Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фитохимическое изучение бутонов гвоздики и плодов кардамона и их стандартизация

На правах рукописи

ТАРРАБ ИСМАИЛ

ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ БУТОНОВ ГВОЗДИКИ И ПЛОДОВ КАРДАМОНА И ИХ СТАНДАРТИЗАЦИЯ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

3 О ОКТ 2014

005553877

Москва-2014

005553877

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет им.И.М.Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

кандидат фармацевтических наук, доцент Евдокимова Ольга Владимировна Официальные оппоненты:

Лякина Марина Николаевна - доктор фармацевтических наук, заместитель начальника управления экспертизы № 3 готовых лекарственных средств ФГБУ «НЦ ЭСМП» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Чаузова Александра Викторовна - кандидат фармацевтических наук, старший преподаватель кафедры организации фармацевтической деятельности фармацевтического факультета ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Самарский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «08» декабря 2014 г. в 14.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 006.070.01 при Государственном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений» (117216, г. Москва, ул. Грина, 7) по адресу: 123056, г. Москва, ул. Красина,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ГНУ ВИЛАР Россельхозакадемии www.vilarnii.ru

Автореферат разослан « » / О 2014 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

Д.2

доктор фармацевтических наук

Громакова А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Лекарственные средства растительного происхождения занимают важное место среди препаратов, применяющихся при различных заболеваниях человека. Актуальность использования таких препаратов значительно возросла в последние десятилетия, особенно в связи с ростом токсико-аллергических заболеваний, связанных с лечением синтетическими препаратами. Препараты из лекарственного растительного сырья наиболее полно отвечают современным медико-биологическим требованиям, т.к. обладают высокой эффективностью, хорошей переносимостью в терапевтических дозах, большим диапазоном лечебных свойств, что позволяет использовать их для всех возрастных групп в качестве средства для этиопатогенного, симптоматического и профилактического лечения. Однако потребность населения в препаратах природного происхождения удовлетворяется не полностью, в частности, это происходит из-за дефицита лекарственного растительного сырья (ЛРС).

Для расширения номенклатуры российского официнального ЛРС оправдано (Орловская Т.В., 2011; Смирнова Ю.А., 2009) изучать и использовать пищевые растения (в основном, пряно-ароматические), лечебное действие которых в настоящее время подтверждено. Следует отметить, что многие из них, такие как бадьян настоящий (плоды), гвоздичное дерево (бутоны), имбирь лекарственный (корневище), кардамон настоящий (семена), коричник ароматный и к. цейлонский (кора), крокус посевной (рыльца), кунжут индийский (масло из семян), куркума длинная (корневище), пажитник сенной (семена), уже давно применяются в научной медицине многих стран и входят в их Фармакопеи (Европейская, США, Британская, Китайская, Японская и др.), что делает их приоритетными для включения в Российскую фармакопею.

На основании вышеизложенного, актуальным остается вопрос фитохимического изучения пищевых растений как возможных источников биологически активных веществ для дальнейшего внедрения в фармацевтическую практику. Интересными для изучения являются такие растения, как гвоздичное дерево и кардамон настоящий, которые не только широко используются в качестве пищевых растений (пряностей) в различных странах, в том числе и в России, но и являются источником ЛРС в Европе, США, Японии и Китае для получения лекарственных препаратов, некоторые из которых поступают на российский фармацевтический рынок (Доп-пельгерц® Энерготоник, Доппельгерц® Мелисса, Клостерфрау Мелисана®, Бальзам «Золотая звезда», Кармолис® капли, Оригинальный большой бальзам Биттнера , Содекор, Пародонто-цид® и др.). На основе пряно-ароматического сырья создан целый ряд эффективных препаратов и в России, однако из-за отсутствия соответствующих нормативных документов они не используются в достаточной мере. Внедрение новых источников ЛРС, позволит расширить ассортимент российских лекарственных растительных препаратов (ЛРП).

Цель и задачи исследования. Целью исследований является фитохимическое и морфо-лого-анатомическсе изучение сырья гвоздичного дерева и кардамона настоящего и разработка методов их стандартизации.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. изучить химический состав сырья гвоздичного дерева и кардамона настоящего;

2. разработать методики качественного и количественного определения биологически активных веществ в сырье гвоздичного дерева и кардамона настоящего;

3. разработать характеристики подлинности и показатели качества сырья «Гвоздики бутоны» и «Кардамона плоды»;

4. разработать проекты фармакопейных статей.

Научная новизна. Физико-химическими методами охарактеризован качественный состав биологически активных веществ (БАВ) бутонов гвоздики и плодов кардамона. Установлены компоненты эфирного масла изучаемых объектов, в бутонах гвоздики впервые установлено наличие линалоола. Впервые в бутонах гвоздики идентифицированы миристиновая, олеиновая, линолевая и у-линоленовая кислоты, а в плодах кардамона - пальмитиновая, олеиновая, лино-левая, а- и у-линоленовая кислоты. Установлено наличие в бутонах гвоздики свободных Сахаров (фруктоза, рамноза) и органических кислот (щавелевая, фумаровая, янтарная); в семенах

кардамона обнаружены свободные сахара (лактоза, глюкоза, фруктоза, рамноза) и органические кислоты (щавелевая, лимонная, янтарная, фумаровая), а в коробочках плодов кардамона - свободные сахара (лактоза, глюкоза, фруктоза, рамноза) и органические кислоты (щавелевая, лимонная, фумаровая).

Показана возможность применения физико-химических методов анализа для определения подлинности (ТСХ) изучаемых объектов по гидрофильным веществам и доброкачественности (спектрофотометрия) бутонов гвоздики.

Предложены макро- и микроскопические диагностические характеристики сырья гвоздичного дерева и кардамона настоящего, а также товароведческие показатели, которые могут быть использованы в стандартизации сырья гвоздичного дерева и кардамона настоящего. Установлены показатели и нормы качества сырья «Гвоздики бутоны» и «Кардамона плоды».

Степень внедрения. Теоретические положения и результаты экспериментальных исследований, изложенные в диссертационной работе, используются в учебном процессе кафедры фармации ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им.И.М.Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (акт внедрения от 03.02.2014).

Практическая значимость. В качестве JIPC предложены бутоны гвоздики и плоды кардамона. На основании данных фитохимического, фармакогностического и товароведческого анализа разработаны проекты двух фармакопейных статей «Гвоздики бутоны» и «Кардамона плоды», все разделы которых были апробированы в ОАО «Красногорсклексредства» (акт внедрения №158 от 13.11.2013, акт внедрения №159 от 13.11.2013) с целью включения в Государственную фармакопею Российской Федерации XIII издания.

Основные положения, выносимые на защит}7:

результаты исследования фитохимического состава бутонов гвоздики и плодов

кардамона;

разработка методик качественного и количественного определения БАВ в сырье гвоздичного дерева и кардамона настоящего;

результаты морфолого-анатомического изучения бутонов гвоздики и плодов кардамона с установлением диагностических характеристик сырья;

результаты исследований и обоснование показателей и норм качества сырья «Гвоздики бутоны» и «Кардамона плоды» для проектов фармакопейных статей.

Апробация полученных результатов. Основные положения работы доложены и обобщены на конгрессах: II Международный конгресс «Физическое и духовное здоровье: традиции и инновации», 2012; XX Российский национальный конгресс "Человек и лекарство", 2013; Евразийский конгресс «Медицина, фармация и общественное здоровье», 2013; на научно-практических конференциях: Международная заочная научно-практическая конференция «Актуальные направления научных исследований XXI века: теория и практика», 2013.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им.И.М.Сеченова «Совершенствование образовательных технологий додипломного и последипломного медицинского и фармацевтического образования» (Per. номер 01.2.01168237).

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, постановке задач исследования, выборе объектов исследования, проведении экспериментальных исследований, теоретических изысканиях, обобщении полученных данных, Автор изучил JIPC, разработал и предложил методики стандартизации по БАВ. Автором проведена аналитическая и статистическая обработка полученных данных и результатов экспериментов.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенных исследований соответствуют пунктам 2, 3 и б паспорта специальности.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатные работы, в том числе 8 - в журналах, рекомендованных ВАК Российской Федерации для публикации результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата и доктора фармацевтических наук.

Объем и структура диссертационной работы. Материалы исследования изложены на 198 страницах машинописного текста, содержит 46 таблиц и 56 рисунков. Список литературы включает 168 источника, из них 115 на иностранных языках.

Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав, выводов, списка использованной литературы и приложений.

Во введении обоснована актуальность темы, определены цель и задачи исследования, сформулированы научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе представлен обзор литературы, в которой дан анализ возможности использования пищевых растений (пряностей) для расширения ассортимента JÏPC в Российской Федерации:

Во второй главе приведены сведения об объектах изучения, о методах и приборах, используемых в экспериментах.

Третья глава посвящена фотохимическому изучению JIPC гвоздичного дерева и кардамона настоящего; представлены результаты по анализу основных БАВ (эфирных масел, жирных кислот, фенольных соединений, свободных Сахаров и органических кислот) с применением хроматографических методов (ГЖХ, ВЭЖХ).

В четвертой главе изложены результаты исследований по разработке методик качественного и количественного определения БАВ в сырье гвоздичного дерева и кардамона настоящего.

В пятой главе освещены вопросы стандартизации изучаемых видов сырья.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Характеристика объектов и методов исследования

Объектом исследования служило растительное сырье: бутоны гвоздики (Syzygium aromaticum (L.) err. et Perry, семейства миртовых (Myrtaceae)) и плоды кардамона (Elettaria cardamomum (L.) Maton, семейства имбирных (Zingiberaceae), отвечающее требованиям ГОСТ 29047-91 «Пряности. Гвоздика. Технические условия» и ГОСТ 29052-91 «Пряности. Кардамон. Технические условия», соответственно.

Отбор средних и аналитических проб для анализа сырья, определение влажности, золы общей и золы, нерастворимой в 10 % растворе кислоты хлористоводородной, измельченности, примесей, содержание дубильных и экстрактивных веществ, микроскопические исследования проводили в соответствии с ГФ XI издания.

Для получения фотографий анатомо-диагностических признаков использовали микроскоп Olympus СХ41 (Япония) с окуляром 10х; объективами 4х, Юх, 20хи40хс цифровой насадкой (Olympus DIGITAL CAMERA С-3000 ZOOM (Япония)). Фотографии были обработаны на компьютере с помощью программ Adobe Photostop 7.0.

Исследования проводили при помощи современных физико-химических методов: газожидкостной хроматографии (ГЖХ), высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), хроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ) и спектрофотометрии.

Химический состав компонентов эфирных масел и жирных кислот изучали методом ГЖХ на хроматографе «Кристаллюкс-4000М».

Разделение эфирных масел осуществляли на кварцевой капиллярной колонке HP-5ms (сополимер 5% дифенил - 95 % диметилполисилаксан) (Agilent, США) размером 30 м х 0,25 мм х 0,25 мкм, градиент температуры колонки - от 100 "С до 150 °С, скорость нагрева 5 °С в минуту (давление на колонке 1 атм.). Газ-носитель - азот, температура испарителя 220 °С с расходом газа-носителя (азота) - 30 мл/мин, воздуха - 300 мл/мин, водорода - 30 мл/мин, скорость подачи 3 мл/мин, деление потока 1:10. Детектор пламенно-ионизационный, температура детектора -250 °С. Объем вводимой пробы 1 мкл. Время анализа 12 мин.

Разделение жирных кислот проводили на капиллярной колонке с полярной стационарной фазой Supelcowax-10 (Supelco, США) размером 30 м х 0,25 мм * 0.25 мкм, при температуре колонки 220 °С (давление на колонке 0,9 атм.). Газ-носитель - азот, температура испарителя 250 °С с расходом газа-носителя (азота) - 30 мл/мин, воздуха - 300 мл/мин, водорода -30 мл/мин, скорость подачи 3 мл/мин, деление потока 1:10. Детектор пламенно-ионизационный, температура детектора - 250 °С. Объем вводимой пробы 1 мкл. Время анализа 10 мин.

Химический состав фенольных соединений, свободных Сахаров и органических кислот изучали методом ВЭЖХ на хроматографе фирмы «GILSTON», модель 305 (Франция), инжектор ручной, модель RHEODYNE 7125 (США) с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы «MultiChom for Windows».

В качестве неподвижной фазы при изучении состава фенольных соединений была использована металлическая колонка размером 4,6 х 250 мм Kromasil С 18, размер частиц сорбента 5 мкм, подвижной фазой служила система метанол - вода - фосфорная кислота концентрированная (400:600:5). Анализ выполняли при комнатной температуре со скоростью подачи элюента 1 мл/мин. Детектирование проводилось с помощью УФ-детектора «GILSTON» UV/VIS модель 151, при длине волны 254 нм. Объем вводимой пробы 50 мкл. Время анализа 70 мин.

В качестве неподвижной фазы при изучении состава свободных Сахаров и органических кислот была использована металлическая колонка размером 6.5 х 300 мм ALTECH ОА-1000 Organic Acids, подвижной фазой служил 0.005М раствор серной кислоты. Анализ выполняли при температуре 20°С со скоростью подачи элюента 1 мл/мин. Детектирование проводилось с помощью УФ-детектора «GILSTON» UV/VIS модель 151, при длине волны 190 нм. Объем вводимой пробы 20 мкл. Время анализа 30 мин.

Хроматографию в тонком слое проводили на пластинках «TLC Silica gel 60 F254» Aluminium sheets «MERCK» (Германия) 200 x 200 мм, «TLC Silica gel 60» Aluminium sheets «MERCK» (Германия) 200 x 200 мм.

При разработке ТСХ-методик были использованы подвижные фазы, широко используемые для идентификации фенольных и липофильных соединений, а также оригинальные хрома-тографические системы. Хроматографировали восходящим способом в камере хроматографи-ческой фирмы Camag (Швейцария).

В качестве растворов для детектирования фенольных соединений использовали дифе-нилборилоксиэтиламина спиртовый раствор 1 % и полиэтиленгликоля спиртовый раствор 5 %; для детектирования липофильных соединений анисового альдегида раствор 0,5 %.

Бьиа использована система фотодокументирования «Reprostat 3» (фирма Camag, Швейцария) для получения фотографий хроматограмм. Фотографии были обработаны на компьютере с помощью программ Adobe Photostop 7.0.

Спектры извлечений из сырья снимали на регистрирующем спектрофотометре Сагу 50 (Vanan, США), оптическую плотность измеряли в кювете с толщиной слоя 10 мм.

В качестве стандартных образцов (СО) при анализе и разработке методик были использованы стандарты фирм Sigma и Fluka, а также стандарты отвечающие требованиям ФС. Все используемые реактивы были квалификации не ниже «чистые для анализа».

Статистическая обработка результатов анализа проводилась в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения», ГОСТ Р ИСО 5725-3-2002 «Точность (правильность и прецизионность)», Руководством по валидации методик анализа лекарственных средств (Н.В.Юргель и др., 2007) и ОФС 42-0113-09 «Валидация аналитических методик».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Фитохимическое изучение биологически активных веществ сырья гвоздичного дерева и кардамона настоящего

В связи с тем, что данные литературы о химическом составе сырья гвоздичного дерева и кардамона настоящего нельзя считать полными, т.к. в основном изучалось эфирное масло и его

компоненты, нами был проведен фотохимический анализ бутонов гвоздики и плодов кардамона с помощью современных физико-химических методов.

1. Фитохимическое изучение бутонов гвоздики

Методом ГЖХ при исследовании эфирного масла бутонов гвоздики, полученном методом перегонки с водяным паром и путем экстракции гексаном, были подтверждены литературные данные о том, что основным компонентом эфирного масла является эвгенол (более 70 %), также установлено наличие линалоола, который ранее не был описан в составе эфирного масла.

В эфирном масле, полученном из бутонов гвоздики методом перегонки с водяным паром, были идентифицированы линалоол (62,51 мг%) и эвгенол (70,20 %) (Рисунок 1); в гексано-вом извлечении, полученном в аппарате Сокслета, идентифицирован только эвгенол (71,16 %) (Рисунок 2).

Рисунок 1. ГЖХ-хроматограмма спиртового Рисунок 2. ГЖХ-хромато1рамма гексаново-раствора эфирного масла бутонов гвоздики го извлечения из бутонов гвоздики

Для идентификации состава жирных кислот использовали метод ГЖХ, как наиболее часто применяемый в анализе липофильных веществ лекарственных растений и позволяющий получить достоверные и сопоставимые результаты.

Хроматограмма метиловых эфиров жирных кислот бутонов гвоздики представлена на Рисунок 3, Согласно полученным данным, в бутонах гвоздики идентифицированы 5 жирных кислот: миристиновая, пальмитиновая, олеиновая, линолевая и у-линоленовая. Показано, что в жирнокислотном составе бутонов гвоздики преобладает пальмитиновая кислота (более 95 %) (Таблица 1).

Таблица 1

Компонентный состав жирных кислот бутонов гвоздики_

Соединение Время удерживания, мин Содержание

миристиновая 3,33 идентифицирована

пальмитиновая 4,03 7,35%

олеиновая 5,34 27,90 мг%

линолевая 5,56 48,50 мг%

•у-линоленовая 6,06 123,70 мг%

Изучение качественного состава фенольных соединений, свободных Сахаров и органических кислот бутонов гвоздики проводили методом ВЭЖХ.

В бутонах гвоздики обнаружены 12 фенольных соединений (Рисунок 4, Таблица 2). Методом внутренней нормализации установлено, что преобладающим среди фенольных соединений в бутонах гвоздики являются галловая и изоферуловая кислоты и кверцетин.

7

Были обнаружены 2 свободных сахара - фруктоза и рамноза и 3 органические кислоты -щавелевая, фумаровая и янтарная кислоты (Рисунок 5, Таблица 3). Методом внутренней нормализации установлено, что из свободных Сахаров преобладающей является фруктоза, а из органических кислот - щавелевая кислота.

Рисунок 3. хроматограмма

» ■»' ""МИН

гжх-

метиловых

Рисунок 4. хроматограмма

"емин

вэжх-

фенольных

эфиров жирных кислот буто- соединений бутонов гвоздики нов гвоздики

5. ВЭЖХ-хроматограмма свободных Сахаров и органических кислот бутонов гвоздики

Таблица 2

Фенольные соединения бутонов гвоздики

Соединение Время удерживания, мин Количественное содержание в смеси, %

галловая кислота 3,24 15,80

катехин 3,93 8,53

изоферуловая кислота 4,22 21,85

цикориевая кислота 6,32 1,42

кофейная кислота 6,71 3,59

не идент. 7,82 2,51

не идент. 9,05 3,41

дигидрокверцетин 11,69 1,00

феруловая кислота 13,45 4,08

лютеолин 15,28 1,78

кверцетин 18,52 13,63

рутин 23,39 3,00

о-метоксикумарин 32,21 0,45

не идент. 41,75 5,59

коричная кислота 52,26 1,16

Всего: 70,00 100,00

Таблица 3

Свободные сахара и органические кислоты бутонов гвоздики_

Соединение Время удерживания, мин Количественное содержание в смеси, %

щавелевая кислота 4,48 44,46

фруктоза 6,36 12,34

рамноза 8,17 7,47

фумаровая кислота 9,93 4,39

янтарная кислота 11,47 1,95

не идент. 12,87 4,73

не идент. 16,17 2,42

не идент. 17,41 3,97

не идент. 21,82 11,68

не идент. 23,73 6,59

Всего: 30,00 100,00

2. Фитохимическое изучение плодов кардамона

Согласно данным литературы в семенах кардамона в основном проводилось изучение эфирного масла. В зарубежных фармакопеях приведены монографии на ЛРС кардамона: плоды или семена. Нами проведены фотохимические исследования семян и коробочек плодов.

Методом ГЖХ при исследовании эфирного масла семян кардамона, полученном методом перегонки с водяным паром, были идентифицированы 1,8-цинеол, борнилацетат и гераниол, из которых преобладает борнилацетат (Рисунок 6, Таблица 4); в гексановых извлечениях из семян и коробочек плодов кардамона, полученных в аппарате Сокслета, идентифицированы а-пинен, (3-пинен, лимонен, цитронеллол, борнилацетат, из которых и в семенах и в коробочках плодов преобладает лимонен (Рисунки 7 и 8, Таблица 5).

и

. 5

Рисунок

мс кв 6.

"«МИН

ГЖХ- Рисунок

" 14 МИН

ГЖХ- Рисунок 7. хроматограмма спиртового хроматограмма гексанового хроматограмма гексанового из-раствора эфирного масла се- извлечения из семян кардамо- влечения из коробочек плодов

на

мян кардамона

кардамона

Таблица 4

Соединение Время удерживания, мин Содержание

1,8-цинеол 3,20 0,20%

борнилацетат 6,70 1,70%

гераниол 7,06 0,42%

Таблица 5

Компонентный состав эфирного масла семян и коробочек плодов кардамона (метод экс_тракции в аппарате Сокслета) _

Соединение Семена кардамона Коробочки плодов кардамона

Время удерживания, мин Содержание Время удерживания, мин Содержание

а-пинен 2,55 0,10 мг% 2,55 0,30 мг%

Р-пинен 2,83 0,30 мг% 2,83 0,48 мг%

лимонен 3,39 5,70 мг% 3,39 5,80 мг%

цитронеллол 5,67 2,17 мг% 5,68 4,59 мг%

борнилацетат 6,73 0,57 мг% 6,73 0,59 мг%

Для идентификации состава жирных кислот в сырье кардамона использовали метод

ГЖХ.

Хроматограммы метиловых эфиров жирных кислот семян и коробочек плодов кардамона представлены на Рисунках 9 и 10. Согласно полученным данным, в гексановом извлечении из семян и коробочек плодов кардамона идентифицированы следующие кислоты: пальмитиновая, олеиновая, линолевая, а- и у-линоленовая. В семенах и коробочках плодов кардамона преобладает линолевая кислота (Таблица 6).

W|лЛ-_

0£Ю йк ï МИН

Dir ces œffl юз« ces ot.es <в"МИН

Рисунок 9. ГЖХ-хроматограмма метило- Рисунок 10. ГЖХ-хроматограмма метиловых эфиров жирных кислот семян карда- вых эфиров жирных кислот коробочек пло-мона дов кардамона

Таблица б

Соединение Семена кардамона Коробочки плодов кардамона

Время удерживания, мин Содержание Время удерживания, мин Содержание

пальмитиновая 3,99 7,40 % 3,99 0,29 %

олеиновая 5,35 2,35 % 5,36 72,00 мг%

линолевая 5,58 11,95% 5,58 0,31 %

у-линоленовая 6,08 6,51 % 6,08 0,25 %

а-линоленовая 6,90 1,25% 6,89 45,70 мг%

Изучение качественного состава фенольных соединений, свободных Сахаров и органических кислот сырье кардамона (семян и коробочек плодов) проводили методом ВЭЖХ.

В семенах кардамона определены 8 фенольных соединений, а в коробочках плодов установлены 13 фенольных соединений (Рисунки И и 12, Таблица 7). Методом внутренней нормализации установлено, что преобладающей среди фенольных соединений и в семенах и в коробочках плодов кардамона является галловая кислота.

Рисунок 11. ВЭЖХ-хроматограмма фенольных Рисунок 12. ВЭЖХ-хроматограмма фенольных соединений семян кардамона соединений коробочек плодов кардамона

В семенах и коробочках плодов кардамона установлены 4 свободные сахара - лактоза, глюкоза, фруктоза и рамноза, в семенах обнаружены 4 органические кислоты - щавелевая, лимонная, янтарная и фумаровая кислоты, а в коробочках плодов 3 органические кислоты - щавелевая, лимонная и фумаровая кислоты (Рисунки 13 и 14, Таблица 8). Методом внутренней нормализации установлено, что из свободных Сахаров преобладающей является лактоза, а из органических кислот - щавелевая кислота.

Полученные результаты были положены в основу разработки показателей качества перспективных видов ЛРС - бутоны гвоздики и плоды кардамона.

10

Таблица 7

Фенольные соединения сырья кардамона_

Соединение Семена кардамона Коробочки плодов кардамона

Время удерживания, мин Количественное содержание в смеси, % Время удерживания, мин Количественное содержание в смеси, %

таннин (танниновая кислота) 2,83 17,64 - -

галловая кислота 3,08 52,57 3,04 42,50

изоферуловая кислота 4,26 2,06 4,28 3,77

эпигаллокатехингаллат 4,42 4,00 4,52 5,71

не идент. 4,92 3,56 - -

хлорогеновая кислота 5,15 11,00 5,02 3,41

не идент. - - 5,21 9,36

цикориевая кислота - - 6,05 4,05

кофейная кислота 7,35 0,79 7,26 6,11

не идент. - - 7,53 7,58

дикумарин - - 9,73 3,18

не идент. 10,16 0,53 10,67 9,70

дигидрокверцетин - - 11,82 1,92

феруловая кислота - - 13,28 0,16

не идент. - 14,15 0,45

лютеолин - - 15,27 0,15

лютеолин-7-глкжозид 18,74 4,05 - -

не идент. 21,04 3,07 - -

рутин - - 22,43 0,13

коричная кислота 28,61 074 - -

кверцетин - - 35,64 1,25

кемпферол - - 52,06 0,56

Всего: 70,00 100,00 70,00 100,00

ных Сахаров и органических кислот семян ных Сахаров и органических кислот коробо-кардамона чек плодов кардамона

Таблица 8

Свободные сахара и органические кислоты сырья кардамона_

Соединение Семена кардамона Коробочки плодов кардамона

Время Количественное Время Количественное

удержива- содержание в удержива- содержание в

ния, мин смеси, % ния, мин смеси, %

щавелевая кислота 4,38 18,30 4,35 6,20

не идент. 4,62 2,96 4,60 3,30

лактоза 5,18 36,77 5,19 73,04

лимонная кислота 5,73 4,54 5,74 2,93

глюкоза 5,99 4,91 5,96 2,51

не идент. - - 6,23 1,37

фруктоза 6,56 8,63 6,43 2,30

рамноза 6,69 9,11 6,65 4,36

не идент. 7,60 3,14 7,44 2,19

фумаровая кислота 8,21 3,16 8,13 1,40

янтарная кислота 9,79 2,20 - -

не идент. 11,05 1,69 11,04 0,40

не идент. 13,07 3,82 -

не идент. 14,23 0,37 - -

не идент. 16,36 0,41 - -

Всего: 30,00 100,00 30,00 100,00

Исследования по разработке методик качественного и количественного определения биологически активных веществ в сырье гвоздичного дерева и кардамона настоящего

В связи с тем, что медицинское применение находят препараты, содержащие не только эфирное масло, но и водные и водно-спиртовые извлечения из бутонов гвоздики и семян кардамона, представляется целесообразным оценивать содержание в изучаемых объектах не только липофильных веществ, но и гидрофильных веществ. Для этого были разработаны методики качественного и количественного определения БАВ, обуславливающих фармакологическое действие ЛРП из бутонов гвоздики и семян кардамона.

1.Разработка методик качественного анализа методом ТСХ

При разработке ТСХ-методик были проанализированы подвижные фазы, широко используемые для идентификации липофильных и фенольных соединений.

При разработке методики определения липофильных веществ бутонов гвоздики в качестве подвижной фазы был использован толуол, а в качестве экстрагента - метиленхлорид. В качестве растворов сравнения были использованы 1% раствор в толуоле СО эвгенола и 0,1 % раствор в толуоле СО ментола, зоны, которых выполняли роль метчика на хроматограмме.

На хроматограмме раствора СО эвгенола и СО ментола были обнаружены 2 зоны: зона коричневато-фиолетового с Яг около 0,25 (эвгенол), принятая за = 1,0, а также зона сине-фиолетового или фиолетового цвета с II, (по эвгенолу) около 0,4 (ментол).

На хроматограмме извлечения из бутонов гвоздики обнаружены 6 зон липофильных соединений: одна зона сине-фиолетового или фиолетового цвета с (по эвгенолу) около 0,2; одна зона желтого цвета с Я, около 0,35; две зоны красного или розового цвета с около 0,6 и 3,2; две зоны коричневато-фиолетового цвета с Я, около 0,7 и 1,0. Возможно наличие и других зон.

Проведенные исследования позволили установить, что наилучшее разделение фенольных соединений бутонов гвоздики происходит в системе этилацетат - толуол - ацетон - вода -кислота муравьиная безводная (30:10:5:5:5) при экстракции БАВ из сырья спиртом 96 %. В ка-

честве растворов сравнения были использованы 0,05% раствор рутина в спирте 96 % и 0,05 % раствор гиперозида в спирте 96 %, зоны, которых выполняли роль метчика на хроматограмме.

На хроматограмме раствора СО гиперозида и СО рутина были обнаружены 2 зоны желтого, желто-коричневого или желто-зеленого цвета с Rf около 0,3 (гиперозид), принятая за Rs = 1,0, и с R, (по гиперозиду) около 0,45 (рутин).

На хроматограмме извлечения из бутонов гвоздики обнаружены 8 зон: одна зона темного или коричневого цвета с Rj (по гиперозиду) около 0,6; четыре зоны желтого, желто-коричневого или желто-зеленого цвета с R, около 0,8; 1,0; 1,15 и 2,5; три зоны голубого или сине-фиолетового цвета с Rs около 1,7; 2,15 и 2,7. Допускалось наличие темного зоны на линии старта и других зон.

В результате проведенных исследований установлены хроматографические характеристики бутонов гвоздики, которые позволяют идентифицировать сырье.

При разработке методики определения липофильных веществ в сырье кардамона было установлено, что наилучшее разделение соединений достигается в системе метиленхлорид -толуол (1:1) при экстракции БАВ из сырья спиртом 96%. В качестве растворов сравнения были использованы 1 % раствор в толуоле СО эвгенола и 1,25 % раствор в толуоле СО цинеола, зоны, которых выполняли роль метчика на хроматограмме.

На хроматограмме раствора СО эвгенола и СО цинеола были обнаружены 2 зоны: зона коричневато-фиолетового с Rf около 0,45 (эвгенол), принятая за R, = 1,0, а также зона сине-фиолетового или фиолетового цвета с Rs (по эвгенолу) около 0,55 (цинеол).

На хроматограмме извлечений из плодов и семян кардамона обнаружены 9 зон коричневато-фиолетового, сине-фиолетового или фиолетового цвета с R*(no эвгенолу) около 0,25, 0,45, 0,6, 0,75,1,0,1,2,1,7,1,9 и 2,1. Возможно наличие коричневой полосы на линии старта и других зон.

На хроматограмме извлечения из коробочек плодов кардамона обнаружены 9 зон: одна зона зелёного цвета с Rj (по эвгенолу) около 0,2 и 8 зон коричневато-фиолетового, сине-фиолетового или фиолетового цвета с ¿¡около 0,25, 0,45, 0,6, 0,75, 1,0,1,2,1,7 и 1,9. Возможно наличие коричневой полосы на линии старта и других зон.

По наличию основных зон липофильных веществ отличить плоды и семена кардамона не представляется возможным. Однако, в случае если порошок коробочек плодов кардамона выдается за порошок плодов кардамона или порошок семян кардамона этот факт можно установить по наличию зоны зеленого или желто-зеленого цвета с Rs (по эвгенолу) около 0,2 и отсутствию зоны коричневато-фиолетового, сине-фиолетового или фиолетового цвета с Rs около 2,1.

При разработке методики определения гидрофильных веществ сырья кардамона было установлено, что наилучшее разделение фенольных соединений происходит в системе ацетон -этилацетат - толуол - вода - кислота муравьиная безводная (20:10:10:5:5) при экстракции БАВ из сырья спиртом 96 %. В качестве растворов сравнения были использованы 0,01 % раствор кислоты кофейной в спирте 96 %, 0,01 % раствор кислоты хлорогеновой в спирте 96 %, 0,025 % раствор рутина в спирте 96 % и 0,025 % раствор гиперозида в спирте 96 %, зоны, которых выполняли роль метчика на хроматограмме.

На хроматограмме раствора СО кислоты кофейной, СО гиперозида, СО кислоты хлорогеновой и СО рутина были обнаружены 4 зоны: две зоны желтого, желто-коричневого или желто-зеленого цвета с Rf около 0,45 (гиперозид), принятая за R, = 1,0, и с R, (по гиперозиду) около 0,7 (рутин), две зоны голубого цвета с R« (по гиперозиду) около 0,85 (кислота хлорогеновая) и с rj (по гиперозиду) около 1,65 (кислота кофейная).

На хроматограмме извлечений из плодов и коробочек плодов кардамона обнаружены 4 зоны: одна зона желтого, желто-коричневого или желто-зеленого цвета с R, (по гиперозиду) около 0,7, две зоны голубого цвета с R, около 0,85 и 1,65, одна зона желто-коричневого цвета с R, около 1,75. Возможно наличие других зон.

На хроматограмме извлечения из семян кардамона обнаружена только одна зона с Rs (по гиперозиду) около 1,65.

По наличию только одной зоны с (по гиперозиду) около 1,65 на хроматограмме фе-нольных соединений сырья кардамона можно отличить семена кардамона от коробочек плодов и плодов.

Проведенные исследования позволили установить хроматографические характеристики сырья кардамона и составляющие их компонентов (коробочек плодов и семян).

Валидацию разработанных методик проводили по специфичности и пригодности хрома-тографической системы. Специфичность методики оценивали по совпадению хроматографиче-ских профилей различных серий сырья по основным зонам между собой и их соответствию описанию методики. Количество испытуемых серий сырья было не менее трех. Критерием приемлемости являлось совпадение хроматографических профилей различных серий сырья и их соответствие описанию методики. Хроматографические профили различных серий сырья совпали по основным зонам между собой и соответствовали описанию методики. Методика позволяет четко определять зоны в испытуемых сериях по цвету и расстоянию от линии старта относительно пятна СО.

В качестве показателя пригодности хроматографической системы выбрали разрешение между зонами СО на хроматограмме. Значение разрешения между зонами СО составляло не менее 1,5. На основании полученных результатов разработанные методики можно считать прошедшими валидацию.

2,Разработка методик количественного определения биологически активных веществ

2.1. Разработка методики определения эфирного масла в бутонах гвоздики и в семенах кардамона

При разработке методики определения содержания эфирного масла в бутонах гвоздики и семенах кардамона был использован метод 3, описанный в ГФ XI изд., т.к. плотности эфирных масел исследуемых видов сырья близки к единице, и этот метод, схож с методом, рекомендуемым в ведущих зарубежных фармакопеях для оценки содержания эфирного масла в ЛРС.

Для определения оптимальных условий количественного определения эфирного масла по методу 3 (ГФ XI изд., вып.1.) в бутонах гвоздики и в семенах кардамона были изучены основные факторы, влияющие на процесс гидродистилляции: масса навески сырья, измельчен-ность сырья и время перегонки. Критерием оценки эффективности процесса дистилляции являлся выход эфирного масла.

Установлено, что оптимальным условиями для определения эфирного масла в бутонах гвоздики являлись: масса навески 5,0 г, измельченность сырья - 2 мм, время перегонки -2 ч, которые соответствуют требованиям монографии Европейской фармакопеи. В случае определения эфирного масла в семенах кардамона оптимальными условиями являлись: масса навески 20,0 г, измельченность сырья - 2 мм, время перегонки 5 ч, которые соответствуют указаниям монографии Британской фармакопеи.

Валидацию методик проводили только по критериям повторяемость и внутрилаборатор-ная воспроизводимость, т.к. использовалась методика, приведенная в ГФ XI изд.

Повторяемость методик, определенная на одном образце сырья в 6 повторностях в течение короткого промежутка времени с использованием одних и тех же реактивов и оборудования, выражалась величиной относительного стандартного отклонения, которое для бутонов гвоздики составило 2,50 %, а для семян кардамона - 4,69 %, что свидетельствует о прецизионности методик в условиях повторяемости.

Определение внутрилабораторной воспроизводимости методик проводили 2 исполнителя на 3 образцах сырья в трех повторностях. Критерий приемлемости выражался величиной относительного стандартного отклонения, которое для бутонов гвоздики составило 4,43 %, а для семян кардамона - 5,54 %, что указывает на прецизионности методик в условиях воспроизводимости.

На основании полученных результатов, данную методику можно считать прошедшей валидацию.

2.2. Разработка методики количественного определения флавоноидов в бутонах гвоздики

На первом этапе исследований был проведен анализ спектров спиртовых извлечений из бутонов гвоздики (1:50). Показано, что по положению максимумов поглощения флавоноидов из-за наложения более интенсивных полос поглощения сопутствующих веществ вести определение методом прямой спектрофотомерии нецелесообразно.

При использовании спектрофотометрического метода, основанного на реакции комплек-сообразования с алюминия хлоридом, происходит сдвиг полосы поглощения флавоноидов с 330-350 до 390-410 нм. При добавлении спиртового раствора алюминия хлорида в спектре извлечений из бутонов гвоздики появлялся максимум поглощения при 405 нм, который совпал с максимум поглощения спектра гиперозида с алюминия хлоридом, и это позволяет проводить анализ при данной длине волны. Применение раствора исследуемого извлечения без добавления к нему реактива позволяет исключить влияние окрашенных сопутствующих веществ (Рисунок 15).

На основании полученных результатов подобраны оптимальные условия (экстрагент -40 % этанол, измельченность сырья - 2 мм, соотношение сырья и экстрагента - 1:50, время однократной экстракции на кипящей водяной бане - 2 часа) и предложена методика определения суммы флавоноидов с использованием в качестве СО гиперозида.

Валидацию разработанной методики проводили по следующим критериям: линейность, повторяемость, внутрилабораторная воспроизводимость и правильность.

Определение линейности проводили на 5 уровнях концентраций гиперозида - 30 %, 50%, 100%, 150%, 200%, от нормируемого значения. Значение оптической плотности (А) рассчитывалось как среднее из трех измерений. Критерием приемлемости линейности являлся коэффициент корреляции, и если его величина близка единице, то совокупность данных можно описать прямой линией. Коэффициент корреляции составил 0,9974 (Рисунок 16).

Рисунок 15. Спектры спиртовых извлечений бу- Рисунок 16. График зависимости оптиче-тонов гвоздики и спиртового раствора СО гипе- ской плотности от концентрации гиперо-розида зида

1. спиртовое извлечение бутонов гвоздики;

2. спиртовое извлечение бутонов гвоздики с добавлением 2 % спиртового раствора алюминия хлорида;

3. спектр комплекса гиперозида с алюминия хлоридом в спиртовом извлечение бутонов гвоздики;

4. спектр спиртового раствора СО гиперозида;

5. спектр спиртового раствора СО гиперозида с добавлением 2 % спиртового раствора алюминия хлорида

по оси абсцисс - длина волны, нм

по оси ординат - оптическая плотность, ед. .

Повторяемость методики определяли на одном образце бутонов гвоздики в 6 повторностях в течение короткого промежутка времени с использованием одних и тех же реактивов и оборудования. Критерий приемлемости выражался величиной относительного стандартного отклонения, который составил 1,49%, что свидетельствует о прецизионности методики в условиях повторяемости.

Определение енутрипабораторной воспроизводимости методики проводили 2 исполнителя на 3 образцах в трех повторностях. Критерий приемлемости выражался величиной относительного стандартного отклонения, который составил 3,77 %, что указывает на прецизионности методики в условиях воспроизводимости.

Правильность методики устанавливали путем измерения количественного содержания суммы флавоноидов в пересчете на гиперозид в растворах, полученных путем добавления необходимого количества стандарта к исследуемому раствору для концентраций 139%, 152%, 178 %, 203 % (четыре уровня). Критерием приемлемости являлся средний % восстановления при использовании растворов концентраций 139 %, 152 %, 178 %, 203 %, скорректированный на 100 %, и его средняя величина должна была находиться в следующих пределах: 100 + 5 %. Показано, что % восстановления находился в пределах от 98,31 % до 104,62 % и его средняя величина составила - 100,99 %.

На основании полученных результатов, данную методику можно считать прошедшей валидацию.

Метрологические характеристики разработанных методик приведены в таблице 9.

Таблица 9

Метрологические характеристики разработанных методик __

п f Р,% t(P,f) S ДХ Е,%

Методика определения содержания эфирного масла в бутонах гвоздики 6 5 95 2,54 15,70 0,3929 0,9980 6,36

Методика определения содержания эфирного масла в семенах кардамона 6 5 95 2,54 4,69 0,1440 0,3657 7,80

Методика количественного определения суммы флавоноидов в бутонах гвоздики 6 5 95 2,54 3,75 0,0561 0,1425 3,80

Стандартизация сырья гвоздичного дерева и кардамона настоящего

/, Морфолого-анатомическое исследование сырья

1.1. Морфолого-анатомическое исследование бутонов гвоздики

В зарубежных фармакопеях приведены монографии на ЛРС гвоздики, в которых приведены внешние признаки только цельных бутонов гвоздики и анатомо-диагностические признаки сырья, как правило, в виде порошка. Согласно российской нормативной документации оценка подлинности бутонов гвоздики предусмотрена по внешним признакам и для цельных бутонов и порошка из них (Таблица 10).

Для установления и дополнения макро- и микродиагностических характеристик в соответствии с современными требованиями, предъявляемыми к нормативной документации, а также для подготовки фотографий основных диагностических признаков, были проведены исследования внешнего вида бутонов гвоздики и их анатомического строения.

В ходе исследований нами были выявлены следующие внешние признаки сырья гвоздики:

Сравнительный анализ показателей подлинности для бутонов гвоздики в монографиях ведущих зарубежных фармакопей, российской

Показатели Фармакопея ГОСТ 2904791 Проект ФС

Евро-пейска я Японская Британская 1 А " |1Е Я 1 9 а а £ ¡3 в е Украинская

Внешние признаки + (цельные) + (цель ные) + (цельные) + (цельные) + (цельные) + (цельные) + +

Микроскопия + (порошок) + + (порошок) + + (поро-ро-шок) + (поро-ро-шок) - +

Цельное сырье. Смесь цельных нераспустившихся цветочных бутонов гвоздевидной формы темно-коричневого цвета с мелкоморщинистой поверхностью на цветоножке длиной 1017 мм, переходящих вверху в оттопыренные чашелистики, и отдельных их частей. Четыре коричневых или желтовато-бурых лепестка венчика черепицеобразно тугосвернуты (в виде колпачка), под ними находятся многочисленные тычинки и слегка коническая завязь. Запах сильный, ароматический. Вкус водного извлечения сильно-пряный, жгучий.

Порошок. Порошок темно-коричневого цвета со светлыми, желтовато-бурыми вкраплениями, проходящий сквозь сито с отверстиями размером 2,0 мм. Запах сильный, ароматический. Вкус водного извлечения сильно-пряный, жгучий.

Для проведения микроскопического исследования бутонов гвоздики были приготовлены микропрепараты с поверхности, поперечного среза цветоножки, «давленые препараты», а также микропрепараты порошка.

Цельное сырье. При рассмотрении микропрепаратов лепестков с поверхности верхнего и нижнего (Рисунок 17-1) эпидермиса видны слегка вытянутые мелкие клетки многоугольной формы. В мезофилле, особенно ближе к основанию лепестка, встречаются друзы оксалата кальция; крупные схизогенные вместилища овальной формы расположены между изодиаметриче-скими клетками паренхимы (Рисунок 17-2). Друз оксалата кальция много в нитях тычинок и в пыльниках. Пыльца имеют форму тетраэдра, на срезанных углах видны поры (Рисунок 17-3). При рассмотрении микропрепаратов чашелистика с поверхности верхнего и нижнего эпидермиса видны мелкие клетки многоугольной формы, выпуклые устьица аномоцитного типа с верхней стороны эпидермиса (Рисунок 17-4). В мезофилле встречаются друзы оксалата кальция, в основном расположенные вдоль жилок, крупные схизогенные вместилища овальной формы, иногда с каплями эфирного масла, расположенные между изодиаметрическими клетками паренхимы. На поперечном срезе цветоножки виден эпидермис с толстой кутикулой, крупные схизогенные вместилища овальной формы, расположенные в два ряда между изодиаметрическими клетками паренхимы (Рисунок 17-51), губчатая ткань с крупными межклетниками (Ри-сунок17-5Ш), однорядные сосудистые пучки, сопровождаемые склеренхимными волокнами (Рисунки 17-511 и 17-61), встречаются друзы оксалата кальция (Рисунок 17-611). При рассмотрении микропрепаратов «давленого» препарата видны обрывки проводящих сосудов, склерен-химные волокна.

Порошок. При рассмотрении микропрепаратов порошка видны обрывки эпидермиса лепестков с мелкими клетками многоугольной формы, обрывки эпидермиса чашелистиков с выпуклыми устьицами аномоцитного типа, отдельные и в виде цепочек друзы оксалата кальция, крупные схизогенные вместилища овальной формы, обрывки проводящих сосудов, склерен-химных волокон, пыльца формы тетраэдра.

Рисунок 17. Бутоны гвоздики

I - фрагмент нижнего эпидермиса лепестка, увел. 200х, 2 - схизогенное вместилище с каплей эфирного масла, увел. 400х, 3 - пыльца, увел. 400х, 4 - фрагмент чашелистика (верхняя сторона): клетки эпидермиса с устьичным комплексом аномоцитного типа, увел. 200х, 5 - фрагмент поперечного среза цветоложа: I - крупные схизогенные вместилища, расположенные в два ряда,

II - однорядные сосудистые пучки, сопровождаемые склеренхимными волокнами, III - губчатая ткань с крупными межклетниками, увел. 40х, б - фрагмент поперечного среза цветоложа: I - сосудистые пучки с склеренхимными волокнами, II - друзы оксалата кальция, увел. 200х.

1.2. Морфолого-анатомическое исследование плодов кардамона

В зарубежных фармакопеях приведены монографии на ЛРС кардамона: плоды и семена. Практическое применение имеют семена, которые извлекаются из коробочки непосредственно перед использованием. В большинстве зарубежных монографиях описаны внешние признаки только цельных плодов и семян кардамона. Кроме того, в них приведены микроскопические признаки только семян кардамона, а описание анатомо-диагностических признаков коробочек плодов отсутствует. Согласно российской нормативной документации предусмотрено использование плодов кардамона, определение подлинности которых проводится только по внешним признакам (Таблица 11).

Для установления и дополнения макро- и микродиагностических характеристик были проведены исследования внешнего вида коробочек плодов и семян кардамона и их анатомического строения.

Сравнительный анализ показателей подлинности для сырья кардамона настоящего в монографиях ведущих зарубежных фармакопей, рос_сийской нормативной документации и проекте ФС_

Показатели Фармакопея

Британская Япон екая Китайская США ГОСТ 29052-91 Проект ФС

плоды плоды плоды семена плоды плоды

Внешние признаки плоды + (цельные) + (цельные) + (цельные) - + +

семена + (цельные) + (цельные) + (цельные) + + +

Микроскопия плоды - - - - - +

семена + (цельные) - - + - +

В ходе исследований нами были выявлены следующие внешние признаки сырья кардамона:

Цельное сырье. Плоды - коробочки овально-трехгранной формы с ребристой поверхностью, трехгнездные, хрупкие деревянистые, длиной 1-2 см, шириной 0,5-1 см. Цвет плода от светло-зеленого до бурого или светло-кремовый. Каждое гнездо коробочки содержит от 6 до 8 семян в двух рядах. Запах и вкус отсутствуют. Плоды состоят приблизительно из 70 % семян и 30 % коробочек (шелухи).

Семена неправильно-угловатой формы, поперечно-мелкоморщинистые, длиной около 4 мм, шириной около 3 мм. Цвет семян красно-коричневого или красновато-бурого цвета. Запах сильный, ароматный. Вкус водного извлечения пряно-жгучий.

Порошок. Порошок плодов светло-зеленого, светло-желтого, оливково-зеленого или светло-кремового цвета, проходящий сквозь сито с отверстиями размером 2,0 мм. Запах сильный, ароматный. Вкус водного извлечения пряно-жгучий.

Порошок семян светло-желтого, светло-бурого или светло-коричневого цвета, проходящий сквозь сито с отверстиями размером 2,0 мм. Запах сильный, ароматный. Вкус водного извлечения пряно-жгучий.

Проведенные исследования позволили определить диагностические признаки цельного сырья кардамона (плодов и семян), что позволяет идентифицировать плоды и семена кардамона. Отличить порошок плодов кардамона от порошка семян кардамона, которые имеют практическое медицинское применение, в случае наличия порошка коробочек плодов в порошке семян по внешним признакам затруднительно.

Для проведения микроскопического исследования плодов кардамона были приготовлены микропрепараты с поверхности сырья, поперечного среза семян, «давленые препараты», а также микропрепараты порошков.

Цельное сырье. При рассмотрении микропрепаратов коробочек плодов кардамона с поверхности верхнего и внутреннего эпидермиса видны толстостенные клетки многоугольной формы, с верхней стороны образующие розетку в месте прикрепления волоска (Рисунок 18-1). Волоски редкие, простые тонкостенные многоклеточные. Устьичный комплекс парацитного типа встречается только на верхней стороне коробочки плода у ее основания (Рисунок 18-2). Клетки мезокардия состоят их тонкостенных паренхимных клеток различной формы. В нем встречаются овальные клетки, заполненные мелким кристаллическим песком оксалата кальция. При малом увеличение они имеют вид темных, почти черных пятен, при большом - коричневатые с различимой кристаллической зернистостью (Рисунок 18-31). Также в паренхимных клет-

ках содержатся отдельные кристаллы оксалата кальция (Рисунок 18-311) и клетки губчатой паренхимы с крупными межклетниками (аэренхима) (Рисунок 18-4).

На поперечном срезе семян кардамона видны уплощенные, тонкостенные, паренхиматозные клетки присемянника (ариллуса) (Рисунок 18-51). Семянная кожура (теста) состоит следующих слоев: наружный эпидермис (экзотеста) представлен толстостенными, узкими, вытянутыми клетками (Рисунок 18-511); далее идут «поперечные» паренхиматозные клетки (Рисунок 18-5III); слой больших, тонкостенных, прямоугольных клеток, содержащих эфирное масло (Рисунок 18-5IV); 2 или 3 слоя паренхимных клеток (Рисунок 18-5V); слои тонкостенных, спавшихся клеток (Рисунок 18-5VI); палисадные толстостенные склереиды коричневого цвета, плотно прилегающие друг к другу, с шарообразной впадиной, содержащей кристаллы соединений кремния (Рисунок 18-5VII); эндотеста состоит из тонкостенных, сдавленных клеток (Рисунок 18-5VIII). Клетки перисперма тонкостенные, заполненные зернами крахмала, с мелкими кристаллами оксалата кальция (Рисунок 18-6). Эндосперм представлен паренхиматозными, тонкостенными клетками, содержащими алейроновые зерна.

Порошок. При рассмотрении микропрепаратов порошка коробочек плодов кардамона видны обрывки толстостенных клеток эпидермиса многоугольной формы, с местом прикрепления волоска, с устьичным комплексом парацитного типа, паренхимы с овальными клетками, заполненными мелким кристаллическим песком оксалата кальция и кристаллами оксалата кальция, отдельные кристаллы оксалата кальция, а также фрагменты клеток губчатой паренхимы с крупными межклетниками (аэренхима).

При рассмотрении микропрепаратов порошка семян видны тонкостенные, прямоугольные клетки, содержащие эфирное масло (Рисунок 18-7), обрывки палисадных толстостенных склереид коричневого цвета с поверхности (Рисунок 18-8) и поперечном виде, обрывки эндосперма с паренхиматозными, тонкостенными клетками, содержащими алейроновые зерна, обрывки перисперма с тонкостенными клетками, заполненными зернами крахмала, с мелкими кристаллами оксалата кальция, отдельные крахмальные зерна, алейроновые зерна.

По полученным результатам разработаны показатели подлинности сырья гвоздичного дерева и кардамона настоящего. Подготовлены фотографии основных диагностических признаков для включения в проект ФС.

2. Определение основных групп биологически активных веществ в сырье

В российской нормативной документации на бутоны гвоздики и плоды кардамона оценка подлинности проводиться только по органолептическим показателям.

Современные требования, предъявляемые к нормативной документации на ЛРС, предполагают обязательное включение в стандарты качества на лекарственное средство раздела «Определение основных групп биологически активных веществ» с использованием физико-химических методов анализа.

С помощью разработанных ТСХ-методик определения липофильных и гидрофильных веществ установлены хроматографические характеристики бутонов гвоздики, а также плодов кардамона и составляющие их компонентов (коробочки плодов и семена), которые позволяют идентифицировать сырье и которые могут быть включены в проекты ФС.

3. Количественное определение биологически активных веществ в сырье

В связи с тем, что медицинское применение находят препараты, содержащие не только эфирное масло, но и водные и водно-спиртовые извлечения из бутонов гвоздики и семян кардамона, представляется целесообразным проводить определение качества изучаемых объектов и по липофильным (эфирное масло) и по гидрофильным (фенольным, дубильньм) веществам, обуславливающим фармакологическое действие препаратов их них. Кроме того, оправдано определение экстрактивных веществ, т.к. из сырья гвоздики и из сырья кардамона получают препараты путем экстракции.

Рисунок 18. Плоды кардамона 1 - фрагмент экзокарпия коробочки плодов: I - толстостенные многоугольные клетки эпидермиса, II - место прикрепления волоска, увел. 400х, 2 - фрагмент экзокарпия коробочки плодов с устьичным комплексом парацитного типа, увел. 400х, 3 - фрагмент мезокардия коробочки плодов: I - кристаллический песок оксалата кальция, II - кристаллы оксалата кальция, увел. 200*, 4 - фрагмент мезокардия коробочки плодов с клетками губчатой паренхимы с крупными межклетниками (аэренхима), увел. 200х, 5 - фрагмент поперечного среза семени (см. описание в тексте), увел. 200х, 6 - фрагмент семени: клетки перисперма с зернами крахмала (I) и с мелкими кристаллами оксалата кальция (II), увел. 400х, 7 - фрагмент тонкостенных, прямоугольных клеток семени с эфирным маслом, увел. 400х, 8 - фрагмент семени: палисадные толстостенные склереиды коричневого цвета с шарообразными впадинами, содержащие кристаллы соединений кремния, увел. 400х,

3.1 .Количественное определение эфирного масла

Используя разработанную методику, на промышленных сериях бутонов гвоздики и семян кардамона было проведено количественное определение содержания эфирного масла. В бутонах гвоздики оно составило от 15,61 до 16,99 %, что позволяет предложить норму содержания эфирного масла не менее 15,0 %, что соответствует норме указанной в ведущих зарубежных фармакопеях, в семенах кардамона - от 4,82 до 5,41 %, что позволяет предложить норму содержания эфирного масла не менее 4,0 %, которая соответствует норме приведенной в Британской фармакопее на сырье кардамона.

3.2. Количественное определение суммы флавоноидов в бутонах гвоздики

Анализ промышленных серий бутонов гвоздики разработанной нами методикой показал, что содержание суммы флавоноидов в пересчете на пшерозид колеблется от 2,67 % до 3,83 %, что позволяет предложить норму - не менее 2,5 %.

3.3. Определение дубильных веществ

Определение содержания дубильных веществ в бутонах гвоздики и семенах кардамона проводили согласно методике ГФ XI промышленных сериях сырья. Показано, что содержание дубильных веществ в бутонах гвоздики составляет от 4,11 до 5,02 %, что позволило предложить нормы - не менее 3,5 %. Содержание дубильных веществ в семенах кардамона составляет от 0,01 до 0,02 %, а в коробочках плодов кардамона - от 0,04 до 0,06 %, что не позволяет рассматривать сырье кардамона как источник дубильных веществ и делает нецелесообразным оценивать качество сырья кардамона по этому показателю.

3.4. Определение экстрактивных веществ

Определение содержания экстрактивных веществ проводили согласно методике ГФ XI на промышленных сериях изучаемых объектов, в качестве экстрагента использовали воду очищенную, спирт этиловый 96 % и 70 %, которые используются для получения водных и водно-спиртовых извлечений из сырья. Предложены нормы содержания в бутонах гвоздики экстрактивных веществ, извлекаемых водой, не менее 40 %, спиртом 70 % - не менее 35 %, спиртом 96 % - не менее 20 %; в семенах кардамона - экстрактивных веществ, извлекаемых водой, не менее 17 %, спиртом 70 % - не менее 12 %, спиртом 96 % - не менее 10 %,

3.5. Определение числовых показателей

В соответствии с требованиями ОСТ 91500.05.001-00 к структуре и перечню разделов фармакопейной статьи на ЛРС, установлены числовые показатели для стандартизации сырья гвоздичного дерева и кардамона настоящего.

Определены числовые показатели цельных бутонов гвоздики: влажность не более 27 %; золы общей не более 6 %; золы, нерастворимой в 10 % растворе кислоты хлористоводородной, не более 0,5 %; потемневших бутонов, цветоножек и плодов не более 5 %; поврежденных бутонов не более 2 %; частей гвоздичного дерева, не являющиеся сырьем (веточки) не более 1,5 %; содержание частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 2 мм, не более 2 %; содержание частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 0,18 мм, не более 2 %; органические примеси, не более 0,5 %; минеральных примесей не более 1 %; а также порошка бутонов гвоздики: влажность не более 27 %; золы общей не более 6 %; золы, нерастворимой в 10 % растворе кислоты хлористоводородной, не более 0,5 %; содержание частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 0,18 мм, не более 8 %; минеральных примесей не более 1 %.

Определены числовые показатели цельных плодов кардамона: недоразвитых плодов не более 3,5 %, поврежденных плодов не более 0,5 %; цельных семян кардамона: влажность не более 17 %; золы общей не более 6 %; золы, нерастворимой в 10 % растворе кислоты хлористоводородной, не более 3 %; содержание частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 2 мм, не более 3%; содержание частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 0,18 мм, не более 2%; органические примеси не более 1 %; а также порошка семян кардамона: влажность не более 17 %; золы общей не более 6 %; золы, нерастворимой в 10 % растворе кислоты хлористоводородной, не более 3 %; содержание частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 0,18 мм, не более 5 %.

Результаты проведенных исследований использованы при разработке проектов ФС «Гвоздики бутоны» и «Кардамона плоды».

выводы

1. Современными физико-химическими методами проанализирован состав биологически активных веществ бутонов гвоздики и плодов кардамона. Изучены компоненты эфирного масла изучаемых объектов, в бутонах гвоздики впервые установлено наличие линалоола. Впервые в бутонах гвоздики идентифицированы миристиновая, олеиновая, линолевая и у-линоленовая кислоты, а в плодах кардамона - пальмитиновая, олеиновая, линолевая, а- и у-линоленовая кислоты, Установлено наличие в бутонах гвоздики 2 свободных Сахаров (фруктоза, рамноза) и

3 органических кислот (щавелевая, фумаровая, янтарная); в семенах кардамона обнаружены

4 свободные сахара (лактоза, глюкоза, фруктоза, рамноза) и 4 органические кислоты (щавелевая, лимонная, янтарная, фумаровая), а в коробочках плодов кардамона - 4 свободные сахара (лактоза, глюкоза, фруктоза, рамноза) и 3 органические кислоты (щавелевая, лимонная, фумаровая).

2. Разработаны и валидированы ТСХ-методики определения липофильных и гидрофильных веществ в сырье гвоздичного дерева и кардамона настоящего. Предложены хроматографи-ческие характеристики, позволяющие идентифицировать исследуемое сырье.

3. Разработаны и валидированы методики количественного определения эфирного масла в бутонах гвоздики и семенах кардамона. Предложены нормы содержания эфирного масла - не менее 15,0 % для бутонов гвоздики и не менее 4,0 % для семян кардамона. Разработана и вали-дирована методика количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на гиперозид в бутонах гвоздики и предложена норма ее содержания - не менее 2,5 %.

4. Предложены макро- и микроскопические диагностические характеристики сырья гвоздичного дерева и кардамона настоящего, а также числовые показатели (влажность, дубильных веществ, экстрактивных веществ, измельченность, зола общая и зола, нерастворимая в 10% растворе хлористоводородной кислоты, примеси) и нормы их содержания.

5. Разработаны проекты ФС «Гвоздики бутоны» и ФС «Кардамона плоды», прошедшие апробацию на фармацевтическом предприятии.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Пешкова, Я. В., Евдокимова, О. В., Тарраб, И., Решетова, В. А. Пищевые растения как источник средств для снижения риска развития заболеваний желудочно-кишечного тракта/ Я. В. Пешкова, О. В. Евдокимова, И. Тарраб, В. А. Решетова // Естественные и технические науки.-2012.-№ 1.-С. 142-144.

2. Глазкова, И. Ю., Ярошенко, М. А., Решетова, В. А., Тарраб, И. А., Евдокимова, О. В. Обзор витаминно-минеральных комплексов и биологически активных добавок к пище на фармацевтическом рынке / И. Ю. Глазкова, М. А. Ярошенко, В. А. Решетова, И. А. Тарраб, О. В. Евдокимова // Традиционная медицина. - 2012. - № 5. - С. 17-25.

3. Евдокимова, О. В., Тарраб, И. А. Морфолого-анатомическое изучение плодов кардамона / О. В. Евдокимова, И. А. Тарраб // Традиционная медицина. - 2012. - № 5. -С. 231-234.

4. Тарраб, И. А., Евдокимова, О. В. Морфолого-анатомическое изучение бутонов гвоздики / И.А. Тарраб, О.В. Евдокимова // Традиционная медицина. - 2012. - № 5. - С. 308— 311.

5. Тарраб, И. А. Исследование дубильных веществ в новом источнике лекарственного растительного сырья - гвоздики бутонах / И. А. Тарраб // Материалы XX Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - 2013. - С. 440.

6. Тарраб, И. А. Исследование экстрактивных веществ в новых источниках лекарственного растительного сырья - гвоздики бутонах/ И.А. Тарраб // Материалы XX Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - 2013. - С. 440-441.

7. Тарраб, И. А., Евдокимова, О. В. Количественное определение суммы флавоноидов в бутонах гвоздики / О. В. Евдокимова, И. А. Тарраб // Традиционная медицина. - 2013. -№ 1 (32).-С.38-42.

8. Евдокимова, О. В., Тарраб, И. А. Разработка и валидация методик оценки подлинности бутонов гвоздичного дерева / О. В. Евдокимова, И. А. Тарраб // Сборник научных трудов по материалам международной заочной научно-практической конференции «Актуальные направления научных исследований XXI века: теория и практика». - 2013. -№ 1 (1). - С. 22-26.

9. Евдокимова, О. В., Тарраб, И. А. Хроматографическое изучение состава жирного масла плодов кардамона / О. В. Евдокимова, И. А. Тарраб // Материалы. Евразийский Конгресс с международным участием, под ред. А. С. Гаврилова - Екатеринбург : УГМА, 2013 - С. 110— 113.

10. Тарраб, И.А., Евдокимова, О.В. Хроматографическое изучение состава жирного масла бутонов гвоздики / И.А. Тарраб, О.В. Евдокимова // Материалы. Евразийский Конгресс с международным участием, под ред. А. С. Гаврилова - Екатеринбург : УГМА, 2013 - С. 121124.

11. Евдокимова, О. В., Тарраб, И. А. Изучение состава свободных Сахаров и органических кислот бутонов гвоздичного дерева / О. В. Евдокимова, И. А. Тарраб // Сборник научных трудов по материалам международной заочной научно-практической конференции «Актуальные направления научных исследований XXI века: теория и практика». - 2013. - № 3 (3).-С. 24-27.

12. Evdokimova, О. V., Neneleva, Е. V., Tarrab, I., Glazkova, I. Y. Comparison of Lipophilic Substances of the Bark of Chinese (Cinnamomum cassia (L.) C. Presl.) and Ceylon Cinnamon (Cinnamomum zeylanicum Blume) / О. V. Evdokimova, E.V. Neneleva, I. Tarrab, I. Y. Glazkova // World Applied Sciences Journal. -2013. -27 (1). -P. 70-73.

13. Evdokimova, О. V., Tarrab, I., Neneleva, E. V., Glazkova, I. Y. Testing Phenol Compounds in Spices / О. V. Evdokimova, I. Tarrab, E. V. Neneleva, I. Y. Glazkova // European Journal of Applied Sciences. -2013.-5 (5). - P. 142-145.

14. Евдокимова, О. В., Тарраб, И. А. Разработка и валидация ТСХ-методик оценки подлинности сырья кардамона / О. В. Евдокимова, И. А. Тарраб // Традиционная медицина. -2013. - №.4 (35). - С.38-40.

Отпечатано в ООО «Издательство Спутник+» ПД № 1-00007 от 26.09.2000 г. Подписано в печать 08.10.2014 г. Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,0 Печать авторефератов (495)730-47-74, 778-45-60