Автореферат и диссертация по медицине (14.00.05) на тему:Фиброз печени при хронических вирусных гепатитах B и C

003474306 На правах рукописи

ПАВЛОВ Чавдар Савов

ФИБРОЗ ПЕЧЕНИ ПРИ ХРОНИЧЕСКИХ ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТАХ ВИС

14.00.05 - внутренние болезни

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

2 5 КЮЯ2003

Москва - 2009

003474306

Работа выполнена в Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова

Научные консультанты:

академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

ИВАШКИН Владимир Трофимович КОГАН

Евгения Александровна

УСПЕНСКИЙ

Вячеслав Максимилианович

НИКИТИН

Игорь Геннадиевич

МИШНЕВ

Олег Дмитриевич

Ведущая организация: Московский государственный медико-стоматологический университет.

Защита диссертации состоится « » сентября 2009 г. в 14.00 на заседании диссертационного совета Д 215.009.02 при Государственном институте усовершенствования врачей Министерства обороны Российской Федерации (107392, г. Москва, ул. Малая Черкизовская, д. 7).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного института усовершенствования врачей МО РФ.

Автореферат разослан « » июня 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совету доктор медицинских наук, профессор

Бакулин И.Г.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ИГА индекс гистологической активности

ИММП ингибиторы металлопротеиназ

ИПСА индекс пульсационный селезеночной артерии

ММП матриксные металлопротеиназы

ОЖСС общая железосвязывающая способность сыворотки (крови)

отп ортотопические трансплантации печени

ПБП пункционная биопсия печени

ПВТ противовирусная терапия

УВО устойчивый вирусологический ответ

УЗДГ ультразвуковая допплерография

ФП фиброз печени

хвг хронический вирусный гепатит

хгв хронический гепатит В

хгс хронический гепатит С

хзп хронические заболевания печени

ЦП цирроз печени

эгдс эзофагогастродуоденоскопия

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Изучение патогенеза, совершенствование диагностики и повышение эффективности терапии хронических заболеваний печени (ХЗП) представляют собой наиболее актуальные проблемы современной гепатологии.

По данным ряда авторов, летальность в течение 5 лет и после постановки диагноза цирроза печени (ЦП) составляет 45-86% [Блюм Х.Е., 2005; Виноградова Е.В., 2005; Хазанов А.И., 2006; Маевская М.В. и др., 2004]. Основной путь прогрессирования ХЗП - развитие последовательных стадий фиброза печени (ФП) с формированием в конечном итоге цирроза и рака печени, что во многом предопределяет плохой жизненный прогноз и короткие сроки выживаемости этой категории больных [Игнатова Т.М., 2002; Лобзин Ю.В. и др., 2003; Маевская М.В. и др., 2006; Bataller R. et al., 2005].

Сегодня не существует единой теории патогенеза хронических вирусных гепатитов (ХВГ). Необоснованно противопоставляются такие процессы, как хроническое воспаление, включающее в себя обязательным компонентом воспалительную репарацию, и процесс репарации ткани печени в ответ на повреждение. Часть исследователей связывает прогрес-сирование ХВГ с развитием иммунного воспаления, другие авторы считают формирование ЦП результатом нарушения репарации стромы и гепа-тоцитов в участках повреждения портальных трактов и паренхимы печени [Farber J. et al., 1975; Коненков В.И. и др., 2000; Мезенцева Г.А., 2005; Непомнящих Г.И. и др., 2002; Akiri G. et al., 2003; Bataller R. et al., 2003].

В настоящее время в нашей стране единственным доступным методом определения степени и распространенности ФП остается пункционная биопсия печени (ПБП). Данная методика инвазивна, проводится в госпитальных условиях и имеет ряд противопоказаний [Лобзин Ю.В. и др., 2003; Никитин И.Г. и др., 2001; Непомнящих Г.И. и др., 2002; Ющук Н.Д. и др., 2002; Blanc J. et al., 2005; Colletta С. et al., 2005].

В последние годы за рубежом начали широко применяться методы неинвазивной диагностики ФП. К преимуществам современных методов неинвазивной диагностики перед ПБП относятся: простота, отсутствие противопоказаний, высокая диагностическая точность на различных стадиях ФП, возможность оценивать динамику фиброза, удобство применения скрининг-метода для пациентов из групп риска и использование в амбулаторных условиях.

Принципиально важна возможность неинвазивной диагностики своевременного определения ранних стадий ФП, что позволяет в короткие сроки назначить терапию и предотвратить дальнейшее прогрессирование

фиброза [Глушенков Д.В. и др., 2008; Castera L. et al., 2005; Carpechot С. et а]., 2006; Cherry К., 2006; Kelleher Т. et al., 2005; Ziol M. et al., 2005]. Все вышесказанное диктует необходимость разработки и внедрения в клиническую практику новых неинвазивных методов диагностики ФП, безопасность которых значительно расширит круг пациентов и позволит использовать их в амбулаторных условиях.

Лечение больных ФП и ЦП остается одной из ключевых проблем клинической гепатологии. Рост инвалидизации и высокая смертность больных ХЗП в результате развития осложнений, крайне недостаточное количество проводимых в нашей стране ортотопических трансплантаций печени (ОТП), отсутствие альтернативных трансплантаций печени консервативных методов лечения пациентов с терминальной стадией заболевания диктует необходимость новых подходов к терапии [Arthur М., 2002; Ebihara Y. et al., 2006; Fallowfield J. et al., 2006; Friedman S„ 2004].

В мире сегодня активно ведутся поиски альтернативных методов лечения больных ХЗП в двух направлениях: создание генно-инженерных препаратов, активно влияющих на структурные изменения печени при ЦП, и использование стволовых клеток крови и клеток-предшественников клеток печени, позволяющих восстановить поврежденные при цирротиче-ской трансформации функции печени [Behlke М., 2006; Brittan М. et al., 2002; Bucala R. et al., 1994; Direkze N. et al., 2003; Ebihara Y. et al., 2006; Iredale J„ 2007].

Все вышесказанное определяет актуальность изучения патогенеза, совершенствования методов диагностики ФП, разработки и внедрения в клиническую практику генно-инженерных препаратов, эффективно влияющих как на процессы регенерации и восстановления функций печени, так и способных вызвать обратное развитие ФП путем активации (на клеточном уровне) процессов его деградации.

Цель работы: изучение патогенеза фиброза при хроническом вирусном гепатите с определением механизмов регуляции фиброгенеза в ткани печени; совершенствование диагностики фиброза с разработкой метода количественной оценки коллагена в ткани печени; определение диагностических возможностей неинвазивных методов исследований (эласто-метрии, сывороточных тестов и допплеровского исследования сосудов печени), а также создание и оценка эффективности генно-инженерных конструкций с антифиброзным действием на экспериментальной модели цирроза печени.

Задачи исследования:

1. Изучить различные регуляторы фиброгенеза в ткани печени: тромбоцитарный ростовой фактор (PDGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF1), пролиферирующий антиген клеточного ядра (PCNA), CD68

(мембранный рецептор макрофагов), CD34 (показатель неоангиогенеза), АК (актомиозин - показатель активности клеток Ито), коллаген 4-го типа (С4), матриксные металлопротеиназы (ММП-2, -7, -9), ингибиторы метал-лопротеиназ (ИММП-1, -4) в ткани печени у больных ХВГ. Определить роль регуляторов фиброгенеза в патогенезе ФП у больных ХВГ. Провести сравнительный анализ этих показателей и основных морфологических, лабораторных и клинических проявлений активности ХВГ.

2. Усовершенствовать системы полуколичественной оценки ФП, разработать метод его количественной оценки и с их использованием проанализировать влияние показателей гистологической активности гепатита и степени ФП на эффективность и результаты противовирусной терапии (ПВТ) у больных ХВГ.

3. Оценить клиническое значение сывороточных показателей обмена железа, эластометрии, фибротеста, допплерографического УЗИ сосудов печени в неинвазивной диагностике степени фиброза у больных ХВГ, а также провести сравнительный анализ диагностической точности различных методик неинвазивной оценки в зависимости от стадии ФП и предложить алгоритм оптимального их использования в клинической практике.

4. На основании изучения экспериментальной модели определить терапевтические возможности генно-инженерного подхода к лечению ФП и оценить эффективность антифиброзного действия следующих четырех генов человека: гена фактора роста гепатоцитов (HGF), гена урокиназы (UPA), гена матриксной металлопротеиназы-1 (ММП-1) и гена матрикс-ной металлопротеиназы-8 (ММП-8).

Научная новизна

1. Впервые определены место и роль таких медиаторов фиброгенеза, как: тромбоцитарный ростовой фактор (PDGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF1), пролиферирующий антиген клеточного ядра (PCNA), CD68 (мембранный рецептор макрофагов), CD34 (показатель неоангиогенеза), АК (актомиозин - показатель активности клеток Ито), коллаген 4-го типа (С4), матриксные металлопротеиназы (ММП-2, -7, -9), ингибиторы металлопротеиназ (ИММП-1, -4) в патогенезе ФП у больных ХВГ.

2. Разработан оригинальный метод количественной оценки ФП с определением всего объема коллагеновых волокон в ткани печени.

3. Изучена зависимость между показателями индекса гистологической активности (ИГА), степенью ФП и эффективностью ПВТ у больных ХВГ, а также показана возможность обратного развития фиброза на фоне проведения ПВТ.

4. Впервые определено клиническое значение и проведен сравнительный анализ диагностической точности сывороточных показателей

обмена железа, эластометрии, фибротеста, показателей кровотока в сосудах печени на разных стадиях ФП у больных ХВГ.

5. Впервые создана и апробирована на экспериментальной модели панель генетических конструкций с использованием генов матриксных металлопротеиназ (ММП-1, -8), фактора роста гепатоцитов и урокиназы, которые могут оказывать терапевтический эффект на ФП.

Практическая значимость

Определены уровни медиаторов фиброгенеза в ткани печени: тром-боцитарного ростового фактора (PDGF), инсулиноподобного фактора роста (IGFI), пролиферирующего антигена клеточного ядра (PCNA), CD68 (мембранного рецептора макрофагов), CD34 (показателя неоангиогенеза), АК (актомиозина - показателя активности клеток Ито), коллагена 4-го типа (С4), матриксных металлопротеиназ (ММП-2, -7, -9), ингибиторов металлопротеиназ (ИММП-1, -4), что может быть использовано в клинической практике в целях оценки морфологических, лабораторных и клинических показателей активности и стадии ХВГ.

Выявлены благоприятные прогностические факторы вирусологического ответа на ПВТ у больных хроническим гепатитом С (ХГС) и хроническим гепатитом В (ХГВ). Установлено, что выраженный ФП (F3-F4) снижает эффективность и уменьшает частоту достижения устойчивого вирусологического ответа комбинированной противовирусной терапии (Пег-ИФН-а-2а/рибавирин) больных ХГС; степень ФП у больных ХГВ не влияет на эффективность ПВТ ламивудином.

Показано, что сывороточные показатели обмена железа, эластомет-рия, фибротест, допплерографические показатели кровотока в сосудах печени могут быть использованы в комплексной неинвазивной диагностике стадии ФП у больных ХВГ.

Установлена эффективность применения методов неинвазивной диагностики ФП (эластометрия печени, актитеста), что позволяет использовать их в качестве скрининг-метода ФП в широкой клинической практике. Разработаны методические подходы для повышения диагностической точности выполнения эластометрии и оценки результатов фибротеста у больных ХВГ.

Предложен генно-терапевтический метод лечения ФП с использованием генов фактора роста гепатоцитов (HGF), урокиназы (UPA), матрикс-ной металлопротеиназы-1 (ММП-1) и матриксной металлопротеиназы-8 (ММП-8).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

Выраженные некровоспапительные изменения в ткани печени у больных ХГС сопровождаются более тяжелой степенью фиброза. Выра-женость морфологических данных не зависит от генотипа HCV и уровня

виремии. Для больных ХГС характерны высокие показатели ангиогенеза и экспрессии ММП-2, высокая пролиферативная активность клеток Ито. Проведение ПВТ приводит к положительной динамике морфологических данных, снижению показателей ангиогенеза, снижению пролиферативной активности клеток Ито, повышению активации механизмов антиметалло-протеиназной защиты. Благоприятными прогностическими факторами УВО являются высокая активность АЛТ, высокий исходный показатель ИГА, низкая степень фиброза печени.

Для больных ХГВ характерно повышение значений показателей ангиогенеза и экспрессии ММП-2, высокая пролиферативная активность клеток Ито. Проведение ПВТ ламивудином больных ХГВ приводит к положительной динамике морфологических данных, сопровождается снижением пролиферактивной активности клеток Ито, снижением уровня экспрессии ММП-7 и -9, уменьшением значений ангиогенеза и активацией механизмов антиметаллопротеиназной защиты. Регресс морфологических данных при проведении ПВТ не зависит от степени фиброза печени и наличия HBeAg до лечения.

Морфологическое исследование печени с количественной оценкой ФП позволяет оценить количество фиброзной ткани в рамках одной стадии фиброза по МЕТА VIR. Для оценки ФП у больных хроническими гепатитами В и С могут быть использованы неинвазивные методы: диагностическая точность эластометрии сопоставима с данными морфологического исследования для выявления стадий фиброза F3-F4; диагностическая точность метода фибротеста сопоставима с данными морфологического исследования для выявления стадий фиброза F2-F4; диагностически значимыми УЗДГ-показателями выраженности ФП являются пульсацион-ный индекс селезеночной артерии (ИПСА) и средняя скорость кровотока воротной вены (ССВВ); дополнительным критерием тяжести ФП является повышение показателей обмена железа.

Генетические конструкции на основе оптимизированных генов в эксперименте значительно увеличивают экспрессию потенциально терапевтических генов урокиназы, фактора роста гепатоцитов, ММП-1 и -8 и могут быть использованы в разработке генно-инженерной терапии фиброза печени.

Реализация результатов исследования

Результаты исследования используются в лечебно-диагностической деятельности и учебно-педагогическом процессе клиники пропедевтики внутренних болезней, гастроэнтерологии и гепатологии ММА им. И.М. Сеченова (директор - академик РАМН, профессор Ивашкин В.Т.) и в клиниках Кардиокомплекса Минздрава России (директор - академик РАМН и РАН, профессор Чазов Е.И.).

Апробация диссертации

Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на: Одиннадцатой, Двенадцатой, Тринадцатой Российских Гастроэнтерологических неделях (Москва, 2005, 2006, 2007); Восьмой, Десятой, Одиннадцатой, Двенадцатой и Тринадцатой Всероссийских конференциях «Гепатология сегодня» (Москва, 2003, 2005, 2006, 2007, 2008); 8-м Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург - Гастро-2006» (Санкт-Петербург, 2006); 6-й конференции гастроэнтерологов Южного федерального округа (Ессентуки, 2007); 7-й Восточно-Сибирской гастроэнтерологической конференции с международным участием (Красноярск, 2007); Всероссийской научно-практической конференции «Высокие медицинские технологии» (Москва, 2007); конференции Главного медицинского управления УД Президента РФ «Диагностика и лечение болезней органов пищеварения с позиций доказательной медицины» (Москва, 2007); Тринадцатой Всероссийской образовательной интернет-сессии «Проблемы интерниста» (Москва, 2008); 12-й Фальк-неделе печени (Фрайбург, 2003); 9-м Болгарском национальном конгрессе гастроэнтерологии с курсом последипломного обучения (София, 2006); международном конгрессе «International liver congress-Asian Pacific Association for the study of the liver» (Гонгконг, 2008); 16-й Объединенной Европейской Гастронеделе «UEGW 2008» (Вена, 2008).

Публикации

По теме диссертации опубликованы 73 печатные работы, из них 17 -в рекомендованных ВАК изданиях. Получен патент «Способ оценки степени фиброза печени при хроническом вирусном гепатите» от 20 апреля 2009 г. №2352950.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 278 страницах машинописного текста и состоит из 6 глав (обзор литературы, описание материала и методов исследования, собственные результаты и их обсуждение), выводов, практических рекомендаций и списка литературы из 248 источников (89 отечественных и 159 зарубежных авторов). Работа иллюстрирована 58 таблицами, 113 рисунками и 10 клиническими примерами.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

За период с 2000 по 2006 г. в кабинете биопсии клиники пропедевтики внутренних болезней, гастроэнтерологии и гепатологии ММА им. И.М. Сеченова выполнено 1450 биопсий печени. За указанный период число пациентов с вирусным поражением печени составило 995 чел.: ХВГ (903

пациента) и ЦП (92 пациента) в возрасте от 15 до 78 лет (средний возраст 42,9+1,7 года).

Данные о распределении больных по полу и возрасту представлены в табл. 1.

Таблица 1

Распределение больных ХЗП по полу и возрасту

Группа больных Кол-во больных Муж./жен. Возраст, лет

ХВГ 903 (91%) 1,4:1 29,8±0,8

ЦП 92 (9%) 0,8:1 56±3,7

Всего... 995 (100%) 1,3:1 42,9+1,7

Диагноз ХВГ и ЦП устанавливали на основании результатов комплексного клинико-лабораторного обследования больных и результатов биопсии печени. Для уточнения этиологии ХВГ и ЦП использовались данные анамнеза (указание на перенесенный острый вирусный гепатит, перенесенные гемотрансфузии, оперативные вмешательства, аборты), осмотра, результаты исследования крови на маркеры вирусных гепатитов (HBsAg, HBsAb, HBeAg, HBeAb, HBcAb IgM, HB с Ab IgG, HBV DNA, HCVAb, HCV RNA).

В клинической картине у всех больных ХВГ наблюдался астенический синдром различной степени выраженности. В соответствии с критериями ВОЗ [Miller А. et al., 1981] в зависимости от выраженности астенического синдрома больные ХВГ распределились следующим образом: у 181 (20%) больных астенический синдром был оценен в 0 баллов, у 543 (61%) - в 1 балл, а у 179 (19%) больных - в 2 балла.

Из объективных симптомов у больных ХВГ следует отметить следующие: стойкий субфебрилитет - у 10 (1%) больных, лихорадка интер-миттирующего характера, резистентная к антибиотикотерапии, - у 63 (7%). У 27 (3%) больных наблюдали зудящие высыпания на коже по типу крапивницы. Умеренную периферическую лимфоаденопатию (максимальные размеры лимфоузлов < 2 см) выявили у 144 (16%) больных, у 18 (3%) из них были увеличены внутрибрюшные лимфатические узлы (в воротах печени, селезенки), размеры периферических и висцеральных лимфатических узлов достигали 2,5 см. Печень и селезенка были увеличены у 379 (42%) и 352 (39%) больных соответственно.

Из всей выборки пациентов выделено 149 больных, получивших противовирусную терапию: из 46 больных ХГВ терапию ламивудином получили 26, интерфероном - 20; из 103 больных ХГС терапию Пег-ИФН-а-2а - 47, интерфероном короткого действия + рибавирином - 56. Всем больным, при отсутствии вирусологического ответа, проведены повторные

ПБП (до и после лечения) и проанализированы динамика и влияние показателей морфологической активности гепатита и степени ФП на эффективность ПВТ.

Исследование больных проводилось по единому плану, который включал:

- клинические исследования (опрос, осмотр, пальпация, перкуссия, аускультация);

- инструментальные исследования (УЗИ брюшной полости, ЭГДС, рентгенологическое исследование);

- рутинные лабораторные исследования (клинический и биохимический анализы крови, коагулограмма);

- ПБП и морфологическое исследование ткани;

- при наличии показаний: стернальная пункция и трепанобиопсия костного мозга;

- характеристика состояния обмена железа;

- эластометрня;

- фибро- и актитест;

- допплерография сосудов печени.

Морфологическая оценка фиброза:

1. Полуколичественная оценка морфологических признаков ХГ проводилась с использованием балльных систем Knodell, METAVIR, Ishak.

2. Количественная оценка фиброза печени выполнена по собственному методу, который основывается на автоматизированной оценке морфологических срезов ткани печени, окрашенных пикросириусом красным (Заявка на патент РФ «Способ количественной оценки степени фиброза печени» - приоритет 17.10.07 г. №2007138369).

3. Иммунногистохимическое выявление антигенов в парафиновых срезах проведено иммунопероксидазным методом по общепринятой методике. С помощью моно- и поликлональных антител выявляли ММП-2, -7, -9, ИММП-1, -4 (LabVision), PDGF, IGF1, АК, PCNA, Аро, С4, CD34, CD68 (DAKO). В качестве вторичных антител применяли биотинилированные антитела к иммуноглобулинам мыши и кролика (DAKO LSAB+KIT, PEROXIDASE).

В целях неинвазивной диагностики фиброза изучались:

1. Показатели обмена железа:

- железо и общая железосвязывающая способность сыворотки (ОЖСС) крови - колориметрическим методом с применением стандартных наборов фирмы «Lachema»;

- ферритин-сыворотки - иммунорадиометрическим методом с применением стандартных наборов ИРМО-ферритин для людей;

- трансферрин сыворотки крови - методом радиальной иммунодиф-фузии в агаре с применением моноспецифических антисывороток.

2. Эластические свойства ткани печени - эластометрия. Исследования проведены на аппарате «FibroScan 502».

3. Неинвазивная диагностика ФП с применением методики фибро- и актитеста (BioPredictive, Франция).

4. Показатели кровотока в сосудах печени - допплерографическое УЗИ выполнялось на аппарате Toshiba Nemio (SSA-550A).

Результаты неинвазивных методов исследования ФП сравнивались с данными морфологического исследования.

Пункционная биопсия печени проведена всем 149 (100%) больным ХВГ до начала курса ПВТ. Как следует из представленных в табл. 2 и 3 данных, абсолютное большинство (121 чел. - 81%) обследованных больных имели активность AI и А2 (по MET A VIR) воспалительного процесса в печени. У 28 (19%) больных имел место ХГ с активностью A3. У 121 (81%) больного в биоптате печени были выражены фиброзные изменения,

Таблица 2

Распределение больных ХВГ (п=149) в зависимости от индекса гистологической активности гепатита по системе МЕТА VIR (Р. Bedossa, Т. Poynard, 1996)

Хронический гепатит Оценка по системе METAVIR Количество больных.

С минимальной активностью AI 57 (38%)

С умеренной активностью А2 64 (43%)

С выраженной активностью A3 28(19%)

Таблица 3

Распределение больных ХВГ (п=149) в зависимости от стадии заболевания (степени фиброза) по системе МЕТА VIR (Р. Bedossa, Т. Poynard, 1996)

Степень фиброза Цифровой индекс Количество больных

Нет фиброза F0 31 (21%)

Портальный фиброз Fl 75 (51%)

Портальный фиброз + несколько фиброзных септ F2 23(15%)

Септальный фиброз без цирроза F3 20(13%)

Цирроз F4 -

в т. ч. у 43 (28%) чел. был выявлен портальный фиброз с несколькими фиброзными септами или множество фиброзных септ без цирроза.

Анализ степени фиброза по системам Кпоёе11 и МЕТАУШ отличий в морфологической трактовке стадий фиброза не выявил. Сравнительная оценка стадий фиброза по двум системам представлена в табл. 4.

Таблица 4

Сравнительная оценка ФП у больных ХВГ (п=149) по системам \IETAVIR (Р. Ве^а, Т. Роупага, 1996) п КпоаеН (В.В. Серов, 1996)

Оценка фиброза по системе МЕТАУ1Я Цифровой индекс МЕТАУИ* Оценка фиброза по системе КпоёеП Баллы КпоёеП Кол-во больных

Нет фиброза Р0 Нормальные портальные тракты 0 31 (21%)

Портальный фиброз Р1 Фиброз и расширение портальных трактов, перипор-тальный фиброз 1 75 (51%)

Портальный фиброз + несколько фиброзных септ 2 23 (15%)

Сеитальный фиброз без цирроза РЗ Портальные септы, фиброз с нарушением долькового строения печени 3 20(13%)

Цирроз Р4 Сформированный цирроз 4 -

У основной массы больных ХГС (65 чел. - 63%) гистологическая активность гепатита оценена как А1/А2, у 35 (34%) чел. - как АЗ по МЕТАУШ. Больные ХГВ были представлены в трех группах ИГА (табл. 5).

Биопсия печени произведена 21 больному ХГС с нормальным уровнем сывороточных трансаминаз. Морфологический анализ биоптатов показал, что у всех больных имел место гепатит с активностью А1/А2, у 15 (71%) чел. - фиброз П, у 4 (19%)-Р2, а у 2 (10%) чел. степень фиброза оценена как БЗ. Таким образом, несмотря на отсутствие показателей биохимической активности, у этих больных имелись признаки гистологической активности хронического гепатита С.

Лечение Пег-ИФН-а-2а + рибавирином получили 47 пациентов. Средний возраст больных составил 35,6±10,9 лет. В группу вошли

Таблица 5

Распределение больных ХВГ(п=149) в зависимости от ИГА и этиологии ХГ

Группа больных Этиология гепатита

ИГА (по METAV1R) HCV (п=103) HBV (п=46)

АО 3 (3%) 1 (2%)

А1 25 (24%) 3 (7%)

А2 40 (39%) 24 (52%)

A3 35 (34%) 18(39%)

34 мужчины (средний возраст 35,6+1,8 года) и 13 женщин (35,7+3,8 года). Распределение больных с учетом генотипа вируса: 34 пациента с 1-м генотипом и 13 - с 3-м генотипом соответственно. Средний уровень АЛТ (до начала лечения) составил 121,3+83,4 Ед/л, ACT - 102,8+61,3 Ед/л. У 44 (94%) больных ХГС отмечено наличие биохимической активности гепатита: АЛТ - 127,3+12,8 Ед/л, ACT - 107,7+9,3 Ед/л соответственно. У 3 (6%) пациентов нормальные значения: АЛТ - 37,6+1,8 Ед/л и ACT - 33,7+1,2 Ед/л. Морфологическая оценка биоптатов ткани печени проведена по системе Knodell. С учетом показателя ИГА пациенты распределились следующим образом: у 27 (58%) больных ИГА гепатита составил 9-12 баллов, у остальных 20 (42%) пациентов - 4-8 баллов (рис. 1).

□ ИГА

0-3 4-8 9-12 13-18

балла баллов баллов баллов

Рис. 1. Распределение больных ХГС (п=47) в зависимости от ИГА гепатита

Вирусная нагрузка определена у всех 47 больных: у 34 (72%) количество вируса составило более 2 млн. копий/мл (высокая вирусная нагрузка), у 13 (28%) - менее 2 млн. копий/мл (низкая вирусная нагрузка). Распределение больных в зависимости от количества вируса, ИГА и степени ФП представлено на рис. 2.

а

11№Б]Г|Г|1

□ Более 2 млн. к/мл О Менее 2 млн. кУмл

Рис. 2. Распределение больных в зависимости от вирусной нагрузки и показателей ИГА

Как видно из данных рис. 3. у основной массы больных (24 чел. -51%) с высокой вирусной нагрузкой фиброз был оценен в 1 балл, а у 20 (43%) пациентов данной группы ИГА составил 9-12 баллов.

Возраст больных ХВГ. получавших ламивудин, варьировался от 17 до 63 лет (средний возраст 34,2+2,4 года). Группу составили 24 (92%) мужчины и 2 (8%) женщины. Распределение больных в зависимости от степени повышения активности АЛТ показало (см. рис. 3), что у 13 (50%) пациентов она была минимальной. Из них у 10 (38%) чел. концентрация АЛТ находилась в пределах нормальных значений. У 7 (27%) больных отмечалось повышение активности АЛТ в 2 раза и более в сравнении с нормальными показателями. У 6 (23%) чел. АЛТ в 5 раз и более превышала верхний лимит нормы.

50%-40%-30%-20%-10%-0%-

п=7

/ 11=6

У VI

1/

АЛТ > Ш

АЛТ > 2М АЛТ > 5Ы

Рис. 3. Распределение больных ХГВ по биохимической активности

Распределение больных ХГВ по степени активности АЛТ в зависимости от наличия НВеА° показано в табл. 6.

Таблица 6

Распределение больных по степенн активности АЛТ в зависимости от наличия НВеА§

Показатель Больные ХГВ, позитивные по HBeAg (п=9) Больные ХВГ, негативные по HbeAg (п=17)

АЛТ > 1N (40-79 ед/л) 1 (12%) 12(71%)

АЛТ >2N (80-199 ед/л) 4 (44%) 3 (17,5%)

АЛТ > 5N (200 ед/л и выше) 4 (44%) 2(11,5%)

Отдельная оценка ИГА в зависимости от типа НВУ показала, что у больных, позитивных по HBeAg, среднее значение ИГА составило 11,0+0,8 балла. Аналогичный показатель у лиц, негативных по HBeAg, -7,7+0,8 балла. Гистологическая активность у больных ХГВ первой подгруппы была достоверно выше в сравнении с пациентами, негативными по HBeAg (1=5,07; р=0,0009). Распределение больных по степени тяжести гепатита представлено в табл. 7.

Таблица 7

Распределение больных ХВГ в зависимости от индекса гистологической активности (но Кпо<1е11)

Показатель Больные ХГВ (п=26)

ИГА 3 балла (гепатит минимальной активности) 4(15%)

ИГА 4-8 баллов (гепатит низкой активности) 8(31%)

ИГА 9-12 баллов (умеренно активный гепатит) 9 (35%)

ИГА 13-18 баллов (гепатит высокой активности) 5 (19%)

Методы статистического анализа

Статистическая обработка была проведена с применением пакетов программ SPSS 16,0 и Epi Info 6, version 6.02 и включала создание базы данных, автоматизированную проверку качества подготовки информации и статистический анализ [Гланц С., 1998; Реброва О.Ю., 2000; Флетчер Р. и др., 1998; Власов В.В., 2001]. Для оценки эффективности лечения с учетом небольших по численности групп использовался парный критерий Стьюдента, измерялось значение признака до лечения и после терапии.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка механизмов фпброгенеза у больных ХГС

Изучение особенностей морфологических проявлений и молекулярных механизмов регуляции процессов пролиферации, апоптоза, клеточной дифференцировки, неоангиогенеза и фиброза, ведущих к перестройке печеночной ткани при хроническом гепатите С, проведено на материале повторных ПБП 9 пациентов с ХГС. Подбор схемы, доз препаратов (ин-терферон+рибавирин) и сроков лечения проводился с учетом вирусной нагрузки и генотипа вируса (для генотипа 1 - 48 недель, для генотипов 2 и 3-24 недели). До начала лечения у пациентов (п=9) имелся ХГС умеренной активности (ИГА 9,7±1,1 балла), умеренный фиброз (2,4+0,3 балла). По завершении курса лечения активность ХГС расценена как минимальная (ИГА 6,5±1,0 балла) (р=0,05).

Изучена функциональная активность следующих медиаторов, регулирующих процессы фпброгенеза и регенерации в ткани печени (табл. 8).

Таблица 8

Регуляторы фпброгенеза в ткани печени

Название Краткая характеристика

РГЮР - тромбоцитарный ростовой фактор Активатор пролиферации стромальных клеток (фибробластов) и неоангиогенеза, взаимодействует с рецептором тирозинкиназного типа

ЮР1 - инсулиноподобный фактор роста Регулятор активности звездчатых клеток. Активатор пролиферации стромальных клеток (фибробластов) и неоангиогенеза, взаимодействует с рецептором тирозинкиназного типа

С034 - мембранный рецептор мезенхимальных стволовых клеток и эндотелия Маркер эндотелия новообразованных сосудов (неоангиогенеза)

С068 - мембранный рецептор макрофагов Маркер макрофагов

РСЫА - пролиферирующий антиген клеточного ядра Маркер клеточной пролиферации и репарации ДНК

Аро-протеин Показатель РАЭО опосредованного апоптоза

С4 - коллаген 4-го типа Компонент экстрацеллюлярного матрикса

АК - актомиозин Маркер гладкомышечных клеток и миофибробла-стов (клеток Ито)

□ До лечения

□ После лечения

□ До лечения

□ После лечения

Оценка активности двух разнонаправленных процессов (синтеза / деградации) экстрацеллюлярного матрикса в ткани печени проведена путем изучения уровней протеаз, расщепляющих компоненты межклеточного вещества, - матриксные металлопротеиназы (ММП-2, -7, -9) и тканевые ингибиторы матриксных металлопротеиназ (ИММП-1, -4), подавляющие активность ММП.

в

Рис. 4. Показатели: а - С4 в ткани печени до и после лечения больных

ХГС; б - АК в ткани печени до и после лечения больных ХГС; в - коллаген 4 при ХГС в синусоидах (указано Т) (х400) и портальном тракте (указано ||) (х250)

Пролиферативная активность клеток Ито и фибробластов оценивалась по количеству С4, а также по активности экспрессии АК, ЮР1 и РБСР. Все четыре показателя (коллаген 4-го типа, актомиозин, инсулино-подобный фактор роста и тромбоцитарный ростовой фактор) характеризовались высокими уровнями до начала терапии и падением активности после ее окончания (рис. 4 и 5). Таким образом, на фоне комбинированной ПВТ снизилась пролиферативная активность клеток Ито и фибробластов, уменьшился синтез компонентов экстрацеллюлярного матрикса и соответственно темпы прогрессирования фиброза у больных ХГС.

В результате проведенного исследования было установлено, что у больных ХГС до начала ПВТ ММП-2, -7 и -9 при иммуногистохимиче-ском исследовании выявляются в цитоплазме гепатоцитов, холангиоцитов, эндотелия сосудов, клеток Купфера и фибробластических элементов, воспалительного инфильтрата стромы.

В целом можно заключить, что исходно у больных ХГС имели место высокие показатели ангиогенеза и экспрессии ММП-2, которые в сочетании с высокой пролиферативной активностью клеток Ито и фибробластов могли приводить к прогрессированию фиброза и развитию цирротической трансформации ткани печени. Комбинированная ПВТ сопровождалась снижением пролиферативной активности клеток Ито и фибробластов, повышением уровня экспрессии ММП-7 и -9 в гепатоцитах, а также уменьшением ангиогенеза в строме. При этом компенсаторно происходила активация механизмов антиметаллопротеиназной защиты путем усиления выработки ИММП-1 и -4, что приводило к восстановлению баланса регуляторов синтеза экстрацеллюлярного матрикса и торможению дальнейшего прогрессирования повреждения ткани печени.

Оценка механизмов фиброгенеза у больных ХГВ

Группа больных ХГВ, которым проведена оценка механизмов фиброгенеза, составила 8 чел. Всем пациентам был назначен ламивудин (в дозе 100 мг/сут) сроком на 52 недели. До начала лечения у 5 пациентов были выявлены гепатит низкой гистологической активности (ИГА 7,1+1,2), умеренный фиброз (2,6±0,2), у 1 больного - гепатит умеренной активности (10 баллов), слабый фиброз, у 2 пациентов - гепатит высокой активности (13,5+0,5), тяжелый фиброз.

Проведенные исследования у больных ХГВ до начала ПВТ подтвердили установленное ранее (у пациентов с ХГС) наличие ММП-2, -7 и -9 в цитоплазме гепатоцитов, холангиоцитов, эндотелия сосудов, а также фибробластических элементов и клеток Купфера, воспалительного инфильтрата стромы печени. Уровни экспрессии ММП-2 и -9 в гепатоцитах, как правило, были выше таковых в клетках Купфера и фибробластах, а пока-

затели ММП-7 (в отличие от ХГС) не отличались в различных типах клеток (рис. 6 и 7).

Гепатоц Купфер Эндот Мф инф Фв инф

а

Рис. 5. Показатели: а - ЮП в клетках печени до и после лечения больных ХГС; б - РОСБ в различных типах клеток печени до и после лечения больных ХГС; в - продукция факторов роста клетками Купфера (указано Т) и клетками инфильтрата (указано при ХГС (х400)

Гепатоц Купфер Эндот Фб инф Холанг

Рис. 6. Показатели ММП-2 в различных типах клеток печени до и после лечения больных ХГВ

Гепатоц Купфер Эндот Фб инф Холанг

Рис. 7. Показатели ММП-7 в различных типах клеток печени до и после лечения больных ХГВ

Результаты повторных исследований после проведения курса ПВТ показали мозаичный характер изменений показателей ММП. Отмечено достоверное снижение активности ММП-2 в гепатоцитах. В то же время экспрессия ММП-7 и -9 уменьшилась в гепатоцитах и увеличилась в клетках Купфера (рис. 8 и 9).

□ До лечения

□ После лечения

Гепатоц Купфер

Рис. 8. Показатели ММП-9 в различных типах клеток печени до и после лечения больных ХГВ

Рис. 9. ММП-9 и ИММП-1 в клетках Купфера (указано |) и гепатоцитах (указано при ХВГ (х400)

Таким образом, у больных ХГВ имелись высокие показатели ангио-генеза и экспрессии ММП-2, которые в сочетании с высокой пролифера-тивной активностью клеток Ито и фибробластов могли приводить к про-грессированию фиброза и развитию цирротической трансформации ткани печени. Терапия ХГВ ламивудином сопровождалась снижением пролифе-ративной активности клеток Ито и фибробластов, снижением уровня экспрессии ММП-7 и -9 в гепатоцитах, а также уменьшением фибро- и ангио-генеза в строме. Выявлены увеличение экспрессии ММП-7 и -9 и ИММП в клетках Купфера, макрофагах и клетках эпителия, а также активация механизмов антиметаллопротеиназной защиты в указанных клетках в результате усиления выработки ИММП-1 и -4, что привело к восстановлению баланса регуляторов синтеза экстрацеллюлярного матрикса и замедлению прогрессирования хронического гепатита.

Динамика показателей фиброза печени у больных ХГС на фоне противовирусной терапии

Всем больным (п=47) назначался Пег-ИФН-а-2а 1 раз в неделю (подкожно) и рибавирин (перорально) в зависимости от генотипа HCV и массы тела пациента (1-й генотип - 1000-1200 мг/сут, 2-й и 3-й генотипы -800 мг/сут). С учетом международных стандартов по ведению и лечению больных гепатитом С длительность курса лечения определялась следующим образом: генотип 1 - 48 недель, генотипы 2 и 3 - 24 недели. При условии позитивного теста на HCV RNA через 24 недели от начала лечения ПВТ прерывалась.

Биохимические и вирусологические показатели на фоне терапии. По результатам контрольного обследования на момент окончания терапии произошло снижение уровня AJIT с 107,5±8,1 до 27,1 ±2,6 Ед/л (среднее

значение изменения 81,2±8,5 Ед/л; 95% ДИ 63,5-97,3; р=0,0001) и АСТ - с 88,8±5,99 до 28,97+2,7 Ед/л (среднее значение изменения 59,8±6,5 Ед/л; 95% ДИ 46,9-72,8; р=0,0001) - парный критерий Стьюдента.

Вирусологический ответ на лечение получен у 37 (79%) пациентов, не получен у 10 (21%) больных. Устойчивый вирусологический ответ (УВО) зафиксирован у 20 (43%) пациентов.

Выявлена прямая достоверная корреляционная зависимость между активностью АЛТ сыворотки крови у пациентов до лечения и вирусологическим ответом (г=0,355; р=0,017) (рис. 10). У пациентов с вирусологическим ответом (п=35) средние показатели активности АЛТ сыворотки крови были достоверно выше - 135,6±14,9 Ед/л - по сравнению с больными, не ответившими на терапию (п=10), - 71,3+9,98 Ед/л (р=0,001; 95% ДИ 100,5-28.3). По результатам анализа данных выявлена достоверная прямая корреляционная зависимость между вирусологическим ответом и активностью АЛТ<2 норм (г=0,36; р=0,017) - коэффициент Пирсона. У пациентов с нормальными показателями АЛТ вирусологический ответ наблюдался в меньшем проценте случаев, чем у больных с повышенным до 2 норм уровнем АЛТ (р=0,036; 95% ДИ 0,02-0,05).

Анализ биохимических и вирусологических результатов лечения позволил выявить прямую корреляционную зависимость между вирусологической и биохимической ремиссией (г=0,577; р=0,0001) (рис. 1 !)•

Вирусологический ответ

• АЛТ (до начала лечения) уэ Вирусологический ответ - Регрессионый анализ (г=0,355; р=0,017)

Рис. 10. Зависимость между активностью АЛТ сыворотки крови и вирусологическим ответом у пациентов с ХГС до лечения и вирусологическим ответом

Многофакторный анализ показателей, оказывающих влияние на достижение вирусологического ответа, подтвердил зависимость частоты наступления ответа от генотипа вируса НСУ. Отмечена обратная достовер-

ная корреляционная зависимость между генотипом вируса и вирусологическим ответом (г=-0,338; р=0,0001). Аналогичная зависимость наблюдалась и при достижении биохимического ответа (г=-0,239; р=0,024) - коэффициенты Спирмена и Пирсона.

1,2 т-

§ щ

й 0.0 -

-2700 -700 1300

Биохимический ответ на лечение

• Бои химический и вирусологический ответ на лечение - Регрессионный анализ (г=0,577; р=0,0001)

Рис. 11. Зависимость между биохимическим и вирусологическим ответом на лечение больных ХГС

По результатам проведенных исследований не удалось получить достоверных данных в пользу зависимости вирусологического ответа от исходного количества вируса (вирусной нагрузки) ни при одном из генотипов вируса. У пациентов с 1-м генотипом НСУ отмечена недостоверная обратная корреляционная зависимость между вирусологическим ответом и вирусной нагрузкой. То есть, чем больше вирусная нагрузка у больного до начала лечения, тем менее вероятен УВО (г=-0,283; р=0,35) - коэффициент корреляции Спирмена.

Анализ показателей некровоспалительной реакции и фиброза по данным морфологического исследования до начала терапии показал наличие достоверной прямой корреляционной зависимости между степенью фиброза и ИГА (г=0,37; р=0,015). То есть, чем больше выражены признаки гистологической активности гепатита до лечения, тем тяжелее степень ФП. Достоверной зависимости между ИГА и степенью ФП с генотипом и количеством вируса мы не выявили.

У больных с 3-м генотипом вируса средний уровень АЛТ сыворотки крови был достоверно выше - соответственно 156,2+22,7 Ед/л, чем у пациентов с 1-м генотипом - 98,1±12,6 Ед/л (р=0,02; 95% ДИ 9,5-106,7). Уровни фиброза и ИГА у больных с 1-м и 3-м генотипами вируса достоверно не отличались (р>0,05).

Таким образом, если рассматривать всю группу пациентов, то вирусологический ответ достоверно чаще наблюдался у пациентов с 3-м генотипом (р=0,018; 95% ДИ 0,05-0,46), которые составили основную группу больных с высокой биохимической активностью гепатита Если для больных создать одинаковые условия, т. е. смотреть частоту вирусологического ответа у больных с 1-м и 3-м генотипами вируса, нормальным или повышенным (<2 норм уровнем AJIT), то достоверно чаще УВО наблюдался у пациентов с 1-м генотипом (р=0,02; 95% ДИ 0,64-0,07).

Полученные нами данные позволили сделать вывод, что достижение раннего вирусологического ответа (исчезновение вирусной РНК на 12-й неделе лечения) зависело от степени ФП по данным ПБП до начала лечения. У пациентов с F3 фиброза вирусологический ответ наблюдался реже, однако эти показатели недостоверны (г=-0,22; р=0,22) - корреляционный коэффициент Пирсона. Аналогичные данные показал анализ с использованием коэффициента Спирмена (г—-0,13; р=0,45). Одним из объяснений отсутствия достоверной связи может служить небольшой объем выборки больных с выраженной степенью фиброза F3 (п=5).

Кроме того, по лабораторным данным на момент окончания лечения выявлена зависимость между частотой УВО и степенью ФП по данным морфологического исследования до начала ПВТ. Наблюдалась достоверная обратная корреляционная зависимость между степенью фиброза и вирусологическим ответом. У пациентов, у которых по данным исходной ПБП фиброз был оценен как F3 (по системе МЕТА VIR), достоверно реже наблюдалась вирусологическая ремиссия (г=-0,256; р=0,015) - коэффициенты Спирмена и Пирсона.

Динамика показателей фиброза печени у больных ХГВ на фоне противовирусной терапии

Динамическая оценка клинического статуса больных ХГВ в процессе лечения ламивудином показала уменьшение выраженности астенического синдрома, размеров печени и лихорадки. У 2 пациентов с желтухой получена нормализация уровня билирубина. Существенных изменений в степени выраженности синдрома правого подреберья и размерах селезенки не наблюдалось.

Биохимические показатели на фоне лечения. По результатам контрольного обследования на момент окончания терапии произошло снижение уровня AJIT с 118,27±22,5 до 41,67±6,9 Ед/л (среднее значение изменения 76,6±25,2 Ед/л; 95% ДИ 22,5-130,6; р=0,009) и ACT - с 107,53±23,3 до 41,8+6,4 Ед/л (среднее значение изменения 65,7+25,4 Ед/л; 95% ДИ 11,2-120,27; р=0,022) - парный критерий Стьюдента.

Динамическое исследование активности аминотрансфераз показало, что у большинства больных ХГВ (86%) с различной степенью биохимиче-

ской активности нормализация АЛТ происходила в течение первых 6 мес лечения, у 2 пациентов - с 7-го месяца приема ламивудина. У пациентов с исходно нормальной биохимической активностью существенных изменений концентрации АЛТ и ACT в процессе лечения не наблюдалось.

Нормализация аминотрансфераз к моменту завершения лечения наблюдалась у 10 (71%) пациентов. Стойкая нормализация аминотрансфераз через 6 мес после окончания лечения наблюдалась у 8 (57%) больных.

У 5 (22%) пациентов с исходно повышенной активностью АЛТ в процессе печения ламивудином отмечалось уменьшение биохимической активности, однако к моменту окончания лечения концентрация АЛТ превышала верхний лимит нормы. У 2 (9%) пациентов при завершении лечения активность АЛТ превышала исходную. Клиренс сывороточной HBV ДНК к 3-му месяцу лечения ламивудином наблюдался у 23 (88%) больных, к 6-му месяцу - у всех пациентов. При дальнейшем мониториро-вании ДНК HBV реактивация репликации вируса, сопровождавшаяся повышением активности аминотрансфераз, наблюдалась у 4 пациентов. В 2 случаях причиной виремии послужило возобновление приема наркотиков, в связи с чем больные были исключены из исследования. У 2 других пациентов проводилось исключение суперинфекции HCV и тестирование ДНК HBV на выявление мутации YMDD локуса. Результаты этих исследований были отрицательными. У одного из этих пациентов виремия носила временный характер, и на момент окончания лечения наблюдался клиренс HBV ДНК. У второго пациента при дальнейших обследованиях клиренса HBV ДНК не отмечалось.

На момент окончания лечения клиренс HBV ДНК отмечался у 20 (87%) пациентов. Клиренс HBV ДНК через 6 мес после завершения приема ламивудина сохранялся у 15 (65%) пациентов.

HBeAg-сероконверсия наблюдалась у 5 (21%) пациентов. Из них у 2 (8%) пациентов достигнут клиренс HBsAg (HBsAg-, HBsAb-). Серокон-версии по HBsAg не отмечалось.

Анализ подгруппы пациентов, у которых была получена HBeAg-сероконверсия, показал исходно высокую биохимическую и гистологическую активность. Концентрация АЛТ в 5 раз и более превышала верхний лимит нормы (278,2±65,8 Ед/л), среднее значение ИГА по системе Knodell составило 10,5±1,0 балла.

Динамика морфологических показателей активности ХГВ. После окончания лечения повторная ПБП выполнена 23 больным. По результатам морфологической характеристики биоптатов печени среднее значение ИГА составило 6,3±0,7 балла и было достоверно ниже аналогичного показателя до лечения ламивудином (8,6+0,7 балла, 95% ДИ 1,124-3,37, среднее значение изменений 2,25±0,53 - парный критерий Стьюдента; р=0,001).

Средний показатель фиброза до лечения составил 2,0±0,3 балла. По окончании курса терапии степень фиброза была достоверно ниже аналогичного показателя до лечения ламивудином (1,19±0,16 балла, 95% ДИ 0,32-1,29, среднее значение изменений 0,8±0,23 - парный критерий Стью-дента; р=0,003) (табл. 9).

До начала лечения у 5 пациентов выявлены гепатит низкой гистологической активности (ИГА 7,1±1,2), умеренный фиброз (2,6±0,2), у 1 больного - гепатит умеренной активности (10 баллов), слабый фиброз, у 2 пациентов - гепатит высокой активности (13,5+0,5), тяжелый фиброз.

У больных с тяжелым ФП (Е=3 балла) произошло достоверное снижение ИГА после терапии с 9,75±1,031 до 7,38±6,4 балла (среднее значение изменений 2,375±0,905 - парный критерий Стьюдента; р=0,0341); степени фиброза - с 3,0±0,2 до 1,5±0,2 балла (среднее значение изменений 1,500±0,26 - парный критерий Стьюдента; р=0,001). Однако достоверных изменений АЛТ не произошло (р=0,132).

У больных с исходно повышенным уровнем АЛТ на фоне лечения произошло достоверное снижение ИГА с 9,18±0,942 до 6,18+0,84 балла после терапии (среднее значение изменений 3,000±0,588 - парный критерий Стьюдента; р=0,0001); степени фиброза - с 2,18±0,325 до 1,27+0,195 балла (среднее значение изменений 0,909±0,285 - парный критерий Стьюдента; р=0,01), АЛТ - с 148,00±25,202 до 38,82±7756 Ед/л (среднее значение изменений 109,182±28,012 - парный критерий Стьюдента; р=0,003).

Таблица 9

Динамика ИГА (по Кпос1еН) у больных ХГВ (п=23) при проведении терапии ламивудином

До лечения (баллы) После лечения (баллы)

а и. X о н Я 3 О. го и к 2 1 2 3 О. м и

Количество больны: (п=23) Перииортальные и МО! видные некрозы Внутридольковая лист фия и очаговые иекрс Портальное воспален Фиброз ИГА (сумма) Перииортальные и мостовидные некроз Внутридольковая дисп фия и очаговые некрс Портальное воспален Фиброз о < 1— К

М+т 1,6+0,5 2,1+0,4 2,8+0,4 2,0+0,3 8,6+0,7 1,3+0,2 1,1+0,2 2,5+0,2 1,19+0,2 6,3+0,7

Р >0,05 <0,05 >0,05 0,003 0,001 - - - - -

Уменьшение ИГА на 2 балла и более получено у 12 (52%) пациентов. Изменение ИГА в пределах 1 балла расценивалось как отсутствие динамики ИГА и наблюдалось у 3 (13%) пациентов. Ухудшение гистологической картины печени, определявшееся как увеличение ИГА на 2 балла и более, выявлено у 1 (4%) больного ХГВ.

Оценка гистологического ответа у HBeAg-пoзитивныx и НВеА«-негативных больных ХГВ представлена в табл. 10 и 11.

Таблица 10

Изменение активности воспалительно-некротического процесса в печени у больных ХГВ в зависимости от статуса HBeAg после лечения ламивудином

Показатель Уменьшение ИГА Увеличение ИГА Без изменений

HBeAg-пoзитивныe (п=8) 4 (25%) 1 (6%) 2(12,5%)

HBeAg-нcгaтивныe (п=15) 8 (50%) - 1 (6%)

Значения р 0,34 0,17 0,22

Таблица 11

Изменение степени фиброза у больных ХГВ в зависимости от статуса HBeAg после лечения ламивудином

Показатель Уменьшение степени фиброза Увеличение степени фиброза Без изменений

НВеА£-позитивные (п=8) 3 (19%) - 3(19%)

HBeAg-нeгaтивныe (п=15) 5(31%) 1 (6%) 4 (25%)

Значения р 0,19 0,12 0,32

Таким образом, на фоне лечения ламивудином больных ХГВ (в течение 48 недель) отмечено достоверное уменьшение суммарного ИГА гепатита (р=0,001). Наблюдалась положительная динамика ИГА: уменьшение дистрофии гепатоцитов и распространенности очаговых некрозов (р<0,05). Выявлено статистически значимое уменьшение степени ФП (р=0,003). Кроме того, имеющиеся гистологические изменения не зависели от статуса HBeAg.

Прогностическая ценность методов эластометрни, фибротеста и допплерографин в диагностике фиброза печени у больных ХВГ

Обследовано 200 больных ХВГ (средний возраст 35,6±10,9 года). Больные распределены в три группы, каждая из которых была обследована одним из трех методов: ультразвуковой допплерографией (УЗДГ), эла-стографией и фибротестом (100, 50 и 50 чел. соответственно). Пациенты находились в клинике им. В.Х. Василенко с диагнозом хронического гепатита - 75% (HCV РНК+) и 25% (HBV ДНК+). Всем больным в день проведения методов неинвазивной диагностики выполнена ПБП. Результаты неинвазивных методов сравнивались с данными полуколичественной оценки фиброза по системе МЕТА VIR. С учетом степени фиброза пациенты разделены на группы (F0-F2) и (F3-F4).

Результаты исследований прогностической ценности методов для выявления цирроза печени представлены в табл. 12 и на рис. 12.

Таблица 12

Прогностическая ценность методов для выявления цирроза печени

Метод AUROC 95% ДИ Р Качество метода

Эластография 0,963 0,929-0,997 0,001 отличное

Фибротест 0,950 0,894-1,005 0,001 отличное

УЗДГ/ИПСА 0,927 0,869-0,984 0,001 отличное

УЗДГ ССВВ 0,803 0,690-0,946 0,001 очень хорошее

Сравнительный анализ данных 3 методов для выявления выраженного (БЗ) фиброза представлен в табл. 13 и на рис. 13.

—- Эластография AUROC=0.963

-Фибротест

AUROC=0.950

-УЗДИПСА

AUROC=0.927

-УЗДССВВ

AUROC=0.803

-Диагональная

линия

0.4 0.6 0.8 1 Специфичность

Рис. 12. Сравнительный анализ ROC-кpивыx 3 неинвазивных методов для выявления цирроза печени

Таблица 13

Результаты применения неинвазивных методов выявления выраженного (ГЗ) фиброза печени

Метод АШОС 95% ДИ Р Качество метода

Эластография 0,888 0,815-0,960 0,001 очень хорошее

Фибротест 0,884 0,824-0,944 0,001 очень хорошее

УЗДГ ИПСА 0,843 0,755-0,930 0,001 очень хорошее

УЗДГ ССВВ 0,695 0,591-0,820 0,001 среднее

Таким образом, данные УЗДГ, эластографии и фибротеста высокодостоверны, информативны и позволяют проводить неинвазивную диагностику выраженного (РЗ-Р4) фиброза печени у больных ХГС и ХГВ. Высокий уровень качества методов позволяет рекомендовать их как скрининг-тесты степени фиброза печени в широкой клинической практике.

Накопленный опыт проведения биопсии и неинвазивных методов оценки фиброза печени позволил нам предложить следующий алгоритм их применения в клинической практике. Вначале проводят УЗИ в В-режиме, что позволяет выявить признаки портальной гипертензии и наличие цирроза печени. При их отсутствии проводят УЗДГ. ИПСА>1,2 и ССВВ<8,4 см/с указывают на наличие у пациента выраженного (Б4)

Эластография А1Л=ЮС=0.888

Фибротест АиЯОС=0.884

УЗД И ПСА АШС>С=0.843

УЗД ССВВ АиРС>С=0.695

Диагональная линия

Рис. 13. Сравнительный анализ ЯОС-кривых 3 неинвазивных методов для выявления выраженного (БЗ) фиброза печени

Специфичность

фиброза печени. Диагноз фиброза Р1-РЗ целесообразно устанавливать с применением 2 методов неинвазивной диагностики или биопсии печени рис. 14.

) УЗИ (В режим)

УЗД

Рнс. 14. Алгоритм применения биопсии и неинвазивных методов диагностики в целях определения стадии фиброза печени

Экспериментальный фиброз печени

Экспериментальная модель фиброза разработана на 62 самцах мышей (12 С57В1.-6 и 50 ВАЬВ/с); 10 интактных мышей ВАЬВ/с составили контрольную группу. Интоксикацию проводили СС14 (20% раствор в оливковом либо минеральном масле, первая инъекция 50 мкл на мышь, вторая -100 мкл и последующие - по 150 мкл, дважды в неделю) в течение 16 недель. На 8-й и 16-й неделях печень извлекали для гистологического исследования. Количество коллагеновых волокон и их распределение оценивалось после окраски морфологических препаратов пикросириусом красным, гематоксилин-эозином и по Ван-Гизону.

Изучена возможность спонтанного (без постороннего воздействия) обратного развития фиброза печени на разные сроки длительности (от 8 до 12 недель) введения гепатотоксического яда. Количественная морфологическая оценка коллагеновых волокон в ткани печени проведена по «Способу количественной оценки степени фиброза печени» (Заявка на

патент РФ от 17.10.07 г. №2007138369). Количество коллагена оценивалось непосредственно после прекращения интоксикации и через 2 недели, когда мыши получали только пищу и воду. В эксперимент вошли 28 особей линии С57ВЬ-6, которые были разделены на 4 группы. На 8-й неделе введения ССЦ забито 6 мышей (группа 1). Параллельно на 8-й неделе введения яда была прекращена интоксикация 8 мышей той же линии (группа 2). Эта группа мышей забита с последующим морфологическим исследованием через 2 недели, в течение которых интоксикация не проводилась. Аналогичный эксперимент был проведен и на 12-й неделе введения яда. Результаты количественной оценки коллагена в ткани печени представлены в табл. 14.

На фоне продления сроков токсического воздействия ССЦ (с 8 до 12 недель) отмечено прогрессирование фиброзных изменений в ткани печени - увеличение количества коллагенновых волокон с 18671±1166 до 27855±10853 пикселей (р<0,01). При прекращении введения яда на 8-й неделе отмечается достоверное уменьшение количества коллагена в печени с 18671±1166 до 8691 ±3237 пикселей. При продлении сроков интоксикации до 12 недель также сохраняется возможность обратного развития фиброза, но эти изменения выражены в меньшей степени. На этом сроке отмечено уменьшение количества коллагена с 27855±10853 до 25179±4896 пикселей (р>0,05).

Таблица 14

Результаты количественной оценки коллагена в ткани печени у мышей линии С57ВЬ-6 (п=28) на разных сроках интоксикации ССЦ

Количественная оценка коллагеновых волокон в ткани печени Группа 1 (п=6) Группа 2 (п=8) Группа 3 (п=8) Группа 4 (п =6)

8 недель интоксикации ССЦ 8 недель интоксикации ССЦ + 2 недели без введения яда 12 недель интоксикации ССЦ 12 недель интоксикации ССЦ + 2 недели без введения яда

Среднее значение (М±т) в пикселях 18671±1166 8691±3237 27855+10853 25179±4896

Примечание. Для групп 1-2 р<0,01; для групп 3-4 р>0,05; для групп 1-3 р<0,01.

Таким образом, можно сделать вывод, что по мере увеличения сроков воздействия гепатотоксического яда происходит не только количественное накопление коллагена в ткани печени, но и уменьшается возможность спонтанного обратного развития фиброза.

Генетическое моделирование аитифиброзиоН терапии в эксперименте

Для разработки генно-терапевтического подхода к лечению ФП проведены испытания антифиброзного действия следующих четырех генов человека: гена фактора роста гепатоцитов (HGF), гена урокиназы (UPA), гена матриксной металлопротеиназы-1 (ММП-1) и гена матриксной ме-таллопротеиназы-8 (ММП-8).

Максимальный уровень экспрессии генов HGF, ММП-1 и -8 получен путем оптимизации их кодонного состава.

Для экспрессии генов в печени мышей использовали высокоэффективный плазмидный вектор pC4W (фирма МОНА, Россия). После модификации каждый из четырех генов был встроен в указанный вектор с получением плазм идов.

Экспрессию белков в культуре клеток человека НЕК-293 (in vitro) определяли после их транзитной трансфекции соответствующими генетическими конструкциями. Для демонстрации экспрессии генов in vivo генетические конструкции в виде «голой» ДНК вводили в хвостовую вену мышам BALB/c и C57BL-6 методом гидродинамической инъекции. Продукцию белков характеризовали путем измерения их концентрации, а также ферментативной активности (UPA, ММП-1). В культуральной среде клеток НЕК-293 через 24 ч после трансфекции концентрация ММП-1 и -8 составила 10-20 мкг/мл, а концентрация HGP и UPA - 1-2 мкг/мл, что в 3-5 раз превышает уровень экспрессии тех же генов для конструкций на основе традиционного экспрессионного вектора pcDNA3 (рис. 15). В экспериментах in vivo через 24 ч после инъекции ДНК концентрация HGP в плазме крови составила 20-40 нг/мл, а ММП-1 и -8 - 0,5-1 мкг/мл, причем на долю активной металлопротеиназы приходится более 15% от ее суммарного количества. Перечисленные белки также обнаруживаются в экстрак-

1 | pC4W вектор Q pcDNA3 векгор

wr/мл

I

Рис. 15. Экспрессия белков в культуре трансфицированных клеток

тах печени мышей в концентрациях 7 мкг/г ткани (HGP ) и 1,3 мкг/г ткани (ММП-1 и-8) (рис. 16).

Q После введения плазмиды

|~~] Физиологические концентрации е крови человека

1,5

п _

500

20

4

-Ц rfl Ik

HGF UPA MMP1

Рис. 16. Экспрессия белков в печени и плазме крови здоровых мышей BALB/c

Таким образом, созданные конструкции позволяют достичь высокого уровня экспрессии потенциально терапевтических генов как in vitro (в культуре клеток), так и in vivo (в печени и плазме крови мышей). В дальнейшем указанные конструкции могут быть использованы для изучения антифиброзного действия данных генов в экспериментальных моделях ФП у животных.

ВЫВОДЫ

1. Выраженные признаки некровоспалительной реакции в ткани печени у больных хроническим гепатитом С сопровождаются более тяжелой степенью ее фиброза. Зависимость между морфологическими данными (уровень ИГА и степенью фиброза) и характеристиками вируса (генотип HCV и уровень виремии) отсутствует.

2. Комбинированная терапия (Пег-ИФН-а-2а/рибавирин) больных ХГС приводит к положительной динамике морфологических данных: отмечается достоверное снижение показателей некроза и воспаления, тенденция к уменьшению степени фиброза. Благоприятными прогностическими факторами УВО на ПВТ являются высокая активность АЛТ сыворотки крови до начала лечения и высокий исходный показатель ИГА. У больных со стадиями ФП F1 и F2 вирусологический ответ наступает чаще, чем у пациентов со стадией фиброза F3 (р=0,001).

3. Для больных ХГС характерны высокие показатели ангиогенеза (CD34 и PDGF), экспрессии ММП-2 и высокая пролиферативная активность клеток Ито (С4, АК и IGF1), что может приводить к прогрессирова-нию фиброза и развитию цирротической трансформации. Комбинирован-

пая ПВТ больных ХГС (Пег-ИФН-а-2а/рнбавирин) приводит к достоверному снижению пролиферативной активности клеток Ито, фибробластов, ангиогенеза в строме, достоверному повышению уровня экспрессии ММП-7 и -9 в гепатоцитах. При этом отмечается достоверное повышение активации механизмов антиметаллопротеиназной защиты путем усиления выработки ИММП-1 и -4, что может способствовать восстановлению баланса регуляторов синтеза экстрацеллюлярного матрикса и нормализации структуры ткани печени.

4. Терапия ламивудином больных хроническим гепатитом В в течение 48 недель приводит к положительной динамике морфологических данных: снижение ИГА составляет 2,4±0,9 балла (р=0,001), снижение степени фиброза - 1,5+0,3 балла (р=0,001), при этом динамика морфологических данных не зависит от степени фиброза печени до лечения. Существенных различий в характере гистологических изменений в печени у НВеАй-позитивных и НВеА«-негативных пациентов не выявлено. У больных ХГВ с исходно повышенным уровнем АЛТ на фоне лечения отмечается достоверная положительная динамика биохимической активности гепатита (с 148,0+25,2 до 38,8+7,8 МЕ/мл).

5. Для больных ХГВ характерно повышение значений показателей ангиогенеза и экспрессии ММП-2, а также высокая пролиферативная активность клеток Ито. Терапия ламивудином больных ХГВ сопровождается снижением пролиферативной активности клеток Ито и фибробластов (р<0,005), снижением уровня экспрессии ММП-7 и -9 в гепатоцитах, а также уменьшением ангиогенеза в строме (р<0,005) при увеличении экспрессии ММП-7, -9 и ИММП в клетках Купфера, макрофагах и клетках эпителия, что свидетельствует о восстановлении баланса регуляторов синтеза экстрацеллюлярного матрикса, активации механизмов антиметаллопротеиназной защиты и уменьшении дальнейшего прогрессирования фибротической реакции печени.

6. Морфологическое исследование печени с количественной оценкой фиброза определяет весь объем коллагеновых волокон в исследуемом материале, что позволяет оценить количество фиброзной ткани в рамках одной стадии фиброза по МЕТАУЖ, и исключает влияние субъективных факторов на результаты заключения.

7. Диагностическая точность метода эластометрии сопоставима с данными морфологического исследования печени для выявления продвинутых стадий ФП у больных хроническими гепатитами В и С и составляет при выраженном фиброзе (ЕЗ) - 89%, при ЦП (Б4) - 96,4%. К факторам, уменьшающим диагностическую точность исследования, относятся возраст пациента старше 50 лет, ИМТ > 28 кг/м", наличие стеатоза печени.

8. Диагностическая точность метода фибротеста сопоставима с данными морфологического исследования для выявления стадий ФП ¥2-¥А у больных хроническими гепатитами В и С и составляет при ФП Р2-РЗ 85,2% , а при фиброзе РЗ-Р4 - 95,2%.

9. При проведении допплерографии наиболее диагностически значимыми показателями выраженности ФП у больных ХВГ являются пуль-сационный индекс селезеночной артерии и средняя скорость кровотока воротной вены. При этом диагностическая точность для ИПСА при ЦП (Р4) составляет 82,7%, при выраженном фиброзе (РЗ) - 76,1%; диагностическая точность для ССВВ при ЦП (Р4) составляет 77,4%, а при выраженном фиброзе (РЗ) - 65,3%.

10. У больных ХВГ со стадиями ФП (Р2-РЗ) показатели обмена железа (ферритин, железо и НТЖ сыворотки крови) достоверно превышают таковые значения в группе контроля и у больных с начальной стадией фиброза (Р1), что позволяет использовать указанные показатели в качестве дополнительных критериев стадий ФП (Р2-РЗ) у данной категории пациентов.

11. При проведении генно-инженерной терапии ФП в эксперименте генетические конструкции на основе оптимизированных генов способны экспрессировать потенциально терапевтические гены урокиназы, фактора роста гепатоцитов, ММП-1 и -8. При этом плазмидный экспрессивный вектор рС4\У позволяет в 3-5 раз увеличить уровень экспрессии указанных генов по сравнению с традиционно используемыми конструкциями на основе экспрессионного вектора рсОКАЗ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для наиболее точной диагностики фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С рекомендуется использовать автоматизированный метод количественной оценки, измеряя весь объем коллагена в исследуемом материале (биоптате). Количественный показатель можно использовать для изучения темпов прогрессирования ФП и оценки эффективности препаратов с антифиброзным действием.

2. У больных ХГС и ХГВ при проведении ПВТ для оценки ФП следует проводить эластометрию печени и фибротесты в качестве скрининг-методов перед началом терапии, а также каждые 6 мес для оценки динамики фиброза печени. При этом лимитирующим фактором для проведения фибротеста является холестатический синдром (повышение уровня ГГТП и билирубина); для эластометрии: избыточная масса тела (более 28 кг/м2), наличие стеатоза печени, возраст старше 50 лет.

3. Диагностику ранних стадий фиброза (F1-F2) целесообразно проводить с использованием, по крайне мере, 2 неинвазивных методов исследования или биопсии печени.

4. В качестве неинвазивного показателя степени гистологической активности воспалительного процесса в печени у больных ХГВ и ХГС следует рассматривать линейную скорость в воротной вене (норма -11,3±3,7 см/с; AI - 18,9±10,8 см/с; А2 - 9,9±2,7 см/с) и диаметр селезеночной вены (норма - 5,9±1,8 мм; Al - 7,9+1,9 мм; А2 - 7,1±1,4 мм).

5. В комплексной диагностике ФП могут быть использованы показатели линейной скорости кровотока в воротной вене и размеры (диаметр) селезеночной вены и общей печеночной артерии. При этом степени фиброза Fl и F2 соответствует скорость кровотока в воротной вене 15,1 ±8,7 и 8,6±2,2 см/с соответственно (норма - 11,3±3,7 см/с), а также диаметр селезеночной вены - 6,9±1,0 и 8,2±2,0 мм соответственно (норма - 5,9+1,8 мм) и диаметр общей печеночной артерии - 5,1+0,6 и 5,9+1,5 мм соответственно (норма - 4,6+0,9 мм).

6. Измененные сывороточные показатели обмена железа (ферритин, железо и НТЖ) следует рассматривать как дополнительные критерии ФП (F2-F3) у больных ХГВ и ХГС.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гепатит С: естественное течение и подходы к терапии // Клин, перспект. гастроэнтерол., гепатол. - 2001. - №3. - С. 2-6.

2. Синдром перегрузки железом у больных хроническими вирусными гепатитами // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2001. - Т. 11, №4. - С. 57-58 (соавт. Ивашкин В.Т.).

3. Сравнительный анализ сывороточных показателей обмена железа у больных хроническими вирусными гепатитами с различным индексом гистологической активности гепатита // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2001. - Т.11, №5 (прил. №15). - С. 84 (соавт.: Маев-ская М.В., Франк Г.А., Лукина Е.А., Левина A.A., Ивашкин В.Т.).

4. Характерные особенности метаболизма железа у больных хроническими вирусными гепатитами и циррозом печени // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2001. - Т.11, №1 (прил. №12). - С. 17 (соавт.: Маевская М.В., Франк Г.А., Лукина Е.А., Ивашкин В.Т.).

5. Содержание железа и ферритина в ткани печени больных хроническими вирусными гепатитами (ХВГ) // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2002. - Т.12, №1 (прил. №16). - С. 12 (соавт.: Маевская М.В., Левина A.A., Лукина Е.А., Ивашкин В.Т.).

6. Веро-рибавирин в лечении больных хроническим гепатитом С // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2003. - Т. 13, №6. -С.80-84 (соавт.: Ивашкин В.Т., Маевская М.В., Лапшин А.В., Радионова Е.Н., Шипулин Г.А., Богославская Е.В., Гущин А.Е.).

7. Динамика биохимических, вирусологических и гистологических характеристик хронического гепатита В на фоне лечения ламивудином и интерфероном-а // Матер. Восьмой Российской конф.: Гепатология сегодня, 17-19 марта 2003 г.; Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2003. - Т. 13, №1 (прил. №18). - С.7 (соавт.: Галимова С.Ф., Маевская М.В., Шульпекова Ю.О., Ивашкин В.Т., Никитин И.Г., Сторожаков Г.И., Золотаревский В.Б.).

8. Клинико-морфологическая характеристика хронического вирусного гепатита В на фоне лечения ламивудином // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2003. - Т.13, №1. - С. 65-72 (соавт.: Галимова С.Ф., Маевская М.В., Шульпекова Ю.О., Ивашкин В.Т.).

9. Опыт применения веро-рибавирина при лечении больных хроническим гепатитом С // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. -2003. - Т.13, №2. - С.38-42 (соавт.: Ивашкин В.Т., Маевская М.В., Лапшин А.В., Радионова Е.Н., Шипулин Г.А., Богославская Е.В., Гущин А.Е.).

10. Ранний вирусологический ответ у больных хроническим гепатитом С, получающих комбинированную терапию Реафероном и Веро-рибавирином // Матер. Восьмой Российской конф.: Гепатология сегодня, 17-19 марта 2003 г.; Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. -2003. - Т. 13, №1 (прил. №18). - С. 12 (соавт.: Родионова Е.Н., Маевская М.В., Павлов Ч.С., Шипулин Г.А., Богославская Е.В., Гущин А.Е., Ивашкин В.Т., Лапшин А.В.).

11. Сравнительный анализ показателей метаболизма железа и биохимической активности хронического вирусного гепатита // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2003. - Т.12, №1 (прил. №18). -С. 20 (соавт.: Лукина Е.А., Маевская М.В., Ивашкин В.Т., Левина А.А., Франк Г.А.).

12. Iron metabolism in hepatitis В and С: Accidental or regular differences? // XII Falk Liver Week, Freiburg (Germany), 2003, October 17-19, Falk symposium - N137 «Liver diseases: Advances in Treatment and Prevention» Abs. N 111 (соавт.: V. Ivashkin, E. Lukina, S. Galimova, T. Solovjeva, Ju. Mamukova, N. Khoroshko, G. Frank, A. Levina, E. Sysojeva).

13. Seronegative chronic hepatitis C: Long-term monitoring // XII Falk Liver Week, Freiburg (Germany), 2003, October 17-19, Falk symposium -N137 «Liver diseases: Advances in Treatment and Prevention» Post. Abs. N 84 (соавт.: V. Ivashkin, E. Lukina, F. Filatov, N. Khoroshko, G. Frank, E. Sysojeva).

14. Малые дозы алкоголя и эффективность противовирусной терапии гепатита С // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2005. - Т. 15, № 5. - С.41-46 (соавт.: Маевская М.В., Золоторевский В.Б., Ивашкин В.Т., Шарафеева О.П., Ведерникова A.B., Ондос Ш.А.).

15. Современные методы ранней диагностики фиброза печени // Клин. мед. - 2005. - Т. 83, №12. - С.58-60 (соавт.: Золотаревский В.Б., Ивашкин В.Т., Шульпекова Ю.О., Коган Е.А.).

16. Современные представления о патогенезе, диагностике и лечении фиброза печени II Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. -

2005. - №2. - С. 13-20 (соавт.: Шульпекова Ю.О., Золотаревский В.Б., Ивашкин В.Т.).

17. Успешное лечение больного хроническим гепатитом D с тяжелым фиброзом (Клиническое наблюдение) // Клин, перспект. гастроэнтерол., гепатол. - 2005. - №6. - С.31-34 (соавт.: Буеверов А .О., Ешану B.C., Маевская М.В., Золотаревский В.Б., Ивашкин В.Т.).

18. Биопсия печени: Методология и практика сегодня // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2006. - №4. - С.65-78 (соавт. Ивашкин В.Т.).

19. Возможность обратимости цирроза печени (клинические и патогенетические предпосылки) II Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2006. - №1. - С.20-29 (соавт.: Золотаревский В.Б., Томкевич М.С., Коган Е.А. и др.).

20. ГЦК у больной вирусным (HCV+) циррозом печени (Клиническое наблюдение) // Матер. Двенадцатой Российской Гастроэнтерол. нед. 16-18 окт. 2006 г.; Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. -

2006. - Т.16, №5 (прил. № 28). - С.85 (соавт.: Ондос Ш.А., Маевская М.В., Ивашкин В.Т.).

21. Динамика гистологической активности хронического гепатита В (ХВГ-В) у больных, леченных ламивудином // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2006. - Т.16, №1. - С.39 (соавт.: Галимова С.Ф., Ивашкин В.Т.).

22. Динамика показателей воспаления и фиброза печени у больных хроническим вирусным гепатитом С (ХВГ-С) на фоне комбинированной терапии (интерфероном-а + рибавирином) // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2006. - №1 (прил. №27). - С. 45 (соавт.: Маевская М.В., Золотаревский В.Б., Ивашкин В.Т., Коган Е.А., Широкова E.H.).

23. Механизмы прогрессирования воспаления и фиброза при хронических вирусных гепатитах // Матер. 8-го межд. Славяно-Балтийского науч. форума: Санкт-Петербург - Гастро-2006, М-116, № 411; Гастроэнтерол. Санкт-Петербурга. - 2006. -№1-2 (соавт.: Коган Е.А., Томкевич М.С., Золотаревский В.Б., Ивашкин В.Т.).

24. Особенности клинического течения, целесообразность и эффективность противовирусной терапии хронического гепатита, обусловленного действием алкоголя и вируса гепатита С // Клин, перспект. гастроэнте-рол., гепатол. - 2006. - №5. - С.3-9 (соавт.: Маевская М.В., Ивашкин В.Т., Ведерникова A.B., Золотаревский В.Б.).

25. Роль апоптоза в прогрессировании воспаления и фиброза печени у больных хроническими вирусными гепатитами (ХВГ) // Рос. журн. гаст-роэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2006. - № I (прил. №27). - С. 38 (соавт.: Коган Е.А., Томкевич М.С., Золотаревский В.Б., Ивашкин В.Т.).

26. Фиброз печени и показатели обмена железа у больных хроническими вирусными гепатитами (ХВГ) // Матер. Одиннадцатой Российской конф.: Гепатология сегодня, 27-29 марта 2006 г.; Рос. журн. гастроэнте-рол., гепатол., колопроктол. - 2006. - Т. 16, №1 (прил. №27). - С.34 (соавт.: Лукина Е.А., Левина A.A., Золотаревский В.Б., Ивашкин В.Т.).

27. Hepatocellular carcinoma in patient with viral (HCV-RNA+) liver cirrhosis-(case report) // Bulgarian J. of Hepatogastroenterology. - 2006. - N2.

- P.95 (соавт: Sh. Ondos, M. Morozova, D. Glushenkov, M. Maevskaya, V. Ivashkin).

28. Безопасно ли проведение биопсии печени // Матер. Двенадцатой Российской конф.: Гепатология сегодня, 19-21 марта 2007 г.; Рос. журн. гаст-роэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2007. - Т. 17, №1 (прил. №29). - С.90

29. Биопсия и морфологическое исследование в диагностике хронических заболеваний печени неуточненной этиологии // Рос. журн. гастро-энтерол., гепатол., колопроктол. - 2007. -№1 (прил. №29). - С.90 (соавт.: Ивашкин В.Т., Маевская М.В., Золотаревский В.Б., Широкова E.H.).

30. Влияние показателей индекса гистологической активности (ИГА) и степени фиброза печени на эффективность противовирусной терапии хронического гепатита С (ХГС) Пег-интерфероном-а-2а и рибави-рином // Матер. Двенадцатой Российской конф.: Гепатология сегодня, 1921 марта 2007 г.; Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2007.

- Т.17, №1 (прил. №29). - С.37 (соавт.: Ивашкин В.Т., Маевская М.В., Золотаревский В.Б., Ондос Ш.А.).

31. Диагностическая точность эластометрии у больных ХГС/ХГВ на разных стадиях фиброза печени // Матер. Тринадцатой Российской Гастроэнтерол. нед., 22-24 окт. 2007 г.; Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2007. - Т.17, №5 (прил. №30). - С. 90 (соавт.: Глушенков Д.В., Золотаревский В.Б., Маевская М.В., Ивашкин В.Т.).

32. Как оценить и уменьшить риск фиброза, цирроза и гепатоцел-люлярной карциномы (ГЦК) у пациентов с хронической инфекцией вирусами гепатита В (HBV) и С (HCV) // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2007. - №5. - С.16-23 (соавт. Ивашкин В.Т.).

инфекцией вирусами гепатита В (HBV) и С (HCV) // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2007. - №5. - С.16-23 (соавт. Ивашкин

B.Т.).

33. Место биопсии и морфологического исследования ткани печени у детей и взрослых в практике клинициста // Клин. мед. - 2007. - №9. -

C.72-77 (соавт. Котович М.М.).

34. Неинвазивная диагностика фиброза печени // Сб. лекций конф.: Диагностика и лечение болезней органов пищеварения с позиций доказательной медицины. - М., 2007. - С.67-71 (соавт.: Глушенков Д.В., Ивашкин В.Т.).

35. Неинвазивная диагностика фиброза печени с использованием аппарата «Фиброскан» // Сб. матер. Всерос. науч.-практ. конф.: Высокие медицинские технологии. - М., 2007. - С. 106.

36. Особенности клиники и эффективность противовирусной терапии хронического гепатита, обусловленного действием алкоголя и вируса гепатита С И Клин. мед. - 2207. - Т.85, №1. - С.47-51 (соавт.: Ивашкин В.Т., Маевская М.В., Ведерникова A.B., Золотаревский В.Б.).

37. Показатели УЗ-ангиографии в комплексной оценке фиброза печени у больных хроническим гепатитом С // Матер. Тринадцатой Российской Гастроэнтерол. нед., 22-24 окт. 2007 г.; Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2007. - Т.17, №5 (прил. №30). - С. 165 (соавт.: Коновалова О.И., Ивашкин В.Т.).

38. Принципы диагностики и подходы к терапии фиброза и цирроза печени // Рос. мед. журн. - 2007. - Т.9, № 1. - С. 11 -15.

39. Стандартный интерферон-а в лечении больных хроническим гепатитом С // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2007. -Т.17, №1. - С.14-19 (соавт.: Ивашкин В.Т., Маевская М.В., Лапшин A.B.).

40. Структура хронических заболеваний печени по данным биопсии и морфологического исследования ее ткани // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2007. -№1 (прил. №29). - С. 90 (соавт.: Ивашкин В.Т., Маевская М.В., Золотаревский В.Б., Широкова E.H.).

41. Трехлетняя динамика основных нозологических форм хронических заболеваний, потребовавших проведения биопсии печени // Матер. Тринадцатой Российской Гастроэнтерол. нед., 22-24 окт. 2007 г.; Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2007. - Т.17, №5 (прил. №30). - С. 90 (соавт.: Широкова E.H., Ивашкин В.Т., Маевская М.В., Золотаревский В.Б., Ондос Ш.А.).

42. Экспериментальный цирроз печени: мифы и реальность // Матер. Тринадцатой Российской Гастроэнтерол. нед., 22-24 окт. 2007 г.; Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2007. - Т.17, №5 (прил.

(прил. №30). - С. 91 (соавт.: Пекло М.М., Липатова Л.Н., Власик Т.Н., Золотаревский В.Б., Ивашкин В.Т.).

43. Эластометрия у больных ХГС на ранних стадиях фиброза печени // Матер. Тринадцатой Российской Гастроэнтерол. нед., 22-24 окт. 2007 г.; Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2007. - Т. 17, №5 (прил. №30). - С.90 (соавт.: Глушенков Д.В., Золотаревский В.Б., Ма-евская М.В., Ивашкин В.Т.).

44. Анализ показателей эластометрии и фибротеста у больных ХГС/ХГВ на разных стадиях фиброза печени // Матер. Восьмой ВосточноСибирской гастроэнтерол. конф. с межд. участ. и Красноярской краевой гастроэнтерол. конф.: Клинико-эпидемиологические проблемы заболеваний органов пищеварения, 17-18 апр. 2008 г. - Красноярск, 2008. - С.296-297 (соавт.: Глушенков Д.В., Золотаревский В.Б., Ивашкин В.Т.).

45. Вирус гепатита В - основной этиологический фактор хронического гепатита, цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы // Рус. мед. журн. - 2008. - Т. 16, №4. - С. 157-160 (соавт. Бакулин И.Г.).

46. Вклад изучения показателей печеночного кровотока в клинической оценке активности и степени фиброза хронических вирусных гепатитов (ХВГ) // Матер. Тринадцатой Российской конф.: Гепатология сегодня, 17-19 марта 2008 г.; Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. -2008. - Т.18, №1 (прил. №31). - С.30 (соавт.: Коновалова О.Н., Ивашкин В.Т.).

47. Вклад эластометрии в клиническую оценку тяжести цирроза печени // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2008. - Т.18, №5 (прил. №32). - С.84 (соавт.: Глушенков Д.В., Галушко М.Ю., Ивашкин В.Т.).

48. Возможности эластометрии и фибротеста в диагностике цирроза печени (Клиническое наблюдение) // Матер. Тринадцатой Российской конф.: Гепатология сегодня, 17-19 марта 2008 г.; Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2008. - Т.18, №1 (прил. №31). - С.9 (соавт.: Глушенков Д.В., Маевская М.В., Ивашкин В.Т.).

49. Гиперферритинемия у больного хроническим гепатитом С с отсутствием доминантных мутаций HFE и хорошим ответом на противовирусную терапию // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. -2008. - Т.18, №5 (прил. №32). - С.83 (соавт.: Герман E.H., Буеверов А.О., Маевская М.В., Ивашкин В.Т.).

50. Клиническое значение актитеста в оценке активности HCV/HBV // Матер. Тринадцатой Российской конф.: Гепатология сегодня, 17-19 марта 2008 г.; Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2008. -Т.18, №1 (прил. №31). - С.24 (соавт.: Глушенков Д.В., Золотаревский В.Б., Ивашкин В.Т.).

51. Комбинированное противовирусное лечение пегилированным интерфероном-а-2а и рибавирином больных хроническим гепатитом С, принимающих умеренные дозы алкоголя // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2008, - Т. 18, №2. - С.35-41 (соавт.: Ондос Ш.А., Маевская М.В., Ивашкин В.Т.).

52. Неинвазивная диагностика фиброза печени на ранних стадиях его развития (Клиническое наблюдение) // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2008. - Т. 18, №5 (прил. №32). - С. 83 (соавт.: Глу-шенков Д.В., Коновалова О.Н., Золотаревский В.Б., Ивашкин В.Т.).

53. Новый метод количественной оценки фиброза печени // Матер. Тринадцатой Российской конф.: Гепатология сегодня, 17-19 марта 2008 г.; Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2008. - Т. 18, №1 (прил. №31). - С. 19 (соавт.: Пекло М.М., Золотаревский В.Б., Власик Т.Н., Ивашкин В.Т.).

54. Оценка фиброза печени у больных НАСГ с использованием метода эластометрии // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. -2008. - Т. 18, №1 (прил. №31). - С.65 (соавт.: Глушенков Д.В., Золотаревский В.Б., Ивашкин В.Т.).

55. Разработка и тестирование оптимизированных генетических конструкций для экспрессии терапевтических генов в клетках печени // Матер. Тринадцатой Российской конф.: Гепатология сегодня, 17-19 марта 2008 г.; Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2008. - Т. 18, №1 (прил. №31). - С.20 (соавт.: Шевелев А.Я., Пекло М.М., Рыбалкин И.Н., Липатова Л.Н., Янушевская Е.В., Руткевич П.Н., Руткевич Н.М., Каширина Н.М., Слинкин М.А., Гурская Т.Д., Манушкина Ж.Э., Парфенова Е.В., Ивашкин В.Т., Власик Т.Н.).

56. Результаты первого Российского сравнительного исследования чувствительности и специфичности эластометрии и фибротеста у больных хроническими вирусными гепатитами // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2008. - Т. 18, №1 (прил. №31). - С.36 (соавт.: Глушенков Д.В., Коновалова О.Н., Золотаревский В.Б., Ивашкин В.Т.).

57. Современные возможности эластометрии, фибро- и актитеста в диагностике фиброза печени // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2008. - T.XVIII, № 4. - С. 43-52 (соавт.: Глушенков Д.В., Ивашкин В.Т.).

58. Создание модели токсического фиброза печени у мышей // Матер. Тринадцатой Российской конф.: Гепатология сегодня, 17-19 марта 2008 г.; Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2008. - Т. 18, №1 (прил. №31). - С.19 (соавт.: Пекло М.М., Золотаревский В.Б., Шевелев А.Я., Рыбалкин И.Н., Липатова Л.Н., Власик Т.Н., Ивашкин В.Т.).

59. Ультразвуковое ангиологическое исследование и эластометрия -перспективные направления неинвазивной диагностики фиброза печени // Консилиум медикум. - Приложение: Гастроэнтерология. - 2008. - №2. С.23-26 (соавт.: Коновалова О.Н., Ивашкин В.Т.).

60. «ФиброМакс» - комплекс сывороточных неинвазивных тестов для диагностики хронических диффузных заболеваний печени // Гепато-логический форум: Прил. к журн. «Клин, фармакол. и тер.» - 2008. - №3.

- С.22-27 (соавт.: Глушенков Д.В., Ондос Ш.А., Ивашкин В.Т.).

61. Чувствительность и специфичность фибротеста у больных ХГС/ХГВ на разных стадия фиброза печени // Матер. Тринадцатой Российской конф.: Гепатология сегодня, 17-19 марта 2008 г.; Рос. журн. гаст-роэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2008. - Т.18, №1 (прил. №31). - С.25 (соавт.: Глушенков Д.В., Золотаревский В.Б., Ивашкин В.Т.).

62. Эластометрия в оценке динамики фиброза печени у больных хроническим гепатитом С (ХГС), леченных Пег-интерфероном-а и риба-вирином // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2008. -Т.18, №1 (прил. №31). - С.37 (соавт.: Ондос Ш.А., Глушенков Д.В., Ивашкин В.Т.).

63. Эластометрия или биопсия печени: как сделать правильный выбор? // Рос. мед. вести. - 2008. - Т. 12, №1. - С. 31-37.

64. Clinical value of the Acti-Test in the estimation of activity of chronic hepatitis HCV/HBV // Hepatology International (official journal of the Asian Pacific Associatiation for the study of the liver). - june 2008. - Vol. 2. - Sup. 2.

- P.276. - S.143 (poster) (соавт.: D. Glushenkov, V. Zolotorevskii, V. Ivash-kin).

65. Non-invasive diagnostics of liver fibrosis at early stage of its development (clinical supervision) // Hepatology International (official journal of the Asian Pacific Associatiation for the study of the liver). - june 2008. - Vol.2. -Sup.2. - P.396. - S.172 (poster) (соавт.: D. Glushenkov, O. Konovalova, V. Zolotorevskii, V. Ivashkin).

66. Sensitivity and Specificity of Fibro Test in Patients with Chronic Hepatitis C/B at Different Stages of Hepatic Fibrosis // Hepatology International (official journal of the Asian Pacific Associatiation for the study of the liver). -june 2008. - Vol. 2. - Sup. 2. - YI-18, S48 (oral presentation (соавт.: D. Glushenkov, O. Konovalova, V. Zolotorevskii, V. Ivashkin).

67. The contribution of studying of parameters of hepatic blood flow in clinical estimation of activity and fibrosis degree of chronic virus hepatitis Gut (international journal of gastroenterology and hepatology), 16th United European Gastroenterology Week «UEGW 2008» Vienne, Austria, 18-22 October 2008, Poster abstract P0293 (соавт.: О. Konovalova, V. Ivashkin).

68. Влияние комбинированной противовирусной терапии (Пег- ин-терферон-а-2а + рибавирин) на молекулярные механизмы фиброзирования при хроническом гепатите С (ХГС) // Матер. Четырнадцатой Российской конф.: Гепатология сегодня, 16-18 марта 2009 г.; Рос. журн. гастроэнте-рол., гепатол., колопроктол. - 2009. - Т.Х1Х, №1 (прил. №33). - С.42 (со-авт.: Коган Е.А., Ивашкин В.Т., Золотаревский В.Б.).

69. Комплексная оценка фиброза печени у больных хроническим гепатитом В (ХГВ) и С (ХГС) с использованием ультразвуковой доппле-рографии // Матер. Четырнадцатой Российской конф.: Гепатология сегодня, 16-18 марта 2009 г.; Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2009. - Т.Х1Х, №1 (прил. №33). - С.36 (соавт.: Коновалова О.Н., Ивашкин В.Т., Золотаревский В.Б.).

70. Молекулярные механизмы фиброгенеза у больных хроническим гепатитом В (ХГВ) // Матер. Четырнадцатой Российской конф.: Гепатология сегодня, 16-18 марта 2009 г.; Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2009. - Т.Х1Х, №1 (прил. №33). - С.25 (соавт.: Коган Е.А., Галимова С.Ф., Ивашкин В.Т., Золотаревский В.Б.).

71. Прогностическая ценность методов неинвазивной диагностики фиброза печени у больных хроническими гепатитами В (ХГВ) и С (ХГС) // Матер. Четырнадцатой Российской конф.: Гепатология сегодня, 16-18 марта 2009 г.; Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2009. -Т.Х1Х, №1 (прил. №33). - САЗ (соавт.: Коновалова О.Н., Глушенков Д.В., Ивашкин В.Т., Золотаревский В.Б.).

72. Сравнительный анализ данных ультразвуковой допплерографии, эластометрии и фибротеста в неинвазивной диагностике цирроза печени вирусной этиологии // Матер. Четырнадцатой Российской конф.: Гепатология сегодня, 16-18 марта 2009 г.; Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2009. - Т.Х1Х, №1 (прил. №33). - С.43 (соавт.: Коновалова О.И., Глушенков Д.В., Ивашкин В.Т., Золотаревский В.Б.).

73. Фибротест в диагностике ранних стадий фиброза печени у пациентов с хроническим гепатитом В (ХГВ) // Матер. Четырнадцатой Российской конф.: Гепатология сегодня, 16-18 марта 2009 г.; Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2009. - Т.Х1Х, №1 (прил. №33). - С.43 (соавт.: Коновалова О.И., Глушенков Д.В., Ивашкин В.Т., Золотаревский В.Б.).

ПАТЕНТ

Способ оценки степени фиброза печени при хроническом вирусном гепатите от 20 апреля 2009 г. №2352950.

Подписано в печать 15.05.2009 г. Формат 60*90, 1/16. Объем 3.0 п.л. Тираж 100 экз. заказ № 126 Отпечатано в ООО «Техноком» г. Москва, Смоленская пл. 13/21, т. 956-32-01

Актуальность темы

Изучение патогенеза, совершенствование диагностики и повышение эффективности терапии хронических заболеваний печени (ХЗП) представляют собой наиболее актуальные проблемы современной гепатологии.

По данным ряда авторов, летальность в течение 5 лет и после постановки диагноза цирроза печени (ЦП) составляет 45-86% [8, 12, 17, 18, 83]. Основной путь прогрессирования ХЗП - развитие последовательных стадий фиброза печени (ФП) с формированием в конечном итоге цирроза и рака печени, что во многом предопределяет плохой жизненный прогноз и короткие сроки выживаемости этой категории больных [23, 26, 31, 39, 40, 61,97].

Сегодня не существует единой теории патогенеза хронических вирусных гепатитов (ХВГ). Необоснованно противопоставляются такие процессы, как хроническое воспаление, включающее в себя обязательным компонентом воспалительную репарацию, и процесс репарации ткани печени в ответ на повреждение. Часть исследователей связывает прогрессирование ХВГ с развитием иммунного воспаления, другие авторы считают формирование ЦП результатом нарушения репарации стромы и гепатоцитов в участках повреждения портальных трактов и паренхимы печени [28, 42, 48, 91, 96, 107, 126 ].

В настоящее время в нашей стране единственным доступным методом определения степени и распространенности ФП остается пункционная биопсия печени (ПБП). Данная методика инвазивна, проводится в госпитальных условиях и имеет ряд противопоказаний [31, 46, 47, 50, 55, 88, 105,114].

В последние годы за рубежом начали широко применяться методы не-инвазивной диагностики ФП.

К преимуществам современных методов неинвазивной диагностики перед ПБП относятся: простота, отсутствие противопоказаний, высокая диагностическая точность на различных стадиях ФП, возможность оценивать динамику фиброза, удобство применения скрининг-метода для пациентов из групп риска и использование в амбулаторных условиях.

Принципиально важна возможность неинвазивной диагностики своевременного определения ранних стадий ФП, что позволяет в короткие сроки назначить терапию и предотвратить дальнейшее прогрессирование фиброза [13, 14, 16, 112, 115, 117, 158, 242]. Все вышесказанное диктует необходимость разработки и внедрения в клиническую практику новых неинвазивных методов диагностики ФП, безопасность которых значительно расширит круг пациентов и позволит использовать их в амбулаторных условиях.

Лечение больных ФП и ЦП остается одной из ключевых проблем клинической гепатологии. Рост инвалидизации и высокая смертность больных ХЗП в результате развития осложнений, крайне недостаточное количество проводимых в нашей стране ортотопических трансплантаций печени (ОТП), отсутствие альтернативных трансплантаций печени консервативных методов лечения пациентов с терминальной стадией заболевания диктует необходимость новых подходов к терапии [92, 124, 125, 134].

В мире сегодня активно ведутся поиски альтернативных методов лечения больных ХЗП в двух направлениях: создание генно-инженерных препаратов, активно влияющих на структурные изменения печени при ЦП, и использование стволовых клеток крови и клеток-предшественников клеток печени, позволяющих восстановить поврежденные при цирротической трансформации функции печени [100, 108, 109, 122, 124, 149, 214].

Все вышесказанное определяет актуальность изучения патогенеза, совершенствования методов диагностики ФП, разработки и внедрения в клиническую практику генно-инженерных препаратов, эффективно влияющих как на процессы регенерации и восстановления функций печени, так и способных вызвать обратное развитие ФП путем активации (на клеточном уровне) процессов его деградации.

Цель работы: изучение патогенеза фиброза при хроническом вирусном гепатите с определением механизмов регуляции фиброгенеза в ткани печени; совершенствование диагностики фиброза с разработкой метода количественной оценки коллагена в ткани печени; определение диагностических возможностей неинвазивных методов исследований (эластометрии, сывороточных тестов и допплеровского исследования сосудов печени), а также создание и оценка эффективности генно-инженерных конструкций с антифиброзным действием на экспериментальной модели ЦП.

Задачи исследования:

1. Изучить различные регуляторы фиброгенеза в ткани печени: тром-боцитарный ростовой фактор (PDGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF1), пролиферирующий антиген клеточного ядра (PCNA), CD68 (мембранный рецептор макрофагов), CD34 (показатель неоангиогенеза), АК (ак-томиозин - показатель активности клеток Ито), коллаген 4-го типа (С4), мат-риксные металлопротеиназы (ММП-2, -7, -9), ингибиторы металлопротеиназ (ИММП-1, -4) в ткани печени у больных ХВГ. Определить роль регуляторов фиброгенеза в патогенезе ФП у больных ХВГ. Провести сравнительный анализ этих показателей и основных морфологических, лабораторных и клинических проявлений активности ХВГ.

2. Усовершенствовать системы полуколичественной оценки ФП, разработать метод его количественной оценки и с их использованием проанализировать влияние показателей гистологической активности гепатита и степе-пи ФП на эффективность и результаты противовирусной терапии (ПВТ) у больных ХВГ.

3. Оценить клиническое значение сывороточных показателей обмена железа, эластометрии, фибротеста, допплерографического УЗИ сосудов пеI чени в неинвазивной диагностике степени фиброза у больных ХВГ, а также провести сравнительный анализ диагностической точности различных методик неинвазивной оценки в зависимости от стадии ФП и предложить алгоритм оптимального их использования в клинической практике.

4. На основании изучения экспериментальной модели определить терапевтические возможности генно-инженерного подхода к лечению ФП и оценить эффективность антифиброзного действия следующих четырёх генов человека: гена фактора роста гепатоцитов (HGF), гена урокиназы (UPA), гена матриксной металлопротеиназы-1 (ММП-1) и гена матриксной металлопро-теиназы-8 (ММП-8).

Научная новизна

1. Впервые определены место и роль ряда медиаторов фиброгенеза: тромбоцитарного ростового фактора (PDGF), инсулиноподобного фактора роста (IGF1), пролиферации антигена клеточного ядра (PCNA), CD68 (мембранного рецептора.макрофагов), CD34 (показателя неоангиогенеза), АК (ак-томиозина - показателя активности клеток Ито), коллагена 4-го типа (С4), матриксных металлопротеиназ (ММП-2, -7, -9), ингибиторов металлопротеи-наз (ИММП-1, -4) в патогенезе ФП у больных ХВГ.

2. Разработан оригинальный» метод количественной оценки ФП с определением всего объема коллагеновых волокон в ткани печени.

3. Изучена зависимость между показателями ИГА, степенью ФП и эффективностью ПВТ у больных ХВГ, а также показана возможность обратного развития фиброза на фоне проведения ПВТ.

4. Впервые определено клиническое значение и проведен сравнительный анализ диагностической точности сывороточных показателей обмена железа, эластометрии, фибротеста, показателей кровотока в сосудах печени' на разных стадиях ФП у больных ХВГ.

5. Впервые создана и апробирована на экспериментальной модели панель генетических конструкций с использованием генов матриксных металлопротеиназ (ММП-1, -8), фактора роста гепатоцитов и урокиназы, которые могут оказывать терапевтический эффект на ФП.

Практическая значимость

Определены уровни медиаторов фиброгенеза в ткани печени: тромбоцитарного ростового фактора (PDGF), инсулиноподобного фактора роста (IGF1), пролиферирующего антигена клеточного ядра (PCNA), CD68 (мембранного рецептора макрофагов), CD34 (показателя неоангиогенеза), АК (ак-томиозина - показателя активности клеток Ито), коллагена 4-го типа (С4),' матриксных металлопротеиназ (ММП-2, -7, -9), ингибиторов металлопротеиназ (ИММП-1, -4), что может быть использовано в клинической практике в целях оценки морфологических, лабораторных и клинических показателей активности и стадии ХВГ.

Выявлены благоприятные прогностические факторы вирусологического ответа на ПВТ у больных ХГС и ХГВ. Установлено, что выраженный ФП (F3-F4) снижает эффективность и уменьшает частоту достижения устойчивого вирусологического ответа комбинированной противовирусной терапии (Пег-ИНФ-а-2а/рибавирин) больных ХГС; степень ФП у больных ХГВ не влияет на эффективность ПВТ ламивудином.

Показано, что сывороточные показатели обмена железа, эластометрия, фибротест, допплерографические показатели кровотока в сосудах печени могут быть использованы в комплексной неинвазивной диагностике стадии ФП у больных ХВГ.

Установлена эффективность применения методов неинвазивной диагностики ФП (эластометрия печени, актитеста), что позволяет использовать их в качестве скрининг-метода ФП в широкой клинической практике. Разработаны методические подходы для повышения диагностической точности выполнения эластометрии и оценки результатов фибротеста у больных ХВГ.

Предложен генно-терапевтический метод лечения ФП с использованием генов фактора роста гепатоцитов (HGF), урокиназы (UPA), матриксной метал-лопротеиназы-1 (ММП-1) и матриксной металлопротеиназы-8 (ММП-8).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

Выраженные некровоспалительные изменения в ткани печени у больных ХГС сопровождаются более тяжелой степенью фиброза. Выраженость морфологических данных не зависит от генотипа HCV и уровня виремии. Для больных ХГС характерны высокие показатели ангиогенеза и экспрессии ММП-2, высокая пролиферативная активность клеток Ито. Проведение ПВТ приводит к положительной динамике морфологических данных, снижению показателей ангиогенеза, снижению пролиферативной активности клеток Ито, повышению активации механизмов антиметаллопротеиназной защиты.

Благоприятными прогностическими факторами УВО являются высокая активность AJ1T, высокий исходный показатель ИГА, низкая степень фиброза печени.

Для больных ХГВ характерно повышение значений показателей ангио-генеза и экспрессии ММП-2, высокая пролиферативная активность клеток Ито. Проведение ПВТ ламивудином больных ХГВ приводит к положительной динамике морфологических данных, сопровождается снижением проли-ферактивной активности клеток Ито, снижением уровня экспрессии ММП-7 и -9, уменьшением значений ангиогенеза и активацией механизмов антиме-таллопротеиназной защиты. Регресс морфологических данных при проведении ПВТ не зависит от степени фиброза печени и наличия HBeAg до, лечения.

Морфологическое исследование печени с количественной оценкой ФП позволяет оценить количество фиброзной ткани в рамках одной стадии фиброза по METAVIR. Для оценки ФП у больных хроническими гепатитами В и С могут быть использованы неинвазивные методы: диагностическая точность эластометрии сопоставима с данными морфологического' исследования для выявления стадий фиброза F3-F4; диагностическая точность метода фиброте-ста сопоставима с данными морфологического исследования для выявления стадий фиброза F2-F4; диагностически значимыми УЗДГ-показателями выраженности ФП являются пульсационный индекс селезеночной артерии (ИПСА) и средняя скорость кровотока воротной вены (ССВВ); дополнительным критерием тяжести ФП является повышение показателей обмена железа.

Генетические конструкции на основе оптимизированных генов в эксперименте значительно увеличивают экспрессию потенциально терапевтических генов урокиназы, фактора роста гепатоцитов, ММП-1 и -8 и могут быть использованы в разработке генно-инженерной терапии фиброза печени.

Реализация результатов исследования

Результаты исследования используются в лечебно-диагностической деятельности и учебно-педагогическом процессе клиники пропедевтики внутренних болезней, гастроэнтерологии и гепатологии ММА им. И.М.Сеченова (директор академик РАМН, проф. Ивашкин В.Т.) и в клиниках Кардиокомплекса Минздрава России (директор академик РАМН и РАН, проф. Чазов Е.И.).

Апробация диссертации

Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на: Одиннадцатой, Двенадцатой, Тринадцатой Российских Гастроэнтерологических неделях (Москва, 2005, 2006, 2007); Восьмой, Десятой, Одиннадцатой, Двенадцатой и Тринадцатой Всероссийских конференциях «Гепатология сегодня» (Москва, 2003, 2005, 2006, 2007, 2008); 8-м Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург- Гастро-2006» (Санкт-Петербург, 2006); 6-й конференции гастроэнтерологов Южного федерального округа (Ессентуки, 2007); 7-й Восточно-Сибирской гастроэнтерологической конференции с международным участием (Красноярск, 2007); Всероссийской научно-практической конференции «Высокие медицинские технологии» (Москва, 2007); конференции Главного медицинского управления УД Президента РФ «Диагностика и лечение болезней органов пищеварения с позиций доказательной медицины» (Москва, 2007); Тринадцатой Всероссийской образовательной интернет-сессии «Проблемы интерниста» (Москва, 2008); 12-й Фальк-неделе печени (Фрайбург, 2003); 9-м Болгарском национальном конгрессе гастроэнтерологии с курсом последипломного обучения (София, 2006); международном конгрессе («International liver congress-Asian Pacific Association for the study of the liver») (Гонгконг, 2008); 16-й Объединенной Европейской Гастронеделе «UEGW 2008» (Вена, 2008).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 73 печатные работы, из них 17 -в рекомендованных ВАК изданиях.

По материалам диссертации оформлено 4 заявки на получение патента Российской Федерации:

1. «Способ количественной оценки степени фиброза печени - Заявка №2007138369 от 17.10.07 г.

2. Ген ММР 1 opt металлопротеиназы 1 - Заявка № 2008125414 от 25.06.08 г.

3. Ген ММР 8 opt металлопротеиназы 8 - Заявка № 2008125413 от 25.06.08 г.

4. Ген HGF opt фактора роста гепатоцитов - Заявка № 2008125409 от 25.06.08 г.

5. Получен патент «Способ оценки степени фиброза печени при хроническом вирусном гепатите» от 20 апреля 2009 г. №2352950.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 278 страницах машинописного текста и состоит из 6 глав (обзор литературы, описание материала и методов исследования, собственные результаты и их обсуждение), выводов, практических рекомендаций и списка литературы из 248 источников (89 отечественных и 159 зарубежных авторов). Работа иллюстрирована 58 таблицами, 113 рисунками и 10 клиническими примерами.

ВЫВОДЫ:

1. Выраженные признаки некровоспалительной реакции в ткани печени у больных ХГС сопровождаются более тяжелой степенью ее фиброза. Зависимость между морфологическими данными (уровень ИГА и степень фиброза) и характеристиками вируса (генотип HCV и уровень виремии) отсутствует.

2. Комбинированная терапия (Пег-ИНФ-а-2а/рибавирин) больных ХГС приводит к положительной динамике морфологических данных: отмечается достоверное снижение показателей некроза и воспаления, тенденция к уменьшению степени фиброза. Благоприятными прогностическими факторами УВО на ПВТ являются высокая активность AJIT сыворотки крови до начала лечения и высокий исходный показатель ИГА. У больных со стадиями ФП F1 и F2 вирусологический ответ наступает чаще, чем у пациентов со стадией фиброза F3 (р=0.001).

3. Для больных ХГС характерны высокие показатели ангиогенеза (CD34 и PDGF), экспрессии ММП-2 и высокая пролиферативная активность клеток Ито (С4, АК и IGF1), что может приводить к прогрессированию фиброза и развитию цирротической трансформации. Комбинированная ПВТ больных ХГС (Пег-ИНФ-а-2а/рибавирин) приводит к достоверному снижению пролиферативной активности клеток Ито, фибробластов, ангиогенеза в строме, достоверному повышению уровня экспрессии ММП-7 и -9 в гепатоцитах. При этом отмечается достоверное повышение активации механизмов антиметаллопротеиназной защиты путем усиления выработки ТИМП-1 и -4, что может способствовать восстановлению баланса регуляторов синтеза экс-трацеллюлярного матрикса и нормализации структуры ткани печени.

4. Терапия ламивудином больных ХГВ в течение 48 недель приводит к положительной динамике морфологических данных: снижение ИГА составляет 2.4±0.9 балла (р=0.001), снижение степени фиброза - 1.5±0.3 балла р=0,001), при этом динамика морфологических данных не зависит от степени фиброза печени до лечения. Существенных различий в характере гистологических изменений в печени у HBeAg-позитивных и HBeAg-негативных пациентов не выявлено. У больных ХГВ с исходно повышенным уровнем АЛТ на фоне лечения отмечается достоверная положительная динамика биохимической активности гепатита (с 148.0±25.2 до 38.8±7.8 МЕ/мл).

5. Для больных ХГВ характерно повышение значений показателей ан-гиогенеза и экспрессии ММП-2, а также высокая пролиферативная активность клеток Ито. Терапия ламивудином больных ХГВ сопровождается снижением пролиферативной активности клеток Ито и фибробластов (р<0.005), снижением уровня экспрессии ММП-7 и -9 в гепатоцитах, а также уменьшением ангиогенеза в строме (р<0.005) при увеличении экспрессии ММП-7, -9 и ТИМП в клетках Купфера, макрофагах и клетках эпителия, что свидетельствует о восстановлении баланса регуляторов синтеза экстрацеллюлярного матрикса, активации механизмов антиметаллопротеиназной защиты и уменьшении дальнейшего прогрессирования фибротической реакции печени.

6. Морфологическое исследование печени с количественной оценкой фиброза определяет весь объем коллагеновых волокон в исследуемом материале, что позволяет оценить количество фиброзной ткани в рамках одной стадии фиброза по METAVIR и исключает влияние субъективных факторов на результаты заключения.

7. Диагностическая точность метода эластометрии сопоставима с данными морфологического исследования печени для выявления продвинутых стадий ФП у больных хроническими гепатитами В и С и составляет при выраженном фиброзе (F3) - 89.0%, при ЦП (F4) - 96.4%. К факторам, уменьшающим диагностическую точность исследования, относятся возраст пациента старше 50 лет, ИМТ > 28 кг\м , наличие стеатоза печени.

8. Диагностическая точность метода фибротеста сопоставима с данными морфологического исследования для выявления стадий ФП F2-F4 у больных хроническими гепатитами В и С и составляет при ФП F2-F3 85.2%, а при фиброзе F3-F4 - 95.2%.

9. При проведении допплерографии наиболее диагностически значимыми показателями выраженности ФП у больных ХВГ являются пульсаци-онный индекс селезеночной артерии и средняя скорость кровотока воротной вены. При этом диагностическая точность для ИПСА при ЦП (F4) составляет 82.7%, при выраженном фиброзе (F3) - 76.1%; диагностическая точность для ССВВ при ЦП (F4) составляет 77.4%, а при выраженном фиброзе (F3) -65.3%.

10. У больных ХВГ со стадиями ФП (F2-F3) показатели обмена железа (ферритин, железо и НТЖ сыворотки крови) достоверно превышают таковые значения в группе контроля и у больных с начальной стадией фиброза (F1), что позволяет использовать указанные показатели в качестве дополнительных критериев стадий ФП (F2-F3) у данной категории пациентов.

11. При проведении генно-инженерной терапии ФП в эксперименте генетические конструкции на основе оптимизированных генов способны экспрессировать потенциально терапевтические гены урокиназы, фактора роста гепатоцитов, ММП-1 и -8. При этом плазмидный экспрессионый вектор pC4W позволяет в 3-5 раз увеличить уровень экспрессии указанных генов по сравнению с традиционно используемыми конструкциями на основе экс-прессионного вектора pcDNA3.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для наиболее точной диагностики ФП у больных ХГС и ХГВ рекомендуется использовать автоматизированный метод количественной оценки, измеряя весь объем коллагена в исследуемом материале (биоптате). Количественный показатель можно использовать для изучения темпов прогрессирования ФП и оценки эффективности препаратов с антифиброзным действием.

2. У больных ХГС и ХГВ при проведении ПВТ для оценки ФП следует проводить эластометрию печени и фибротесты в качестве скрининг-методов перед началом терапии, а также каждые 6 мес для оценки динамики фиброза печени. При этом лимитирующим фактором для проведения фибротеста является холестатический синдром (повышение уровня ГГТП и билирубина); для эластометрии: избыточная масса тела (ИМТ> 28 кг\м2), наличие стеатоза печени, возраст старше 50 лет.

3. Диагностику ранних стадий фиброза (F1-F2) целесообразно проводить с использованием, по крайне мере, 2 неинвазивных методов исследования или биопсии печени.

4. В качестве неинвазивного показателя степени гистологической активности воспалительного процесса в печени у больных ХГВ и ХГС следует рассматривать линейную скорость в воротной вене (норма - 11.3±3.7; А1 -18.9±10.8; А2 - 9.9±2.7 см/с) и диаметр селезеночной вены (норма - 5.9±1.8; А1 -7.9+1.9; А2-7.1±1.4 мм).

5. В комплексной диагностике ФП могут быть использованы показатели линейной скорости кровотока в воротной вене и размеры (диаметр) селезеночной вены и общей печеночной артерии. При этом степени фиброза F1 и F2 соответствует скорость кровотока в воротной вене 15.1±8.7 и 8.6±2.2 см/с соответственно (норма — 11.3±3.7 см/с), а также диаметр селезеночной вены - б.9±1.0 и 8.2±2.0 мм (норма - 5.9±1.8) и диаметр общей печеночной артерии - 5.1±0.6 и 5.9±1.5 мм соответственно (норма - 4.6±0.9 мм).

6. Измененные сывороточные показатели обмена железа (ферритин, железо и НТЖ) следует рассматривать как дополнительные критерии ФП (F2-F3) у больных ХГВ и ХГС.

253