Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Фенотипическая характеристика популяций и субпопуляций мононуклеарных клеток, особенности их реагирования на опухолеассоциированные антигены у больных со злокачественными и доброкачественными опухолями молочных желез

На правах рукописи

ПРОСКУРА 003067693

Андрей Викторович

ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОПУЛЯЦИЙ И СУБПОПУЛЯЦИЙ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК, ОСОБЕННОСТИ ИХ РЕАГИРОВАНИЯ НА ОПУХОЛЕАССОЦИИРОВА1ШЫЕ АНТИГЕНЫ У БОЛЬНЫХ СО ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМИ И ДОБРОКАЧЕСТВЕННЫМИ ОПУХОЛЯМИ МОЛОЧНЫХ ЖЕЛЕЗ

14.00.16 - патологическая физиология 14.00.14- онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск 2006

003067693

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (Новосибирск)

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Аутеншлюс Александр Исаевич

Сидоров Сергей Васильевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Цырендоржиев Дондок Дамдинович Красильников Сергей Эдуардович

доктор медицинских наук

Ведущая организация:

Государственное учреждение Научно-исследовательский институт региональной патологии и патоморфологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (Новосибирск)

диссертационного совета Д 001.048.01 в Государственном учреждении Научный центр клинической и экспериментальной медицины Сибирского отделения Российской академии медицинских н»"к по адресу: ул. Академика Тимакова, 2, г. Новосибирск, 630117. Тел/факс 8(383)333-64-56

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН

Защита состоится

.2007 года в

.часов на заседании

Ученый секретарь диссертационного совета д.б.н.

Пальчикова Наталья Александровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В структуре заболеваемости и смертности от злокачественных новообразований женского населения рак молочной железы занимает первое место. Ежегодно в мире регистрируется 1,1 млн. новых случаев рака молочной железы и 373 тыс. смертей от него (l'erley .Г., 2001). В России с 1993 по 2003 годы стандартизированные показатели заболеваемости раком молочной, железы увеличились на 19% , смертности на 12%, ежегодно от этого заболевания умирают более 22,7тыс. больных (в 1983 г. - 12,5 тыс.). Прирост показателя смертности в России с 1983 по 2003 годы составил 51%. В 2004 г. количество вновь выявленных больных с I-1I стадиями рака молочной железы в нашей стране составило 61,6% , III- 25,4% , IV- 11,9% (Давыдов М.И.. 2005). Из представленных статистических данных следует, что проблема ранней диагностики, лечения и профилактики рака молочной железы до настоящего времени не решена и чрезвычайно важна в клинической онкологии.

Еще в 1977 г. злокачественные новообразования были отнесены к группе патологических состояний, индуцирующих вторичные иммуподефициты, выраженность которых обусловлена степенью распространенности процесса, причем многие методы лечения, применяемые у больных злокачественными опухолями, усугубляют вторичный иммунодефицит.

В связи с этим весьма актуальным является изучение состояния иммунной системы у больных злокачественными новообразованиями и ее взаимоотношений с растущей опухолью. Многочисленными исследованиями было показано, что по антигенному спектру опухолевые клетки отличаются от клеток здоровой ткани (Абелсв Г.И., 2000; Столярова В.М., 2000; Лихтенштейн A.B., 2003). Исследования молекулярной опкобиологии направлены на определение структурных и функциональных изменений онкогенов, генов-супрессоров и модуляторов, которые могут служить специфическими маркерами клонов малигнизированных клеток и опухолевого роста в целом. Такие маркеры могут использоваться для формирования групп риска развития опухолевых заболеваний, в качестве тестов для досимгпоматической диагностики, прогнозирования течения опухолевого процесса и выявления метастазов и рецидивов первичного очага (Кайряк О.В., 1996; Абелев Г.И., 2000; Артамонова Е.В., 2003).

В последние годы, благодаря новым технологиям, появились сообщения о реакции монопуклеарных клеток на опухолеассоциированные антигены у больных со злокачественными новообразованиями, которая зависела от варианта дифференцировки опухоли. Так было показано, что при высокодифферепцировапном варианте опухоли количество монопуклеарных клеток экспрессирующих под действием фетальных

протеинов СД8+ антиген, выше, чем при умеренно - и низкодифференцированных опухолях (Lee T.V.. 2000; Аутеншдгос Л.И., 2003).

Следовательно, реакция иммунной системы на ОЛА (список сокращений стр. 20) зависит от варианта дифференцировки опухоли, поэтому, изучение характера реагирования мононуклеаров па опухолеассоциированные акгшены, их функциональной активности, осуществляющуюся через цитокинопуго сеть является актуальным, так как дает возможность не только понять механизм формирования противоопухолевого иммунитета или его супрессии, но и диагностировать, в том числе и на ранних этапах развития злокачественного новообразования, вариант дифференцировки опухоли, что дает

возможность правильно выбрать тактику лечения.

Цель работы: изучить фенотипический состав мононуклеарных клеток в периферической крови и их функциональное состояние у больных со злокачественными и доброкачественными опухолями молочных желез.

Задачи исследования:

1. Определить количественные характеристики популяций и субнопуляций лимфоцитов, изучить реакцию мононуклеарных клеток на опухолеассоциированные антигены и провести гитогистологические исследования у больных раком молочной хселезы и локализованными формами мастопатии.

2. Определить взаимосвязь между результатами иммуногенетического анализа, содержанием основных субпопуляций Т - лимфоцитов и показателями реакции мононуклеарных клеток на опухолеассоциированные антигены у больных раком молочной железы и локализованными формами мастопатии.

3. Изучить содержание цигокипов: II.-lp, IL-2, 1L-4, TNF-a и уровни антител к TNF-a у больных раком молочной железы и локализованными формами мастопатии.

Научная новизна. Впервые показано, что на фоне снижения относительного содержания популяций и субпопуляций Т-лимфоцитов у больных с опухолями молочной железы только при злокачественных новообразованиях наблюдали активагщго иммунной системы.

Впервые обнаружена реакция мононуклеарных клеток на опухолеассоциированные антигены, заключающаяся в повышении относительного содержания клеток с фенотипом CD8-<- после инкубации их с фетальными протеинами.

Впервые показана взаимосвязь между реакцией мононуклеарных клеток на фатальные протеины и характером ассоциированности аллельиых вариантов IILA-генов

при раке молочной железы и локализованных формах мастопатии. У больных раком молочной железы при повышении относительного содержания лимфоцитов с фенотипом CD8) после инкубации с фетальными протеинами наиболее часто вьивлялся генотип HLA-А1, а при отсутствии реакции - генотип -А2, -В12, -В15. При повышении относительного содержания лимфоцитов с фенотипом CD8+ после инкубации с фетальными протеинами у женщин с локализованными формами мастопатии выявлялись HLA- антигены -DR2 в сочетании с -A3 и -А19.

Впервые показано, что существуют достоверные различия между содержанием IL-2 и IL-4 у больных раком молочной железы по сравнению с больными с локализованными формами мастопатии и здоровыми лицами. Содержание TNF-a у сольных раком молочной железы повышено по сравнению со здоровыми лицами.

Впервые обнаружены антитела к TNF-a у больных со злокачественными и доброкачественными опухолями молочных желез, но при раке молочной железы их уровень был выше, чем при локализованных формах мастопатии.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные при выполнении диссертационного исследования данные о прямой корреляции повышения относительного содержания лимфоцитов с фенотипом CD8t после интубации с фетальными протеинами со степенью злокачественности дают возможность более точно выделить среди больных раком молочной железы группы с тем или иным вариантом дифференцировки и, следовательно, выбрать оптимхтьпую тактику лечения для каждой группы больных. Показатели реакции мононуклеарных клеток на опухолеассоциированные антигены позволяют сформировать группу риска по развитию рака молочной железы среди больных с локализованными формами мастопатии и, не исключено, выявлять пациентов с клеточной атипией иной локализации.

Осношгые положения диссертации, пмпосимьте на защит}'.

1. Злокачественные новообразования характеризуются возрастанием относительного содержания клеток с фенотипом CD71. Показатели реакции мононуклеарных клеток на фстальные протеины у больных раком молочной железы прямо коррелируют с содержанием высокодифференцированных клеток и обрати - с количеством патологических митозов и содержанием низко - и умереннодифференцированньгх клеток.

2. Повышение относительного содержания лимфоцитов с фенотипом CD8+ после инкубации с фетальными протеинами у больных раком молочной железы сопряжено с

генотипом Н1Л-Л1, а его отсутствие - с генотипами -Л2, -В12 и -В 15. У больных с локализованными формами мастопатии при повышении относительного содержания СШ+ - лимфоцитов поело инкубации с фетальными протеинами выявляется HIA -антиген -DR2 в сочетании с -A3 и -Al 9. 3. У больных раком молочной железы повышено содержание TMF-a и уровни антител к

нему по сравнению со здоровыми лицами и больными с локализованными фирмами мастопатии, у последних также отмечаются более высокие уровни TNF-a и антител к нему по сравнению со здоровыми.

Апробация материапов диссертации. Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на VII Международном конгрессе tío пластической, реконструктивной хирургии и онкологии, 28-30 ноября 2004 года в г. Москве; на Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием, посвященной 110-летию со дня рождения проф. Ю.А. Ратнера, 20-22 апреля 2005 года в г. Казани.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ, из них 3 в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 108 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 4 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка цитированной литературы. Работа ил;пострирована 3 рисунками и 14 таблицами, указатель использованной литературы содержит 159 источников, из которых 59 отечественных и 100 иностранных.

МАТЕРИАЛ И МЕ ТОДЫ

Объектом исследования служила периферическая кровь 91 больной раком молочной железы, 70 женщин с локализованными формами мастопатии и 38 здоровых лиц, не имеющих в анамнезе указаний на онкологические заболевания. По гистологическому строению у пациенток с РМЖ был выявлен инфильтративный лротоковый рак. Иммунологический анализ у больных со злокачественными новообразованиями проводили до оперативного вмешательства, а также до лучевой и химиотерапии. Обследовали больных находящихся на лечении в III онкологическом

отделении Муниципального учреждения здравоохранения городской клинической больницы №1 г. Новосибирска.

Количественное определение популяций и субпопуляций лимфоцитов осуществляли методом непрямой ичмунофлюорссценции с использованием моноклональных антител серии ШСО, произведенных НГЩ «Медбиоспектр» (г. Москва) согласно прилагаемым рекомендациям. ,

В качестве ОАА применяли фстальные протеины в изотоническом растворе хлорида натрия, содержащие раковоэмбриональный антиген - 84 МЕ/мл, хорнонический гонадотропин человека - 170 МЕ/мл, нейронспецифическую енолазу - 1,35 МЕ/мл, углеводные антигены -СА-19-9 - 144 МЕ/мл и СА 125-512 МЕ/мл, альфафетопротеин -172 МЕ/мл и микроглобулин человека - 4 МЕ/мл. Оценку реакции лимфоцитов на ФП проводили в соответствии с патентом №2118819 по изменению относительного содержания C.D8- клеток после инкубации МНК с ФП (100 мкл, исходная концентрация бежа 2.5 мг/мл) in vitro в течение 1 часа по сравнению с контрольной пробой, содержащей вместо ФП 100 мкл раствора хлорида натрия.

Для подтверждения специфичности реакции лимфоцитов на ФП параллельно инкубировали МНК с раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) по указанной выше технологии и в той же концентрации по белку.

Позитивной или положительной «+» считалась реакция, при которой относительное содержание CD8- лимфоцитов повышалось после инкубации MHIC с ФП на 15% и более по сравнению с соответствующей контрольной пробой. Во всех остальных случаях реакция считалась негативной или отрицательной «-». Пороговое значение достоверности реакции на ФП, равное 15% превышает допустимый предел ошибки [Леонова Т.Я., 1993].

После хирургическою вмешательства проводилось гистологическое исследование препаратов опухоли, окрашенных по стандартной методике гематоксилином и эозином. Учитывали гистологический вариант опухоли вообще, способность строить специфические структуры, ядерпо-цитоплазматическое соотношение в клетке, наличие митозов, в том числе аттических. Кроме того, по общепринятым критериям оценивали степень злокачественности опухоли.

Частоту встречаемости опухолевых клегок различной степени зрелости (в%) определяли следующим способом: с помощыо морфометрической сетки с 121 рабочими точками-узлами, вставленной в окуляр микроскопа, нри увеличении 20 х 1,5 х 10 =300х методом случайного наложения сетки на опухолевую ткань определяли количество точек, попавших на высоко -, умеренно - и низкодифференцированную опухолевую ткань. В

каждом случае подсчитывали 10 полей зрения и для каждой категории клеток подсчитывали среднее арифметическое значение, выраженное в процентах. При определении степени дифференцировки учитывали: гистологический вариант опухоли вообще, способность строить специфические структуры, ядерно-цитоплазматическое соотношение в клетке, наличие митозов, в том числе атипических. Кроме того, по общепринятым критериям оценивали степень злокачественности опухоли.

Таким образом, патог нозологическая картина характеризовалась следующими признаками, которым была дана бальная оценка:

- границы опухоли с окружающей тканыо: четкие - 1 балл, наряду с четким! границами имеются крупные участки ответвления -2 балла, наряду с четкими границами опухолевого узла имеются мелкие тонкие тяжи - 3 балла, четкость границ отсутствует, имеется диффузга,ш рост опухоли 4 балла.

- наличие опухолевых клеток в сосудах: опухолевых клеток в сосудах нет - 1 балл, наличие опухолевых клеток в сосудах сомнительно - 2 балла, единичные клетки в сосудах - 3 балла, много клеток в сосудах - 4 балла.

- инфильтрация: отсу тствует - 1 балл, слабая - 2 балла, умеренная - 3 балла, выраженная 4 балла.

- число митозов в поле зрения: отсутствуют - 1 балл, единичные 2 балла, 2-3 3 балла, 4-5 -4 балла, 6-10 - 5 баллов, более 10-6 баллов.

- патологические митозы: отсутствуют - 1 балл, единичные -2 балла, в большом количестве.....3 балла.

преобладание в опухоли клеточных элементов различной степени дифференцировки: высокодифферепцированные (ВД) - 1 балл, умереннодифференцированпые (УД) 2 балла, низкодифференцировапиые (НД) 3 балла.

- степень злокачественности: I степень - 1 балл, II степень - 2 бхтла, III степень -

3 балла.

- метастазы в регионарных лимфоузлах: нет - 0 баллов, есть -1 балл.

В целом сумма баллов, указанных выше примаков, явилась интегральным показателем патошстологической картины опухоли, а их числовые значения позволили выявить взаимосвязь между показателями реакции МНК на ФП и патогистологичсской картиной опухоли.

Определение 1ILA антигенов I класса осуществлялось в стандартном лимфоцитотоксическом тесте по методу Терасаки. Использевалась панель тигшругощих сывороток НИИ гематологии и переливания крови «Гиссанс» (Санкт-Петербург). Специфичности гена DRB1-HLA антигенов класса II определялись методом полимеразпой

цепной реакции ДНК. Для типирования использовались наборы НПО «ДНК-технология» (Москва).

Математическая обработка результатов иммуиогепетических исследований частот распределения HLA-антигснов (АГ%) и расчет относительного pHCKa(RR) проводилась с помощью традиционного генетико-статнстнческого анализа.

Иммуногепетические исследования были проаедспм совместно с сотрудниками лаборатории клинической иммуиогс нетики Государственного учреждения Научно-исследовательского института клинической иммунодо! ии Сибирского отделения Российской академии медишшских наук, г. Новосибирска (руководитель-академик РАМН ГШ. Коненков) у 67 женщин, больных раком молочной железы до начала лучевой и химиотерапии и у 23 женщин с локализованными формами мастопатии, находившимся на учете в городском онкологическом диспансере муниципальной клинической-больницы №1 г. Новосибирска. В качестве генетического контроля использовалась репрезентативная группа здоровых женщин (п-143) из регионального этнического кош роля для Западной Сибири.

Содержание IL-lp, IL-2, IL-4 и TNF-u определяли с помощью иммуноферчентпого анализа в сыворотке крови пациентов, используя реагенты для количественного определения цитокиттоп производства предприятия «Протеиновый контур», г. Сайт-Петербург.

Определение уровней AT класса G к TNF-a у больных и здоровых лиц проводили с помошыо твердофазного ИФА. Использовали TNF-ix, предоставленный НИКТИБАВ НПО « Пекгор» в концентрации 40 мкг/мл. Уровни AT класса G к TNF-a определяли по коэффициенту (К), который представлял собой отношение оптической плотности продукта реакции в лунках с опытной сывороткой, к оптической плотности продукта реакции в лунках с ссронегативной сывороткой. Значения коэффициента (К) равные или более 1,20 считали положит ельными.

Результаты исследования обработаны статистически. Данные в таблицах представлены в виде М±т, где М - среднее, т - ошибка. Определяли достоверность различий (р) с использованием критериев Стмодема (1), Вилкоксона-Маюга-Уигни (U), метода углового преобразования Фишера, и коэффициента корреляции (г) по программе StalGraphics Plus. Справедливость нулевой гипотезы принимали при 5% уровне значимости.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При ЛФМ и РМЖ относительное содержание СОЗ±,С1>4+,СВ8+ клеток было существенно ниже, чем у здоровых, причем при ЛФМ эти показатели были еще ниже, чем при РМЖ. Кроме того, при ЛФМ снижалось также содержание С016+ и СШ5+ лимфоцитов, а при РМЖ повышалось количество С071- клеток по сравнению со здоровыми и ЛФМ (табл. 1.).

Таблица 1

Относительное содержание популяций и субпопуляций лимфоцитов у здоровых лиц.

больных локализованными формами мастопатии и раком молочной железы

Группы обследованных СБЗ С04 СЭ8 СЭ22 С016 СБ95 СЭ71 С025 СБЗЗ

1 .Здоровые п=38 59,13 ±1,72 38,38 ±1,05 28,13 ¿1,35 9.94 ±0,97 14.56 ±0,88 27,88 ±2,55 3,50 ±0,85 5,50 ±1,23 9,88 ±1,24

2. ЛФМ п-60 45.90 ±1,04 28,80 ±0,75 18,90 =0,70 7,79 ±0,60 10,79 ±0,67 22,21 ±1,81 3,07 ±0,38 3.72 ±0,66 8,21 ±0,80

З.РМЖ п-71 50,09 ±0,99 29,79 ±0,85 20,07 10,74 10,30 ±0,57 15,71 +0.83 27,53 ±1,16 7,06 ±0,52 5,13 ±0,41 12,37 ±0,76

Р 1-2*** 1-3*** 2-3** ] _2*** 1-3*** 2-3* 1_2*** 2-3* 2-3*** 2-3* 1-3** 2-3*** 2-3** 2-3**

Примечание: * - р<0,05; ** - р-а0,01; *** - р<0,001

При изучении реакции МНК на ФП было обнаружено, что изменения касаются в основном субпопуляции - лимфоцитов (табл. 2), причем, если судить по средним величинам, то происходит достоверное повышение относительного содержания этих клеток после инкубации с ФП только в группе больных РМЖ. При этом, естественно, происходит снижение соотношения СШ - иммунорегулягорного индекса (ИРИ). В

11% случаев у женщин е ЛФМ так же была выявлена позитивная реакция МНК на ФП. При гистологическом исследовании удаленных у этих пациенток опухолей выявлена атипическая гиперплазия, которую относят к предраковым состояниям (Краевский А.В., 1993).

Таблица 2

Относительное содержание С04+, С! )8 • клеток и ИРИ после инкубации МНК с ФП у здоровых лиц, больных локализованными формами мастопатии и раком молочной железы

Группы обследованных сш С1)8 ИРИ

1.Здоровые а - инкубация без ФП б инкубация с ФП 38.38± 1,05 40,1911,97 28,13=1,35 26,50 = 1,17 1,41±0,08 1,561.0,11

2. Больные с ЛФМ а - инкубация без ФП б - инкубация с ФП 28,80±0,75 28,57±0,84 18,90=0,70 17,60=0,63 1,62=0,06 1,69 = 0,07

3. Больные РМЖ а — инкубация без ФП б - инкубация с ФП 29,79+0,85 30,5511,01 20,07=0,73 26,49(0,94*** 1,60=0,07 1,25.10,06***

Р За-Зб*** За-Зб***

Примечание: *** - р<0,001

В дальнейшем для сравнения относительного содержания СШ+ - и СП8+ -клеток, а также ИРИ больные РМЖ были разделены на две группы, в зависимости от наличия или отсутствия реакции на ФП (табл. 3). Если в 1 группе средний уровень СМ+ -лимфоцитов не изменялся после инкубации с ФП, то во 2 он достоверно повышался.

Таблица 3

Относительное содержание С1)4= и СШ+ лимфоците и величина ИРИ в группах больных раком молочной железы с наличием и отсутствием реакции на ФП

Группы больных РМЖ СМ СГ)8 ИРИ

"+" реакция 1-инкубация без ФП 30,00±1,09 19,16=0.86 1,6710,09

2-инкубация с ФП 27,77±1.09 27,84=1,21 1,05±0,05

реакция З-инкубация без ФП 29,46^1,46 21,46=1,34 1,48±0,12

4-ипкубацияс ФП 34.82±1,70 24.43=1,51 1,57±0,13

Р 2-4 * 2-4** 2-4**

Примечание: * - р<0,05; ** - р<0,01

У больных РМЖ при позитивной реакции МНК на ФП отмечается снижение О'П юситслъного и абсолютного содержания CDS' повышение относительного содержания CD95+ - и относительного и абсолютного содержания CD71+ - лимфоцитов. Следовательно, при позитивной реакции МНК на ФП отмечается активация иммунной системы у больных РМЖ (табл. 4).

Таблица 4

Относительное и абсолютное содержание популяций и субпопуляций лимфоцитов у больных раком молочной железы при пози тивной и негативной реакциях MIIK на Ф11

Реакция .МНК на ФП Содер жшше МНК CD3 С1)4 CD8 CD20 CD16 CD95 CD71 CD25 CD38

1-отн. 48.901,06 29,841 0,92 19,48 i: 0,67 10,33+ 0,73 16,12± 1,01 30,021 1,26 8,37t 0,57 5,47:1: 0,42 12,711: 0,81

Пози-

тивная 2-абс. 0,80± 0,04 0,51± 0,03 0,32i 0,02 0,17± 0,02 0,27-t 0,02 0,4 9± 0,03 0,13± 0,01 0,09-i 0,01 0,21i 0,02

Негативная 3-отн. 52,45± 2,15 30,29± 1,24 24,09:= 0,51 10,59= 0,97 14,82± 1,53 21,59± 2,07 4,00± 0,85 4,59± 1,00 11.73± 1,73

4-абс. 1,021 0,08 0.57 0,04 0.46 г 0,04 0,20.t 0,02 0,30.1. 0,04 0.430,05 0,08t 0,02 0,091 0,02 0,231 0,04

Р 2-4* 1-3* 2-4* 2-4* 1-3* 1-3* 2-4*

Примечание: * - р<0,05

При сопоставлении показателей популяций и субпопуляций лимфоцитов с патогистологической картиной установлено, что корреляционные связи могут быть как прямыми, так и обратными.

Необходимо подчеркнуть, что достоверно обратные корреляционные связи отмечаются у больных РМЖ между содержанием С025+ - лимфоцитов и митозами, патологическими мшозами, степенью злокачественности, процентным содержанием НД клеток в опухоли.

В целом же, отмечена достоверно обратная корреляционная связь между относительным содержанием клеток с маркерами активации (С1)25+,С07Н,С1)95+) и показателями, отражающими степень злокачественности опухоли, что так же

12

подтверждается прямой корреляционной связью между выше указанными лимфоцитами и процентным содержанием ВД клеток в опухоли.

Прямая корреляционная связь выявлена между относительным содержанием С1)20; -лимфоцитов (В-клетки) и митозами, степенью злокачественности, процентным содержанием НД клеток, соотношениями ИД/УД ПД ВД, УД'ВД. что также косвенно подтверждается обратной корреляционной связью между указанными выше фенотипами МНК и процентным содержанием ВД клеток в опухоли. Что касается СВ16+ -лимфоцитов, то достоверно отмечалась обратная корреляционная связь между клетками с этим фенотипом и соотношением УД'ВД.

Наиболее значимые корреляционные связи менаду уровнем прироста (в %) относительного содержания С08+ - лимфоцитов после инкубации МНК с ФП и показателями патогистологической картины у больных РМЖ представлены в табл. 5.

Как видно из таблицы, при РМЖ достоверно обратная корреляционная связь установлена с патологическими митозами, вариантом дифференцировки опухоли, процентным содержанием НД и УД клеток. /Достоверно прямая корреляционная связь выявлена между процентом прироста СЭ8+ - клеток после инкубации МПК с ФП и процентным содержанием ВД клеток.

Таблица 5

Корреляционная связь между уровнем прироста (в %) относи!ельного содержания С08+ лимфоцитов после инкубации МНК с ФП и показателями патогистологической картины у больных раком молочной железы

Пагогисгологи-ческий показатель г Р

Патологические митозы -0,365 <0,05

Степень злокачественности -0,394 <0,05

НД(%) -0,360 < 0,05

УД(%) -0,476 <0,008

ВД(%) 0,528 <0,003

Примечание: г - коэффициент корреляции; р- достоверност ь различий

В результате проведенного иммуногенетического анализа было установлено, что одновременно при РМЖ и ЛФМ повышены частоты встречаемости аытигенов I1LA - А19, -DR2 и фенотипа А2/А19 (р<0,01) относительно контроля. Перечисленные HLA-антигены ассоциируются с предрасположенностью как к РМЖ, так и ЛФМ, то есть, являются общими иммуногенешческими признаками этих заболеваний. Остальные IlLA-ассоциации у болт,пых РМЖ и ЛФМ не совпадали. Частоты встречаемости HI.A-антигенов В27, -В40, - DR1 и DR6 у больных РМЖ значительно превышали таковые в контроле (р<0,01 ). У больных ЛФМ частота антигена HLA - В14 была выше, чем в контроле и одновременно выше, чем при РМЖ.

Был проведен иммуногснстический анализ в группах больных РМЖ (п~45) и ЛФМ (n^8), МНК которых после инкубации с ФП продемонстрировали позитивную реакцию, характеризующуюся повышением относительного содержания CD8+ лимфоцитов. Сравнивались группы позитивного ответа МНК на ФП с остальными больными РМЖ и ЛФМ, поскольку, как было отмечено выше, некоторые сочетания HLA-антигеиов не встречались в контроле. Установлено, что позитивный ответ МНК па ФН у

больных РМЖ (п=45) ассоциирован с антигеном HLA .....AI. Отсутствие позитивной

реакции на ФП у больных РМЖ (п=22) ассоциируется с фенотипами I1LA -А2/В12, -А2/В15, -B15/DR2, -B16/DR5. У больных ЛФМ позитивный ответ на ФП (п=8) ассоциирован с фенотипами HLA -A3/DR2 и -A19/DR2 при сравнении с отсутствием позитивных реакций на ФП (п=15).

Сравнительный анализ групп без позитивных реакций на ФП у больных РМЖ и ЛФМ выявил преобладание при ЛФМ антигенов HLA -А1 (46,67% против 9,09%-РМЖ),-В13 (26,67% против 0% - РМЖ) и фенотипа -A1/DR7 (26,67 против 0% - РМЖ). HLA-шггигены и фенотипы, ассоциированные с позитивными реакциями на ФП по CD8) антигену у больных РМЖ также встречаются и среди больных ЛФМ. Вероятно, MIIIC реагирующие на ФП встречаются у больных РМЖ, имеющих те же lILA-фенотипы, что и некоторые больные ЛФМ. Таким образом, установлено, что выраженность реакции МНК на ФП у больных РМЖ и ЛФМ устойчиво ассоциируется с определенными HLA-антигенами, то есть носит весьма специфический характер.

Содержание IL-2 было примерно одинаковым у здоровых и больных ЛФМ, и лишь при РМЖ оно достоверно превышало соответствующий показатель у женщин с доброкачественным процессом в молочной железе. Уровень IL-4 повышался и при ЛФМ, и при РМЖ по сравнению со здоровыми женщинами (табл. б).

Таблица 6

Уровни 11.-2 и 1Ь-4 (пкг/мл) в сыворотке крови здоровых и больных

Группы И-2 1Ь-4

1.Здоровые п-38 130,51*21,60 14,85*1,26

2. ЛФМ п=42 140,06+6.90 88,27+18,89

З.РМЖ п-86 183,06*14,84 95,14*16,05

Р 2-3* 1-2* 1-3**

Примечание: * - р<0,05; ** - р<0,01

Наиболее низкий уровень П.-1Р отмечался в сыворотке крови здоровых лиц. У больных РМЖ содержание 1Ь-1р было ниже, чем у больных ЛФМ, но достоверно выше по сравнению со здоровыми лицами. У больных РМЖ также отмечалось достоверное повышение содержания ТЫГ-а и уровней антител к нему по сравнению с донорами и уровней антител к ЮТ-а по сравнению с больными ЛФМ. У лиц с ЛФМ содержание ТОРи и антител к ТЫР-а было выше, чем в группе здоровых женщин, однако по содержанию 'ШР-а различия были статистически не значимы.

Таблица 7

Содержание цигокинов и уровни антител к Т№-а у больных и здоровых лиц

Группы п 1Ь-1Р, пкг/мл М+т 'ШР-а, Пкг/мл М+т Уровни АТ к 'ШР-а (к) М+ т

1. Здоровые 38 53,4+9,6 61,1+8,7 1,20-0,04

2. Больные ЛФМ 42 177,7*28,4 119.6+32,8 1,61=0,18

3. Больные РМЖ 86 119,1=20,7 238,2+26,2 2,10=0,08

Р 2-1** 3-1* 3-2* 3-1** 2-3* 1-3** 2-1** 3-2*

Примечание: * - р <0,05; ** - р<0,01

Так как содержание 1Ь-1Р у больных РМЖ и ЛФМ и здоровых лиц колебалось в широких пределах, был проведен сравнительный анализ частоты встречаемости (в %) их содержания в соответствии с вышеуказанной градацией (рис. I). Анализ показал, что в

диапазоне от 0 до 100 пкг/мл не Е(аблюдалось достоверна различий в частоте ипречаемости между донорами и больными. В диапазоне 101 200 тткг/мл частота встречаемости у доноров была более чем в два раза выше по сравнению с больными. Главно!: отличительной одайсиностью явилось отсутствие в группе доноров, в отлита от больных, наиболее высоки* показателей содержания ¡И р (более 201 пкт/мл),

90 -80 -70 60 50 -40 -30 20 10 0

Рис. 1. Встречаемость (%) градаций 11-1Р (гш мл) у больных с онколя [ и ческой лаюлошей

И ДОНОрОВ,

Примечание: * - отличия статистически значимы по сравнению с донорами (р<0,01);

& - отличия еттисти чески значимы ш сравнению с группой ЛФМ (р<0.01)

При РШК" и ЛФМ, по сравнению со здоровыми лицами, достоверно чаще встречались высокие уровни ДТ к ТМР-га (1.61 и 6оле<Д Выработка организмом ЛТ к ТМР-(I може! быть расценена как защитней механизм, направленный на нейтрализацию действия *Ш1*-а, как на опу холь, так и на прилегмощие к ней нормальные ткани (рис. 2).

Изучение корреляционных связей между содержанием в крввч провоспалиге.тьных

иитокиион показало, что прямая корреляцдонная зет« и мочь Отмечается между ti -1 р и

TNF-a-y больных ШЖ (г Ю.370. р 0,05) и ЛФМ(гКШ0, (КО.01)1 )

Анализ на тоги cm логической картины РМЖ позволил установить, что только

между соотношением ПД-'УД клейме и содержанием IL-lß с\ щестыуеч прямая

коррелят (ионная .зависимость (ffl,46 I ,р«.0,003).

г-

90

80

70

60

50

гР

40 30 20 10 0

Доноры ЛФМ РМЖ

| fio, оо-1,30 ит^зТ-Т.бо оиГеТ!

['не. 2 Встречаемость (%) уровней шггйтчл к TNF-et среди больных с онкологической патологией и доноров.

11римечаииф: * - отличия статййияйеки значимы по срапнен^ с донорами (p<().ül) ** - отличия статистически значимы но сравнению с донорами (pcO.öl)

Как показали резу:гьтазы исследования, повышение относ н ¡ ел ьн ого содержания Cl№+ -лимфойитов после инкубации МНК с ФГ1, отмечается, в основном, при РМЖ с

преобладанием более высокого варианта дифференпировки и, следовательно, более низкой степени злокачественности. Именно при таком варианте дифференпировки у больных выявляются блокирующие антитела, которые выполняют протективную по отношению к опухоли функцию (эффект экранирования). Отсутствие реакции МНК на ФП при низкодифференциро ванном варианте злокачественного новообразования, при котором не выявлялись антитела к ОАА, есть не что иное, как отражение толерантности иммунной системы к недифференцированным и низкодифференцироканным структурам (Lee T.V., 2000; Balkwill F., 2001).

Выявленные различия в характере ассоциированности аллельных вариантов HLA-генов с реакциями на фстальный протеин лимфоидных клеток женщин с доброкачественным и злокачественным характером опухолевого роста в ткани молочной железы свидетельствуют и о раз.шчиях в иммуногенетичеекой детерминированности функций клеток иммунной системы, принимающих непосредственное участие в контроле над антигенным постоянством тканей и реализации функций противоопухолевого иммунитета.

Подтвержденный клиническими данными и патогистологическими исследованиями, феномен реакции МНК на ФП носит неслучайный характер, что открывает новые перспективы в подходе к лечению и диагностике онкологической патологии.

ВЫВОДЫ

1. У больных раком молочной железы повышено содержание клегок с фенотипом CD71+, что свидетельствует об активизации иммунной системы по сравнению с локализованными формами мастопатии.

2. Увеличение относительного содержания лимфоцитов с фенотипом CD8+ после инкубации с феталъными протеинами имеет прямую корреляцию с относительным содержанием высокодиффсрснцированных клеток в опухоли, и обратную корреляцию с патологическими митозами и относительным содержанием низко - и умереннодифференцированных клеток.

3. Увеличение численности Т ..... лимфоцитов с фенотипом CD8t, после инкубации с

фетальными протеинами, наиболее часто выявляли у больных раком молочной железы с генотипом IILA -Al, тогда как низкая реактивность клеток в этом тесте характерна для больных с генотипами - А2, -В 12, -В 15. У женщин с локализованными формами мастопатии, лимфоциты которых высоко реагируют на инкубацию с фетальными

протеинами, и имеющих генотип HLA DR2 в сочетании с ЛЗ и А19 существует риск развития рака молочной железы.

4. У больных раком молочной железы в сыворотке крови отмечено достоверное повышение содержания IL-2 но сравнению с больными локализованными формами мастопатии и IL-4 по сравнению со здоровыми лицами. Содержание П.,-Iß в сыворотке крови больных раком молочной железы и локализованными формами мастопатии превосходило гаковое у здоровых лиц, и не зависело от нозологической формы заболевания. При раке молочной железы и локализованных формах мастопатии, по сравнению со здоровыми липами, достоверно чаще встречались высокие уровни антител к TNF-ct.

5. Патогистологические исследования молочных желез у больных со злокачественными опухолями позволили установить, что только между соотношением низко -/умеренно дифференцированных клеток и содержанием IL-Iß существует прямая корреляционная зависимость.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Показатели реакции мононуклеарных клеток на фетальные протеины могут быть использованы при динамическом наблюдении за женщинами, имеющими в семейном анамнезе случаи рака молочной железы, в качестве вспомогательного критерия диагностики опухолевой трансформации ткани молочной железы.

2. У пациентов с местнораспространенным раком молочной железы выбор метода лечения до операции может быть основан на полученных нами результатах, так как эффективность того или иного вида терапии связана с вариантом дифференцировки опухоли, о котором с высокой точностью можно судить по характеру реакции мононуклеарных клеток на фетальные прогеины.

3. Женщины, оперированные по поводу локализованных форм мастопатии, и имеющие положительную реакцию мононуклеарных клеток на фетальные протеины, должны находиться на диспансерном наблюдении онколога в связи с риском развития рака молочной железы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ IIO ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Иммуногенетический анализ реакции лимфоцитов на опухолеассоциированные

антигены у больных раком молочной железы и фиброаденоматозом / А.И. Аутеншлюс,

В.И. Коненков, И.Ю. Короткова, Г.Г. Иванова, C.B. Сидоров, М.М. Черснкова, A.B.

Проскура, A.B. Шевченко, Ю.В. Седова, А.Н. Шкунов. // Бюллетень СО РАМН. 2004.

- Т. 114, №4. -С. 67-74.

2. Реакция мононуклеарных клеток на фетальные протеины и результаты патогиетологичеекого исследования злокачественных новообразований в легком и молочной железе / А.И. Аутеншлюс, А.Н. Шкунов, A.B. Проскура, Ю.В. Седова, C.B. Сидоров, Г.Г. Иванова, Е.С. Михайлова, Д.В. Морозов, K.P. Рахманов. // Цитокины и воспаление. - 2005. - Т. 4, №2. С. 16-23.

3. Содержание цигокииов IL-lß, TNF-a и уровни антител к TNF-a у больных с онкологическими и воспалительными заболеваниями / А.И. Аутеншлюс, А.Н. Шкунов, F.F. Иванова, A.B. Проскура, Е.С. Михайлова, Ю.В. Седова, Н.Б. Кузнецова, Д.В. Морозов, A.B. Клименков, C.B. Сидоров // Цитокины и воспаление. - 2005. Т. 4, № 3. -С. 11-15.

4. Ответ лимфоцитов на фетальные протеины при раке молочной железы и легкого / А.И. Аутеншлюс, А.Н. Шкунов, Ю.В. Седова, A.B. Проскура, C.B. Сидоров, Е.С. Михайлова, М.М. Черепкова, Д.В. Морозов // VII Международный конгресс по пластической, реконструктивной хирургии и онкологии. - Москва, 2004. - С. 20.

5. Ответ мононуклеарных клеток па фетальные протеины при онкологической патологии молочной железы / А.И. Аутеншлюс, А.Н. Шкунов, C.B. Сидоров, Д.В. Морозов, A.B. Проскура, Ю.В. Седова, Л.П. Радченко, Е.С. Михайлова, М.М. Черепкова// Лечение рака и предраковых заболеваний молочной железы: Межрегиональная научно-практическая конференция с международным участием, посвященная 110-летию со дня рождения проф. IO.A. Ратнера. - Казань, 2005. - С. 32-33.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ - антиген АТ - антитело

АТ к TNF-a - антитела к фактору некроза опухоли - a

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВД - высокодифференцированные клетки

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

ИРИ - иммунорегуляторный индекс

ИФА - иммуноферменгньш анализ

ЛФМ - локализованные формы мастопатии

МНК - мононуклеарные клетки

МСА - мупиноподобный специфический антиген

НД - низкодифференцированные клетки

ОАА - опухолеассопиированные антигены

РМЖ - рак молочной железы

РЭА - раковоэмбриональный антиген

СА - 15-3 - раковый антиген

УД - умереннодифференцированные клетки

ФИТЦ - флюоресцеинаизотиоцианат ФП - фетальные протеины

Н1А - лейкоцитарные антигены человека II. ингерлейкин

1аА, 1<2(> - иммуноглобулины классов А, О ТЫР-а - фактор некроза опухоли

Соискатель

р-

Подгшсано к печати / ? ч-^С-МС/AJf формат - 60x84 - 1 печатный лист

Бумага: офсетная Печать: Duplo DP-43S Тираж: 100 экз. Номер заказа № 526 Типография ООО "ЮГУС ПРИНТ" г. Новосибирск, ул. Залесского, 4