Автореферат диссертации по фармакологии на тему Целенаправленное фитохимическое изучение плодов софоры японской
На правах рукописи
ГОРБАЧЕВА Людмила Александровна
ЦЕЛЕНАПРАВЛЕННОЕ ФОТОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПЛОДОВ СОФОРЫ ЯПОНСКОЙ
15.00.02. - фармацевтическая химия и фармакогнозия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук
Курск -1998
Работа выполнена в Курском государственном медицинско университете, Симферопольском государственном университет /Украина/
Научные руководители: кандидат фармацевтических нау:
доцент Дрозд Г.А.
кандидат химических наук, доцеь
Гришковец В.И.
Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, пр<
Ведущая организация - Московская медицинская академия и? И.М.Сеченова
Защита состоится " 25" ноября 1998 г. в 15°° часов на засед, нии диссертационного совета К.084.57.02 при Курском государс-венном медицинском университете /305033, г.Курск, ул. К. Маркс
3/-
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Курског государственного медицинского университета
Автореферат разослан "Ж " 1998 г.
фессор Бубенчиков А.А.
доктор фармацевтических наук, пр<
фессор Куркин В.А.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук
Е.Н. Паши
Актуальность темы
Современная научная медицина широко использует расти-ельное сырье в лечебных целях. В то же время биологически ак-ивные вещества (БАВ), ответственные за весь спектр фармаколо-ического действия, для многих из них остаются недостаточно вы-сненными, а оценка качества сырья проводится по товароведче-ким показателям: содержание золы, влаги, экстрактивных веществ. [ числу таких объектов относятся плоды софоры японской.
Софора японская (Sophora japónica L., сем. Fabaceae) многие отни лет применяется в научной и народной медицине при различ-ых заболеваниях. Бутоны служат источником промышленного поучения рутина и кверцетина. Из плодов готовят настойку, которую спользуют в виде орошений, промываний или тампонов для лече-ия экзем, острых и хронических гнойных воспалительных процес-ов. Перечисленный диапазон фармакологической активности мож-о обосновать за счет активизации процессов регенерации, что редполагает положительное влияние на иммунный статус. С этой озиции легко объяснимы и другие аспекты их применения в на-одной медицине. В то же время для этого сырья достаточно изу-енным является только один класс БАВ - флавоноиды, но сущест-ующая нормативно-техническая документация на плоды софоры понской предусматривает их стандартизацию по товароведческим оказателям. В этой связи имеется настоятельная необходимость азработки более совершенных методик определения качества сы-ья с применением традиционных и новейших физико-химических :етодов исследования, установление взаимосвязи фармакологиче-кой активности с химической структурой каждой группы выделен-ых веществ.
Цель и задачи исследования
Цель работы заключалась в целенаправленном фитохимиче-ком исследовании плодов софоры японской с выделением классов иологически активных веществ для определения их иммунологи-еской активности и разработки методов объективной стандартиза-ии сырья.
Для достижения цели решались следующие задачи:
- провести общее химическое исследование плодов софоры понской по основным группам биологически активных веществ;
- изучить иммунотропную активность водных извлечений : плодов, как основного вида фармакологической активности сырья;
- выделить основные классы биологически активных вещее плодов софоры японской и изучить их вклад в иммунотропную а тивность;
- выделить в индивидуальном состоянии и изучить структу] фармакологически активных соединений;
- разработать методики количественного определения осно ных групп фармакологически активных веществ;
- пересмотреть и уточнить товароведческие показатели к чества сырья;
- разработать проект фармакопейной статьи на плоды соф ры японской.
Научная новизна
Проведено химическое изучение плодов софоры японско Определено наличие флавоноидов, полисахаридов, дубильных в ществ, тритерпеновых соединений, азотистых оснований.
Разработаны методические приемы анализа качественного со тава, выделения тритерпеновых соединений и водорастворимых п< лисахаридов.
Впервые из плодов софоры получен полисахаридный ко? плекс, углеводный состав которого представлен арабинозой, гала] тозой, рамнозой, ксилозой и галактуроновой кислотой. Раствор] мый полисахарид охарактеризован по молекулярной массе, соде] жанию свободных и метоксилированных карбоксильных груп: степени этерификации.
Впервые проведено сравнительное определение количестве! ного содержания флавоноидов в зрелых и недозрелых плодах е взаимосвязи с иммунотропной активностью.
Исследование иммунологической активности плодов софор японской проведено впервые. Определен диапазон активной доз сырья и выделенных из него полисахаридов, флавоноидов, сапош нов, вызывающей стимуляцию иммунного ответа, установлена д] намика формирования иммунитета при длительном применении о-вара из плодов.
Впервые представлены экспериментальные данные по выд< лению и изучению химического состава сапонинов, а также их ил муностимулирующей активности. Выделены и охарактеризованы
ритерпеновых гликозидов, содержащихся в преобладающих коли-ествах, из которых 4 - впервые выделены из плодов софоры японкой, а сапонин со структурой З-О-Р-О-глюкуронопиранозид сояса-югенола В - впервые описан в литературе.
Экспериментально обоснована целесообразность заготовки лодов софоры японской в фазу неполной зрелости.
Впервые разработаны полные критерии определения качества ырья и обоснованы сроки его хранения.
Показана перспективность направленного фитохимического сследования растительного сырья во взаимосвязи с определенным идом фармакологической активности.
Практическая значимость и внедрение результатов исследования
Разработан и подготовлен к рассмотрению проект дополнения фармакопейной статье "Плоды софоры японской".
Результаты исследований плодов софоры японской используйся в научных исследованиях и учебном процессе кафедр фарма-огнозии Курского государственного медицинского университета и [рославской государственной медицинской академии, научной ра-оте кафедры органической химии Симферопольского государст-енного университета.
В практику пульмонологического отделения городской клини-еской больницы № 6 г. Курска внедрено применение отвара пло-ов софоры японской в течение 10 дней с целью повышения имму-ологической резистентности организма при хроническом бронхи-
а
На защиту выносятся:
- результаты исследования химического состава плодов софо-ы японской;
- доказательство строения ранее не описанных в литературе ля плодов софоры японской тритерпеновых соединений, полиса-аридов;
- результаты исследований иммунологической активности лодов софоры японской;
- экспериментальные данные по стандартизации плодов софо-ы японской.
Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук
. .. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планол научно-исследовательских работ Курского государственног медицинского университета (номер государственной регистраци 01.9.80000183).
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены: на научнс практической конференции, посвященной 25-летию фармацевтиче ского факультета Курского государственного медицинского инсти тута (Курск, 1991); 1 съезде иммунологов России (Новосибирс! 1992); Третьей украинской конференция по медицинской ботаник (Киев, 1992); Международном конгрессе "Народная медицина Рос сии - прошлое, настоящее, будущее" (Москва, 1993); I Междуна родном конгрессе по иммунореабилитации (Дагомыс, 1994); II Рос сийском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москвг 1995); Международном экологическом форуме «Современные экс логические проблемы провинции» (Курск, 1995); на 210 националь ном конгрессе Американского химического общества (Чикагс 1995).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 16 работ, из них 2 на английском языке.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 171 странице машине писного текста и состоит из введения, обзора литературы (1 глава экспериментальной части (7 глав), общих выводов, списка литера туры и приложения. В тексте содержится 20 таблиц, 23 рисункг Список цитируемой литературы содержит 218 . источника, из них 73 на иностранных языках.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении обоснована актуальность избранной темы, опре делены цели и задачи исследования, показана научная и практиче екая значимость работы.
Обзор литературы, представленный в первой главе, состоит из вух частей. В первой части представлена краткая ботаническая ха-актеристика софоры японской, сведения о химическом составе, армакологических свойствах, применении и препаратах. Во вто-ой части описаны иммуномодулирующие свойства основных клас-эв БАВ природного происхождения, растений и препаратов.
Объектом исследования служили плоды софоры японской, за-этовленные согласно требованиям ВФС 42-452-72 в Краснодар-ком крае и в окрестностях г. Симферополя (Крым) в 1993 - 1996 эдах. Фазу зрелости определяли визуально, сопоставляя окраску лодов и степень потемнения семян с фармакопейным описанием.
Изучение качественного состава, установление иммунологической активности плодов и выделение основных групп БАВ
Предварительными фитохимическими исследованиями плодов эфоры японской было установлено присутствие в сырье полисаха-идов, свободных Сахаров, азотсодержащих веществ, флавоноидов, ритерпеновых соединений и дубильных веществ.
Качественными реакциями, основанными на осаждении низ-омолекулярными спиртами и хроматографией в тонком слое сор-ента продуктов кислотного гидролиза, обнаружены кислые поли-ахариды. В сырье содержатся незначительные количества азоти-гых оснований, способных давать положительные реакции на ал-алоиды. Качественными реакциями и хроматографией в тонком пое сорбента обнаружено большое количество флавоноидов, кото-ые в виду своей изученности нами не выделялись. Хроматографи-й в тонком слое сорбента и качественными реакциями были обна-ужены тритерпеновые гликозиды, присутствующие в других видах гого рода.
Исследованиями иммунологической активности отвара плодов эфоры японской установлено развитие стимуляции иммунного от-ета на введение эритроцитов барана при 5-10-кратном внутриже-удочном введении, 15-кратное введение практически не влияет, а 0-кратное введение супрессирует развитие этого процесса у жи-отных.
Последующим изучением выявили различие иммунологиче-кой активности сырья в зависимости от фазы зрелости плодов, ровень активности плодов, собранных в недозрелом состоянии, в
среднем, в 1,4 раза выше, чем у вполне зрелых. В данных видах сь рья было проведено количественное определение флавоноидов.
Проведенными исследованиями установили, что зрелые плод содержат флавоноидов, в пересчете на кемпферол-3,7-диглюкози, 5,0%, недозрелые - 3,32%, Так как выделение и изучение индивид} альных веществ флавоноидной природы не представляло для ш научного интереса, в качестве объекта для изучения иммунотро1 ной активности флавоноидов был выбран рутин-стандарт, соде] жащийся в данном виде сырья. Образец ГСО предоставлен доктс ром фармацевтических наук Н.Ф. Комиссаренко (ГНЦЛС, г. Хар] ков). Анализ экспериментальных данных показал, что рутин обл. дает супрессирующей активностью, увеличивающейся с количес вом приемов.
Выделение и химическое изучение полисахаридного комплекса
Выделение полисахаридного комплекса из плодов софор японской проводилось путем трехкратной экстракции сырья горз чей водой очищенной.
Очистку концентрированного водного извлечения от фенол] ных соединений и тритерпеноидов осуществляли последующей эк< тракцией н-бутиловым спиртом. Полисахариды высаждали тре? кратным объемом 96%-ного этилового спирта. В целях дальнейше очистки был проведен диализ через полупроницаемую мембран против воды очищенной и обработка катионитом, что позволил освободиться от катионов металлов.
Выделенный полисахаридный комплекс дает положительны качественные реакции с меди сульфатом, цинка сульфатом, свини ацетатом основным. По результатам хроматографического исследс вания продуктов полного кислотного гидролиза установлено, что состав полисахарида входят Э-арабиноза, Б-галактоза, Ь-рамноза Б-галактуроновая кислота. Преобладающий сахар, Б-галактурс новая кислота, составляет 85% массы. Нейтральная фракция пред ставлена арабан-галактановым комплексом. На основании исследс ваний сделали заключение, что выделенный полисахаридный ко\ плекс представляет собой пектин с содержанием нейтральных сах< ров.
Определение молекулярной массы полисахаридного компла са проводилось вискозиметрическим методом. Молекулярная масс
1ектина, полученного из плодов софоры японской варьирует в пределах 13000 у.е., что, с учетом молекулярной массы галактуронпи-занозильного фрагмента, равной 177 у.е., соответствует ориентиро-зочно 70 звеньям в полимерной цепи.
Более глубокое исследование качественного состава пектина 5ыло проведено методом ИК-спектроскопии. Характеристические шстоты полос валентных колебаний (у) при 1740 и 1630 см"1 (у 3=0), подтвердили кислый характер исследуемого вещества.
Для определения анионных свойств пектина, характеризую-цих его иммунологическую активность, производили расчет коэффициентов свободных (Кс), этерифицированных (Кэ) карбоксиль-1ых групп. Полученные данные титрометрического анализа корре-шруют с результатами ИК-спектроскопии исследуемого образца по юотношению площадей под полосами колебаний в сложноэфирной 1704 см ) и свободной (1630 см ) карбоксильных группах. Выде-генный кислый полисахарид софоры японской характеризуется вы-:оким содержанием свободных карбоксильных групп и низкой сте-1енью этерификации.
Результаты иммунологических исследований полисахаридного сомплекса свидетельствуют о том, что он стимулирует процесс формирования иммунного ответа у животных в 2,2 раза, в сравне-ши с контролем при однократном введении. Данное действие уси-швается при увеличении кратности приема, достигая максимума в \,5 раза, в сравнении с контролем при 20-ти кратном введении.
Выделение и химическое изучение тритерпеновых гликозидов
Выделение сапонинов осуществляли экстракцией н-¡утиловым спиртом, насыщенным водой, позволившей избавиться >т части сопутствующих веществ. Экстракт концентрировали упа-)иванием и методом препаративной колоночной хроматографии на ;иликагеле в системе растворителей хлороформ - 96%-ный этило-(ый спирт (10:1 -» 1:1), насыщенный водой, и разделили на четыре рракции близких по хроматографической подвижности гликозидов.
Предварительная очистка гликозидов проведена адсорбцион-гой хроматографией на силикагеле при элюировании системой рас-ворителей (1) хлороформ - 96%-ный этиловый спирт (10:1 -> 1:1), [асыщенный 25%-ным водным аммиаком. ТСХ-анализ выделен-[ых фракций в системе хлороформ - метиловый спирт - 25%-ный
водный аммиак (15:5:1) показал, что одна фракция содержит оди! гликозид (8-1), в каждой из оставшихся - по два близких по хро матографической подвижности гликозида. Разделение на индиви дуальные гликозиды 8-2 - Б-5 проводили рехроматографированиен на микросферическом силикагеле 8Преаг1 в системе растворителе] (1), что позволило достигнуть необходимой эффективности разде пения.
Предварительную структуру гликозидов устанавливали мето дом хроматографического анализа продуктов полного кислотноп гидролиза путем сравнения с достоверными образцами тритерпено вых агликонов и Сахаров в различных системах растворителей. В< всех выделенных соединениях установлено наличие одного аглико на. На основании изучения физических свойств и данных 13С-ЯМР спектра (табл.1) его идентифицировали как пентациклический три терпеноид соясапогенол В или ЗР,22р,24-тригидроксиолеан-12-ен ТС-хроматографией в качестве углеводных компонентов для веще ства 8-1 идентифицировали Б-глюкуроновую кислоту, 8-2 - Б глюкозу и Б-глюкуроновую кислоту, 8-3 - Б-галактозу и Б- глюку роновую кислоту, 8-4 - Ь-рамнозу, Б-глюкозу и Б-глюкуроновук кислоту, Б-5 - Ь-рамнозу, Б-галактозу и Б-глюкуроновую кислоту.
Для выяснения последовательности соединения моносахарид ных остатков в углеводородных цепях применили частичный ки слотный гидролиз 1 н трифторуксусной кислотой в смеси диоксан вода (1:1). У всех гликозидов первым углеводным компонентом присоединенным непосредственно к агликону, является Б глюкуроновая кислота. Концевым сахаром гликозидов 8-4 и 8-5 яв ляется Ь-рамноза.
Доказательство размера окисного цикла моносахаридных ос татков проводилось путем обработки гликозидов 0.01 н растворо? трифторуксусной кислоты в смеси вода - диоксан 1:1 в течение дву: часов. В данных условиях легко гидролизуются фуранозидные свя зи, но совершенно не затрагиваются пиранозидные гликозидны связи. В 13С-ЯМР-спектрах отсутствовали сигналы углеродных ато мов в области 79-84 м.д., характерные для фуранозидов.
Таблица №1
Химические сдвиги углеродных атомов агликона тритерпе-швых сапонинов плодов софоры японской в 13С ЯМР-спектре 5 м.д., О - ТМС, С5В5>0
№ Вещество
атома агликон 8-1 8-2 8-3 8-4 8-5
1. 39,0 38,6 38,6 38,5 38,6 38,5
2. 28,4 26,7 26,5 26,7 26,6 26,7
3. 80,2 90,9 90,9 90,8 90,9 91,0
4. 43,2 43,8 43,7 43,8 43,8 43,9
5. 56,4 56,2 56,3 56,4 56,2 56,2
6. 19,2 18,6 18,7 18,7 19,0 19,0
7. 33,6 33,3 33,3 33,2 33,3 33,4
8. 40,1 40,0 40,0 40,0 40,1 40,0
9. 48,1 47,8 47,7 47,8 47,8 47,9
10. 37,3 36,5 36,5 36,6 36,7 36,8
11. 24,1 24,1 24,1 24,0 24,1 24,0
12. 122,5 122,4 122,5 122,5 122,5 122,6
13. 144,9 144,9 144,9 145,0 144,9 144,8
14. 42,4 42,4 42,4 42,5 42,6 42,5
15. 26,5 26,5 26,5 26,6 26,5 26,7
16. 28,7 28,7 28,7 28,8 28,7 28,9
17. 38,0 38,0 38,0 38,1 38,0 38,1
18. 45,4 45,3 45,4 45,5 45,4 45,4
19. 46,8 46,8 46,9 46,9 46,9 46,8
20. 30,9 30,9 30,9 31,0 30,9 зм
21. 42,3 42,4 42,4 42,5 42,6 42,5
22. 75,5 75,6 75,6 75,6 75,7 75,5
23. 23,6 22,6 22,8 22,7 23,0 23,4
24. 64,7 63,4 63,4 63,5 63,4 64,0
25. 16,3 15,7 15,8 15,7 15,9 16,0
26. 17,2 17,0 17,1 17,0 17,2 17,1
27. 25,7 25,8 25,8 25,7 25,9 25,7
28. 28,7 28,7 28,6 28,7 28,8 28,7
29. 33,3 33,3 33,4 33,3 33,4 -33,3
30. 21,1 21,2 21,2 21,1 22,0 21,2
Окончательное установление структуры тритерпеновых глико зидов проводили на основании данных спектроскопии ЯМР. Отне сение сигналов для агликоновой части выполняли путем сопостав ления с литературными данными по химическим сдвигам для со ясапогенола В. Отнесение сигналов моносахаридных остатков про водили на основе литературных данных для незамещенных сахароь с учетом эффектов гликозилирования.
Установление типов гликозидных связей между моносахарид ными остатками и между сахарной частью и агликоном осуществ ляли путем анализа эффектов гликозилирования для сигналов С атомов в 13С ЯМР-спектре. При этом наблюдали положительны эффекты на а-атомах, составляющие +4-11 м.д. и обычно неболь шие отрицательные эффекты на р-атомах, равных 0-2 м.д., что оп ределяет (В-конфигурацию гликозидных связей. Установление кон фигурации гликозидных связей также подтверждалось путем анали за величин констант спин-спинового взаимодействия (КССВ) 1-го ] 2-го протонов сахарного остатка в ПМР-спектрах. При этом значи тельные величины КССВ характерны для диаксиального располо жения скелетных протонов Н-1 и Н-2, что соответствует Р-конфи гурации остатков Б-глюкопиранозы, Ъ-галактопиранозы и Б-глю копиранозы.
Для остатка Ь-рамнозы в любом случае (как для а-, так и дл (3-конфигурации) наблюдается малое значение КССВ равное 1-1 Гц, поскольку экваториален протон Н-2. В этом случае доказатель ство а-конфигурации гликозидной связи проводилось путем на блюдения и анализа величин ядерных эффектов Оверхаузера (ЯЭО при предоблучении протонов Н-1. В случае а-конфигурации пре доблучение Н-1 остатка рамнозы вызывает появление ЯЭО (2-4% только на пространственно сближенном протоне Н-2. В случае (3 конфигурации гликозидной связи (аксиальный протон Н-1) ЯЭС наблюдается на аксиальных протонах Н-3 и Н-5 вследствие 1,3 диаксиальных взаимодействий (пространственной сближенности) Определение величин ЯЭО проводилось путем съемки ПМР спектров в разностном варианте. Для гликозидов Б-4 и Б-5 ЯЭО на блюдался только на протонах Н-2, что подтверждает а-конфигура цию гликозидных связей остатков Ь-рамнозы в этих соединениях.
На основании спектральных изучений гликозиды идентифи цированы как З-О-р-Б-глюкуронопиранозид соясапогенола В (Б-!)
3-0-Р-0-глюкопиранозил-(1 ->2)-0-р-В-глюкуронопиранозид сояса-погенола В (8-2), 3-0-Р-В-галактопиранозил-(1-»2)-0-Р-0-глюку-ронопиранозид соясапогенола В (8-3), З-О-а-Ь-рамнопиранозил-(1->2) -О-Р-В-глюкопиранозил - (1-»2)-0-Р-Б-глюкуронопиранозид соясапогенола В (8-4), 3-0-а-Ь-рамнопиранозил-(1—>2)-0-(3-0-га-лактопиранозил-( 1 ->2)-0-Р-Б-глюкуронопиранозид соясапогенола В (8-5). Вещество 8-1 является новым тритерпеновым глнкозидом. Гликозид 8-2 известен под названием азукисапонин II, 8-3 - сояса-понин III, 8-4 - азукисапонин V и Б-5 - соясапонин I. Соединения 82 - 8-5 были выделены ранее из бутонов софоры японской, но из плодов - впервые. Химические превращения веществ представлены на рис 1 и 2.
Исследования иммунологической активности сапонинов показали, что препараты в дозах 0,01 г/кг веса обладают выраженным иммуносупрессирующим действием, которое ослабевает с уменьшением количества вводимого вещества. Однако, в дозах, близких к 0,0005 г/кг, стимуляция иммунного ответа составляет 803%, в сравнении с контролем.
Исследование многократного применения препаратов сапонинов выявило выраженную иммуностимулирующую активность, постепенно уменьшающуюся с длительностью приема. Сопоставление результатов исследования иммунологической активности отвара плодов с активностью сапонинов установило совпадение динамики формирования процесса иммунной стимуляции животных, вызванной введением эритроцитов барана.
Схема химических превращений тритерпеновых гликозидов £>-4,8-2,8-1, выделенных из плодов софоры японской.
Схема химических превращений тритерпеновых гликозидов 8-5, 8-3, 8-1, выделенных из плодов софоры японской.
Исследования по стандартизации плодов софоры японской
В ходе иммунологических исследований было установлено, что все выделенные классы природных соединений, обуславливают активность плодов софоры. Для объективной оценки качества сырья в проект ВФС введены показатели количественного содержания полисахаридов, флавоноидов, тритерпеновых сапонинов.
Количественное определение содержания флавоноидов в плодах софоры японской проведено спектрофотометрически по методике анализа настойки.
Количественное содержание полисахаридов в плодах софоры проведено гравитометрически по методике, изложенной в ГФ-Х1 для листа подорожника.
Определение количественного содержания тритерпеновых гликозидов проведено методом гравитометрии и основано на экстракции н-бутиловым спиртом, насыщенным водой, с последующей очисткой экстракта и получением сухого остатка.
Проведенные исследования позволили установить следующие критерии доброкачественности сырья: содержание суммы флавоноидов в пересчете на кемпферол-3,7-диглюкозид - не менее 3,0%; суммы полисахаридов - не менее 8,0%; суммы тритерпеновых сапонинов - не менее 1,5%; влажность - не более 14%; общей золы - не более 3%; золы, не растворимой в 10%-ной соляной кислоте - не более 1,0%; содержание пожелтевших, побуревших и почерневших частей растения - не более 8,0%; примеси стеблей и листьев - не более 6,0%; органической примеси - не более 0.5%; минеральной - не более 1,0%.
ВЫВОДЫ
1. Изучен качественный химический состав плодов софоры японской. Установлено наличие свободных и связанных Сахаров, аминокислот и азотсодержащих соединений, дубильных веществ, флавоноидов и сапонинов.
2. Изучено влияние отвара из недозрелого и вполне зрелого сырья на гуморальный иммунный ответ (ГИО) у животных, позволивший устранить имеющиеся в литературе противоречия по поводу времени сбора плодов софоры японской в пользу фазы неполной зрелости.
3. Проведено определение количественного содержания фла-воноидов, составляющее для недозрелых плодов 3,32% и для собранных в фазу полной зрелости - 5,0%, что не коррелирует с влиянием водных извлечений из сырья на ГИО у животных.
4. Иммуностимулирующее действие сырья мало зависит от содержания в них флавоноидов, т.к. рутин, содержащийся в плодах софоры японской, стимулирует ГИО при однократном введении всего в 1,4 раза и вызывает нарастающую супрессию с увеличением кратности приемов.
5. Впервые выделен и охарактеризован суммарный полисахарид, в состав которого входят галактуроновая кислота (85%), ара-биноза, галактоза, рамноза и ксилоза. Доказана его гомогенность и определены вязкость, количество свободных (22%) и этерифициро-ванных (21%) карбоксильных групп. Молекулярная масса полисахарида (13 ООО у.е.) в сопоставлении с аналогичной величиной га-лактуронового фрагмента свидетельствует о содержании ориентировочно 70 галактуронопиранозидных звеньев в молекуле пектина.
6. Полисахаридный комплекс при 1-кратном внутрижелу-дочном введении стимулирует ГИО в 2,2 раза, и активность возрастает с увеличением кратности приема до 354%, однако не достигает уровня влияния отвара из плодов, т.е. не является доминирующем в этом виде фармакологического действия.
7. Из плодов софоры японской впервые выделены 5 индивидуальных тритерпеновых сапонинов (гликозиды 1 - 5), строение которых доказано физико-химическими методами, анализом С- и Н+-ЯМР-спектров и сравнением с достоверными образцами хроматографией на пластинках "БПиГоГ, агликон которых идентифицирован как Зр,22(3,24-тригидроксиолеан-12-ен или соясапогенол В. Суммарный выход сапонинов из воздушно-сухого сырья составляет 1,7%.
8. Строение выделенных сапонинов установлено как 3-0-0-О-глюкуронопиранозид соясапогенола В (8-1), 3-0-(3-0-глюко-пиранозил-(1-»2)-0-Р-0-глюкуронопиранозид соясапогенола В (Б-2), 3-0-3-0-галактопиранозил-(1-»2)-0-Р-В- глюкуронопиранозид соясапогенола В (8-3), 3-0-а-Ь-рамнопиранозил-(1-»2)-0-Р-0-глю-копиранозил-(1-»2)-0-р-0-глюкуронопиранозид соясапогенола В (8-4), 3-0-а-Ь-рамнопиранозил-(1-»2)-0-Р-В-галактопиранозил-(1->2)-0-Р-0-глюкуронопиранозид соясапогенола В (8-5). Строение
веществ S-2 - S-5 для плодов софоры японской описаны впервые, а гликозид S-1 является новым тритерпеновым гликозидом.
9. Уровень активности сапонинов плодов софоры японской при 1-кратном введении превышает 800%, при многократном - несколько ослабевает. По влиянию на иммунную систему это коррелирует с активностью отвара из плодов. Это свидетельствует о том, что именно тритерпеновые сапонины обеспечивают основной вклад в стимуляцию ГИО.
10. На основании исследований разработан проект временной фармакопейной статьи "Плоды софоры японской" с введением в качестве количественных показателей определение содержания фла-воноидов, полисахаридов и сапонинов.
Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:
1. Горбачева Л.А. и др. Химическое и биологическое обоснование необходимости совершенствования стандартизации действующих веществ плодов софоры японской. /Горбачева Л.А., Дрозд Г.А., Писарев В.М., Гапонов A.M., Локтионов A.B., Ермакова А.Е. // Проблемы стандартизации и контроля качества лекарственных средств. Т.2. Физико-химические методы стандартизации и контроля качества лекарственных средств и средств медицинского микроанализа. - М. -1991. - С. 26-27.
2. Горбачева Л.А. и др. Экспериментальное обоснование анализа взаимосвязи химического состава софоры японской с фармакологической активностью. /Горбачева Л.А., Дрозд Г.А., Писарев В.М., Гапонов A.M., Ермакова А.Е., Локтионов A.B. //Актуальные вопросы фармацевтической науки и практики: Тезисы докладов научно-практической конференции, посвященной 25-летию фармацевтического факультета Курского государственного медицинского института. - Курск. -1991. - Ч. 2. - С. 190-191.
3. Горбачева Л.А. и др. Иммунофармакологическое изучение плодов софоры японской. /Горбачева Л.А., Дрозд Г.А., Писарев В.М., Гришковец В.И., Чирва В.Я. //Тезисы докладов 1 съезда иммунологов России. - Новосибирск. - 1992. - С. 115-116.
4. Дрозд Г.А. и др. Влияние различных факторов на иммуно-фармакологические свойства лекарственных растений. /Дрозд Г.А., Горбачева Л.А., Писарев В.М., Конопля А.И., Гапонов A.M., Ерма-
кова А.Е., Жуков И.М., Георгиев Б.П. // Тезисы докладов 1 съезда иммунологов России. - Новосибирск. - 1992. - С. 145.
5. Горбачева JI.A. и др. Иммунофармакогностическое исследование плодов софоры японской. / Горбачева JI.A., Дрозд Г.А., Писарев В.М., Гришковец В.И., Чирва В.Я. //Третья Украинская конференция по медицинской ботанике: Тезисы докладов. Часть - Киев. -1992. С. 40-41.
6. Дрозд Г.А., Горбачева JI.A., Дрозд Н.Г. Научное обоснование широкого использования плодов софоры японской в народной медицине. //Народная медицина России - прошлое, настоящее, будущее: Тезисы докладов Международного конгресса. - М. - 1993. -С. 193-194.
7. Дрозд Г. А., Горбачева Л. А. Фармакогностическо-иммунологическое изучение плодов софоры японской (Sophora japónica L.). //Фармация. - 1994. - XLIII, N1. - С. 34-37.
8. 8.Gorbachova L.A., Yermakova A.E., Drozd G.A. Fruits of sophora japanese as means of immunorehabilitation. //International journal of immunorehabilitation. Abstracts of the international congress on immunorehabilitation. - 1994. - №1. - Supplement. - P. 127.
9. Дрозд Г.А. и др. Лекарственные растения - основа создания препаратов для иммунореабилитации. /Дрозд Г.А., Горбачева Л.А., Жуков И.М., Дрозд Н.Г., Ермакова А.Е. // II Российский национальный конгресс "Человек и лекарство": Тезисы докладов. - М. - 1995.-С. 135-136.
10. Горбачева Л.А. и др. Плоды софоры японской - экологически безопасный иммуностимулятор. /Горбачева Л.А., Дрозд Г.А., Гришковец В.И., Ермакова А.Е., Прокопенко Л.Г. //Современные экологические проблемы провинции: Международный экологический форум. - Курск. - 1995. - С. 62-63.
11. Горбачева Л.А. и др. Поиск экологически безопасных иммуностимуляторов: сапонины плодов софоры японской. /Горбачева Л.А., Дрозд Г.А., Гришковец В.И., Ермакова А.Е., Прокопенко Л.Г. //Современные экологические проблемы провинции: Международный экологический форум. - Курск. - 1995. - С. 63-64.
12. Gorbacheva L.A. et all. The study of triterpene glycosides of Sophora japónica Seeds. //Gorbacheva L.A., Grichkovets V.l., Drozd G.A., Chirva V.Ya. //Symposium on Saponins: Chemistry and Biological
Activity. 210 th ACS National Meetind. Abstr. - Chicago. - 1995. -AGFD-156.
13. Горбачева Л.А.и др. Выделение и характеристика полисахарида плодов софоры японской./ Горбачева Л.А.; Гришковец В.А., Дрозд Г.Г., Чирва В .Я.// Химия природных соединёний.-1995.-№5. -С. 748-749. ' ''"'
14. Гришковец В.А., Горбачева JI.A. ТритерпенЬвые гликози-ды семян Sophora japónica II Химия природных соединений.-1995,-№5.-С. 709 -713.
15. Гришковец В.А., Горбачева Л.А. Количественное определение содржания тритерпеновых гликозидов в плодах Sophora japónica // Химия природных соединений.-1996.-№1. - С. 104 -106.
16. Гришковец В.А., Горбачева Л.А.Весовой и спектрофото-метрический методы количественного определения тритерпеновых сапонинов в плодах Sophora japónica // Химия природных соеди-нений.-1997.-№1. - С. 69 -70.