Автореферат и диссертация по медицине (14.00.27) на тему:Фитодинамическая терапия экспериментальных опухолей печени

Па правах рукописи Дли служебного ноль ¡опанпм

№ оз^.

ГОЛОЩДПО» РОМАН СГГПТ.Ш1Ч

РГБ ОД

V-:; ГГ0

ФОТОДИПЛМИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ОПУХОЛЕЙ ПЕЧЕНИ

(14.00.27 - хирургия 1 4.00.14 - онкология)

Автореферат диссертации на соискание ученой сгспсмм кандидата медицинских наук

14 ОС К К А 200!)

1'aGoia выполнена в Московской Медшшнскон Академии им И.М_Ссмснова Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Э.И. I аш.лерин доктор медицинских наук Т.Г. Дюжсва

Официальные оппоненты:

Док юр медицинских наук, профессор Ю.И. Hanoi ко Доктор медицинских наук, профессор С.С. Харнас

Педущее учреждение - Институт хирургии им. A.B. Вишневского РАМН

Защита состоится «_»_2000 г. п « » часов на заседании

Диссертационного совета Д.074.05.02 в Московской Медицинский Академии им. U.M. Сеченова (1 19881, Москва, ул. Б. Пироговская, дом 2/6) С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (119881, г. Москва, Зубовская площадь, дом I)

Автореферат разослан «_»____2000 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор A.M. lllyjiyi

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЛВОТЫ.

Актуальность проблемы.

Поиск и сопершенстновамие способов лечения злокачественных опухолей печени является актуальной проблемой современной медицины. Рост числа больных опухолями печени, невысокая эффективность известных способов лечения (хир>ргичсское лечение, лучевая и химиотерапия), обусловленная поздней лиагноешкои и резистентностью опухолей к лечению (A.M. Граиов, А.Е. Борисов 1986, H.H. Трапезников 1990, III.И. Каримов 1992, L.N. Blumgart 1994), послужили основой для поиска новых подходов к лечению этого заболевания.

Ii последние годы в терапии злокачественных опухолей интенсивно развивается новое направление, получившее название фотодииамическая терапия (ФДТ).

В основе ФДТ лежит пзаимодейстпне фотосенсибилнзатора. способного накагипшам.ся в опухоли и светового излучения определенной длимы полны, в peiVJH.rare чет происходит фотохимическая реакция с образованием синглстпого кислорода п других свободных радикалов. которые обладают высокой hito токсической активностью.

И настоящее время фотодииамическая терапия с успехом используется для 1СЧС1ШЯ больных с опухолями кожи, дыхательной, пищеварительной и выделительной :пстем (J. Kelly 1976, Y. Hayata 1980, A. Sibille 1991, B.B. Соколов 1999).

Клинический опыт применения ФДТ с целью лечения опухолей печени нсутствуст. ")ю обусловлено анатомическим расположением печени, отсутствием |ффективпых методик лазерного облучения интрапаренхиматознмх опухолей, а также пособов введения фотосенсибилизаторов, обеспечивающих преимущественное скопление их в опухоли печени. Существуют единичные работы по изучению ффективности ФДТ экспериментальных опухолей печени.

В большинстве стран в качестве фотосенсибилизатора используется производное смагонорфирина с различными фирменными названиями (фотофрин -1, пгемаюпорфирпновый эфир или фотофрин -2, фотосан). В России для ФДТ с 1992 .Via применялся первый отечественный фотосенсибилизатор на основе :матопорфмрнна - фотогем. разработанный в МГАТХ'Г им. М.В. Ломоносова [38].

В 1994 году в ГНЦ РФ "ПИОППК" под руководством чл.-корр. РАН, проф. .П.Норожцопа был синтезирован фотосенсибшшзатор второго поколения - фогосснс Е>С) - сульфированный фталоцпанин алюминия. Фотосенс в отличие от фогогема >ладасг высокой фотдннамичсскон акгивпосп.ю в красной области спскгра.

наличием интенсивного максимума поглощения в более длинноволновой час! спектра (675±2 им), то есть в районе большей световой проницаемости, «п обеспечивает развитие фотодинамического эффекта на большую глубину, до 1 см. Пр использовании других фотосеисибилизаторов (фотофрин, фотогем, фсофорбп, развитие фотодинамического эффекта происходит лишь на глубине 3-4 мм в ткаш которая подвергается облучению.

Важным вопросом комплексной терапии опухолей является способ введет: химиоирепаратов и фотосенсибилизаторов. Известные по данным литературы метод введения препаратов при лечении злокачественных опухолей (внутривенньи внугрнартериальиый, внутрибрюшиниый, впутриплевральный) сопровождают высокой общей токсичностью. Применяемые для лечения опухолей печени метод химиоэмболизации долевых ветвей воротной вены и печеночной артерии (Golstein 1 al., 1976; A.M. Гранов 1996) позволяют концентрировать препараты в опухоли, одиак не приводят к снижению общей токсичности вследствие того, что они быстр вымываются из здоровой паренхимы печени в системный кровоток. Учитывая то. чг фотосенсибилизаторы обладают высокой токсичностью, их введение пр фотодинамической терапии опухолей печени необходимо осуществлять такт способом, который способствовал их концешрирации в опухоли, предупрежда распространение в системный кровоток, то есть общую фототоксичность и позволя проводить облучение в ранние сроки после введения.

Цель работы

Разработать методику фотодинамической терапии экспериментальных оиухоле печени и оценить ее эффективность.

Задачи исследования

1 Создать модель внутриорганной опухоли печени.

2.Разработать способ введения фотосенсибилизатора, обеспечивающий сп преимущественное накопление в доле-мишени (доле-опухоленосителе) печени.

3.Изучить распределение фотосенсибилизатора «Фотосенс» в доле-мишени печени i других тканях при различных способах введения.

4.Разработать методику лазерного облучения виутрнорганных опухолей печени npi различных способах введения фотосенсибшнпатора.

5.Изучить результаты фотодинамической терапии экспериментальных опухолей печени.

Научная новизна

Впервые разработана методика фотодинамической терапии (ФДТ) •жсперимепталышх опухолей печени, включающая использование отечественного фогосспсибилизатора «Фотосенс» и доказана ее эффективность.

Впервые показана возможность создания внутриорганной опухоли печени с использованием взвеси опухолевых клеток перевитого подкожно альвеолярного слизистого рака (штамм РС-1) и изучена кинетика роста опухоли.

Разработан селективпо-окклюзионный способ введения фотосенса в сосуды доли-опухоленосителя печени. Изучено распределение фотосенса в опухоли, окружающей опухоль паренхиме печени, интактной доле печени и коже крыс и проведен сравнительный анализ с результатами распределения фотосенса при системном внутривенном введении.

Показано преимущество селективно-окклюзионного метода по сравнению с системным внутривенным введением фотосенса: возможность концентрации фотосенсибилизатора в опухоли и окружающей опухоль паренхиме печени и проведения облучения в ранние сроки после введения препарата (15 мин).

Изучены различные параметры (мощность, световая доза) и способы (дистанционное, внутритканевое, монопозиционное и полипозиционное) облучения опухоли печени при фотодииамической терапии. Показано, что выбор способа облучения зависит от расположения опухоли печени: при поверхностном расположении опухоли возможно проведение дистанционного облучения, при внутрипаренхиматозном расположении опухолевого узла целесообразно проведение внутритканевого облучения.

Проведен сравнительный анализ результатов фотодииамической терапии экспериментальных опухолей печени при монопозиционном и полипозиционном облучении. Показано, что монопозиционное облучение приводит к развитию тотальных и массивных некрозов в опухоли печени к 3 суткам после лечения, однако не предотвращает дальнейшего роста опухоли. Полипозиционное облучение имеет преимущества перед монопознционпом, особенно при размерах опухолей более 0,5 см в диаметре, так как наиболее полно воздействует как па опухоль, так и на окружающую опухоль паренхиму печени и приводит к торможению роста опухоли на 81.3%, наблюдаемому через 21 сутки после лечения.

Практическая значимость

Разработана новая модель внутриорганной опухоли печени у крьк (альвеолярный слизистый рак печени крыс, штамм РС-1, по гнстологичсскот структуре являющийся холангиоцеллюлярной карциномой), которая характеризуете! солидным ростом, 83,6%-ной прививаемостью и может быть использована [ экспериментальной онкологии.

Определены сроки проведения фотодинамической терапии послс шпрапаренхиматозной прививки альвеолярного слизистого рака. кот орыс определяются размерами опухоли, соизмеримыми с глубиной внутриткансвогс проникновения лазерного луча при использовании фотосснсибилизатора «Фотосенс» н началом стадии экспоненциального роста опухоли в печени.

Разработана методика облучения альвеолярного слизистого рака печени при селективно-окклюзионном и пункционном введении фотосенса. Показано, что при селскгивно-окклюзионном способе облучение следует проводить через 15 минут после введения фотосенса (максимальное накопление препарата в опухоли), а при пункционном введении - через 2 часа послс инъекции фотосснсибилизатора в опухоль. Доказана необходимость экранирования зоны облучения для предотвращения 1ермического повреждения окружающих органов и тканей.

Показано, что расположение опухоли (внутрипеченочное или поверхностное) необходимо учитывать во время изучения распределения фотосеиса, а также при фотодиагностикс и фотодинамической терапии злокачественных опухолей печени, так как истинные показатели накопления фотосснсибилизатора можно регистрировать лишь в поверхностно расположенной опухоли, тогда как при внутрнпеченочном расположении опухолевого узла регистрируются показатели накопления фотосенснбнлизатора в паренхиме печени, покрывающей опухоль, которая концентрирует препарат в большей степени, чем опухоль.

Предложены критерии для выбора методики облучения. Ими являются размеры опухоли и характер ее расположения в опухоли. При размерах опухоли менее 5 мм в диаметре применяют монопозиционное облучение. Опухоли больших размеров облучают из нескольких позиций. При внутрипаренхиматозном расположении опухоли проводят внутритканевое облучение с использованием интерстициалыюго диффузора. Облучение опухолей, расположенных на поверхности печени, проводят диффузорами для дистанционного воздействия.

Апробация материалов диссертации

Основные положения работы доложены на международной конференции!! «Диа! ностика и лечение опухолей печени» (г. Санкт-Петербург, 1999 г.) и VIII международной конференции хирургов-гепатологов стран СНГ «Вахидовскпе чтения -2000» (г. Ташкент, 2000 г.).

По теме диссершции опубликовано 2 печатные работы.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Объем и структура работы.

Диссертационная работа изложена на 195 страницах машинописного текста, иллюстрирована 21 рисунком. 28 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных наблюдений, заключения, выводов и списка литературы, включающего 175 источников, в гом числе 132 зарубежных.

Материал и методы.

Проведено 529 экспериментальных исследований на 370 беспородных крысах-самцах массой 90-200 г, полученных из питомника "Столбовая " и содержащихся в вивариях МНИОИ им. Г1.А. Герцена.

Общая характеристика исследований представлена в таблице 1.

Таблица 1.

Общая характеристика экспериментальных исследований.

N п\п Вид эксперимента Число крыс

1. Моделирование внутриорганной опухоли печени 340

2. Изучение кинетики роста альвеолярного 20

слизистого рака в печени.

3. Разработка методики селективно-окклюзионного

введения фотосенса 20

4. Изучение распределения фотосенса в тканях. 21

5. Изучение результатов фотодинамической терапии

опухолей печени. 128

Всего животных. 370

Всего экспериментов. 529

Все исследования па животных проводили согласно принципам Российского национального комитета но бионике 1'АН.

Операции проводили в условиях общего обезболивания: бриетал 50 мг/кг внутримышечно.

Методика моделирования виутриорганной опухоли печени у крыс.

Для создания внутриорганной опухоли печени (ОГ1) использовали штаммы асцитной гепатомы Зайделя (АГЗ) и альвеолярного слизистого рака печени крыс (штамм РС-1). Прививку осуществляли путем интрапаренхиматозной имплантации в долю-мншепь печени крысы 0,1 мл 20%-ной взвеси опухолевых клеток РС-1 и 0.2 мл асцигической жидкости, содержащей клетки ЛГЗ.

Кинетику роста альвеолярного слизистого рака в печени изучали следующим образом: на 4, 11, 18, 25 и 32 сутки после интрапаренхиматозной имплантации взвеси опухолевых клеток крыс вскрывали, проводили макроскопическое исследование печени, после чего долю-опухоленоситель забирали, фиксировали в 10%-ном растворе формалина и направляли в отделение патоморфолопш ОНЦ им. H.H. Блохина для гистологического исследования.

Методики введения фотосенсибилизатора «Фотосенс».

1. Селективно-окклюзионный способ введения фотосенса.

Селективно-окклюзионный способ введения фотосенса в долю-мишень (долю-опухоленоситель) печени был предложен профессором Э.И. Гальпериным с целью быстрого накопления фотосенса в опухоли и уменьшения поступления препарата в системный кровоток, что может предотвратить развитие общей фототоксичности, а также создаст условия для проведения облучения в ранние сроки после введения препарата.

Способ предполагал введение фотосенса в афферентный сосуд доли-мишени (онухоленосителя) печени (долевую ветвь воротной вены или печеночной артерии) с временной окклюзией этой доли путем наложения сосудистых зажимов на указанные ветви афферентных сосудов и долевую ветвь печеночной вены для предотвращения отюка крови. Использование долевой ветви печеночной артерии для введения препарат у крыс не представлялось возможным в виду малого диаметра сосуда.

Методика селективно-окклюзионного введения фогосенса заключалась в следующем: крысам выполняли срединную лапаротомшо, мобилизацию доли-мшпепи

печени (центральная или верхняя латеральная) путем рассечения связок, выделяли афферентные (ветвь воротной вены и печеночной артерии) и эфферентные (ветвь печеночной вены) сосуды доли-мишени печени, брали их на турникеты. Производили пункцию ветви воротной вены н вводили в нее препарат в дозе 0.5 и 1,0 мг/кг в объеме 0,6 мл, одновременно прекращая кровоток (отток и приток) путем наложения сосудистых зажимов на ветвь воротной вены (проксимапьнее места пункции) и долевые ветви печеночных артерии и вены. Длительность окклюзии составляла 5 минут. Кровоток восстанавливали путем снятия зажимов с сосудов.

Для оценки эффективности метода было изучено распределение фотосенса в опухоли, доле-мишени печени (доле-опухоленосителе), интактной доле печени и коже крыс при системном внутривенном и селективно-окклюзионном способах введения.

2. Пункциоппое введение фотосенса в опухолевый узел.

Крысам производили срединную лапаротомию, пунктировали центр опухоли, после чего фотосенс вводили непосредственно в опухолевый узел в объеме 0,3 мл в дозе 0,5 мг/кг.

Методики изучения распределения фотосенса в тканях крыс.

Распределение фотосепса в опухоли, окружающей опухоль паренхиме печени, интактной доле печени и коже крыс изучали в МНИОИ им. П.Л. Герцена под руководством доктора медицинских наук профессора П.В. Соколова путем исследования специфической нормированной флюоресценции (НФ) ¡ютосенсибилизатора контактным методом на лазерной диагностической установке 'Спектр" (ТОО "Кластер") и аппарате «ЛЭСА-7» («Биоспек», ИОФ РАН, Москва) 1ерез 5, 10, 15, 35 мин и 24 часа после введения селективно-окклюзионным или исгемным внутривенным способом. Регистрацию НФ проводили в 3 точках [зучаемой ткани и рассчитывали средние значения. При оценке распределения ютосенса в опухоли учитывали ее локализацию в доле печени (внутрипеченочное, на овсрхпости доли печени, смешанное).

Методика облучения альвеолярного слизистого рака печени при фотодинамической терапии.

Фотдипамическую герашпо альвеолярного слизистого рака неченм проводи, на 11 суIки после прививки опухоли.

При сслекгивно-окклюзиошюм способе облучение проводили через 15 мин после введения фотосснса.

При пункциопном способе с целью выбора оптимального ишерпала меж, введением фоюсенсибилизатора и облучением, облучение опухоли проводили чер 15 минут н 2 часа после введения фотосснса. Полагали, что временной интервал меж, введением фотосенса и проведением облучения будет способствовать рапномсрпо|\ распределению фотосснса в опухоли.

Ныли использованы следующие параметры облучения: ^=670 им: мощност ь облучения от 100 до 200 мВт/см , световая доза 50 Дж/см2 (п=б). 100 Дж/см2(п=5); время облучения 4 мин 20 сек, 8 мин 40 сек и 12 мин 50 сек.

Важно отметить, что при равной световой дозе время дистанционного облучеш опухоли было больше, чем внутритканевого облучения и достигало 26 минут.

При фоюдинамической терапии применяли внутритканевое пли дистанцпошн облучение, что определялось расположением опухоли в доле печени. II; впутрипечепочпом расположении опухоли применяли внутритканевое облучение помощью пшерстициалыюго цилиндрического диффузора длиной 0.5 и 1 см. даюши матрицу света на 360°), при поверхностном - дистанционное (с помощью диффузор оборудованного линзой, позволяющей создать пятно облучения соизмеримое размерами ОП), при смешанном - сочетание внутритканевою и дистанционно! облучения.

При разрабшке методики фотодинамической терапии (ФД'Г) альвеолярно1 слизистого рака печени крыс использовали монопозиционное и нолииозициошк облучение.

При мопопозиционном способе облучение осуществляли из одной иознци расположения диффузора. Этот способ применяли на начальных эшнах разрабогк метода ФД'Г опухолей печени. В дальнейшем этот вид облучения применяли лишь ир лечении опухолей малых размеров (менее 4 мм в диаметре).

С целью повышения эффективности ФДГ использовали полипознциошк облучение, при. котором диффузор 1юслед0ва1елы10 перемещали по oi ношению

опухоли, что позволяло подвергнуть воздействию лазерного луча все участки опухоли. При этом в зону облучения входила часть паренхимы печени, окружающей опухоль. Число позиций облучения составляло от 2 до 4, что определялось числом опухолевых узлов в доле печени (более одного узла) и их размерами (более 4 мм в диаметре).

С целью предозвращения термическою поражения окружающей опухоль паренхимы печени и других тканей во время облучения альвеолярного слизистого рака печени крыс производили экранирование зоны воздействия с помощью черной пленки, в которой формировали «окно», соответствующее размерам облучаемой поверхности печени.

Методика изучения влияния ¡-минутной окклюзии сосудов доли-опухоленосителя печени па результаты фотодинамической терапии опухолей печени.

Псем животным фотосепс вводили внутривенно системно (в вену хвоста) в объеме 0,6 мл в дозе 1 мг/кг. Через 24 часа после введения фотосенсибилнзатора проводили фогоднпамичсскую терапию, причем животным опытной группы облучение осушесшляли на фоне предварительной 5-мпнугпой окклюзии афферентных и эфферентных сосудов доли-опухолепосителя, а животным контрольной группы - без предварительной окклюзии. ФДТ проводили путем моноиозиционного внутритканевого облучения опухоли печени. Результаты оценивали на 7 сутки после лечения: измеряли размеры опухоли, вычисляли объем опухоли, рассчитывали показатель торможения роста опухоли и проводили гистологическое исследование долн-опухоленосителя печени.

Методика оценки результатов фотодинамической терапии ачьвеолярного слизистого рака печени крыс.

Результаты фотодинамической терапии оценивали на 3 и 21 сутки после лечения как при селективно-окклюзнонном, так и при пункционном введении фотосенса. На 3 сутки, прежде всего, рассматривали принципиальную возможность повреждения опухоли и окружающей опухоль паренхимы печени, когда вероятность обнаружения альтеративных изменений в ткани высока, переносимость животными лечения, оценку различных параметров монопозиционного облучения опухоли. Для этою оценивали состояние животных во время, и после лечения, проводили визуальный осмотр и гистологическое исследование опухоли и окружающей опухоль паренхимы печени. На 21 сутки после лечения оценку эффективности бинарной терапии производили с

помощью макро- и микроскопическою исследования опухоли и окружающей омухо; паренхимы печени, рассчитывали обьем опухоли печени, а также показа[cj торможения роста опухоли (ТРО).

Обьем опухоли рассчитывали по формуле (Carlsson ct all., 1983):

V„„= (Л x В2) х л/6

V„„- объем опухоли Л - максимальный диаметр опухоли В — минимальный диаметр опухоли п=3,14

11оказа1сль торможения pocia опухоли рассчитывали по формуле:

ТРО (%) = [(РО К0Мф„ль - РО о„Ь1Г)/РО к,,,,,,,,,,,,.] х 100 % , где

ТРО - торможение роста опухоли

РО „,,„,— объем опухоли (мм1) у крыс опытной группы

РО „„„роль - объем опухоли (мм') у крыс контрольной группы (Контрольные группы составили крысы с опухолью печени без лечения, животные, которым проводили облучение без предваршелмюю введения фотосенса и крысы, которым вводили фогосснс, но облучение не проводили).

Значимым терапевтическим эффектом считали торможение роста опухоли па 5' %(З.П. Софыша, Д.Б. Сыркин, Л. Голднп, Л. Кляйп, 1980).

Методика патоморфологических исследований.

Патоморфологическне исследования были проведены в отделепш пагоморфолопш ОНЦ РАМН им. H.H. Блохина под руководством Н.Т. Райхлнпа Гистологический материал (опухоль, ткань печени), полученный от 168 крыс фиксировали в 10%-пом растворе формалина, заливали в парафин, препарать окрашивали гематоксилин-эозином. При микроскопическом анализе материал: обращали внимание на степень повреждения опухоли и окружающей пареихимь печени. Микроскопические критерии степени повреждения опухоли печени был! следующие: ограниченные некрозы - повреждение менее 50% опухолевых клеток i узле, массивные некрозы - более 2\3 опухолевых клеток, тотальные некрозы - по/ микроскопом видны лишь "тени" опухолевых клеток или единичные (до 5^ сохранившиеся клетки.

1Ччу.м.Ким соГ)С11)смпы\ исследовании II м\ обсуждение.

Моделирования внутриорганной опухопн печени.

Исследования показали, что штамм асцитной гепагомы Зайделя не может быть использован для моделирования внутриорганной опухоли печени, так как инграпаренхиматозпая имплантация асцнтнческой жидкости, содержащей клетки ЛГЗ, не сопровождалась развитием опухоли ни у одной из 23 крыс.

Напротив, интрапаренхиматозная прививка опухолевой взвеси альвеолярного слизистого рака сопровождалась развитием опухоли печени у 159 из 190 животных (83,6%).

Изучение кинетики роста альвеолярного слизистого рака в печени показало, что опухоль характеризуется солидным относительно медленным ростом с латентным периодом (до 5 суток после прививки) и последующей фазой экспоненциального роста. Микроскопически опухоль определялась уже к 4 суткам после прививки, на 11 сутки размеры ОП составляли 5-9 мм в диаметре, а к 18-25 суткам опухоль достигала 20 мм в диаметре. Эго позволило определить срок проведения фотодипамнческой терапии - на 11 сутки после прививки, при переходе латентной стадии в экспоненциальную, когда опухоль четко визуализировалась, а ее размеры были сопоставимы с глубиной внутритканевого проникновения лазерного луча при использовании фотосенсибилизатора «Фотосенс»(1 см).

Разработка и обоснование селектияно-окклюзиониого способа введения фотосепса.

1. Анатомические исследования.

В результате проведенных анатомических исследований (п=12) установлено, что печень крыс состоит из 6 долей, каждая из которых имеет артериальное кровоснабжение и венозный приток по воротной вене. Основной объем печени составляют верхняя и центральная доли. Верхняя доля состоит из 2 сегментов, имеющих различное кровоснабжение: верхнего латерального и верхнего медиального.

Было покачано, что долевые артериальные сосуды печени не могут быт использованы для введения фотосенса ввиду их малого диаметра (менее 1 мм) Селективное введение препарата в долю печени у крыс возможно только в вств: воротной вены, так как ее диаметр превышает 1 мм.

Общий ствол воротной вены у крыс имеет диаметр 2-2,5 мм. Ветви ворогпо! вены к верхней латеральной и центральной долям печени расположены впепеченочпо имеют диаметр 1-1,5 мм и доступны для пункции.

Ветви печеночных вен изучаемых долей печени имеют диаметр 2-2,5 мм. Вен; центральной доли печени до впадения в нижнюю полую вену расположен; внепеченочно на протяжение 2-3 мм, на турникет взяга быть не может, однакс доступна для наложения на нее сосудистого зажима. Ветвь печеночной вены верхней латеральной доли в области впадения в нижнюю полую вену хотя и имеет короткий (около 1 мм) внепеченочный участок, однако может быть выделена транспаренхиматозно и взята на турникет. Печеночная вена верхней доли печени расположена в толще паренхимы печени и не может быть временно пережата без повреждения паренхимы печени. Остальные доли печени расположены целиком на нижней полой вене и не могут быть использованы для отработки техники селективпо-окклюзионного введения фотосенса.

Таким образом, для изучения селективно-окклюзионного метода введения фогосенса в долю-мишень печени, согласно выполнению заданных условий, могут быть использованы центральная и верхняя латеральная доли печени крыс.

Для определения объема раствора фотосепса, вводимого селективпо-окклюзионным в кровеносное русло доли-мишени печени (нейтральной доли), были использованы следующие объемы: 0,4; 0,6; и 1 мл (п=8).

В результате проведенных исследований был выбран объем 0,6 мл, не вызывающий увеличения и возможного повреждения паренхимы доли-мишени печени при интенсивном ее окрашивании. Наложение сосудистых зажимов на афферентные и эфферентные сосуды центральной доли печени сразу после введения фотосенса в дозе 1 мг/кг в объеме 0,6 мл в ветвь воротной вены этой доли приводило к интенсивному стойкому окрашиванию паренхимы этой доли печени, при этом другие доли не окрашивались.

Введение 0,4 мл раствора фотосенсибилизатора не вызывало интенсивного окрашивания паренхимы доли-мишени печени, а 1,0 мл - приводило к видимому увеличению обьема доли печени и возможному повреждению паренхимы печени.

Таким образом, селективное введение фотосснса в долю-мишень печени крыс без применения микрохирургической техники возможно только через долевую ветвь воротной вены (диаметр долевой ветви печеночной артерии менее 1 мм), а 5 минутная окклюзия афферентных и эфферентных сосудов доли-мишени печени приводит к стойкому окрашиванию паренхимы этой доли, предупреждая окрашивание других долей печени. Объем 0,6 мл считаем оптимальным для введения фотосенснбилизатора селскшвно-окклюзионным способом в долю-мишень печени крыс.

Для опенки эффективности разработанного метода необходимо было изучить распределение фотосснса в различных тканях крыс.

2. Изучение распределение ботосенеа в тканях крыс.

Изучение распределения ФС п тканях здоровых крыс представлено в таблице 2. Фотосснс вводили в ветвь воротной вены центральной доли печени.

Таблица 2.

Показатели нормированной флюоресценции фотосенса в различных долях печени и коже здоровых крыс при селективно-окклюзионном и системном внутривенном

Время исследования после введения препарата Способ введения фотосенса Показатели нормированной флюоресценции, (у.е.) Место измерения (доля печени)

Центральная (доля-мишень' Верхняя латеральная (интактная) 11равая латеральная (интактная) кожа

10 мин Селективно-окюпозионный Системный внутривенный 141,2144,8 112,6±6,8 55,6±2,1 * 119,5+11,9 76.2+17,1 113,1 ±8.4 6,9+1,2* 15,2+0.9

15 мин Селективно-окклюзионный Системный внутривенный 157.0+39,4 118.3+8,6 70,0+4,6* 106,4±8,6 76,7+17,8 111,5±6.7 10,5+1,1* 19,8±3,6

35 мин Селектнвпо-окклюзиониый Системный внутривенный 165,1 ±39,7 114,0+5,9 99,5+7,9* 122,0±4,6 91,4±8,9 106,0+3,9 11,3+0,5* 21,8+3,8

24 ч Селектнвно-окклюзионный Системный внутривенный 79,9±46,3 133,9+3,8 117,5+6,1 138,6+9,7 99,9±7,2* 134.2+2,0 17,6+2.3 18,4+0,3

* - Различие показателей НФ в идентичных тканях крыс при системном и селективно-окклюзионном введении достоверно - р<0.05.

Из таблицы 2 следует, что содержание фотосеисибилизатора в доле-мишени печени (центральная доля) через 10, 15, 35 минут и 24 часа после селективно-окклюзионного введения по абсолютным значениям было выше, однако достоверно не отличалось от системного введения. В иптактной верхней доле печени в тги же сроки после системного введения содержание фотосенсибилизатора было достоверно больше, чем при селектшшо-окклюзионпом (р<0,05). Эга различия сохранялись и относительно другой интактной доли печени (правой латеральной), однако, различия ввиду значительных отклонений не были достоверными.

В коже через 10, 15 и 35 минут при системном введении фотосенса отмечалось достоверно большее его накопление по сравнению с селективно-окклюзионным (соответственно 15,2+0,9 у.е. и 6,9±1,2 у.е., р<0,05; 19,8+3,6 у.е. и 10,5+1,1 у.е., р<0,05; 21,8±3,8 у.е. и 11,3±0,05 у.е., р<0,05). Через 24 часа показатели нормированной флюоресценции фотосенса в коже как после системного, так и после селективпо-окклюзионного методов введения достоверно не отличались (18,4+0,3 у.е. и 17,0±2,6 у.е., р>0,05), что, вероятно было связано с восстановлением кровотока в доле-мишени печени после снятия окклюзии и перераспределением фотосеисибилизатора в системный кровоток.

Изучение распределения ФС в опухоли и паренхиме доли-опухолеиоентеля печени у крыс с альвеолярным слизистым раком печени при различном расположении опухолевых узлов представлено в таблице 3.

Таблица 3.

Показатели нормированной флюоресценции фотосенса в опухоли нечени н окружающей опухоль паренхиме печенн через 10 минут после введения препарата селективно-окклюзионным способом (п=3).

№ п/п Расположение опухоли в доле печени Расположение датчика при измерении нормированной флюоресценции Показатели нормированной флюоресценции (у.е.)в различных точках

а б в

1 Внутрипеченочное 83,7±18,9 199,1 ±25,9 161,5±39,7

2 На поверхности доли печени 46,1±5,5* - 112,6+6,8

3 Смешанное 53,2±11,9 131,7+35,9 145,2±40,4

* - Различие показателей нормированной флюоресценции фотосенса при поверхностном и внутрипеченочном расположении опухоли достоверно, р<0,05. а - опухоль

б - непосредственно прилежащая к опухоли паренхима печени в - отдаленная от опухоли паренхима доли-опухоленоснгсля печенн

Из таблицы 3 следует, что нормированная флюоресценция фотосепса в опухоли при поверхностном се расположении была достоверно ниже, чем при впугрппсченочноч (соогнетегпепно 46,1+5,5 у.е. и 83.7±|8.9 у.е., р<0,05). Такая же зависимость наблюдалась и мри сравнении показателей НФ в опухоли, расположенной впутрипеченочно н выходящей иод капсулу доли печени, однако достоверности в разнице показателей не было (еоотегствепно 46,1±5,5 у.е. и 53.2+11,9 у.е., р>(),05). Вероятно, это было связано с тем. что при поверхностном расположении опухолевого узла мы снимаем истинные показатели нормированной флюоресценции ФС опухоли, а при ипугриисчепочпом или смешанном его расположении в сферу влияния датчика спектроскопа попадает паренхима печени, покрывающая опухоль, коюрая, по-видимому, накапливает фогосенспбилпзатор более интенсивно, чем опухоль.

Таким образом, локализацию опухоли необходимо учитывать во время изучения распределения фоюсенса при различных способах введения, а также при фотодпагпостике и фотодпиамичсской терапии злокачественных опухолей печени.

Результаты изучения распределения фотосенса в различных тканях крыс с опухолью печени при системном внутривенном и селективно-окклюзионном введении представлены в таблице 4. Использовались крысы с одинаковым расположением опухоли в печени.

Таблица 4.

Показатели нормированной флюоресценции фоюсенса в опухоли и окружающей опухоль паренхиме печени крыс при сслсктнвно-окклюзиопном и системном внутривенном введении фогсенспПнлнзатора в дозе 1 мг/кг.

Мес то измерения Способ введения Показатели нормированной флюоресценции, у.е. Время измерения после введения ФС

10 мин 15 мин 35 мин

Опухоль печени Селективно-окклюзиопый Системный внутривенный 84±|9 46,1+5,5 88+9 65.4+7,4 113+24 70,0+6,1

Окружающая опухоль паренхима печени Селективно-окклюзиопый Системный внутривенный 161,5±39,7 111,2±6,4 178.9+15,2 116.6+5,2* 148,2+20.3 117,1+3

* - достоверность различий показателен нормированной флюоресценции фотосепса в идентичных тканях в одинаковые промежутки времени после селсктивно-окклютиоппого и системного введения фотосенсибнлизатора, р<0.05.

Из таблицы 4 следует, что се.пективно-окклюзионный метод введения по сравнению с системным внутривенным приводит к большему накоплению

фотосенсибилизатора в опухоли печени и окружающей опухоль паренхиме печен через 10, 15 и 35 минут после введения ФС, т.е. способствует концентрац» фотосенсибилизатора в опухоли печени и предупреждает его распространение системный кровоток в ранние сроки после введения (15-35 минут).

Выявлена дозовая зависимость при введении фотосенса сслсктивнс окклюзионным способом. Показатели нормированной флюоресценции фотосенса пр введении его в дозах 0,5 и 1,0 мг/кг представлены в таблице 5.

Таблица 5

Показатели нормированной флюоресценции фотосенснбнлпзагора в опухол печени, окружающей опухоль паренхиме печени и коже уха крыс мри сслсктпвш 0ККЛЮ1И0Н110М введении фотосенса в дозах 0,5 н 1,0 мг/кг.

Место Доза ФС, Показатели нормированной флюоресценции (у.е.)

измерения мг/кг Время измерения после введения фотосепса

5 минут (до 10 мин 15 мин 35 мин

снятия (после снятия (после снятия (после снятия

зажимов) зажимов) зажимов) зажимов)

Опухоль 0,5 46,3±14,6 55,8±11,9 51.9+5,7 56,1 ±9,5

1,0 63±9 84± 19 88±9* 113±24*

Окружающая

опухоль 0,5 28±9 43,2±21,8 52,3+7,8 55,3±7,0

паренхима 1,0 108,5+13,9* 161,5±3 9,7* 178,9+15,2* 148,2+20,3*

печени

0,5 4,9±0,7 6,4±0,9 5,0±1,3 5,9±1,1

Кожа 1,0 6,9+1,2 10,0±1,2* 8,5±0,9* 10,7+1,6*

* - Различие показателей нормированной флюоресценции фотосенса в соответствующи промежуток времени в одинаковых тканях при введении препарата в дозах 1,0 и 0,5 мг/к достоверно, р<0,05.

Из таблицы 5 следует, что при селективно-окклюзионном введении ФС в дозе 1, мг/кг накопление препарата в опухоли через 15 и 35 минут после введения был достоверно выше, чем при введении в дозе 0,5 мг/кг. В окружающей опухол паренхиме печени эти различия наблюдались в течение всего срока исследования.

Доза 1 мг/кг была выбрана для проведения фотодинамической тераии альвеолярного слизистого рака печени крыс.

Полученные данные свидетельствуют о том, что облучение альвеолярног слизистого рака печени крыс необходимо проводить в первые 35 минут поел селектнвно-окклюзионного введения ФС, оптимально через 15 минут, так как в эго срок отмечается максимальное содержание фотосенсибилизатора в окружагаще; опухоль паренхиме печени, его содержание в опухоли достоверно не отличается о показателя 11Ф, регистрируемого через 35 минут после введения, а также еще н

происходит выход нефиксированного в доле-опухолспосителс препарата в сиск-миый кровоток.

Результаты фотодинамической терапии альвеолярного слизистого рака печени крыс при селекппкшо-оккютониом введении фотосепеа.

1. Результаты фогодиначичсском терапии опухолей печени на 3 сутки после

облучения.

Размеры опухолей печени на II суткн после прививки как в группе крыс, которым проводили облучение световой дозой 50 Дж/см2 (п=5), так и в ipyune жнвошых. коюрым проводили облучение свсгоиой дозой 100 Дж/см" (п 6) не отличались: соответственно 76.6±30.8 мм3 и 53.8±34,3 мм', р>0.05. У всех жнвошых опухоли располагались внугрипеченочпо.

Показатели нормированной флюоресценции фотосенса в опухоли и окружающей опухоль паренхиме печени у крыс обеих ipynn через 15 минут после селективпо-окклюзионного введения npermpaia достоверно не отличалась: соответственно 38,8±17,7 у.е. и 22,6±3,8 у.е., р>0.05 (в опухоли) и 41±6.7 у.е. п 21,4±4/> у.е., р>0.05 (в окружающей паренхиме печени).

В течение сеанса облучения крысы вели себя спокойно. Каких-либо реакций. сш1дс!ельсп>ующнх о болевых ощущениях, не тмечено.

Результаты ФДТ на 3 сутки после монопозиционного облучения ОГ1 световыми дозами 50 и 100 Дж/см2 при мощности 200 мВт/см2 на фоне сслективпо-окклюзиошюго введения фотосенса свидетельствовали о возможном повреждении опухоли независимо от уровня световой дозы: у 72.7% животных наблюдали тотальные некрозы опухолевых клеюк, у 9,1% - массивные некрозы, у 18,2% - ограниченные некрозы.

В дальнейших экспериментах по ФДТ альвеолярного слизистого рака мы использовали световые дозы 50 и 100 Дж/см2 и мощность 100, 150 и 200 мВт/см2.

2. Изучение роли экранирования зоны облучения во время фотодннамичеекчй терапии альвеолярного слизистого рака печени на результаты лечения.

Изучение роли экранирования зоны облучения во время фотодинамнческой терапии показало, что у крыс, которым проводили экранировали черной пленкой (п=4), в окружающей опухоль паренхиме печени некрозы не развивались, тогда как в контрольной группе без экранирования (п=4) наряду с повреждением опухоли печени были некрозы в окружающей опухоль паренхиме печени и прилежащих петлях кишечника.

Таким образом, экранирование зоны облучения позволяет предотвратить развитие очагов некроза в окружающей опухоль тканях.

4. Результаты фотодинамнческой терапии опухолей печени на 21 сутки после

облучения.

Изучение результатов фотодинамнческой терапии альвеолярного слизистого рака печени крыс па 21 сутки после мононозиционного облучения опухоли (световая доза 100 Дж/см2, мощность 100 мВт/см2, время воздействия 4 мин 20 сек) (п=20) показало, чю данный способ лечения не эффективен: размеры опухолей увеличивались (соответственно до и на 21 сутки после лечения 159±49,7 мм^ до 892±384,02 мм^, р>0,05), а при гистологическом исследовании, наряду с участками тотального и массивного некроза опухоли печени, отмечались сохранные узлы, особенно, расположенные в периферических участках опухоли, что возможно связано с неполным облучением опухоли вследствие несоответствия размеров опухолевого узла и площади воздействия лазерного излучения.

В дальнейших экспериментах с целью облучения максимального количества опухолевых клеток, как в центре опухоли, так и на ее периферии, был применен способ полнпозиционного облучения опухоли.

Результаты макроскопического исследования доли-опухоленосителя на 21 сутки после нолипозиционного облучения на фоне селективно-окклюзионного введения фогосенса (п=9) представлены на рисунке 1.

■ 11 сутки после припиики опухоли

□ 32 сутки после прививки опухоли (21 сутки после лечения)

Рисунок 1. Размеры опухолей печени в опытной н контрольной группе (лечение не проводили) па 11 и 32 сутки после прививки опухоли.

На рисунке 1 видно, что на 11 сутки после прививки размеры опухолей как в опытной, так и в контрольной группе достоверно не отличались: соответственно 76,97±29,5 и 45,6±16,5 мм', р>0,05. На 21 сутки после ФДТ в опытной группе (п=9) достоверного роста опухоли не было (соответственно до и после лечения 76,97±29,5 и 57,2+25,03 мм3, р>0,05), тогда как в контрольной группе (крысы с ОП без лечения, П--13) отмечался достоверный росг ОП: с 45.6±16,5 до 397.04+41,7 мм3, р<0.05. 1Указатель торможения роста опухоли по сравнению с контрольной группой составил 81,3%. При гистологическом исследовании у 8 из 9 крыс отмечали тотальный некроз опухоли, горда как в кошрольпоп группе у всех животных обнаруживались сохранные опухолевые узлы.

Изучение влияния 5-минутной окклюзии сосудов доли-опухолепосителя при системном внутривенном введения фотосенса на результаты фотодинамической терапии опухолей печени.

Изучение роли 5-минутной окклюзии приводящих и отводящих сосудов долн-опухоленосителя печени при системном внутривенном введении фотосепса на результаты фотодинамической терапии альвеолярного слизистого рака печени крыс (п=13) свидетельствовало о следующем. При прочих равных условиях (световая доза -100 Дж/см2, мощность 200 мВт/см2, время воздействия - 8 мин 40 сек, одинаковые показатели нормированной флюоресценции фотосенса в опухоли и окружающей паренхиме печени) на 7 сутки после облучения у крыс, которым после системного введения фотосенса проводили 5-минутную окклюзию приводящих и отводящих сосудов долн-онухолепоси1еля достоверного увеличения размеров опухоли после лечения отмечено не было (соо1вс1ственно до и после лечения 52,5±1б и 75,7+20,7

мм1, р>0,05), а при гистологическом исследовании опухолей отмечали развит! тотальных некрозов опухолевых узлов. У животных контрольной группы, которы после системного введения фотосенса окклюзии сосудов доли-опухоленосителя I проводили, отмечалось достоверное увеличение размеров опухоли (соответственно л и после лечения 75,7+24,4 и 175,5±40,2 мм3, р<0,05), а при гистологичсско исследовании опухоли были выявлены лишь массивные некрозы.

Таким образом, 5-минутная окклюзия сосудов доли-опухоленосителя нос; введения фотосенса позволяла увеличит!, площадь некрозов опухоли на 15-20% п сравнению с контрольной группой, а также способствовала торможению рост опухоли на 55,3%.

Результаты фотодинамической терапии при пункционном введении фотосена в опухолевый узел.

1. Результаты фотодинамической терапии па 3 суткн после облучения.

Анализ результатов на 3 сутки после монопозиционного внутриткансвог облучения опухоли печени на фоне пупкционного введения фотосснса показа следующее. При микроскопическом исследовании доли-опухоленосителя печени крьн которым облучение проводили через 15 минут после введения фотосенсибилизатора, опухоли обнаруживались как опухолевые узлы с признаками тотального или чащ массивного некроза, так и сохранившиеся опухолевые узлы. Соотношени сохранившейся и некротической опухолевой ткани по площади составляло пример» 1:1, т.е. только 50 % опухолевой ткани было в состоянии некроза.

На 3 сутки после облучения опухоли печени, проведенного через 2 часа поел

введения фотосенса, при .....югнческом исследовании было обнаружено, чп

большинство опухолевых узлов находились в состоянии тотального или массивноп некроза. Более 65% опухолевой ткани было в состоянии некроза. Однако, выявлялис отдельные, преимущественно мелкие, сохранившиеся опухолевые узлы.

В контрольных группах (пункционное введение фотосснса без облучения 1 облучение опухоли без предварительного введения фотосенса) через 3 суток поел! воздействия гистологическая картина была идентичная: обнаруживалиа множественные, иногда очень крупные сохранившиеся опухолевые узлы, в отдельны; опухолевых узлах имелись преимущественно центральные некрозы. Соотношспш

сохранившейся и некротической опухолевой ткани по площади составляло примерно 10:1.

Таким образом, рез)льтаты фотодинамической терапии альвеолярного слизистого рака печени крыс на 3 сутки после лечения на фоне иункционного введения фотосенса непосредственно в опухолевый узел свидетельствовали о возможности развития некрозов опухоли. Кроме того выявлена необходимость соблюдения временного интервала между введением фогосенсибилизагора и проведением облучения. При облучении опухоли через 2 часа после иункционного введения ФС наблюдалось увеличение площади некрозов в опухолях на 15% по сравнению с 15-мнпутпым интервалом.

2. 1'с ¡ульгагы фогодннамнчсскоп терапии на 21 сутки после облучения.

Результаты фотодинамической терапии на 21 сутки после полипозиционного облучения опухоли (световая доза 100 Дж/см2, мощность 150 мВт/см2, время воздействия 4 мин 20 сек), проведенного через 2 часа после пункционного введения фоюсепса представлены на рисунке 2.

120/ 100 80 60 40 20 0

Объем опухоли (мм3)

111 сутки после прививки опухоли

032 сутки после прививки опухоли (21 сутки после лечения)

опытная группа контрольная группа

Рисунок 2. Размеры опухолей печенн в опытной и контрольной группе (лечение не проводили) на 11 и 32 сутки после прививки опухоли.

На рисунке 2 видно, что на II сутки после прививки размеры опухолей в опытной и контрольной (лечение не проводили) группах достоверно не отличались: соответственно 41,3±15.7 мм3 и 23±8,2 мм3, р>0,05. На 21 сутки после ФДТ при макроскопическом исследовании достоверного роста опухоли не было обнаружено (соошектмепно до и после лечения 41,3±15,7 мм3 и 42,45± 13,1 мм3, р>0,05). В

контрольном группе отмечали достоверный роет опухоли: соответственно с 23±8,2 мм3 до 108,7±33,1 мм3, р<0,05.

Показатель торможения роста опухоли в опытной группе составили 60,8% - но сравнению с крысами без воздействия.

Таким образом, представленные результаты фотодинамической терапии альвеолярного слизистого рака печени крыс (штамм РС-1) при сслсктивно-окклюзионном и пункционном введении фотосенса свидетельствуют о возможности использования разработанной методики для лечения опухолей печени в эксперименте и являются основанием для подготовки метода к клинической апробации.

ВЫВОДЫ.

1. Пункционная интрапаренхиматозная имплантация взвеси опухолевых клеток альвеолярного слизистого рака печени (штамм РС-1) в долю-мишень печени крыс сопровождается стандартным ростом внутриорганной опухоли солидного типа с элементами слизеобразования и 83,6% прививаемостью, что позволяет использовать ее в качестве новой модели в экспериментальной онкологии.

2. Изучение кинетики роста альвеолярного слизистого рака в печени свидетельствует о наличии латентного периода (в течение недели после прививки), фазы экспоненциального роста (10-25 сутки после прививки), переходящей к стабилизации роста в поздние сроки. Фотодинамическуго терапию целесообразно начинать в начале фазы экспоненциального роста опухоли, т.е. через 11 суток после ее прививки в печень.

3. Разработанный и апробированный в эксперименте селективно-окклюзионный метод введения фотосенса имеет преимущества перед системным внутривенным, т.к. способствует быстрому преимущественному накоплению препарата в опухоли и окружающей опухоль паренхиме доли-мишени печени и позволяет проводить облучение в ранние сроки - через 15 минут после введения фотосеисибилизатора.

4. Используемые параметры однократного монопозиционного облучения (световая доза 50 и 100 Дж/см , мощность 150 и 200 мВт/см2) являются достаточными для повреждения опухоли в виде массивных и тотальных некрозов, однако не исключают возможности последующего роста опухоли. Для повышения эффективности фотодинамической терапии целесообразно использован.

иолипозшшошюе облучение с обязательным включением в зону облучения паренхимы печени, окружающей опухоль.

5. Разработанная методика фотодинамической терапии (селективно-окклгазионное введение фотосенса в дозе 1 мг/кг с последующим полипозиционным облучением опухоли) является эффективным методом лечения альвеолярного слизистого рака печени крыс: торможение роста опухоли на 21 сутки после лечения составило 81,3%, у 90% животных при гистологическом исследовании опухоли были выявлены тотальные некрозы.

6. Разработанная методика фотодинампческой терапии альвеолярного слизистого рака печени крыс при пункционном введении фотосенса в опухоль в дозе 0,5 мг/кг с последующим полипознппонпым облучением опухоли может быть использована для лечения опухолей печени, так как сопровождается торможением роста опухоли на 21 сутки после лечения на 60,8%.

Список рабог, опубликованных по теме диссертации:

1. Фотодинамическая терапия альвеолярного слизистого рака печени крыс при пункционном введении фотосенсибилизатора в опухоль (экспериментальное исследование). Анналы хирургической гепатологии т. 5, № 2, с. 303, 2000 г.(соавт.: Э.И. Гальперин, Т.Г. Дюжева, Н.Т. Райхлип, H.H. Казачкина, В.В. Соколов, В.Р. Нахамияев).

2. Биохимические и морфологические особенности холангиоцеллюлярного рака печени крыс РС-1. Экспериментальная онкология. Украина, Киев, (соавт.: Гальперин Э.И., Т.Г. Дюжева, Е.М. Трещалнна, Н.Т. Райхлип, В.А. Кобляков, Н.В. Андронова, Ю.Д. Сорокина). В печати.