результате исследования резкие различия в интенсивности лазер-индуцированной аутофлуоресценции между нормальной слизистой оболочкой МП и очагами поверхностного РМП (р<0,001) позволили получить дополнительную диагностическую информацию при количественной оценке локальной интенсивности флуоресценции слизистой оболочки МП при ФДД с препаратом аласенс

4. Изучение корреляции данных ЛФС с данными

морфологического исследования биоптатов выявило уровни

пороговых значений спектрально-флуоресцентных

диагностических параметров, характерных для флуоресценции неизмененной слизистой оболочки МП, очагов воспаления и очагов поверхностного РМП после внутрипузырного введения препарата аласенс, что позволило повысить эффективность дифференциальной диагностики опухолевых и неопухолевых изменений слизистой оболочки МП

Реализация результатов исследования

По теме предлагаемого научного исследования опубликовано 10 научных работ

Результаты диссертационной работы включены в программу преподавания онкоурологии на кафедре онкологии ФППО им И М Сеченова, внедрены в клиническую практику отделения урологии клинического госпиталя ГУВД г Москвы.

Апробация работы

Основные материалы диссертации представлены на Российских и международных конференциях 5-м Всероссийском съезде онкологов (Высокие технологии в онкологии) (Казань, 2000), Международной научной конференции «Современные методы фотодинамической (флуоресцентной) диагностики и фотодинамической терапии» (Обнинск, 2001), на съезде онкологов (Минск, 2004), на 11 Международном Конгрессе Ассоциации фотодинамической терапии (Шанхай, 2007), на международной конференции по применению лазеров (1СО]\Ю/ЬАТ 2007 , Минск, 2007), на международной конференции «Биофотоника 2007» (Нижний Новгород, 2007), на международном конгрессе по онкохирургии - устный и постерный доклад (Краснодар, 2008), на конференции по флуоресцентной диагностике и фотодинамической терапии (Москва, 2008).

Объем диссертации

Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста Состоит из введения, 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций Список литературы содержит 80 научных источников, из них 16 -

российский авторов и 64 - иностранных. Диссертация иллюстрирована 10 таблицами, 23 рисунками

Содержание диссертационного исследования

Материалы и методы исследования

Распределение злокачественных опухолей мочевого пузыря по стадиям проведено согласно международной классификации злокачественных опухолей по системе Т N М 2002г В исследование включены 198 больных поверхностным РМП. Исследуемая группа больных представлена преимущественно пациентами мужского пола в соотношении 3,8 1, а также пациентами в возрасте старше 60 лет 53,0±3,5% и пациентами до 40 лет 13,0±2,4% В исследуемую группу включены 67 больных первичным поверхностным РМП и 131 больной с рецидивом поверхностного РМП после ранее проведенного противоопухолевого лечения. Большее число пациентов в группе рецидивных опухолей представлено после трансуретральной резекции мочевого пузыря

В исследуемой группе больных пациенты с первичной cr in situ (стадия Tis), составляли 3,5±1,3%, пациенты с РМП с инвазией субэпителиальной соединительной ткани слизистой оболочки мочевого пузыря (символ Т1) - 66,7±3,4% Высокая степень дифференцировки опухоли (G1) выявлена у большего числа больных - 54,5±3,5%, низкая степень дифференцировки - у 7,6±1,9% У 79 (39,9%) больных была диагностирована унифокальная опухоль, при этом из них у 37(46,8%) больных первичным РМП и у 42(53,2%) рецидивным РМП, у 119 (60,1%) множественные опухоли, причем у 30(25,2%) пациентов первичным РМП и 89(74,8%) рецидивным РМП

С учетом представленных данных по степени агрессивности опухоли, можно сделать вывод, что в исследуемую группу вошли преимущественно больные, имеющие умеренный 54(27,3±3,2 %) и высокий 102(51,5±3,6%) риск развития рецидива опухоли МП, что требует проведения тщательного исследования состояния слизистой оболочки МП до лечения и в мониторинге за пациентами

Для проведения ФДД использовался препарат аласенс, представляющий собой порошок для приготовления раствора по 0,5 и 1,5г во флаконах для внутрипузырных инстилляций (ГНЦ РФ «НИОПИК», Москва) Для внутрипузырного введения готовили стерильный 3% раствора аласенса Флуоресцентное исследование проводили через 2-3 часа после инстилляции аласенса

Для флуоресцентной цистоскопии была использована аппаратура производства «Карл Шторц GmbH» (Tuttingem, Germany) Источником возбуждения является ксеноновая лампа, оснащенная фильтрами с характеристиками пропускания (380-460 нм) соответствующими максимуму возбуждения флюоресценции ПП1Х в синей области спектра

Для проведения ЛФС применялась компьютеризованная спектрально-флуоресцентная диагностическая установка «Спектр-Кластер» (ООО «Кластер», ИОФ РАН, Москва) (Чиссов В И и соавт 2001) Для возбуждения флуоресценции использовали две длины лазерного излучения А.ех=442 нм (He-Cd лазер) и Хех= 532 нм (твердотельный DPPS лазер), при которых возбуждается как аутофлуоресценция (АФ), так и флуоресценция ПП1Х. Спектры флуоресценции регистрировали в диапазоне 460 - 900 нм при возбуждении с длиной волны 442 нм, и в диапазоне 550 - 900 нм при возбуждении с длиной волны 532 нм Для доставки возбуждающего лазерного излучения к поверхности уротелия и регистрируемого излучения флуоресценции - к фотоприемнику использовали совместимый со стандартными эндоскопами Y-образный кольцевой волоконно-оптический катетер.

Анализ данных ЛФС проводили по следующему алгоритму В качестве диагностического параметра использовали относительный спектрально-флуоресцентный параметр Df При Хех=442 нм его величину рассчитывали как отношение интегральной интенсивности спектра в области 620-650 нм (максимум флуоресценции ПП1Х) к интегральной интенсивности в области 480-520 нм (максимум аутофлуоресценции). При Х,ех=532 нм величину Df определяли как отношение интегральной интенсивности в области 620-650 нм к интегральной интенсивности АФ в области 555-585 нм Отношение величин диагностических параметров, характеризующих различные типы

ткани, например, Df(paK)/Df(HopMa), оценивали как флуоресцентный контраст (Кф) очагов рака на фоне нормальной слизистой оболочки

Методика проведения флуоресцентного исследования состояла в следующем. На первом этапе проводили рутинное цистоскопическое исследование в белом свете Оценивали состояние уротелия, выявляли наличие патологических участков и подозрительных на рак очагов На втором этапе источник освещения переключали на синий свет и проводили флуоресцентную визуализацию уротелия, ведя поиск очагов красной флуоресценции 5-АЛК-индуцированного ПП1Х На третьем этапе исследования в очагах красной флуоресценции, выявленных при панорамном обследовании, проводили измерения спектров при контакте торца диагностического катетера и поверхности МП. Спектры измеряли в центре флуоресцирующих участков, по их периферии, на расстоянии 1 см от видимой границы зоны красной флуоресценции, а также в участках визуально неизмененного уротелия В зависимости от размеров флуоресцирующих зон и их количества при каждом обследовании записывалось в среднем 25-30 спектров Биопсия проводилась из всех очагов красной флуоресценции

После внутрипузырного введения аласенса было измерено 528 спектров флуоресценции, из них в точках нормального слизистой оболочки МП - 178 спектров, в очагах воспаления слизистой оболочки - 92 спектра, в очагах cr in situ и тяжелой дисплазии - 42 спектра, в очагах переходно-клеточного РМП - 216 спектров Без введения аласенса было измерено 355 спектров аутофлуоресценции, в том числе в участках неизмененной слизистой - 156 спектров, в очагах воспаления- 28 спектров, в очагах тяжелой дисплазии - 7 спектров, в очагах РМП - 89 спектров 75 спектра было измерено в подозрительных на рак участках

На следующем этапе исследовали корреляцию данных ЛФС и результатами морфологического исследования биоптатов На основании полученных зависимостей определялись пороговые значения параметра Df, характеризующие (I) нормальный

уротелий, (II) очаги воспаления, начальную и умеренную дисплазию, (III) тяжелую дисплазию и рак

Кроме цистоскопических исследований всем больным проводились клинико-лабораторные исследования с целью установления стадии опухолевого процесса, функционального состояния органов и систем

Результаты исследования лазер-индуцированной аутофлуоресценции

При возбуждении в синей и зеленой области спектра нормальный уротелий интенсивно флуоресцирует, регистрируемые спектры АФ имеют максимумы в районе 500 -520 нм 442 нм при и 580-600 нм при Хех= 442 нм При измерениях in vivo интенсивность регистрируемого спектра может существенно зависеть от геометрии измерений, от расстояния и угла между поверхностью уротелия и торцом волоконно-оптического катетера Для минимизации зависимости интенсивности флуоресцентного сигнала от геометрии измерений все измерения проводили в контакте, при максимально перпендикулярном расположении катетера относительно поверхности уротелия. Ошибка локальных измерений интенсивности АФ в пределах участка уротелия площадью порядка 1 см2 составляла в среднем 10 %. Интенсивность АФ также зависит от локальной концентрации в ткани нефлуоресцирующих эндогенных флуорохромов, которые поглощают возбуждающее и флуоресцирующее излучение В целом, разброс интенсивности АФ при измерениях в различных точках нормального уротелия достигал 50-100% (рис 1) В очагах метаплазии, фолликулярного цистита, воспаления интенсивность АФ была сравнима с интенсивностью флуоресценции нормального уротелия

Рис 1 Спектры аутофчуоресценции, измеренные in vivo в различных точках при сканировании возбуждающего чазерного изучения (532 нм) вдоль поверхности нормального уротелия и очага ПКР МП

Напротив, как показали результаты исследований, в 82 % очагов ПКР МП регистрировалось резкое (от 5 до 20 раз) падение интенсивности АФ в спектральном диапазоне 450-800 нм (р<0,0001) (рис 1) Достоверное уменьшение интенсивности АФ наблюдалось также в очагах тяжелой дисплазии

В данном исследовании эффект падения интенсивности АФ в очагах ПКР МП наблюдался при более длинноволновом лазерном возбуждении видимого диапазона спектра, которое проникает в биологические ткани на большую глубину, чем УФ излучение, но поглощается ограниченным количеством эндогенных

флуорофоров Так, при Хсх= 442 нм флуоресцируют флавины и ФАД, фосфолипиды, и возможно, некоторые формы коллагена Можно предположить, что при данном возбуждении утолщение уротелия в месте развития неоплазии может приводить к ослаблению флуоресценции коллагена, которая излучается из подлежащих слоев стенки МП Однако, данный механизм не может быть реализован при 532 нм, поскольку излучение в зеленой области спектра практически не поглощается коллагеном. При А.ех= 532 нм происходит возбуждение флуоресценции флавинов и порфиринов, однако, в спектрах АФ, представленных на рис 1-3, отсутствуют характерные полосы флуоресценции эндогенных порфиринов в красной области. Это позволяет предположить, во-первых, что при Хех= 532 нм основной вклад в регистрируемый спектр АФ вносит флуоресценция эндогенных флавинов и, во-вторых, что падение интенсивности АФ в очагах РМП непосредственно связано с уменьшением концентрации эндогенных флавинов в неоплазированных клетках уротелия Подтверждением этого предположения являются результаты работы Anidjar и соавт (1996), в которой было показано, что лазер-индуцированная интенсивность АФ уротелиальных клеток in vitro при Хсх= 488 нм была на порядок выше интенсивности АФ клеток переходноклеточного рака (плохо, умеренно и хорошо дифференцированных), при этом формы спектров АФ последних были идентичны по форме спектрам флуоресценции флавинов. Авторы сделали вывод о значительном уменьшении концентрации эндогенных флавинов что в злокачественных клетках уротелия

Помимо оценки интенсивности АФ, в работе также проводился мониторинг спектрально-флуоресцентного параметра Df_ Было показано, в спектрах лазер-индуцированной АФ нормальной слизистой МП его величина составляет Df = 0 3 ± 0 1 при Хех = 442 нм и Df= 1 0 ± 0 2 при Х,ех = 532 нм При ^ех = 442 нм достоверных различий в величинах Df между нормальным и неоплазированным уротелием не было выявлено, спектры АФ нормальной слизистой и очагов ПКР были идентичны по форме (рис 2),. При Хех = 532 нм у 7 пациентов в спектрах АФ очагов РМП с экзофитной формой роста регистрировалось достоверное возрастание диагностического параметра Df (р<0,05) Как показано на рис 3, в спектре АФ экзофитной опухоли возрастает фоновая интенсивность в красном и ближнем ПК области спектра (580 -715 нм), что отражается на изменении величины Df

Поскольку лазерное излучение с Хех — 532 попадает в полосу поглощения порфиринов и эффективно возбуждает их флуоресценцию, можно предположить, что возрастание фоновой аутофлуоресценции в красной области спектра отражает стадию начала процесса формирования сосудистой системы и связанного с этим повышением количества предшественников гема в очагах неоплазии

Рис 2 Спектры А Ф нор мольного уротелия и ПКР МП, измеренные при возбуждении 442 нм и нормированные на интенсивность АФ в максимуме спектра на 520 нм Морфо югически

высокодифференцированный ПКР МП

н

~ то-

— нормальный уротелии ---экзофитная опухоль (х22 5)

Рис 3 Спектры АФ нормального уротелия и ПКР МП, измеренные при возбуждении 532 ни и нормированные на интенсивности АФ в максимуме спектра на 580 нм Морфоюгически -

высокодиффиринцированный ПКР с очагами микроинвазии в подслизистую основу Визуально -стелящееся образование высотой до 3 мм

3 зооо-

S.

О

500

550 600 650 700 750 800

длина волны, нм

Изучение эффективности комплексного метода флуоресцентной цистоскопии и локальной флуоресцентной спектроскопии в диагностике поверхностного РМП

Через 2-3 часа после инсталляции аласенса в очагах воспаления, дисплазии и рака происходила индукция ПП IX, о чем свидетельствовало появление на фоне зеленой АФ нормального уротелия очаговой красной флуоресценции аласенс-индуцированного ПП1Х Можно видеть, что флуоресцентная визуализация очагов поверхностного РМП варьирует в цветовом восприятии от желтой до красной, ее интенсивность субъективно можно описать в различных оттенках от «слабой» до «сильной»

Распределение индуцированного ПП1Х по поверхности патологических очагов являлось неоднородным, что отражалось в диффузном характере распределения интенсивности индуцированной красной флуоресценции и подтверждалось как при анализе изображений, так и по данным ЛФС.

Проведение количественных измерений методом ЛФС показало, что в нормальном уротелии величина диагностического параметра практически остается на уровне, характерном для АФ Ог (норма) = 0 4 ± 0 1 ( 442 нм) и (норма) = 1 3 ± 0 4 (532 нм). Это согласуется с результатами других авторов о том, что при инстилляции 5-АЛК протопорфирин IX практически не индуцируется в нормальной слизистой оболочке МП [2аак е! а1, 2001] Наибольшие значения величины регистрировались в спектрах, измеренных в морфологически подтвержденных очагах РМП (рис 4,5) Флуоресцентный контраст Кф очагов РМП

относительно нормального уротелия был максимален при А.ех=408 нм, его величина варьировала от 10 до 35 (в среднем около 15) При Хех=532 нм флуоресцентный контраст Кф варьировал от 2 до 20 (в среднем около 6)

Измерения спектров в очагах неспецифической визуальной флуоресценции (воспаление, умеренная дисплазия, переходно-клеточные папилломы) показали значительно меньший флуоресцентный контраст Кф этих очагов относительно нормального уротелия (Кф<4 при iex= 408 нм и Кф<2 при Хех=532 нм)

Необходимо подчеркнуть, что используемый в исследовании алгоритм расчета диагностических параметров включал, помимо интенсивности флуоресценции аласенс-индуцированного ПП1Х, локальную интенсивность АФ Поэтому величина флуоресцентного контраст Кф отражает не только аласенс-индуцированный контраст, который наблюдается визуально, но и эндогенный аутофлуоресцентный контраст, который не визуализируется в ходе флуоресцентной цистоскопии, но регистрируется при измерении спектров флуоресценции в широком спектральном диапазоне (рис 4,5) Таким образом, учитывались оба феномена падение интенсивности АФ в очаге поверхностного РМП и избирательное накопление ПП1Х в клетках уротелиальных карцином Это позволило выявить в ходе исследования 53 скрытых очага, которые визуализировались по слабой красноватой флуоресценции, но локально в этих зонах регистрировались большие значения величины Df Морфологически в этих очагах была подтверждена тяжелая дисплазии (3%), cr in situ (95%) и ПКР (2%).

Рис 4 In vivo спектры фпуоресценции нормального уротелия и CIS МП В спектре нор мольного уротечия доминирует АФ (XMCa=510 нм), Df(„op„a)=0 4 В спектре, из меренно и в очаге неоплазии, доминирует флуоресценция ПГ11Х (Хшо.=635 нм, 705 нм), интенсивность АФ крайне низка, D/(pah)=l5 6

длина волны нм

PPIX (635 нм)

опухоль (0=5) норма (Df=1 0}

Рис 5 ln vivo спектры флуоресценгцш нормального уротечия и РМП В спектре нормального уротечия

доминирует АФ (Х^-590 нм), Df (шр«а>=10 В спектре, измеренном в очаге рака, доминирует флуоресценция ПП1Х(Хшх=635 нм, 705 нм), Df (рак)= 5 О

длина волны, нм

Помимо оценки величины флуоресцентного контраста, в работе была изучена корреляция данных ЛФС и результатов морфологического анализа биоптатов На рис 6 и 7 представлены результаты распределения величин диагностического параметра Ог в зависимости от патологического состояния слизистой оболочки МП Как показывает анализ распределения величины параметра Эг, можно выделить три условных зоны участок нормальной слизистой оболочки МП, участок воспалительного изменения слизистой оболочки МП, очаг поверхностного РМП, включающий

проявления тяжелой дисплазии эпителия слизистой оболочки МП и сг т С1Ш

■ нормальный уротелей

• ПКР

А ПКР (2 я опухоль)

▼ очаги воспаления

♦ ТД и CIS

Ь {П 1

_ D^ 3 5

i-7 ^Т Г*

порядковый номер пациента

Рис 6 Распределение величины диагностического параметра £>/ в соответствии с данными морфологического анализа при лех=532 им

■ нормальный уротелии

• папиллома

▲ ПКР

▼ ПКР (2 я опухоль)

♦ Тяжелая дисплазия

ч воспаление

--Ь-5-i-I4T1 maxD

...¿■«.■i...:■•>.1.1

Рис 7 Распредечение диагностического параметра й/ в соответствии с данными морфо югического анализа при Хех=442 нм

порядковый номер пациента

На основании полученных данных были проведены оценки максимальных пороговых значений спектрально-флуоресцентного параметра характеризующих (1) нормальный уротелий, (2)

очаги воспаления, гиперемии, умеренную дисплазию, и минимальных пороговых значений параметра характеризующих (3) морфологически подтвержденные очаги тяжелой дисплазии и ПКР

Пороговые значения величины Бг _ характеризующие указанные выше типы тканей при обеих длинах волн возбуждения, суммированы в таблице 1.

Таблица 1

Пороговые значения величины спектрально-флуоресцентного диагностического параметра О/ для нормальной слизистой и опухоли мочевого пузыря

Длина волны возбуждения опухоль Воспалительно-измененная слизистая нормальная слизистая

532 нм >4 <2,5 1,3 ±0,4

442 нм >3,5 <2 0,4 ±0,1

Указанные пороговые значения спектрально-флуоресцентного диагностического параметра были выбраны в качестве характеристических для каждой из трех условных категорий (норма, воспаление, очаги поверхностного РМП, включая тяжелую дисплазию) и полученные результаты флуоресцентной цистоскопии были проанализированы с помощью следующих критериев. Если в процессе флуоресцентной визуализации выявлялись очаги флуоресценции, в которых величина соответствовала «опухолевым» значениям, но морфологически в этих очагах не подтверждался рак, то такие результаты рассматривались как ложно-положительные (ЛП) Если в очаге морфологически подтвержденного ПКР визуализировалась красная флуоресценция ПП1Х, но величина была ниже минимальной пороговой величины (опухоль), то такие очаги

квалифицировались как ложно-отрицательные (ЛО) с точки зрения ЛФС, но как истинно-положительные с точки зрения флуоресцентной визуализации

На основании разработанных критериев было подсчитано количество истинно-положительных (ИП), истинно-отрицательных (ИО), ложно-отрицательных (ЛО), ложно-положительных результатов (ЛП), оценена предсказательная ценность положительного результата флуоресцентной цистоскопии (ПЦПР), специфичность (СП) и чувствительность (ЧВ) комплексного метода, а также общая точность метода (ОТМ) (см табл 2).

Применение ЛФС в зонах визуальной красной флуоресценции и объективизация данных флуоресцентной цистоскопии с учетом аутофлуоресцентного и аласенс - индуцированного контраста, повышает положительную прогностическую величину ФДД с 0,67 до 0,94, специфичность ФДД с 70 до 85 % (р < 0,05), при этом общая точность метода возрастает с 80 до 86%, а предсказательная ценность положительного результата флуоресцентной цистоскопии возрастает с 0, 67 до 0,94

Таблица 2

Оценка эффективности комплексного флуоресцентного исследования в диагностике очагов поверхностного РМП

Метод исследования ИП ИО ЛО ЛП СП ЧВ пцп р ОТ м

Флуоресцентная цистоскопия 36 44 2 18 70% 97% 0,67 80%

Флуоресцентная цистоскопия с ЛФС m vivo 31 17 5 3 85% 94% 0 94 86%

Таким образом, ЛФС является малоинвазивным чувствительным методом, позволяющим получать объективную диагностическую информацию из спектров флуоресценции слизистой оболочки МП при возбуждении в видимой области спектра Применение ЛФС в очагах визуальной красной флуоресценции 5-АЛК-индуцированного ПП1Х позволяет выполнять прицельные (адресные) биопсии, снизить число диагностических ошибок, достоверно оценить площадь опухолевого поражения слизистой оболочки МП, преимущественно

в участках слизистой оболочки в зонах формирующегося и/или сформированного рубца стенки МП после проведенного хирургического лечения у больных поверхностным РМП

Проведенные исследования позволяют разработать следующие показания для проведения комплексного диагностического исследования у больных поверхностным РМП 1. Выявление небольших по размерам, стелящихся образований слизистой оболочки МП

2 Дифференциальная диагностика между воспалительными и диспластическими изменениями слизистой оболочки МП и поверхностным РМП

3 Определение площади опухолевого поражения слизистой оболочки МП

4 Поиск опухоли слизистой МП при отрицательных данных рутинной цистоскопии, но при положительных результатах цитологии мочи и/или исследования опухолевых маркеров.

5 Исследование слизистой оболочки МП при наличии рецидивной опухоли МП

6 Мониторинг за состоянием слизистой оболочки МП у больных поверхностным РМП с умеренным и высоким риском развития рецидива опухоли после проведенного хирургического и комплексного лечения

Противопоказанием к проведению комплексного диагностического исследования является повышенная фоточувствительность кожных покровов и слизистых оболочек больного, отмеченная ранее и/или выявленная в настоящее время при проведении исследования, и/или лечении различного рода препаратами, оказывающими фототоксический эффект.

Выводы

1 Разработан комплексный метод флуоресцентного исследования слизистой мочевого пузыря у больных поверхностным раком мочевого пузыря с использованием препарата аласенс, включающий цистоскопию в белом свете, флуоресцентную цистоскопию и локальную флуоресцентную спектроскопию

2 Выявлены резкие различия в интенсивности лазер-индуцированной аутофлуоресценции между участками

нормальной слизистой оболочки и участками поверхностного рака мочевого пузыря (р<0,001) При возбуждении в синей и зеленой областях спектра в 82 % случаев очагов переходноклеточного рака мочевого пузыря имеет место резкое (от 5 до 20 раз) падение интенсивности аутофлуоресценции в спектральном диапазоне 450-800 нм

3 Через 2 часа после внутрипузырного введения раствора аласенса при флуоресцентной цистоскопии в очагах воспаления, дисплазии и очагов рака регистрируется 5-АЛК-индуцированная флуоресценция протопорфирина IX различной степени интенсивности Величина индуцированного флуоресцентного контраста между очагами воспаления, рака и нормальной слизистой оболочкой мочевого пузыря значительно варьирует, что отражает очаговый характер распределения индуцированной флуоресценции протопорфирина IX

4 Пороговые значения величины спектрально-флуоресцентного диагностического параметра (Б^ для нормальной слизистой оболочки норш <0,4 ± 0,1 при использовании длины волны лазерного излучения 442нм и 05 норма <13 ± 0,4 при использовании длины волны лазерного излучения 532нм), для очагов воспаления и начальной дисплазии (Бг < 2 при 442 нм и Эг <2,5 при 532нм ), для очагов тяжелой дисплазии и рака (О¡патология >3 5 при 442нм и ОГпат0Л0ГИЯ >4 при 532нм) (р <0,01)

5 Применение в ходе флуоресцентной цистоскопии малоинвазивного метода ЛФС позволяет получить количественную оценку лазер-индуцированной флуоресценции слизистой оболочки мочевого пузыря и, таким образом, объективизировать данные флуоресцентного исследовании Количественная оценка флуоресценции по разработанному алгоритму с учетом локальной интенсивности лазер-индуцированной аутофлуоресценции слизистой оболочки мочевого пузыря повышает специфичность флуоресцентной диагностики поверхностного РМП с препаратом аласенс с 70 до 85% (р < 0,05)

6 Показаниями к проведению комплексного метода флуоресцентного исследования с использованием препарата аласенс и локальной флуоресцентной спектроскопии у больных

поверхностным раком мочевого пузыря являются выявление небольших по размерам, стелящихся образований слизистой оболочки мочевого пузыря, дифференциальная диагностика между воспалительными, диспластическими изменениями слизистой оболочки и поверхностным раком мочевого пузыря, определение площади опухолевого поражения слизистой оболочки мочевого пузыря и мониторинг за состоянием слизистой оболочки у больных с умеренным и высоким риском развития рецидива опухоли после проведенного хирургического и комплексного лечения

7 Разработанный комплексный метод флуоресцентного исследования слизистой оболочки мочевого пузыря и мониторинг спектрально-флуоресцентных параметров в очагах визуальной флуоресценции позволяет минимизировать число ложно-положительных результатов флуоресценции и выполнять прицельную биопсию измененных участков слизистой оболочки с высокими значениями величины спектрально-флуоресцентного диагностического параметра (Ог)

Практические рекомендации

1 Выявленная корреляция результатов локальной флуоресцентной спектроскопии с данными морфологического исследования позволяет проводить адресную (прицельную) биопсию участков измененной слизистой мочевого пузыря, четко определить предполагаемый объем резецируемых тканей

2 Хорошая переносимость внутрипузырно вводимого препарата аласенс, минимальное число осложнений после исследования позволяет использовать разработанный комплексный метод флуоресцентного исследования у больных с сопутствующими воспалительными изменениями слизистой оболочки мочевого пузыря

3. Наиболее адекватной и эффективной для диагностики является внутрипузырная экспозиция препарата аласенс 2 часа, при этом рекомендуется соблюдение определенного питьевого режима до введения и после введения препарата, изменение положения тела для равномерного распределения препарата по всей поверхности слизистой оболочки мочевого пузыря

4 В целях предупреждения обострения урогенитальных инфекций после проведения флуоресцентного исследования необходим тщательный сбор анамнеза на наличие острого или хронического цистита, простатита, уретрита При наличии данной патологии в анамнезе показано тщательное дообследование больных с определением флоры в моче и слизистой оболочке мочеполовой системы, с последующим выявлением чувствительности к антибактериальной терапии

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Русаков И Г ,Соколов В В , Теплов А А , Ульянов Р.В. и др Применение методов фотодинамической диагностики и терапии в онкоурологии Материалы 5го Всероссийского съезда онкологов (Высокие технологии в онкологии), Казань 2000

2 Соколов В В , Теплов А А , Филоненко Е В , Ульянов Р.В., Жаркова Н Н Флуоресцентная цистоскопия и локальная спектрофотометрия в диагностике рака мочевого пузыря Международная научная конференция «Современные методы фотодинамической (флуоресцентной) диагностики и фотодинамической терапии», Обнинск 13-15 июня 2001.

3 Соколов В В , Русаков И Г , Теплов А А , Ульянов Р.В., Жаркова Н Н , Филоненко Е В , Быстрое А А Фотодинамическая диагностика и терапия рака мочевого пузыря Съезд онкологов, Минск 2004.

4 V V Sokolov , Е V Filonenko, L V Telegina, D G Sukhin, А В Marmarova, R.V. Ulianov, VV Chissov, NN Bulgakova Local Fluorescence Spectroscopy for cancer detection 15 years clinical experience Ilth World Congress of the International Photodynamic Association (IPA-2007), Abstract book, p Changhai, China, March 28-31, p 103 (2007)

5 V V Sokolov , E V Filonenko, L.V Telegina, D G Sukxin, А В Marmarova, R.V. Ulianov, V V Chissov, N N Bulgakova, V V Smirnov, V I Fabelinsky Local Fluorescence Spectroscopy for cancer detection 15 years joint efforts of oncologists and physicists (ICONO/LAT 2007, Abstract on CD, Minsk 2007)

6 V V Sokolov , N N Bulgakova, E V Filonenko, L V Telegina, DG Sukhin, А В Marmaroval), R.V. Ulianov, A A Gladyshev,

V.V Chissov Fluorescence imaging and spectroscopy for cancer detection, Proceedings of International Symposium Topical Problems of Biophotonics-2007, Nizhny Novgorod, 4-11 August, 2007, p 7778

7 Соколов В В , Русаков И Г, Булгакова Н Н , Ульянов Р.В., Теплов А А Флуоресцентные методы в диагностике поверхностного рака мочевого пузыря Сибирский Онкологический журнал, 2007, выпуск 4,, стр 12-33

8 Чиссов В И, Соколов ВВ, Булгакова НН, Ульянов Р.В., Теплов А.А , Русаков И Г Исследование лазер-индуцированной аутофлуоресценции нормального и неоплазированногго уротелия m vivo. Российский онкологический журнал, 2007, №6, стр 18-24.

9 Русаков ИГ, Соколов ВВ, Булгакова НН, Ульянов Р.В., Теплов А А , Чиссов В.И. Флуоресцентная визуализация и in vivo флуоресцентная спектроскопия в диагностике поверхностного рака мочевого пузыря Труды III Троицкой конференции «Медицинская физика и инновации в медицине» Альманах клинической медицины, 2008, Том XVII, часть 1, стр 88-91.

10 Русаков ИГ, Соколов В.В., Булгакова НН, Ульянов Р.В., Теплов А А Флуоресцентные методы диагностики и поверхностный рак мочевого пузыря современное состояние проблемы. Урология, 2008, № 3, стр 67-71

Заказ № 155/09/08 Подписано в печать 17 09 2008 Тираж 100 зкз Уел пл 1,5

- ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 [ / \vrnv с/г ги, е-тай т/о@с/г ги