Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Фармакогностическое изучение надземной части сабельника болотного (Comarum palustre L.) произрастающего на Северо-Западе России
- Ученая степень
- кандидата фармацевтических наук
- ВАК РФ
- 15.00.02
Автореферат диссертации по фармакологии на тему Фармакогностическое изучение надземной части сабельника болотного (Comarum palustre L.) произрастающего на Северо-Западе России
На правах рукописи
GCJ34782Ü 1
ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ НАДЗЕМНОЙ ЧАСТИ САБЕЛЬНИКА БОЛОТНОГО (COMARUM PALUSTRE !_.)■ ПРОИЗРАСТАЮЩЕГО НА СЕВЕРО-ЗАПАДЕ РОССИИ
15.00.02. - фармацевтическая химия, фармакогнозия
- 1 окт 2009
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук
Санкт-Петербург 2009
003478201
Работа выполнена в ГОУ ВПО Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии на кафедре фармакогнозии
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор Буданцев Андрей Львович
Официальные оппоненты:
доктор фармацевтических наук, профессор Гравель Ирина Валерьевна кандидат фармацевтических наук Березина Вера Сергеевна
Ведущая организация:
ГОУ ВПО Ярославская государственная медицинская академия
Защита состоится « 27 » октября 200,9 г. в 15.00 на заседании Диссертационного совета Д 208.088,01 при ГОУ ВПО Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии по адресу: 197376, г. Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, д. 14.
С диссертацией можноознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии по адресу: 197227, г. Санкт-Петербург, пр. Испытателей, д. 14.
Автореферат разослан «М » СЛШШфгт г.
Ученый секретарь
Диссертационного совета Д 208.088.01, кандидат фармацевтических наук
Марченко Н. В.
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Лекарственные препараты, получаемые из растений, занимают важное место в современной медицине среди средств профилактики и лечения многих заболеваний. Это обусловлено их более мягким действием, малой токсичностью и почти полным отсутствием нежелательных побочных эффектов. Поиск новых видов лекарственных растений, способных расширить сырьевую базу и номенклатуру лекарственного сырья, является актуальной задачей.
Растения семейства розоцветные - Rosaceae обладают широким спектром биологической активности и используются как в научной, так и в народной медицине. Сабельник болотный Comarum palustre L. - один из представителей этого семейства, применяется в народной медицине для лечения туберкулеза легких, радикулита, ревматизма, нарушений обмена веществ, дизентерии, опухолей желез и других заболеваний. Широкий спектр фармакологической активности обусловлен содержанием в сабельнике болотном комплекса БАВ. Во всех частях растения содержатся дубильные вещества, флавоноиды, в надземной части - витамин С, фенолкарбоновые кислоты, липиды (Дикорастущие полезные растения России, 2001; Биологически активные вещества растительного происхождения, 2001). В сабельнике болотном, произрастающем на Северо-Западе России, наиболее подробно изучались лишь некоторые фенольные соединения: дубильные вещества, флавоноиды. Сведения о других группах биологически активных веществ, таких как полисахариды, терпеноидные и стероидные соединения, аминокислоты, являются фрагментарными либо вовсе отсутствуют (Косман, 1997).
В настоящее время Comarum palustre часто используется в составе биологически активных добавок (Прокопьева и др., 2003). Большая часть исследований посвящена подземной части сабельника болотного, из которой получена настойка противовоспалительного действия (Сапожникова и др., 2004). Однако, при заготовке подземных органов, надземная часть не используется. С точки
зрения биологической активности и рационального природопользования применение надземной части растения является перспективным.
Сабельник болотный достаточно широко распространен на территории России, в том числе и в Северо-Западном регионе. Поэтому представляется актуальным углубленное изучение компонентного состава и содержания биологически активных веществ в надземной части С. palustre с целью введения данного вида в научную медицину как источника новых фитопрепаратов, открывает перспективы для более эффективного использования растения.
Диссертационная работа выполнена на кафедре фармакогнозии Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии в соответствии с планом научно-исследовательских работ СПХФА по теме «Мониторинг перспективных лекарственных растений флоры России» (номер Государственной регистрации 01200852355). Фармакологические исследования проводились на кафедре фармакологии СПХФА (зав. каф., проф., д.м.н. Крауз В. А.). Исследования с использованием приборных хроматографических и спектроскопических методов выполнены в аналитическом центре академии (Стрелкова Л. Ф.). Исследование аминокислотного состава проводили на базе ВНИИ Особо чистых биопрепаратов (Санкт-Петербург).
Цель и задачи исследования.
Целью данного исследования является фармакогностическое изучение и стандартизация травы сабельника болотного как перспективного источника лекарственного растительного сырья.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Провести предварительный фотохимический анализ надземной части Comarum palustre, произрастающего на территории Северо-Запада России.
2. Изучить качественный состав основных групп биологически активных веществ и разработать методики их количественного определения, про-
вести исследование динамики накопления действующих веществ в зависимости от фазы вегетации и места произрастания растения.
3. Определить острую токсичность и специфические виды биологической активности водных и спиртовых экстрактов из надземной части С. palustre.
4. Установить макро- и микроскопические признаки сырья сабельника болотного.
5. Провести товароведческий анализ для установления норм качества лекарственного растительного сырья.
6. Обобщить полученные данные и на их основе разработать проект нормативного документа (ФСП) на сабельника болотного траву.
Научная новизна. В результате изучения компонентного состава надземной части С. palustre, произрастающего на Северо-Западе России, идентифицировано 13 фенолкарбоновых кислот, из которых впервые для данного вида сырья обнаружены: ванилиновая, и-оксикоричная, вератровая, и-оксибензойная, сиреневая, коричная, салициловая и гентизиновая. Впервые из С. palustre выделены водорастворимые полисахариды (ВРПС), пектиновые вещества (ПВ), изучен их мономерный состав и динамика накопления в разные фазы вегетации растения. Впервые определен качественный и количественный состав аминокислот. Определены компоненты липофильной фракции: основные пигменты и Р-ситостерол, изучена динамика их накопления и количественное содержание. Проведено сравнительное изучение биологически активных веществ (БАВ) надземной части и корневищ сабельника болотного, в результате которого было показано, что оба вида сырья содержат одни и те же группы БАВ, но по количественному содержанию отличаются.
Практическая значимость. Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в надземной части С. palustre. Методика количественного определения дубильных веществ в траве сабельника болотного прямым спектрофотометрическим методом введена в практику научных исследований растительных объектов и учебного процесса на кафедре фармакогнозии СПХФА. Определены сроки и оптимальная фаза вегетации для заготовки сырья, а также
5
предельный размер сырьевой части, подлежащей заготовке. Разработаны критерии подлинности и показатели доброкачественности травы С. palustre. Результаты работы использованы при разработке проекта ФСП на предлагаемый новый вид лекарственного сырья «Сабельника болотного трава». Экспериментально установлено, что водные и спиртовые экстракты из надземной части С. palustre обладают низкой токсичностью, противовоспалительной и анальгезирующей активностью. Данные о компонентном составе и результаты фармакологических исследований надземной части сабельника болотного могут быть использованы при целенаправленном создании новых фитопрепаратов, а также для введения этого вида сырья в практику научной медицины.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на: XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004 г.); Международной научно-практической конференции, посвященной 85-летию академии «Выпускник фармацевтического ВУЗа (факультета) в прошлом, настоящем и будущем» 09.09.04 - 13.09.04 (Санкт-Петербург, 2004); IX Международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» ФИТОФАРМ 2005 (Санкт-Петербург, 2005); Региональной научно-практической конференции (с международным участием), посвященной 40-летию фармацевтического факультета КГМУ (Курск, 2006); 62-й и 63-й региональных конференциях по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2007, -2008 гг.); Научно-практической конференции «Фармация из века в век» (Санкт-Петербург, 2008); 64-й региональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2009 г.).
Публикация. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК».
Основные положения, выносимые на защиту.
• Результаты обнаружения различных ipynn биологически активных веществ в надземной части С. palustre.
• Результаты изучения качественного состава и количественного содержания аминокислот, дубильных веществ, полисахаридов, стероидных соединений, фенолкарбоновых кислот, флавоноидов С. palustre.
• Результаты изучения некоторых видов биологической активности экстрактов из надземной части сабельника болотного.
• Результаты товароведческого анализа сырья «Сабельника болотного трд-ва» и его стандартизация.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 163 страницах машинописного текста, иллюстрирована 43 рисунками и 38 таблицами. Диссертация состоит из введения, 5 глав (обзор литературы, материалы и методы и 3 главы, содержащие результаты экспериментальных исследований), выводов, списка литературы, включающего 162 источника, из них 43 на иностранных языках и 2 приложений.
Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования, представлены научная новизна и практическая значимость работы.
В первой главе на основании обзора данных литературы рассмотрены бо-танико-географическая характеристика, химический состав и биологическая активность Comarum palustre.
Вторая глава содержит описание объектов исследования и используемых методов фитохимического, фармакологического и товароведческого анализа.
В третьей главе приведены результаты фитохимического анализа Comarum palustre и изучения компонентного состава основных групп биологически активных веществ, содержащихся в надземной части растения: аминокислот, полисахаридов, стероидных, терпеноидных и фенольных соединений.
В четвертой главе представлены результаты изучения анальгезирующей, антипролиферативной и антиэкссудативной активности экстрактов из надземной части сабельника болотного.
В пятой главе отражены результаты разработки показателей подлинности и качества травы Comarum palustre.
Приложение 1 - проект ФСП на сырье «Сабельника болотного трава».
Приложение 2 - Акт внедрения методики количественного определения дубильных веществ в надземной части сабельника болотного.
2. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты исследований
Основными объектами исследований служили образцы надземной части сабельника болотного, собранные в разные фазы вегетации в Ленинградской, Псковской и Новгородской областях в мае-сентябре 2002-2007 г.г. Кроме того, при проведении фотохимических исследований для сравнения с надземной частью использовали образцы корневищ сабельника болотного, заготовленные в Ленинградской области (2002,2003 г.) и Алтайском крае (2002 г.).
Фотохимическое изучение сабельника болотного
Предварительная фотохимическая оценка надземной части сабельника болотного показала, что основными группами биологически активных веществ изучаемого вида являются дубильные вещества, флавоноиды, фенольные кислоты, полисахариды, аминокислоты, стероидные и тритерпеновые соединения. Кроме того, присутствуют незначительные количества кумаринов. Не обнаружены кардиотонические гликозиды, азотсодержащие соединения, эфирное масло и антраценпроизводные.
Методами бумажной и тонкослойной хроматографии установлено наличие в надземной части сабельника болотного около 7 флавоноидов, из которых идентифицировали рутин, кверцетин и кемпферол.
Для оценки количественного содержания флавоноидов в сырье была разработана дифференциальная спектрофотометрическая методика. Установлены следующие условия: стандартный образец - кверцетин; аналитическая длина волны 410 нм; комплексообразователь - алюминия хлорида стартовый раствор 1%; измельченность сырья - 1 мм; экстрагент - спирт этиловый 70%; трехкратная экстракция по 30 мин; соотношение сырья и экстрагента -1:30.
С использованием разработанной методики была определена сумма флавоноидов в надземной части С. palustre. Результаты показали, что количест-
венное содержание суммы флавоноидов в пересчете на кверцетин варьирует от 0,30% (в фазу плодоношения) до 0,75 % (в фазу бутонизации).
Содержание флавоноидов в зависимости от места заготовки сырья для образцов надземной части сабельника болотного, заготовленного в фазу цветения, представлено на рис. 1.
113 4 5
Место заготовки сырья
Рис. 1 - Содержание суммы флавоноидов в надземной части Сотагит palustre в фазу цветения
Примечание: Место заготовки: 1,2 - Ленив градская обл.; Всеволожский р-н; 3 -Леаннгр адская обл., окрестности г. Всеволожска; 4 - Ленинградская обл., Приозсрский р-н; 5 - Новгородская обл., Чудовский р-н.
Содержание флавоноидов в образцах корневищ из Ленинградской обл. и Алтайского края, определенное по данной методике, составило менее 0,01%,
Изучение фенольного комплекса С, palustre методом высокоэффективной жидкостной хроматофафии (ВЭЖХ) показало, что в изученных образцах из надземной части сабельника болотного содержится от 15 до 20 фе-нолкарбоновых кислот, из которых было идентифицировано 13, из них - S кислот для изучаемого вида обнаружены впервые: ванилиновая, и-окс и коричная, вератровая, и-оксибензойная, сиреневая, коричная, салициловая и гентизиновая.
Доминирующими кислотами являются феруловая, салициловая, п-оксибензойная и и-кумаровая.
Содержание фенолкарбоновых кислот зависит от места произрастания растений. В сырье, собранном в фазу бутонизации в Тосненском районе, содержится более 2,5% кислот, в образцах из Всеволожского и Кировского районов - менее 0,5%. В сырье, заготовленном в фазу цветения в Новгородской области, накапливается больше кислот (2,82%), чем в образцах из Всеволожского (0,96%) и Приозерского (0,24%) районов (рис. 2, табл. 1).
Рис. 2 - ВЭЖХ спиртоводного извлечения из надземной части Сотагит palustre (Тосненский р-н, Ленинградская обл.)
Примечание: Цифрами обозначены пики, соответствующие не идентифицированным соединениям.
Содержание фенолкарбоновых кислот минимально в фазу массового плодоношения (0,08% в окрестностях г. Пскова).
При изучении качественного состава дубильных веществ установили, что в надземной части сабельника болотного преобладают гидролизуемые дубильные вещества. Для разработки методики количественного определения суммы дубильных веществ спектрофотометрическим методом использовали аналитическую длину волны 265 им, так как при данной длине волны максимумы поглощения спиртоводного извлечения из сырья С. palustre и раствора кислоты галловой совпадают (рис. 3).
Таблица 1 - Компонентный состав фенолкарбоновых кислот надземной части сабельника болотного
Фенолокислоты, % х 10 3 Оксикоричные кислоты, % X 10"3 о4
Место сбора сырья Фенофаза галловая п-окси-беязойная ванилиновая сиреневая хлорогеновая вератровая салициловая кофейная п-кумаровая феруловая п-оксикорич-ная коричная гентизиновая и § 1
Лен. обл.: окрестности г. Всеволожска начало вегетации 0,6 - 8,8 - 5,6 38,8 - 24,6 - 184,2 7,4 - - 0,27
Кировский р-н бутонизация - - 5,6 29,0 8,3 - 43,2 - 119,0 90,0 - - - 0,30
Окрести, г. Всеволожска 0,6 184,0 12,4 2,5 5,2 33,6 - - - 201,1 - - - 0,44
Тосненский р-н - - - 549,0 76,9 78,6 1279,0 - - 627,0 - 42,7 - 2,65
Окрести, г. Всеволожска 1,3 - 7,5 - 5,7 29,8 - - - 235,3 45,5 - - 0,33
Всеволожский р-н цветение - 191,9 22,4 108,2 17,5 42,1 - - - 576,2 - - - 0,96
Приозерский р-н 0,5 - 7,8 - - 25,1 - - 5,1 194,9 6,6 - - 0,24
Новгородская обл., Чудской р-н - - - 594,0 - 209,0 1507,0 - - 150,0 292,0 69,0 0,6 2,82
Леи. обл.: окрестности г. Всеволожска начало плодоношения 2,8 - 8,5 - 1,4 - - 4,5 - 301,1 56,6 - - 0,37
Лужский р-н массовое - - ' 23,0 25,9 86,0 - 21,3 - - 221,0 - - - 0,38
Псковская обл., Опочецкий р-н плодоношение 1,7 - 15,0 28,7 27,2 - 18,7 - 135,0 150,0 - - - 0,38
Окрестности г. Пскова 0,7 38,0 5,8 1,3 4,3 31,4 - - - - 1,2 - - 0,08
200
250 265 300
Длина волны, им
350
Рис. 3 - УФ-спектры поглощения раствора кислоты галловой (1) и извлечения из сырья сабельника (2) В ходе исследований нами определены оптимальные условия экстракции: измельченность сырья - 1 мм; экстрагент - спирт этиловый 20%, соотношение сырья и экстрагента - 1:50; время экстракции - 90 мин. Относительная ошибка определения составила 2,29%.
Результаты количественного определения дубильных веществ в траве С. palustre спектрофотометрическим методом представлены на рис. 4.
"я í и" í Í.2 Tí,2 ........
128
i
6-j 4-i 2 0
10,6
13,6
"7,6'
? _V
3 4 5
Фазы вегетации
6 7
Рис. 4 - Содержание дубильных веществ в надземной части С. palustre
Примечание: Фазы вегетации: 1,2 - Бутонизация; 3-5 - Цветение; 6,7 - Массовое плодоношение. Образцы заготовлены: 1,5- Лен. область, г. Всеволожск; 2 - Лен. область, Тос-ненский р-н; 3 - Лен. область, Всеволожский р-н; 4 - Новгородская обл., Чудовский р-н; 6 -Окрестности г. Пскова; 7 - Лен. область, Лужский р-н.
Установлено, что содержание дубильных веществ в образцах надземной части сабельника болотного снижается к фазе плодоношения (7,6%). Независимо от места произрастания, максимальное содержание дубильных веществ в сырье наблюдается в фазы бутонизации и цветения.
В корневищах, заготовленных в Ленинградской обл., содержание дубильных веществ максимально в фазу окончания вегетации (13,3%).
Из надземной части сабельника болотного были выделены свободные моносахара, водорастворимые полисахариды, пектиновые вещества.
Свободные моносахара извлекали спиртом этиловым 80% из предварительно очищенного от липофильных веществ сырья. Методами бумажной (БХ) и газожидкостной хроматографии (ГЖХ) после дериватизации среди моносахаридов идентифицированы глюкоза, галактоза, манноза, ксилоза и незначительные количества кислоты галактуроновой и фукозы (рис. 5). Содержание свободных моносахаров, определенное спектрофотометрическим методом после реакции с фенолом и кислотой серной концентрированной, составило 2,6-5,0% (в зависимости от фазы вегетации).
Рис. 5 - Схема ГЖХ триметилсилильных производных свободных моносахаров надземной части С. palustre (Приозерский р-н, Лен. область) Примечание: Цифрами обозначены пики, соответствующие не идентифицированным
соединениям.
Водорастворимые полисахариды (ВРПС) извлекали водой из шрота, оставшегося после выделения свободных моносахаров. Мономерный состав ВРПС определяли методами БХ и ГЖХ после гидролиза раствором кислоты трифторуксусной 10% (табл. 2). Было установлено, что водорастворимые полисахариды го надземной части в качестве мономеров содержат маннозу, арабино-зу, глюкозу, галактозу, фукозу, рамнозу, ксилозу и уроновые компоненты, представленные галактуроновой и глюкуроновой кислотами.
Содержание моносахаров в сырье, заготовленном в окрестностях г. Все-воложска, увеличивается в фазу цветения растений.
При сравнении мономерного состава водорастворимых полисахаридов, выделенных из надземной части и корневищ, заготовленных в 2002 г. во Всеволожском районе, следует отметить, что для обоих образцов характерно близкое содержание уроновых кислот. Из нейтральных Сахаров основными мономерами в обоих случаях являются глюкоза и галактоза.
Таблица 2 - Мономерный состав водорастворимых полисахаридов, выделенных из сырья Comarum palustre
Место сбора сырья, фенофаза Мономерный состав, %
Man Ara Glc Gal Fue Rha Xyl Уроновые кислоты
СЬфестности г. Всеволожска нВ 12,8 10,8 6,4 6,3 5,8 2,8 0,7 38,5
Б 14,8 8,0 8,3 8,3 3,1 3,1 1,0 44,0
Ц 16,2 17,3 13,8 8,1 4,2 4,3 1,8 10,4
кЦ-нП 14,8 15,2 13,7 8,7 3,2 3,5 2,2 31,4
Приозерский р-н Ц 16,3 13,9 25,8 5,9 2,4 3,3 1,2 21,8
Всеволожский р-н Ц 12,0 13,1 5,4 6,7 - - - 37,5
Ц* - 2,6 32,6 5,6 0,5 0,7 1,1 54,0
оВ* -к - 7,1 16,1 15,7 - 2,6 1Д 51,7
Примечание: Прочерк означает отсутствие компонента. Расчет проводили в % к общему количеству компонентов. нВ - начало вегетации, Б - бутонизация, Ц - цветение, кЦ-вП - конец цвегения-начало плодоношения, оВ+- к - окончание вегетации, образец корневищ, * - образцы заготовлены в 2002 г.
Для определения степени гомогенности ВРПС проведено их фракционирование методом гель-хроматографии (колонка, заполненная «Sephadex G-50»). Было показано, что водорастворимые полисахариды из надземной части Comarum palustre являются полидисперсными. Однако в их составе можно выделить фракции, содержащие макромолекулы двух основных типов, условно обозначенные как фракции 1 и 2, которые составляют 47% и 24% соответственно от общего количества компонентов ВРПС.
ГЖХ-анализ показал, что основными мономерами макромолекулы полисахарида фракции 1 являются арабиноза и манноза (14,9% и 13,9% соответственно). Во фракции 2 обнаружены глюкоза (около 90%) и не идентифицированные компоненты.
Основными нейтральными остатками моносахаров пектиновых веществ надземной части сабельника болотного являются глюкоза, галактоза и арабиноза; ксилоза и рамноза содержатся в следовых количествах. Содержание уроно-вых кислот в составе пектиновых веществ составляет около 88,0 %.
Изучение аминокислотного состава сабельника болотного проводили методом БХ и на аминокислотном анализаторе ЛКБ 4151 Alpha plus (Швеция). Впервые в надземной части сабельника болотного идентифицировано 12 свободных аминокислот, 5 из которых являются незаменимыми для организма человека (табл. 3).
Преобладающими аминокислотами надземной части сабельника болотного являются треонин, кислота аспарагиновая, тирозин и аланин. В корневищах количественное содержание аминокислот примерно в 2,5 раза выше, чем в надземной части, и составляет около 0,7%. В подземной части преобладают аргинин, серин и кислота аспарагиновая.
Испытание на наличие сапонинов осуществляли с помощью реакции ценообразования в кислой и щелочной среде. ТСХ-анализ с использованием стандартного образца кислоты олеаноловой в системе растворителей бутанол - этанол - аммиака раствор 25% (7:2:5) позволил идентифицировать в спиртовых извлечениях из надземной части и корневищ С. palustre кислоту олеаноловую.
Таблица 3 - Содержание свободных аминокислот в надземной части
С. palustre
Аминокислота Содержание, % Содержание, % от общего количества
Треонин* 0,061 22,8
Кислота аспарапшовая 0,052 19,5
Тирозин 0,041 15,3
Алаиин 0,029 10,9
Кислота глутаминовая 0,020 7,5
Фенилаланин* 0,015 5,6
Аргинин 0,013 4,9
Валин* 0,012 4,5
Серии 0,010 3,7
Изолейцин* 0,005 1,9
Лейдан' 0,005 1,9
Глицин 0,004 1,5
Итого 0,267 100,0
Примечание: '—незаменимая аминокислота.
Методом ТСХ в хлороформных извлечениях из надземной части сабельника болотного в системах растворителей толуол - этилацетат - ацетон (60:20:8) было обнаружено 5-7 веществ стероидной и тритерпеновой природы, среди которых был идентифицирован p-ситостерол. Количественное содержание Р-ситостерола в сырье определяли методом денситометрии.
Содержание p-ситостерола в надземной части растения увеличивалось по мере его развития, начиная с 0,02% (появление первых листьев), и достигало максимального значения в фазу цветения (0,03%), а в фазу начала плодоношения начинало снижаться.
Результаты количественного определения p-ситостерола в различных органах С. palustre представлены на рис. 6. Сравнительно большое содержание p-ситостерола отмечено в стеблях, минимальное - в плодах.
u s
s
u
0,45 г' 0,4 j
0,35 Г" 0,3 0,25
oM"
Л43
0,16
......0,02
2 3 4 5 6
___ U ,>—a
—w t—W У
1
Части растения
Рис, 6 - Содержание (3—ситостерола в различных частях травы сабельника
Примечание: 1 - трава, 2 - стебли, 3 - листья. 4 - бутоны, 5 - цветкя, 6 - плоды; образцы 1-5 заготовлены во Всеволожском районе, 6 - в окрестностях г. Всеволожска.
В хлороформном извлечении из надземной части С. palustre методом ТСХ в системе гексан-ацетон {6:4) обнаружено 7 зон адсорбции. Сочетание хроматографии с УФ-спектрофотометрией позволило идентифицировать хлорофилла а ъ Ь, fi-каротин, ксантофиллы: лютеин, виолаксантин и неоксантин. Максимальное содержание каротиноидов и хлорофщшор накапливалось в сырье в фазу цветения и в среднем составляло 14,3*0,2 мг % и 218,5±9,5 мг % соответственно.
Фармакологическое изучение экстрактов из надземной части сабельника болотного
Определение острой токсичности водных и спиртовых экстрактов сабельника болотного проводили по методу Мшигера-Тейнтера на белых нелинейных мышах самцах массой тела 18-20 г. LDjo при внутрибрюшинном введении для водного экстракта составила 2,4±0,3 г/кг; для спиртового экстракта -4,li0,l г/кг. Экстракты сабельника болотного относятся к малотоксичным.
Анальгезирующее действие водных и спиртовых экстрактов исследовали на моделях «уксуснокислые корчи», «tail-jlick». Эмоциональную реакцию на
болотного
боль определяли по порогу вокализации при электростимуляции корня хвоста крыс.
В тесте «уксуснокислые корчи» наиболее выраженный анальгезирутоший эффект выявлен у спиртового экстракта в дозе 1/10 от ЛДто (рис. 7).
1 2 3 4 5 6 7 8
Акялиэ нруемьге образцы
Рис. 7 - Результата оценки анальгезирующей активности экстрактов сабельника болотного в тесте «уксуснокислые корчи»
Примечание: По оси абсцисс - 1 - контроль; 2 - метами зол: 3,4,5 - водные экстракты в дозах 1/100, 1/30. 1/10 от Л Дм соответственно; 6. 7, 8 - спиртовые экстракты в дозах 1/100, 1/30, 1/10 от ЛДи соответственно; *- отличия от контроля статистически rc существенны
(р>0,05).
На модели «tail-flick» наличие анальгезирующей активности было показано для всех экстрактов. В тесте «электростимуляция корня хвоста» все исследуемые экстракты в диапазоне доз от 1/100 до 1/10 от ДД;о обладали болеутоляющей активностью. Порот вокализации возрастал в 1,9-3,3 раза по сравнению с контролем.
Изучение противовоспалительного действия полученных экстрактов проводили в опытах на белых нелинейных крысах самцах массой тела 180-220 г. Результаты изучения антиэкссудативных свойств экстрактов на модели формалинового отека лапы крысы представлены на рис. 8. Изучаемые экстракты подавляют выраженность фазы экссудации процесса воспаления. Максимальный эффект наблюдали при введении спиртового экстракта в дозе 1/10 от ЛДда.
L f
f I............
i" 1...............с........... x „1
I а и ■ ■ ■..........................^ gl ...........Щ J^...:
40 I I ■ ............ I I ■ - - Щ В
lili lí
0 :. .ШЗ...—-Швя.... -----Ш&i..t шаг-----tt&8L . ни _
12 3 13 6 7 3
Анализируемые образны
Рис. 8 - Влияние экстрактов из надземной части С. palustre на фазу экссудации процесса воспаления (формалиновый отек лапы крысы)
Примечание: I - контроль; 2 - диклофенак; 4,5 - спиртовые экстракты в дозах 1/10. 1/30, 1/100 от ЛД50 соответственно; 6, 7, 8 - водные экстракты в дозах 1/10, 1/30, 1/100 от ЛДи соответственно; отличия от контроля статистически значимы (р<0,05).
Изучение аншпролиферативных свойств экстрактов из надземной части сабельника болотного проводили на модели «ватной гранулемы». Препарат сравнения в дозе 2 мт/кт угнетает процесс пролиферации на 64% по сравнению с контролем. Все экстракты вызывали уменьшение образования грануляционной ткани иа 32-55% по сравнению с показателями контрольной группы. Наиболее эффективный спиртовьти экстракт сабельника болотного в дозе 1/10 от ЛД;«.
Разработка методов стандартизации сырья «Сабельника болотного
трава»
При изучении анатомических признаков различных частей сырья сабельника болотного выявлено, что препараты с поверхности листьев, листочков подчашия, чашелистиков и стебля имеют сходное строение по типу устьиц (аномоцитный) и наличию трихом. Волоски двух типов: простые одноклеточные прямые или изогнутые, более многочисленные на нижней стороне листа, и головчатые с одно-, двухклеточной ножкой и одноклеточной головкой. В основании волосков клепси эпидермиса образуют розетки. В мезофилле листа, чашеч-
ки и подчашия встречаются кристаллические включения кальция оксалата в виде друз. Для стебля характерно непучковое строение.
Для определения подлинности травы сабельника болотного предложены качественные реакции:
- на дубильные вещества: с желатина раствором 1% в натрия хлорида растворе 10%, с солями железа (III);
- на полисахариды: с фенолом и кислотой серной концентрированной;
- на флавоноиды: тонкослойная хроматография в системе растворителей н-бутанол - кислота уксусная ледяная - вода (4:1:2).
Для оценки количественного содержания основных групп БАВ в сырье -дубильных веществ - использовали метод прямой спектрофотометрии, флаво-ноидов - метод дифференциальной спектрофотометрии. Содержание дубильных веществ определяли в пересчете на кислоту галловую. Для полученной методики установлены метрологические характеристики (табл. 4).
Таблица 4 - Метрологические характеристики методики количественного
определения дубильных веществ в надземной части сабельника болотного
/ X S Р,% t(P,/) Ах Е,%
9 11,2 0,1135 95 2,26 0,3 ±2,3
Содержание суммы флавоноидов определяли в пересчете на кверцетин. Метрологические характеристики методики представлены в таблице 5.
Таблица 5 - Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в траве сабельника болотного
/ X S Р,% t(P/) Ах Е, %
9 0,75 0,007 95 2,26 0,016 ±2,11
В результате товароведческого анализа десяти образцов сырья С. palustre установлены следующие числовые показатели, которые были включены в проект ФСП (табл. 6).
Таблица 6 - Числовые показатели сырья - надземной части
сабельника болотного
Наименование показателя Значение показателя, %
Цельное сырье Измельченное сырье
Дубильных веществ в пересчете на кислоту галловую Не менее 7,5 Не менее 7,5
Суммы флавоноидов в пересчете на кверцетин Не менее 0,5 Не менее 0,5
Потеря в массе при высушивании Не более 12 Не более 12
Золы общей Не более 6 Не более 6
Золы, нерастворимой в HCl 10% Не более 1 Не более 1
Частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм - Не более 5
Частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 0,5 мм - Не более 5
Стеблей, в том числе отделенных при анализе Не более 40 -
Частей травы, потемневших, пожелтевших и поврежденных вредителями Не более 5 Не более 5
Органической примеси Не более 1 Не более 1
Минеральной примеси Не более 1 Не более 1
Примечание. Прочерк означает, что для данного сырья определение показателя не
предусмотрено.
При определении динамики накопления БАВ установлено, что максимальное содержание экстрактивных веществ в надземной части наблюдается в фазы бутонизации и цветения (для сырья, собранного в Ленинградской области - около 34%). Содержание экстрактивных веществ в листьях - 38,8±1,1%, в стеблях - 26,6±0,8%. По полученным результатам предложено рекомендуемое значение сырьевой части с длиной стеблей до 30 см.
Результаты анализа содержания основных групп действующих веществ -дубильных веществ и флавоноидов и других числовых показателей в образцах
сырья, собранных в 2003-2006 годы показали, что срок хранения травы сабельника болотного составляет 3 года.
Основные результаты и выводы
1. В надземной части сабельника болотного, произрастающего на Северо-Западе России, установлено наличие дубильных веществ, фенолкарбоновых кислот, флавоноидов, полисахаридов, стероидных и терпеноидных соединений, аминокислот. Результаты сравнительного изучения травы и корневищ показали, что оба вида сырья содержат одни и те же группы биологически активных веществ, но по количественному содержанию отличаются.
2. Установлен состав фенолкарбоновых кислот, флавоноидов, полисахаридов, аминокислот, терпеноидных соединений надземной части С. palustre. Изучена динамика накопления действующих веществ в зависимости от фазы вегетации и места произрастания растений. Разработаны методики количественного определения суммы флавоноидов и дубильных веществ в надземной части сабельника болотного спектрофотометрическим методом, которые использованы для стандартизации травы сабельника болотного по содержанию действующих веществ.
3. Впервые в надземной части С. palustre идентифицированы ванилиновая, п-оксикоричная, вератровая, п-оксибензойная, сиреневая, коричная, салициловая, гентизиновая кислоты. Идентифицированы рутин, кемпферол, кверце-тин, олеаноловая кислота, Р-систостерол, хлорофиллы а и Ь, Р-каротин, лютеин, виолаксантин и неоксантин. В надземной части сабельника болотного впервые идентифицировано 12 свободных аминокислот, из них преобладающими являются треонин, кислота аспарашновая, тирозин, аланип.
4. Определена острая токсичность, установлена анальгезирующая и противовоспалительная активности водных и деалкоголизированных спиртовых экстрактов из надземной части С. palustre.
5. Определены оптимальные сроки заготовки, и размер сырьевой части, подлежащей заготовке. Установлены показатели подлинности и качества сырья.
6. Разработан проект фармакопейной статьи предприятия «Сабельника болотного трава».
Основное содержание работы нзложепо в следующих публикациях:
1. Скляревская, Н. В. Фармакогностическое изучение сабельника болотного (Comarum palustre, L.) / Н. В. Скляревская, Е. Г. Шеховцова, Н. В. Сыро-вежко, Е. И. Саканян // XI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: тез. докл. - М., 2004. - С. 836.
2. Скляревская, Н. В. Сравнительное исследование сырья: трава и корневища сабельника болотного (Comarum palustre L.) / Н. В. Скляревская, Н. В. Сыровежко, Е. Г. Шеховцова // Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 85-летию академии «Выпускник фармацевтического ВУЗа (факультета) в прошлом, настоящем и будущем». -СПб.: СПХФА, 2004. - С. 195-198.
3. Скляревская, Н. В. Количественное определение флавоноидов в траве сабельника болотного / Н. В. Скляревская, Н. В. Сыровежко // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: материалы IX Междунар. съезда Фитофарм 2005. - СПб., 2005. - С. 304 - 306.
4. Скляревская, Н. В. Аминокислотный состав сабельника болотного (Comarum palustre L.) / Н. В. Скляревская, Е. А. Кампе-Немм // Достижения, проблемы и перспективы фармацевтической науки и практики: Материалы региональной научно-практической конференции (с международным участием), посвященной 40-летию фармацевтического факультета КГМУ. - Курск : КГМУ,2006.-С. 314-316.
5. Скляревская, Н. В. Полисахариды сабельника болотного Comarum palustre L. / Н. В. Скляревская, Л. Ф. Стрелкова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2007. -Вып. 62.-С. 111-112.
6. Скляревская, Н. В. Анальгезирующая и противовоспалительная активности экстрактов из надземной части сабельника болотного - Comarum palustre
L. / H. В. Скляревская, С. В. Макарова, В. Ц. Болотова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2008. - Вып. 63. - С. 494-498.
7. Макарова, С. В. О возможности получения сухого экстракта из надземной части сабельника болотного / С. В. Макарова, Н. В. Скляревская, Т. В. Астахова // Фармация из века в век: сб. науч. тр. Ч. 2. Фармацевтические технологии. - СПб.: Изд-во СПХФА, 2008. - С. 74-77.
8. Скляревская, Н. В. Состав и структура полисахаридных комплексов Comarum palustre L. / Н. В. Скляревская, JI. Ф. Стрелкова, А. Б. Зеленцова // Растительные ресурсы. - 2008. - Т. 44, вып.З. - С. 83-89.
9. Скляревская, Н. В. Изучение возможности получения гранулированного сухого экстракта из надземной части сабельника болотного /Н. В. Скляревская, С. В. Макарова, Т. В. Астахова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2009. - Вып. 64. - С. 181-182.
10. Скляревская, Н. В. Фенолкарбоновые кислоты надземной части Comarum palustre L. (Rosaceae) / H. В. Скляревская, А. И. Тулайкин, И. И. Че-месова // Растительные ресурсы. - 2009. - Т. 45, вып. 3. - С. 97-101.
На правах рукописи
Скляревская Нелли Владимировна
ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ НАДЗЕМНОЙ
ЧАСТИ САБЕЛЬНИКА БОЛОТНОГО (COMARUMPALUSTRE L.), ПРОИЗРАСТАЮЩЕГО НА СЕВЕРО-ЗАПАДЕ РОССИИ
15.00.02 — фармацевтическая химия, фармакогнозия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук
Печать Н. В. Андриановой
Подписано к печати 23.09.2009. Формат 60 х 90/16. Бумага тип. Печать ризограф. _Гарнитура «Тайме». Печ. л.3,0. Тираж 100 экз. Заказ 808_
Санкт-Петербург 2009
Оглавление диссертации Скляревская, Нелли Владимировна :: 2009 :: Санкт-Петербург
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Систематическое положение, распространение и местообитания Comarum palustre
1.2. Морфологические особенности сабельника болотного
1.3. Основные группы биологически активных соединений Comarum palustre
1.3.1. Соединения полифенолъной природы
1.3.2. Углеводы
1.3.3. Другие группы биологически активных соединений
1.4. Биологическая активность и применение сабельника болотного
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Объекты исследований
2.2. Методы исследований
2.2.1. Методы фитохимического анализа
2.2.2. Методы фармакологического анализа
2.2.3. Методы товароведческого анализа
Глава 3. ФОТОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ COMARUM
PALUSTRE
3.1. Испытание на присутствие основных групп биологически активных веществ
3.2. Определение содержания экстрактивных веществ и динамика их накопления
3.2.1. Содержание экстрактивных веществ в зависимости от фазы вегетации
3.2.2. Содержание экстрактивных веществ в зависимости от размера сырьевой части растения
3.3. Изучение состава фенольных соединений сабельника болотного
3.3.1. Качественный состав фенольных соединений
3.3.2. Выделение и установление компонентного состава флавоноидов из надземной части сабельника болотного
3.3.3. Количественное содержание флавоноидов
3.3.4. Качественный состав фенолкарбоновых кислот
3.3.5. Количественное содержание фенолкарбоновых кислот в сырье
3.3.6. Количественное содержание дубильных веществ в сырье
3.4. Изучение углеводного состава сабельника болотного
3.4.1. Изучение динамики накопления и состава свободных моносахаров
3.4.2. Изучение динамики накопления и состава водорастворимых полисахаридов
3.4.3. Выделение и анализ пектиновых веществ
3.5. Изучение состава аминокислот сабельника болотного
3.6. Изучение стероидных и терпеноидных соединений Comarum palustre
3.6.1. Изучение тритерпеновых соединений
3.6.2. Определение Р-ситостерола и изучение динамики его накопления
3.6.3. Определение хлорофиллов и каротиноидов
Глава 4. ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ НАДЗЕМНОЙ ЧАСТИ СОМАRUMPALUSTRE
4.1. Определение острой токсичности эктрактов из травы
С. palustre | jg
4.2. Изучение анальгезирующей активности
4.2.1. Модель «уксуснокислые корчи»
4.2.2. Модель «tail-flick»
4.2.3. Модель «электростимуляция корня хвоста»
4.3. Изучение противовоспалительных свойств
4.3.1. Аитипролиферативное действие
4.3.2. Изучение антиэкссудативного действия
ГЛАВА 5. СТАНДАРТИЗАЦИЯ СЫРЬЯ «САБЕЛЬНИКА
БОЛОТНОГО ТРАВА»
5.1. Морфологические диагностические признаки сырья
5.2. Анатомические диагностические признаю! сырья
5.2.1. Анатомическое строение листьев
5.2.2. Анатомическое строение цветков
5.2.3. Анатомическое строение стебля
5.3. Качественные фитохимические реакции на основные группы БАВ jjg
5.3.1. Определение дубильных веществ
5.3.2. Определение флавоноидов
5.3.3. Определение полисахаридов
5.4. Количественное определение действующих веществ
5.5. Определение товароведческих показателей
5.6. Установление срока хранения сырья 143 ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ 146 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 148 ПРИЛОЖЕНИЕ
Введение диссертации по теме "Фармацевтическая химия и фармакогнозия", Скляревская, Нелли Владимировна, автореферат
Актуальность темы. Лекарственные препараты,, получаемые из. растений, занимают важное место в современной медицине среди средств профилактики и лечения многих заболеваний. Это обусловлено их более мягким, действием, малой токсичностью и почти полным отсутствием нежелательных побочных эффектов. Поиск новых видов лекарственных растений, способных расширить сырьевую базу и номенклатуру лекарственного сырья, является актуальной задачей.
Растения семейства розоцветные — Rosaceae обладают широким спектром биологической активности и используются как в научной, так и в народной медицине. Сабельник болотный Сотагит palustre L. — один из представителей этого семейства, применяется? в. народной- медицине для лечения туберкулеза легких, радикулита, ревматизма, нарушений обмена веществ,, дизентерии, опухолей желез и других заболеваний. Широкий спектр фармакологической активности, обусловлен содержанием- в сабельнике болотном комплекса БАВ. Во» всех частях, растения, содержатся дубильные вещества, флавоноиды, в надземной части - витамин* С, фенолкарбоновые кислоты, липиды[14, 27]. В сабельнике болотном, произрастающем.на. Северо-Западе России, наиболее подробно изучались лишь некоторые фенольные соединения: дубильные вещества, флавоноиды. Сведения о других группах биологически активных веществ, таких как полисахариды, терпеноидные и стероидные соединения, аминокислоты, являются фрагментарными либо вовсе отсутствуют [40].
В- настоящее время Сотагит palustre часто используется в составе биологически активных добавок [64]. Большая часть исследований посвящена подземной части сабельника болотного, из которой получена настойка противовоспалительного действия [107]. Однако, при заготовке подземных органов, надземная часть не используется. С точки зрения биологической активности и рационального природопользования применение надземной части растения является перспективным.
Сабельник болотный достаточно широко распространен на территории России, в том числе и в Северо-Западном регионе. Поэтому представляется актуальным углубленное изучение компонентного состава и содержания биологически активных веществ в надземной части С. palustre с целью введения данного вида в научную медицину как источника новых фитопрепаратов, открывает перспективы для более эффективного использования растения.
Диссертационная работа выполнена на кафедре фармакогнозии Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии в соответствии, с планом научно-исследовательских работ СПХФА по - теме «Мониторинг перспективных лекарственных растений, флоры России» (номер Государственной регистрации 01200852355). Фармакологические исследования проводились на кафедре фармакологии СПХФА (зав. каф., проф., д.м.н. Крауз В. А.). Исследования с использованием приборных хроматографических и спектроскопических методов, выполнены в аналитическом центре академии^ (Стрелкова Л. Ф.). Исследование аминокислотного состава проводили на базе ВНИИ Особо чистых биопрепаратов (Санкт-Петербург).
Цель и задачи исследования.
Целью данного исследования является фармакогностическое изучение и стандартизация травы сабельника болотного как перспективного источника лекарственного растительного сырья.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Провести предварительный фитохимический анализ надземной части Comarum palustre, произрастающего на территории Северо-Запада России.
2. Изучить качественный состав основных групп биологически активных веществ и разработать методики их количественного определения, провести исследование динамики накопления действующих веществ в зависимости от фазы вегетации и места произрастания растения.
3. Определить острую токсичность и специфические виды биологической, активности водных и спиртовых экстрактов из надземной части' С palustre.
4. Установить* макро- и микроскопические признаки сырья сабельника болотного.
5. Провести товароведческий анализ для установления норм качества лекарственного растительного сырья.
6. Обобщить полученные данные и на их основе разработать проект нормативного документа (ФСП)>на сабельника болотного траву.
Научная новизна. В результате изучения1 компонентного состава надземной части С. palustre, произрастающего на Северо-Западе России, идентифицировано 13 фенолкарбоновых кислот, из которых впервые для данного вида сырья обнаружены: ванилиновая, я-оксикоричная; вератровая, п— оксибензойная, сиреневая, коричная, салициловая и гентизиновая. Впервые из С. palustre выделены водорастворимые полисахариды (ВРПС), пектиновые вещества (ПВ), изучен их мономерный! состав и динамика накопления в разные фазы вегетации растения. Впервые определен качественный и количественный, состав аминокислот. Определены компоненты липофильной фракции: основные пигменты и (3-ситостерол, изучена динамика их накопления и количественное содержание. Проведено сравнительное изучение биологически активных веществ (БАВ) надземной части и корневищ сабельника болотного; в результате которого было показано, что оба вида сырья содержат одни и те же группы БАВ; но по количественному содержанию отличаются.
Практическая значимость. Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в надземной части С. palustre. Методика количественного определения дубильных веществ в траве сабельника болотного прямым спектрофотометрическим методом введена в практику научных исследований растительных объектов и учебного процесса на кафедре фармакогнозии СПХФА. Определены сроки и оптимальная фаза вегетации для заготовки сырья, а также предельный размер сырьевой части, подлежащей заготовке. Разработаны критерии подлинности и показатели доброкачественности травы С. palustre. Результаты работы использованы при разработке проекта ФСП на предлагаемый новый вид лекарственного сырья «Сабельника болотного трава». Экспериментально установлено,8 что водные и спиртовые экстракты из надземной части С. palustre обладают низкой токсичностью, противовоспалительной и анальгезирующей активностью. Данные'о компонентном составе и результаты фармакологических исследований надземной части сабельника болотного могут быть использованы при целенаправленном создании новых фитопрепаратов, а также-для введения этого вида сырья в практику научной медицины.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на: XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004 г.); Международной научно-практической конференции, посвященной 85-летию академии «Выпускник фармацевтического ВУЗа (факультета) в прошлом, настоящем и будущем» 09.09.04 — 13.09.04 (Санкт-Петербург, 2004); IX Международном съезде «Актуальные, проблемы- создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» ФИТОФАРМ 2005 (Санкт-Петербург, 2005); Региональной научно-практической конференции (с международным участием), посвященной» 40-летию фармацевтического факультета КГМУ (Курск, 2006); 62-й и 63-й региональных конференциях по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2007, 2008 гг.); Научно-практической конференции «Фармация из века в век» (Санкт-Петербург, 2008); 64-й региональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2009 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК».
Основные положения, выносимые на защиту.
• Результаты обнаружения различных групп биологически активных веществ в надземной части С. palustre. • Результаты, изучения» качественного состава и количественного содержания аминокислот, дубильных веществ, полисахаридов, стероидных соединений, фенолкарбоновых кислот, флавоноидов С. palustre.
• Результаты изучения некоторых видов биологической- активности экстрактов из надземной^ части сабельника болотного.
• Результаты товароведческого анализа сырья «Сабельника болотного' трава» и его стандартизация.
Объем, и структура^ диссертации. Работа изложена на 163 страницах машинописного» текста, иллюстрирована 43 рисунками и 38 таблицами. Диссертация состоит из введения, 5 глав (обзор» литературы, материалы и методы и 3 главы, содержащие результаты экспериментальных- исследований), выводов; списка литературы, включающего- 162 источника, из них 43 на иностранных языках и«2 приложений.
Заключение диссертационного исследования на тему "Фармакогностическое изучение надземной части сабельника болотного (Comarum palustre L.) произрастающего на Северо-Западе России"
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ
1. В надземной части сабельника болотного, произрастающего на Северо-Западе России, установлено наличие дубильных веществ, фенолкарбоновых кислот, флавоноидов, полисахаридов, стероидных и терпеноидных соединений, аминокислот. Результаты сравнительного изучения травы и корневищ показали, что оба вида сырья содержат одни и те же группы биологически активных веществ, но отличаются по количественному содержанию.
2. Установлен состав фенолкарбоновых кислот, флавоноидов, полисахаридов, аминокислот, терпеноидных соединений надземной части С. palustre. Изучена динамика накопления действующих веществ в зависимости от фазы вегетации и места произрастания растений. Разработаны методики количественного определения суммы флавоноидов и дубильных веществ в надземной части сабельника болотного спектрофотометрическим методом, которые использованы для стандартизации травы сабельника болотного по содержанию действующих веществ.
3. Впервые в надземной части С. palustre идентифицированы ванилиновая, и-оксикоричная, вератровая, и-оксибензойная, сиреневая, коричная, салициловая, гентизиновая кислоты. Идентифицированы рутин, кемпферол, кверцетин, олеаноловая кислота, p-систостерол, хлорофиллы а и Ь, Р-каротин, лютеин, виолаксантин и неоксантин. В надземной части сабельника болотного впервые идентифицировано 12 свободных аминокислот, из них преобладающими являются треонин, кислота аспарагиновая, тирозин, аланин.
4. Определена острая токсичность, установлена анальгезирующая и противовоспалительная активности водных и деалкоголизированных спиртовых экстрактов из надземной части С. palustre.
5. Определены оптимальные сроки заготовки, и размер сырьевой части, подлежащей заготовке. Установлены показатели подлинности и качества сырья.
6. Разработан проект фармакопейной статьи предприятия «Сабельника болотного трава».
Список использованной литературы по фармакологии, диссертация 2009 года, Скляревская, Нелли Владимировна
1. Антиканцерогенное действие палюстрана на развитие опухолей у крыс, индуцированных 3-( 1 -a-L-арабинопиранозил)-1 -метил-1 -нитрозо-мочевиной (АМНМ) / Н. И. Шеренешева и др. // Бюл. экспер. биол. и медицины. 1998. -Т. 125, №5.-С. 566-568.
2. Бандюкова, В. А. Применение цветных реакций для обнаружения флавоноидов путем хроматографии на бумаге / В. А. Бандюкова // Раст. ресурсы. — 1965. Т. 1, вып. 4. - С. 591-596.
3. Бандюкова, В. А. Фенолокислоты растений, их эфиры и гликозиды / В. А. Бандюкова // Химия природных соединений. — 1983. — №3. С. 263-273.
4. Бандюкова, В. А. Перспективы использования полисахаридов в медицине и фармации / В. А. Бандюкова, JI. В. Лигай // Химико-фармацевтическое производство. 1997. - Вып. 6. - С. 1-20.
5. Баранов, М. П. Жизненная форма Comarum palustre L. / М. П. Баранов, А. В. Степанова // Вопросы сравнительной и экологической анатомии растений: сб. статей. СПб.: Изд-во СПб ун-та, 2003. - С. 56-69.
6. Безделева, А. Б. Жизненные формы семенных растений российского Дальнего Востока / А. Б. Безделева, Т. А. Безделева. — Владивосток : Дальнаука, 2006.-296 с.
7. Безменов, А. Я. Анализ свободных фенолкарбоновых кислот лекарственных растений методом ВЭЖХ / А. Я. Безменов, В. П. Грахов, С. А.Четверня // Вторая республ. конф. по медицинской ботанике: тез. докл. — Киев, 1988. — С. 198-199.
8. Белая, Н. И. Антирадикальная активность фенолов растительного происхождения в реакции с дифенилпикрилгидразилом / Н. И. Белая, Т. А. Филиппенко // Фармацевтичний журнал. 2002. - № 3. - С. 82-87.
9. Беленький; М. Л., Элементы количественной оценки фармакологического эффекта-/ М. Л. Беленький; Л. : Медицина, 1963. - С. 81-117. ,
10. Березина, В. С. Фармакогностическое изучение видов рода Lamium L.s. Ь.:;автореф. дис.канд; фарм. наук: 15.00.02 / В. Gi Березина. СПб., 2003.-23 с. '••■■;■.
11. Биологически активные вещества растительного происхождения. В 3 т. Т. 2. / Б. НГГоловкин и дрг. -М;-Наука, 2001. — 764sc:;
12. Ветров, П. П; Определение содержания липофильных веществ и суммы каротиноидов в растительном сырье / П. П: Ветров; С. В. Гарная, Л. Г. Дол-ганенко // Хим.- фарм) журн. 1989. - Т. 24, № 3. - С. 320.
13. Вишницкая, О. Н. Побегообразование и структура соцветий Comarum palustre (Rosaceae); / О. II. Вишнйцкая, Н. П. Савиных // Раст. ресурсы. 2008. -Т.:44,,вып. 1. -С. 3-12./
14. Влияние палюстрана на индукцию МННГ опухолей желудочно-кишечного тракта крыс / Н. И. Шеренешева и др. // Вестник Онколог, науч. центра им. Н. Н. Блохина РАМН. 2000. - № 1. - С. 3-5.
15. Выделение и анализ природных биологически активных веществ / под. ред. Е. Е. Сироткиной. Томск: ИТУ, 1987. - 185 с.
16. Георгиевский, В. П. Биологически активные вещества лекарственных растений / В: П. Георгиевский, Н. Ф1 Комисаренко, С. Е. Дмитрук. Новосибирск : Наука; 19901 - 333 с.
17. Гладкова; В:НГ GomarumilL:- Сабельник // Арктическая флора СССР. Семейства-Droseraceae— Rosaceae. JI. : Наука, 1984. - Вып. IX, ч. 1. - С. 134
18. Государственная фармакопея Российской Федерации / 12-е изд., ч. 11, Mi : Научный центр экспертизы средств медицинского применения, 2008. -704с. '■■; \ ; . .
19. Государственная фармакопея;СССР: Вып. 1. Общие методы анализа / МЗ СССР. 11-е изд., доп. -М. : Медицина, 1987. - 336 с.
20. Государственная фармакопея СССР: Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное-растительное сырье / МЗ СССР; 11-е изд., доп. - М. : Медицина, 1989.-400 с.
21. Дикорастущие полезные растения России / под ред. А. Л. Буданце-ва; El Е. Лесиовской. СПб.; Изд-во СПХФА, 2001. - 663 с.
22. Дроздова, И. Л. Анализ полисахаридного состава листьев растений рода Arctium (Asteraceae) флоры Центрального Черноземья / И. Л. Дроздова,// Раст. ресурсы.- 2005.- Т. 41, вып. 21-С. 101-106. .
23. Ельяшевич, Ml А. Атомная и молекулярная спектроскопия: Молекулярная спектроскопия / М. А. Ельяшевич . М. : КомКнига, 2006. - 528 с.
24. Жбанков, Р. Г. Инфракрасные спектры и структура углеводов / Р. Г. Жбанков. Минск : Наука и техника, 1972. - 456 с.
25. Захарова, И. Я. Методы изучения микробных полисахаридов / И. Я. Захарова, JI. В: Косенко. Киев : Наукова думка, 1982. — 192 с.
26. Иванова, Н. В. Общая характеристика полисахаридов коры лиственницы / Н. В. Иванова, Р. Г. Оводова, В. А. Бабкин // Химия растительного сырья. -2006. -№'1. -С. 15-20.
27. Игнатов, Ю. Д. Болевой синдром / Ю. Д. Игнатов, В. А. Михайлович. JL : Медицина, 1990. - 95 с.
28. Игошева, Н. И. Распространение некоторых дикорастущих лекарственных и ягодных растений в лесотундре Тюменской области и урожайность их сырья / Н. И. Игошева, Е.А. Шурова // Раст. ресурсы. 2003. - Т. 39, вып. 2. - С. 57-62.
29. Изучение фенольного состава, подземных органов «сабельника болотного / О. Л. Жукова и др. // Вестн. МГУ. Сер.2. 2006. - Т. 47, № 5. - С. 342345.
30. Ингибирующее действие комарумана пектина сабельника болотного Сотагит palustre L. и его фрагментов на адгезию нейтрофилов человека к фибронектину / С. В. Попов и др. // Биохимия. - 2005. - Т. 70, вып. 1. - С. 133-138.
31. Камелин, Р. В. Сабельник — Сотагит L. // Флора Восточной Европы. Т. X. СПб. : Мир и семья; Издательство СПХФА, 2001. - С. 310, 393-394.
32. Клышев, Л! К. Флавоноиды растений (распространение, физико-химические свойства, методы исследования) / Л. К. Клышев, В. А. Бандю-кова, Л. С. Алюкина. Алма-Ата : Наука, 1978. - 220 с.
33. Кобелева, Т. П. Сотагит Ь. — Сабельник // Флора северо-востока европейской части СССР. Семейства Nymphaeaceae- Hippuridaceae. Т. III. Л. :< Наука, 1976.-С. 121-122.
34. Косман, В. М. Идентификация фенольных соединений растительного происхождения методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии: дис. . канд. фарм. наук : 15.00.02 / В. М. Косман. СПб., 1997.-147 с.
35. Кретович, В. JI. Биохимия растений / В. JI. Кретович. М. : Высш. шк., 1996.-520 с.
36. Кузнецова, М. А. Использование растений в народной медицине / М. А. Кузнецова.-М: : Высш; шк., 1994; 142 е.
37. Курбатский, В: И: Comarum Ь. Сабельник // Флора Сибири. Rosaceae: - Новосибирск : Наука. Сиб. отд-ние, 1988 -- С. 35-371
38. Куркин, В. А. Фепилиропаноиды лекарственных растений. Распространение, классификация, структурный анализ, биологическая активность / В^ А. Куркин // Химия природных соединений. 2003. - № 2. - С. 87-110.
39. Лантратова, А. С. Сабельник болотный {Comarum palustre) в Карелии / А. С. Лантратова, Г. Л. Ганюшкина // Бюллетень Главного ботанического сада. М. : Наука, 2003. - Вып.185. - С. 83-86. <
40. Лекарственные растения Сибири для лечения сердечно-сосудистых заболеваний7 Н. В. Казаринова и др.. Новосибирск : Наука, Сиб. отд-ние, 1991.-340 с.
41. Малюк, Е. В. Содержание флавоноидов и оксикоричных кислот в траве Comarum palustre L. различных экотипов / Е. В. Малюк, О. Н. Денисенко // Медицинский вестник Башкортостана. Уфа : Изд-во БГМУ, 2006. - С 148150.
42. Махлаюк, В. П. Лекарственные растения в народной медицине / В. П. Махлаюк. Саратов: Приволжское кн. изд-во, 1993. - 544 с.
43. Методические рекомендации по изучению общетоксического действия фармакологических средств // Ведом. Фармакол. Ком. — 1998. — № 1. — С.27-32.
44. Методы биохимического исследования растений / А. Е. Ермакова и др.. Л. : Наука, 1987. - 430 с.
45. Минаева, В. Г. Лекарственные растения Сибири / В. Г. Минаева. -Новосибирск : Наука, Сиб. отд-ние, 1991.-431 с.
46. Минеральный состав различных органов Comarum palustre L. / Н. П. Холопцева и др. // Раст. ресурсы. 1990. - Т. 26, вып. 2. - С. 228-234.
47. Минина, С. А. Химия и технология фитопрепаратов / С. А. Минина, И. Е. Каухова. М. : ГЭОТАР-МЕД, 2004. - 560 с.
48. Муравьева, Д. А. Полисахариды цветков василька синего / Д. А. Муравьева, В. Н. Чушенко, В. Н. Бубенчикова // Фармация. 1987. - № 2. - С. 2932.
49. Наумчик, Г. Н. Фитохимическое исследование сабельника болотного и приготовление из него некоторых лекарственных препаратов: автореф. дис. . канд. фарм. наук: 15.00.02 / Г. Н. Наумчик. Л., 1964. - 16 с.
50. Никитюк, В. Г. Фитостеролы как биологически активные вещества природных комплексов. Исследования стероидного комплекса препарата «Липохромин» / В. Г. Никитюк, Э. Г. Привалова // Провизор. 1999. - № 8. — С. 3538.
51. Нохрина, Н. Э. Природа и свойства антикоагулянтов из сабельника болотного : автореф. дис. . канд. мед. наук : 14.00.25 / Н. Э. Нохрина. Уфа, 1993.- 18 с.
52. Оводов, Ю. С. Полисахариды цветковых растений: структура и физиологическая активность / Ю. С. Оводов // Биоорг. химия. 1998. - Т. 24, № 7. - С. 483-501.
53. Одуладжа, Дж. О. Разработка технологии лекарственных препаратов из корневищ сабельника болотного: автореф: дис. . канд. фарм. наук: 15.00.01 / Дж. О. Одуладжа. СПб., 2008. - 26 с.
54. Олейников, Д. Н. Методика количественного определения группового состава углеводного комплекса растительных объектов / Д. Н. Оленников, JI. М. Танхаева// Химия растительного сырья. 2006. - № 4. - С. 29-33'.
55. ОСТ 91.500.05.001-00. Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения. — М., 2000. — 65 с.
56. Отто, М. Современные методы аналитической химии (в 2-х томах) / М. Отто // пер. с нем. под ред. А. В. Гармаша Т. 1. М.: Техносфера, 2003. — 416 с. Т. 2. - М. : Техносфера, 2004.-288 с.
57. ОФС 42-0013-03. Правила приемки лекарственного растительного сырья и методы отбора проб. Взамен ГФ XI, вып. 1, С. 267 - М., 2003. - 18 с.
58. Оценка антиоксидантных свойств водных настоев некоторых лекарственных растений и природных лигнинов / А. А. Лапин и др. // Раст. ресурсы. -2008.- Т. 44, вып. 1.- С. 136-141.
59. Пастушенков, Л. В. Лекарственные растения / Л. В. Пастушенков, А. Л. Пастушенков, В. Л. Пастушенков. Л. : Лениздат, 1990. — С. 145-146.
60. Полиенко, Э. М. Фитотерапия в практике лечения нервно-психических заболеваний / Э. М. Полиенко // Фитотерапия и лазеротерапия в XXI веке. Черноголовка (Моск. обл.). М., 1999. - С. 69-72.
61. Полле, А. Я. Выделение и общая характеристика полисахаридов из пижмы обыкновенной, мать-и-мачехи и лопуха войлочного / А. Я. Полле, Р. Г. Оводова, С. В. Попов // Химия растительного сырья. — 1999. № 1. — С. 33-38.
62. Потиевский, Э. Г. Медицинские аспекты применения пектина / Э. Г. Потиевский, А. И. Новиков. М. : Медицинская книга, 2002. — 96 с.
63. Практикум по биохимии: Учебное пособие для студ. вузов / под ред. С. Е. Северина и Г. Л. Соловьевой. М. : Изд-во МГУ, 2005. - 508 с.
64. Практикум по фармакогнозии: Учебное пособие для студ. вузов / под ред. В. Н. Ковалева. Харьков : Изд-во НФаУ, 2004. - 510 с.
65. Препаративная жидкостная хроматография: пер. с англ. / Б. Бидлин-гмейер и др. -М. : Мир, 1990. 360 с.
66. Преч, Э. Определение строения органических соединений. Таблицы спектральных данных / Э. Преч, Ф. Бюльманн, К. Аффольтер. Пер. с англ. -М. : Мир; БИНОМ. Лаборатория знаний, 2006.-438 с.
67. Разветвление галактуронанового кора макромолекулы комарумана, пектина сабельника болотного Comarum palustre L. / Р. Г. Оводова и др. // Биохимия. 2006. - Т. 71, вып. 5. - С. 666-671.
68. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование. Семейство Hych'angeaceae-Haloragaceae / Отв. ред. П. Д. Соколов. JI. : Наука, 1987. - 326 с.
69. Растительные ресурсы России и сопредельных государств: Часть 1 — Семейства Lycopodiaceae — Ephedraceae, часть 2 — Дополнения к 1—7 т. — СПб. : Мир и семья-95, 1996. 571 с.
70. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под ред. Р. У. Хабриева. — М. : ОАО «Издательство Медицина», 2005. С.364-392, 695-707.
71. Сбежнева, В. Г. Способы получения, изучение структуры, анализ полисахаридов, обладающих противоопухолевыми свойствами / В. Г. Сбежнева // Химико-фармацевтическое производство. 1998. — Вып. 6. - С. 1-10.
72. Сернов, Л. Н. Элементы экспериментальной фармакологии / Л. Н. Сернов, В. В. Гацура. М. : Медицина, 2000. - 352 с.
73. Скляревская, Н. В. Сравнительное исследование сырья: трава и корневища сабельника болотного (Comarum palustre L.) / Н. В. Скляревская, Н. В.
74. Сыровежко, Е. Г. Шеховцова // Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 85-летию академии «Выпускник фармацевтического ВУЗа (факультета) в прошлом, настоящем и будущем». — СПб.: СПХФА, 2004. С. 195-198.
75. Скляревская, Н. В.Полисахариды сабельника болотного Comarum palustre L. / Н. В: Скляревская, JI. Ф. Стрелкова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. — Пятигорск, 2007. -Вып. 62.-С. 111-112.
76. Скляревская, Н. В. Состав и структура полисахаридных комплексов Comarum palustre L. / Н. В. Скляревская, Л'. Ф., Стрелкова, А. Б. Зеленцова // Растительные ресурсы. 2008. - Т. 44, вып.З. - С. 83-89.
77. Скляревская,. Н;. В. Фенолкарбоновые кислоты надземной? части; Сотагит palustre Е. (Rosaceae) I Н! ВI Скляревская;. А; И. Тулайкин, ИШ-i Чё-месова?//Растительные:ресурсы: 2009ь- Т. 45; вып^З; —С. 97-101'.
78. Содержание № состав суммарных водорастворимых полисахаридных комплексов>вшадземной1часта^'ат/г/т^/6г/тг'Е. и< Galeobdolonduieum^yds':./ BL С.Бёрезина?юдр(.|//Еаст. ресурсы;.- 20031—Т. 39; вып. 1.-С169-76;
79. Справочник биохимика: пер: с: англ. / Р1 Досон и«др:.1- М: ::Мйр, 1991.-544 с.100! Справочник по>ботанической«микротехнике: Основышеметодьп/ Р!:.П1 Барыкина*; шдр:.1- М- : ИздгВО?МРУ, 2004t 3=12 с.
80. Трещалина, Е. Mi Противоопухолевая активность веществ природного происхождения / Е. М: Трещалина-—Ml :;.Практическая медицина;.2005. -272 с.
81. Фармакогностическое изучение сабельника болотного (Сотагит palustre L.) / Н: В. Скляревская и др. // XT Российский национальный конгресс «Человек и-лекарство»: тез. докл: М;, 2004, — С! 836:
82. Фитопрепарат «Артрозанет» в комплексной? терапии заболеванийопорно-двигательного аппарата / С. К. Сапожникова и др. // VIII Международный съезд Фитофарм 2004, Миккели, Финляндия. СПб., 2004. - С. 581582.
83. Фитохимический и товароведческий анализ лекарственного растительного сырья. Методические указания к лабораторным занятиям по фармакогнозии / под ред. JI. С. Теслова. СПб. : Изд-во СПХФА, 2005. - 152 с.
84. ФС 42 1730 - 86 «Масло облепиховое».
85. Хаззаа, И. X. Экстрагирование липофильных БАВ из травы зверобоя водно-масляными эмульсиями / И. X. Хаззаа, В. А. Вайнштейн, Т. X. Чибиляев // Химико-фармацевтический журнал — 2003. Т. 37, № 7. - С. 20-23.
86. Ходжаева, Ml А. Углеводы Allium. I. Выделение и характеристика полисахаридов / М. А. Ходжаева, 3. Ф. Исмаилов // Химия природных соединений. 1979. - № 2. - С. 137-142.
87. Цвелев, Н. Н. Определитель сосудистых растений Северо-Западной России (Ленинградская, Псковская и Новгородская области). СПб. : Изд-во СПХФА, 2000.-781 с.
88. Чемесова, И. И. Определение содержания дубильных веществ в корневищах Comarum palustre L. и настойки из него спектрометрическим методом
89. И. И. Чемесова, Д. В. Чижиков // Раст. ресурсы. 2004. — Т. 40, вып. 3. - С. 122-128.
90. Черепанов, С. К. Сосудистые растения России и сопредельных государств (в пределах бывшего СССР) / С. К. Черепанов. СПб. : Мир и семья, 1995.-С. 854.
91. Шипулина, JI. Д. Изучение противовирусной активности фракций из сабельника болотного / Л. Д. Шипулина // XI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: тез. докл. М., 2004. - С. 902.
92. Якубов, В. В. Сабельник Comarum L. // Сосудистые растения советского Дальнего Востока. - СПб. : Наука, 1996. - Т. 8. - С. 166.
93. A Universal HPLC method for the determination of phenolic acids in compound herbal medicines / D. Wen et al. // J. Agric. Food Chemistry. 2005. -Vol. 53, № 17. - P. 6624-6629.
94. Anti-inflammatory activity of the pectic polysaccharide from Comarum palustre / S. V. Popov et al. // Fitoterapia. 2005. - Vol. 76, № 3. - P. 281-287.
95. Atlas Florae Europaeae. Distribution of Vascular Plants in Europe. 13. Rosaceae / A. Kurtto, R. Lampinen, L. Junikka (eds). Helsinki, 2004. - 301 p.
96. Ball, P. W. Potentilla L. / P. W. Ball, B. Pawlowski, S. M. Walters // Flora Europaea. Vol. 2. Rosaceae to Umbelliferae. Cambridge, 1968. - P. 39.
97. Bate-Smith, E. C. Chromatography and taxonomy in the Rosaceae / E. C. Bate-Smith // Bot. J. Linn. Soc. 1961. - Vol. 58, № 370. - P. 39-54.
98. Benson, J. R. Some recent advances in amino acid analysis / J. R. Benson // Instrumentation in amino acid sequence analysis. London, New York, San Francisco. - 1975. - P. 1-^0.
99. Bueno, L. Visceral perception: inflammatory and non-inflammatory mediators/L. Bueno//J. Fioramonti Gut.-2002.-Vol. 51, suppl. l.-P. 19-23.
100. Condensed vegetable tannins: biodiversity in structure and biological activities / T. De Bruyne et al. // Biochem. System. Ecol. 1999. - Vol. 27, № 46. -p. 445-459.
101. Differential effect of protein-bound polysaccharide (PSK) on survival ofexperimental murine tumors /1. Algarra et al. // J. Exp. And Clin. Cancer Research. — 19991— Vol. 18, № 1. — Pi 39-46. <
102. Flavonoids inhibit myelin phagocytosis by macrophages; a structure-activity relationships study / J.A. Hendriks et al. // Biochemical Pharmacology. — 2003.-Vol. 65.-P. 877-885.
103. Flora of the Canadian Arctic Archipelago: Descriptions, Illustrations, Identification; and Information Retrieval / S1G. Aiken et al. [Электронный ресурс]^ Toronto, 2003. — Режим доступа: http://www.mun.ca/biology/delta/ arcticf/'. - Загл. с экрана. ,
104. Guillen, A. Potentilla // Flora iberica: plantas vasculares de la Peninsula Iberica e Islas Baleares. Vol. VI. Rosaceae / F. Munoz Garmendia; Felix Navarro (eds). Madrid : Real Jardfn Botanico, CSIC, 1998. - p. 103-104.
105. Harborn, J. B. The flavonoids: advances in research / J. B1 Harborn, T. J. Mabiy. Eondon; New York, 1982. - 744 p.
106. HPLC-reparation and wave-length area ratios of more than 50 phenolic acids and fiavonoids / W. L. Banwart et all. // Chem: Ecol. 1985: - Vol. 11, № 3. -P. 383-395. ;
107. Hutchinson, JI The genera of flowering plants. Vol. 1. Dicotyledons / J. Hutchinson. Oxford : Clarendon Press, 1964.-P. 174-198.
108. Isolation and biological activities of an antineoplastic protein-polysaccharide complex (PS4A) obtained from Mycobacterium vaccae / X. Tian et al. // Anticancer Research. 1999. - Vol.19, № la. - P. 237-243.
109. Isolation and characterization of plant cell walls and cell-wall components / W. S. York et al. // Meth. Enzymol. 1986. - Vol. 118. - P. 3-40.
110. Kalkman, C. Rosaceae // The families and genera of vascular plants, vol. 6 / K. Kubitzki (ed.). Berlin, 2004. - P. 343-386.
111. Mabry, T. J. The systematic identification of flavonoids / T. J. Mabry, K. R. Markham, M. B. Thomas. New York, 1970. - P. 41-353.
112. Magee, D. W. Flora of the Northeast / D. W. Magee, H. E. Ahles. New York, 1999.-243 p.
113. Markham, K. R. Techniques of flavonoid identification / K. R. Markham. London : Academic Press, 1982. - 113 p.
114. Meusel, H. Vergleichende Chorologie der zentraleuropaischen Flora. B.I. / H. Meusel. Berlin, 1965. - S. 174-179.
115. Ikan, R. Natural products: a laboratory guide / R. Ikan. — 2nd ed.- London : Academic Press, 1991. 360 p.
116. Persoon, С. H. Sunopsis plantarum seu Enchiridium botanicum / C.H. Persoon. Paris, 1807. - P. 57-58.
117. Phylogeny and classification of Rosaceae / D. Potter et al. // PI. Syst. Evol. 2007. - Vol.266. - P. 5^13.
118. Pigments in plants / C. Gzygan (ed.). Stuttgart, New York, 1980. - 4481. P
119. Protective effect of comaruman, a pectin of cinquefoil Comarum palustre L. on acetic acid-induced colitis in mice / S. V. Popov et al. // Dig. Dis. Sci. — 2006. -Vol. 51, № 9. P. 1532-1537.
120. Protective effect of gossypitrin on carbon'tetrachloride — induced in vivo hepatotoxity / G. Perez-Trueba et al. // Redox Rep. 2003: - Vol. 8, № 4. - P: 215221.
121. Rice-Evans C.A., Miller N.J. Structure antioxidant activity relationships»of flavonoids / Flavonoids in helth and diseases, 1999. Chapter 5. — P. 199-219:154:Rafinesque, C. S. Flora Telluriana, part 2 / C. S. Rafinesque. -Philadelphia, 1836.-P. 55-56.
122. Robertson, K. R: The genera of Rosaceae in the southeastern United State / K. R. Robertson // J. Arnold Arboretum. 1974. - Vol. 55, № 3. - P. 344-401.
123. Shaharzad, S. Determination of some pharmacologically active phenolic acids in! juices by high performance liquid chromatography / S.Shaharzad, I. Bitsch // J. Chromatogr. 1996. - Vol. 741. - P. 223-231.
124. Sojak, J. Notes- on Potentilla IV. Classification of Wolfs group "Potentillae trichocarpae" / J. Sojak // Candollea. 1987. - Vol. 42, № 21 - P. 491500.
125. Sterols in the herb and rhizomes from Comarum^ palusrte L. / A. Socolowska-Wozniak et al. // Herba polonica: 2002. - Vol: 48, № 4. - P. 210-213.
126. The phylogeny of Rosoideae (Rosaceae)* based on sequences of the internal transcribed spacers (ITS) of nuclear ribosomal DNA and the trnL/F region of chloroplast DNA / T. Eriksson et al. // Int. Jour. Pi: Sci. 2003. - Vol. 164, № 2. -P. 197-211.
127. Torrey, J. Flora of North America, Vol. 1 / J. Torrey, A. Gray. New York : Wiley & Putnam, 1840. - P. 424-447.
128. Usov, A. I. Polysaccharides of algae. Polysaccharide composition of several* calcareous red algae: isolation of alginate from Gorallina pilulitara / A. I. Usov, M. I. Bilan, N. G. Klochkova I I Bot. Marina. 1995. - Vol. 38, № 3. - P. 43-51.
129. Zheng-yi, W. Rosaceae / W. Zheng-yi, P. H. Raven // Flora of China : English-language version. / B. Bartholomew [et al.] (eds). — St. Louis : MBG Press, 2003.-Vol. 9.-500 p.