Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Фармакология иммуномодулятора трекрезана

На правах рукописи

ЖУМАШЕВА Айжангуль Бакитовна

ФАРМАКОЛОГИЯ ИММУНОМОДУЛЯТОРА ТРЕКРЕЗАНА 14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук-

Сап кт-Петсрбу р г 2009

003482134

Работа выполнена в Военно-медицинской академии имени С.М.Кирова

Научные руководители:

доктор медицинских наук профессор Петр Дмитриевич Шабанов кандидат медицинских наук доцент Валерий Петрович Павленко

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки, доктор медицинских наук профессор Николай Андреевич Лосев доктор медицинских наук Павел Васильевич Родичкип

Ведущее учреждение:

Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова

Защита диссертации состоится «_» ноября 2009 года в 13.00 часов на

заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 215.002.07 при Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова (194044, Санкт-Петербург, ул. акад. Лебедева, д. 6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова

Автореферат разослан «__» октября 2009 г.

Ученый секретарь совета

доктор медицинских наук профессор

Борис Николаевич Богомолов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В настоящее время фармакология располагает достаточно большим арсеналом иммуномодулирующих средств, применяемых при различных видах патологии (Цыган В.Н. и др., 2008). К ним относятся препараты микробного происхождения (продигиозан, рибомунил, пирогенал, вакцина БЦЖ), пептидные иммуномодуляторы (тималин, тимо-ген, тимотропин, тимосгимулин, т-активин, интерфероны), синтетические средства (левамизол, нестероидные анаболизанты, дибазол, трекрезан, поли-оксидоний), препараты растительного происхождения (настойка эхиноцеи, иммунал, сироп корня солодки, сплат, настойки женьшеня, элеутерококка, золотого корня). Несмотря на востребованность препаратов микробного, животного и растительного происхождения, многие специалисты отдают предпочтение иммуномодуляторам относительно простого строения, полученным на основе химического синтеза. Среди новых средств этой направленности можно выделить метапрот, полиоксидоний, трекрезан (Болехан A.B., 2006).

Новый отечественный препарат трекрезан - триэтаноламмониевая соль 2-метилфеноксиуксусной кислоты - представляет собой высокоэффективное фармакологическое средство с адаптогенным и иммуностимулирующим действием. Препарат создан в Иркутском институте органической химии СО РАН, прошел доклинические и клинические испытания как адаптогенное средство и разрешен Фармакологическим комитетом МЗ РФ к широкому применению (per. № 94/151/7). Трекрезан оказывает стресспротекторное действие на моделях иммобилизационного и болевого гиподинамического стресса, ускоряет репарацию поврежденных тканей (печень, миокард, мышцы), защищает внутренние органы от повреждающего действия токсинов, СВЧ-облучения, инфекционного фактора, обладает антиоксидантной активностью (Казамировская В.Б. и др., 1996; Шабанов П.Д. и др., 2006). В то же время общий спектр фармакологической активности трекрезана, а также механизмы его действия на организм и, в частности, на иммунную систему, исследованы недостаточно и требуют уточнения (Болехан A.B., 2006). Важно отметить, что для большинства фармакологических препаратов иммуномо-дулирующей направленности важно не только и не столько выраженность их иммуноактивирующего действия, сколько способность устранять иммунодефицита, формирующиеся при различных заболеваниях, прежде всего, воспалительных (Хаитов P.M., 2008). К таким состояниям относят острое бронхо-легочное заболевание (пневмонию), которое занимает одно из ведущих мест среди всех видов легочной патологии в стационарах общего профиля и приобретает важное медико-социальное значение, обусловленное поражением активных в трудовом отношении лиц, а также значительным экономическим ущербом вследствие потери рабочего времени по нетрудоспособности. Особую угрозу при формировании бронхолегочной патологии представляют повторяющиеся эпизоды заболевания пневмонией, свидетельствующие о су-

преосии иммунного ответа и развитии вторичных иммунодефицитных состояний (Чучалин А.Г., 1995, 2008). Иммунопатогенетические механизмы развития острых бронхолегочных заболеваний требуют поиска новых эффективных средств коррекции нарушений иммунного статуса. Перспективными иммуномодуляторами с широкой фармакологической активностью являются новые отечественные иммуномодуляторы трекрезан и полиоксидоний (Кази-мировская В.Б. и др., 1996; Пинегин Б.В. и др., 2004; Болехан A.B., 2006). В то 5ке время, сведений о применении данных средств при остром бронхоле-гочном воспалении сравнительно мало, а сведения об их метаболических и энергостабилизирующих свойствах в тканях легких и иммунокомпетентных клетках при пневмонии отсутствуют.

Целью настоящей работы явилось изучение токсичности, а также иммуностимулирующих и энергостабилизирующих свойств трекрезана и возможности их усиления при комбинированном использовании иммуномоду-ляторов.

В задачи исследования входило:

1. Изучить острую, подострую и хроническую токсичность трекрезана в опытах на мышах, крысах, кроликах и собаках.

2. Изучить влияние трекрезана на показатели клеточного и гуморального иммунитета в модельных системах.

3. Изучить действие трекрезана и комбинаций на его основе на морфологические изменения и энергетический статус в ткани легких и лимфоцитах крови при экспериментальном остром бронхолегочном воспалении у крыс.

4. Изучить влияние трекрезана и комбинаций на его основе на показатели неспецифической резистентности фагоцитарно-макрофагальной •системы и клеточного иммунитета при экспериментальном остром бронхолегочном воспалении у крыс.

Научная новизна работы. Доказано, что трекрезан обладает свойствами малотоксичного соединения (IV класс токсичности) при остром, подоостром и хроническом введении животным разных видов (мыши, крысы, кролики, собаки). Трекрезан мажет быть классифицирован как типичный иммуномодулятор. Он угнетает колониеобразующую активность полипотентных стволовых кроветворных клеток, увеличивает количество ядросодержащих .клеток и стимулирует пролиферацию мононуклеарных клеток, действуя на разных этапах образования лимфоцитов из стволовой кроветворной клетки. Важной особенностью действия трекрезана является его способность стимулировать дифференцировку и функциональную активность более зрелых лимфоцитов, не влияя на новые, функционально незрелые лимфоидные клетки. Кроме того, трекрезан стимулирует

пролиферацию В-лимфоцитов и усиливает продукцию лимфокинов, монокинов и интерферонов. Иммуномодулирующее действие трекрезана сопоставимо с таковым или превышает активность препаратов сравнения (полиоксидония, метапрота). Все исследованные иммуномодуляторы уменьшают экспериментальное острое бронхолегочное воспаление у крыс, нормализуя энергетический обмен в ткани легких и лимфоцитах крови. Они также повышают лимфокинпродуцирующую функцию лимфоцитов, фагоцитарную активность нейтрофилов, активность кислороднезависимых микробицидных систем фагоцитов, снижают фагоцитарное число, показатель завершенности фагоцитоза и активность кислородзависимых микробицидных систем фагоцитов при остром бронхолегочном воспалении. Комбинированное применение трекрезана с другими иммуномодуляторами (метапрот) повышает его иммуностимулирующие свойства.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные экспериментальные данные позволяют рассматривать трекрезан как малотоксичный (безопасный) высоко эффективный иммуномодулятор, активирующий все формы иммунитета (клеточный, гуморальный, фагоцитоз). Простое химическое строение, низкая токсичность, невысокая стоимость препарата позволяет рекомендовать трекрезан в качестве средства выбора при назначении иммуномодуляторов (в сравнении с полиоксидонием и другими препаратами данного класса). Повышение иммуномодулирующей активности трекрезана при комбинировании его с другими иммуномодуляторами (метапро-том, полиоксидонием) позволяет достичь более высоких терапевтических результатов при первичных и вторичных иммунодефицитах. Наконец, результаты проведенного исследования обосновывают новые возможности метаболической защиты организма при бронхолегочных воспалениях с помощью трекрезана и комбинации на его основе. При этом комбинации трекрезана или полиоксидония с метапротом наиболее предпочтительны в лечении бронхолегочных заболеваний как средства выбора для коррекции проявлений вторичного иммунодефицита и нарушений энергетического обмена. Оптимизация указанных процессов обеспечивает полноценность лечения при бронхолегочном воспалении.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Трекрезан в экспериментальных условиях обладает низкой токсичностью и выраженными иммуномодулирующими свойствами.

2. Трекрезан оказывает иммуностимулирующее действие на все виды иммунитета. Он стимулирует пролиферацию мононуклеарных клеток, действуя на разных этапах образования лимфоцитов из стволовой кроветворной клетки, активирует дифференцировку и функциональную активность зрелых лимфоцитов, оказывает прямое стимулирующее влияние на пролиферацию В-лимфоцитов и усиливает продукцию лимфокинов и монокинов. Трекрезан обладает иннтерфероногенной активностью, повышая внутриклеточный син-

тез альфа-интерферона с дальнейшей активацией синтеза гамма-интерферона.

3. Трекрезан и иммуномодуляторы сравнения (полиоксидоний, мета-прот) эффективны при экспериментальном остром бронхолегочном воспалении.; Они уменьшают структурные повреждения ткани легких и нормализует энергетические процессы в легких и лимфоцитах крови. Действие трекрезана усиливается при его совместном применении с полиоксидонием.

4. Трекрезан и иммуномодуляторы сравнения (полиоксидоний,- мета-прот) усиливают процессы неспецифической защиты (фагоцитоз), клеточного и гуморального иммунитета при экспериментальном остром бронхолегочном воспалении. Иммуномодулирующее действие трекрезана усиливается при его совместном применении с полиоксидонием.

Апробация и публикация материалов исследования. Материалы диссертации доложены на международной конференции «Экспериментальная биология и интегральная медицина» (Судак, 2005); на IV международной научной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2006); на 5-ом международном конгрессе по патофизиологии (Пекин, 2006), на заседании Санкт-Петербургского фармакологического общества (Санкт-Петербург, 2007).

Апробация диссертации прошла на межкафедральном заседании кафедры фармакологии и НИЛ иммунологии при кафедре факультетской терапии Боенно-медицинской академии им. С.М.Кирова.

' Реализация результатов работы. Диссертационная работа выполнена в рамках плановой темы НИР Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова № 4.04.133.П.12. Оригинальные авторские подходы методического характера реализованы в научно-исследовательской деятельности и учебном процессе кафедр фармакологии, нормальной физиологии и патологической физиологии Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 7 статей (3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК) и 4 тезиса.

Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 143 страницах машинописного текста, иллюстрированы 27 таблицами и 11 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы. Библиографический указатель содержит 226 наименований, в том числе 164 отечественных и 62 иностранных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Выбор животных. Объектом исследования служили 388 половозрелых белых беспородных крыс самцов и самок массой 180-200 г, 108 половозрелых беспородных мышей самцов массой 18-22 г, 12 кроликов самцов породы «шиншилла» массой 2,5-3,0 кг, полученных из питомника Рапполово РАМН (Ленинградская область) и 8 беспородных собак массой 5,5-9,5 кг. В выборе животных, их содержании и подготовке к эксперименту руководствовались современными требованиями (Трахтенберг И.М. и др., 1991). Животных содержали в виварии в стандартных условиях освещения и питания.

Токсикологические методы исследований. Токсикологические исследования предусматривали экспериментальную оценку острой, подострой и хронической токсичности в соответствии с требованиями «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. В.П.Фисенко. М.: МЗ РФ, 2000».

Острую токсичность (ЛД50) определяли на беспородных мышах массой 18-22 г и крысах массой 180-200 г по методу В.Б.Прозоровского (1967, 2008). Подострую токсичность изучали у крыс массой 180-200 г при введении трекрезана внутрь ежедневно в дозах 1/10 и 1/20 от ЛД50 в течение 6 недель. Регистрировали изменения в поведении крыс по тесту «открытое поле» (Шабанов П.Д. и др., 2002), гематологические и биохимические показатели крови, оценивали морфологические изменения в важнейших органах (мозг, сердце, печень, почки, легкие). Хроническую токсичность исследовали у кроликов породы «шиншилла» массой 2,5-3,0 кг при введении трекрезана внутрь (с кормом) ежедневно в терапевтической дозе 5 мг/кг в течение 6 месяцев и у беспородных собак массой 5,5-9,5 кг при введении трекрезана внутрь ежедневно в дозе 100 мг/кг в течение 3 месяцев. Регистрировали изменения в моче, гематологические и биохимические показатели крови.

Моделирование острого бронхолегочного воспаления на крысах. Острое бронхолегочное воспаление моделировали введением в трахею 0,1 мл скипидара (Кулик A.M., 1986). Сразу после операции и далее на протяжении 5 дней животным опытной группы внутрибрюшинно вводили изучаемые фармакологические препараты. На пятые сутки эксперимента животные подвергались декапитации для забора материала для гистологических, биохимических и иммунологических исследований.

Гистологические методы исследований. Ткань легких размером 1x1 см и толщиной 0,2 см фиксировали в растворе 10%-ного нейтрального формалина, после чего проводили через автоматический универсальный аппарат для гистологической обработки и окраски тканей (АТ-4). Заливка осуществ-

лялась в парафин, срезы делали на микротоме толщиной 5 мкм. Окраску осуществляли гематоксилином и эозином.

Иммунологические методы исследований. Иммунологические исследования проводили, руководствуясь «Методическими материалами по экспериментальному (фармакологическому) и клиническому испытанию иммуномо-дулирующего действия фармакологических средств» (1984).

Исследование клеточного звена иммунитета включало определение реакции торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) с конканавалином А (КонА) 'Л фитогемагглютинином (ФГА), характеризующей функциональное состояние Т-лимфоцитов. Состояние механизмов неспецифической защиты организма оценивали по уровню нейтрофильного фагоцитоза по отношению к микробной тест-культуре после их совместной инкубации (1987). Определяли показатель завершенности фагоцитоза (ПЗФ), фагоцитарный показатель (ФП) - процент фагоцитов из числа сосчитанных нейтрофилов, фагоцитарное чисцо (ФЧ) - среднее число микробов, поглощенных одним активным ней-трофилом. Степень активности кислороднезависимых микробицидных систем фагоцита оценивали с помощью лизосомально-катионного теста (ЛКТ). Кислородзависимые антиинфекционные системы фагоцитов определяли в тесте восстановления нитросинего тетразолия, или НСТ-тесте (Потемкина Е.Е. и др., 2003).

Биохимические методы исследований. Лимфоциты выделяли из цельной крови крыс в градиенте плотности фикол-уротраст. В работе использовалась взвесь лимфоцитов, содержащая 2*106 клеток в 1 мл при контроле на их жизнеспособность. Содержание молочной и пировиноградной кислот определяли в лимфоцитах крови и в 10%-ном гомогенате ткани легкого, приготовленном на 6N хлорной кислоте, энзиматическим методом по Е. Marbach и М. Weil (1967) в модификации И.В. Зарубиной (1984). Свободные аденин-нуклеотиды определяли с помощью восходящей тонкослойной хроматографии.; на пластинах «силуфол» и последующим сканированием на спектроф-луориметре MPF-4 «Hitachi» (Зарубина И.В., Криворучко Б.И., 1982). Свободные адениловые нуклеотиды экстрагировали из лимфоцитов и 10%-ных гомогенатов замороженной в жидком азоте ткани легкого, приготовленных на 6N хлорной кислоте. Стандарты нуклеотидов (АТФ, АДФ и АМФ) фирмы Sigma (США) и исследуемые пробы наносили на пластины «силуфол» в виде пятен на расстоянии 15 мм от нижнего края в конечном объеме 10 мкл. Разделение нуклеотидов проводили в хроматографической камере, насыщенной парами растворителей диоксан-изопропанол-аммиак-вода в соотношении 4:2:1:4. После развития хроматограммы локализацию пятен нуклеотидов осуществляли УФ-облучением. Прямое фотометрирование в отраженном свете проводили на сканирующем устройстве флуориметра при длине волны 260 нм. Скорость сканирования составляла 30 мм/мин, направление сканирования - вдоль оси хроматограммы. Расчет содержания нуклеотидов проводили с учетом калибровочных кривых зависимости площадей пиков пятен от

концентрации хроматографически чистых стандартов. Величину энергетического заряда адениловой системы рассчитывали по формуле: АТФ+0.5АДФ/ АТФ+АДФ+АМФ (Atkinson D., 1968).

Характеристика фармакологических препаратов. В работе использовали иммуномодуляторы трекрезан, полиоксидоний и метапрот. В экспериментах все препараты вводили животным внутрибрюшинно ежедневно на протяжении пяти дней в оптимальной эффективной дозе: трекрезан -25 мг/кг, полиоксидоний - 0,75 мг/кг, метапрот - 25 мг/кг массы тела. Контрольные группы животных получали в эквивалентном объеме физиологический раствор.

Структура и объем исследования представлены ниже:

1. Изучение острой, подострой и хронической токсичности (28 мышей, 38 крыс, 12 кроликов, 8 собак);

2. Изучение влияния трекрезана на показатели клеточного иммунитета и фагоцитоз (50 крыс, 50 мышей);

3. Определение интерфероногенной активности трекрезана (30 мышей);

4. Патоморфологическая оценка экспериментальной модели острого бронхолегочного воспаления у крыс и влияния изучаемых фармакологических препаратов на морфологические изменения в легких (35 крыс);

5. Изучение выживаемости крыс при остром бронхолегочном воспалении и на фоне действия препаратов и их комбинаций (105 крыс);

6. Изучение параметров энергетического обмена в лимфоцитах крови и ткани легких и иммунологических показателей у крыс в норме и при остром бронхолегочном воспалении (20 крыс);

7. Изучение влияния трекрезана, полиоксидония и их комбинации с мета-протом на показатели энергетического обмена в лимфоцитах крови и ткани легких крыс при остром бронхолегочном воспалении (50 крыс);

8. Изучение влияния трекрезана, полиоксидония и их комбинации с мета-протом на иммунологические показатели у крыс при остром бронхолегочном воспалении (50 крыс).

Статистическая обработка результатов исследования. Статистическую обработку результатов исследования проводили на персональном компьютере с использованием пакета программ STATISTICA for Windows стандартными методами с оценкой статистической значимости показателей и различий рассматриваемых выборок по критерию Стьюдента. Различия в сравниваемых группах считались достоверными при уровне значимости 95% (р<0,05). В тексте, таблицах и на рисунках представлены средние значения исследуемых показателей и средняя квадратичная ошибка.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследование общетокснческого действия трекрезана

Сводные данные по среднесмертельной дозе трекрезана (ЛД50) для мышей и крыс представлены в табл. 1. Видно, что чувствительность к острому отравлению самцов и самок практически одинакова.

Таблица 1

Летальные дозы (ЛД50) трекрезана (мг/кг) у мышей и крыс

Способ введения Мыши Крысы

самки самцы самки самцы

Перорально 3600±320 3200±210 6570±150 6300±220

Внутрибрюшинно 2500±120 2000±90 3900±130 3700±125

Исследования токсикологического действия трекрезана в терапевтической дозе 5 мг/кг в течение 6 мес выполнены на кроликах породы «шиншилла». Трекрезан вводили животным с кормом ежедневно. Анализ гематологических и биохимических показателей крови опытной и контрольной групп животных не выявил существенных отличий между ними. Не отмечено значительной разницы между показаниями обеих групп и при микроскопическом анализе внутренних органов животных после 6-месячного применения трекрезана.

Изучение действия трекрезана на крысах при введении препарата в дозах 1/10 и 1/20 ЛД50 выполнено в условиях хронического эксперимента продолжительностью 6 недель, препарат вводили в желудок (подострая токсичность). Полученные данные указывают, что трекрезан оказывал незначительное влияние на поведенческие реакции крыс в «открытом поле», а также гематологические и биохимические показатели крови животных.

Кроме исследований на крысах токсикологические исследования выполнены на собаках (самцах и самках) массой 5,5-9,5 кг. Препарат вводили внутрь в дозе 100 мг/кг ежедневно. В результате проведенных исследований установлено, что при 3-месячном введении в желудок в дозе 100 мг/кг трекрезан не влияет на общее состояние и поведение животных. В течение всего эксперимента собаки, получавшие трекрезан, не отличались от контрольных. Животные имели гладкий шерстный покров, сохраняли обычную двигательную активность, охотно поедали корм. В испытанной дозе препарат не влиял на динамику массы тела животных. При исследовании морфологического состава периферической крови собак, получавших трекрезан, не удалось выявить достоверных различий исследуемых показателей по сравнению с контролем. Однако показатели количества эритроцитов и уровня гемоглобина в

крови животных опытной группы на протяжении всего эксперимента имели тенденцию к повышению по сравнению с контрольной группой. Изменения в лейкоцитарной формуле не найдены. Показатели функций печени, оцененные по активности аланин- и аспартаттрансаминаз, фруктозо-1,6-дифосфатальдолазы, лактатдегидрогеназы и на основании бромсульфалеино-вой пробью макро- и микроскопические исследования внутренних органов также не выявили токсического эффекта трекрезана в этом эксперименте.

Таким образом, трекрезан является малотоксичным веществом с высоким индексом безопасности применения (IV класс безопасности).

Исследование иммунологических свойств трекрезана в эксперименте

Влияние трекрезана на показатели клеточного иммунитета и процессы фагоцитоза у мышей. При исследовании действия препарата на вес тимуса и селезенки (табл. 2) было установлено, что введение трекрезана в дозе 20 мг/кг не оказывало влияние на массу тимуса, но вызывало увеличение массы селезенки.

На содержание клеток перитонеального экссудата трекрезан влияния не оказывал. Процентное содержание макрофагов среди клеток перитонеального экссудата в группах не менялось и оставалось в пределах нормы и составляло около 30%.

Таблица 2

Влияние трекрезана 20 мг/кг на массу тимуса и селезенки мышей

Группа Масса тимуса, мг Масса селезенки, мг

Контроль 25,3±1,5 81,6±3,8

Трекрезан 20 мг/кг 23,4±1,1 96,6±5,8*

Примечание. *р<0,05 по сравнению с показателем в контроле.

Процентное содержание Т-лимфоцитов в селезенке под влиянием трекрезана несколько увеличивалось (табл. 3). В контрольной группе содержание Т- и В-лимфоцитов не изменялось.

Было отмечено стимулирующее влияние трекрезана (20 мг/кг) на резидентные перитонеальные макрофаги. При этом регистрировали усиление как спонтанной (с 0,054±0,002 до 0,118±0,002, р<0,05), так и индуцированной (с 0,105±0,005 до 0,208±0,016, р<0,05) способности макрофагов восстанавливать НСТ, а также способности поглощать нейтральный красный (с 0,488±0,026 до 0,802±0,006, число проб - 5, р<0,01).

Таблица 3

Влияние трекрезана на содержание Т- и B-лимфоцитов в селезенке мышей

Группа Количество лимфоцитов (%)

Т-лимфоциты В-лимфоциты

Контроль 37,1±1,27 50,1±1,75

Трекрезан 20 мг/кг 44,0±1,72* 50,6±2,54

Примечание. *р<0,01 по сравнению с показателем в контроле.

Изучение влияния препарата на функциональную активность индуцированных пептоном нейтрофилов мышей показало, что трекрезан (20 мг/кг) обладал способностью усиливать хемотактическую (хсмоаттрак-тант - 10%-ный раствор пептона) активность нейтрофилов, повышая ее в 2 раза (с 40х106 до 80х106/мл) и фагоцитоз стафилококков (табл. 4).

Таблица 4

Влияние трекрезана 20 мг/кг на фагоцитарную активность нейтрофилов мышей

Препарат Фагоцитарный индекс Фагоцитарное число

Контроль 18,80±0,29 2,05±0,10

Трекрезан 20 мг/кг 28,70±0,51* 2,01±0,05

Примечание. *р<0,01 по сравнению с показателем в контроле.

Таким образом, трекрезан оказывает влияние на перераспределение лимфоидных клеток в организме, а также стимулирующее действие на фагоцитарное звено неспецифического иммунитета.

Влияние трекрезана на показатели гуморального иммунитета. В данном разделе исследований использовали метод локального гемолиза, позволяющий количественно определить клетки, образующие антитела, - без-гелевый вариант локального гемолиза (Казимировская В.Б. и др., 1996). Эксперименты выполнены на белых лабораторных мышах массой 18-21 г. Трекрезан вводили внурибрюшинно в дозе 10 мг/кг. Антигенная нагрузка - эритроциты барана 2x108. Животные в течение 3 дней получали препарат, их забивали на 5 сутки декапитацией, извлекали селезенку и из нее готовили го-могенат. В результате подсчета АОК на 106 спленоцитов установили, что трекрезан стимулирует иммунный ответ по гуморальному типу на 70%.

Для изучения действия трекрезана на реакцию преципитации препарат 10 мг/кг вводили внутрь в течение 7 дней. После этого животных иммунизировали путем внутрибрюшинного введения 1%-ного раствора эритроцитов

барана в объеме 0,25 мл. О выраженности гуморального иммунного ответа суДшш на основании обнаружения в сыворотке мышей гемагглютининов. Реакцию ставили на 7, 14 и 21 сутки после иммунизации (коэффициент рассчитали из значений log титра). Иммунодепрессивное состояние моделировали введением 40 мг/кг аллоксана внутрибрюшинно за трое суток до забоя. Анализ результатов по реакции гемагглютинации показал, что нарастание титра антител в группе животных, получавших трекрезан, достигает максимума на 14-е:сутки - 3,87. На фоне умеренной депрессии иммунной системы в группе живЬтных с экспериментальным диабетом (0,73) предварительное введение животным препарата сопровождается увеличением титра антител на 14 сутки -3,31.

Перечисленные выше факторы указывают на иммунностимулирующие свойства трекрезана, которые связаны с усилением пролиферативной активности В-лимфоцитов.

Углубленное экспериментальное изучение иммуноактивных свойств трекрезана проводили в модельных системах, характеризующих влияние препарата на основные звенья иммунитета - колониеобразующую активность полипотентных стволовых кроветворных клеток костного мозга и селезенки, антителогенез с учетом генного контроля силы иммунного ответа, реакции клеточного иммунитета гиперчувствительности замедленного типа. Использовали животных с такими иммунопатологическими состояниями, как прогрессирующий иммунодефицит и иммунокомплексный гломерулонефрит.

Однократное введение трекрезана внутрибрюшинно за 1 сут до иммунизации приводит к дозозависимой стимуляции IgM-антителообразования на Т-зависимый антиген у высоко- (линия СВА) и низкоотвечающих (линия В6Д2Р1) мышей. Максимальный двукратный эффект наблюдали при использовании трекрезана в дозе 20 мг/кг (табл. 5).

Таблица 5

Влияние трекрезана на первичный ^моральный иммунный ответ у мышей

разных генотипов

Линия мышей Доза трекрезана, мг/кг Количество АОК на селе-

зенку

- 89963+5742

СВА 2 154218±14940**

20 173804+17017**

200 123650±4665*

- 36750±5017

B6fl2Fl 2 55944+6870*

20 85784+9830**

200 71161+7205*

Примечание. *р<0,05; **р<0,01 в сравнении с исходными данными.

" Не выявлено влияния препарата на индуктивную и эффекторную фазы гиперчувствителыюсти замедленного типа. Трекрезан значительно угнетал колониеобразующую активность полипотентных стволовых кроветворных клеток.

Таким образом, трекрезан является и стимулятором антителопродуцен-тов и может быть использован для получения высоких титров антител.

у Влияние трекрезана на интерфероиогенез. Результаты данной серии исследований приведены в табл. 6. При введении мышам плацебо (контрольная группа) в сыворотке животных выявлены минимальные концентрации интерферонов. В среднем в течение 24 ч после внутрибрюшинного введения определялось не более 2,0 ИЕ/мл альфа и 2,4 ИЕ/мл гамма-интерферона.

Аналогичное введение мышам трекрезана уже через 6 ч приводило к существенному (р<0,05) по сравнению с группой плацебо повышению уровня интерферона у животных. За это время образовывалось 54,2 ИЕ/мл интерферона, устойчивого к рН и прогреванию (альфа-типа). Гамма-интерферон, рассчитанный по разнице общего и альфа-интерферона, был в пределах 14,4 ИЕ/мл и его содержание достоверно не отличалось от группы плацебо. Через сутки это соотношение менялось. Альфа-интерферон в среднем оказывался минимальным - 8,3 ИЕ/мл, а гамма-интерферон существенно возрастал до 43,2 ИЕ/мл (р<0,05).

Таблица 6

Индукция альфа- и гамма-интерферона трекрезаном у мышей при внутри-брюшинном введении препарата

Группы мышей Титры интерферонов в сыворотке после внутрибрюшинного введения препарата, ИЕ/мл

через 6 ч через 24 ч

альфа-тип гамма-тип альфа-тип гамма-тип

Трекрезан 54,2±14,1*# 14,4±10,1 8,2±3,8*# 43,2±8,2*#

Контроль (плацебо) 2,0±1,4 2,4±2,4 1,2±1,2 0,6М),6

Положительный контроль (полинуклеотид И:1Д) 160,6±10,2* 0,4±0,4 0,6±0,6 1,6±1,0

Примечание. *р<0,05 по сравнению с показателем в контроле (плацебо).

#р<0,05 по сравнению с показателем положительного контроля.

Полинуклеотид И:Ц (положительный контроль) в аналогичных условиях индуцировал только альфа-интерферон, который через 6 ч достигал уровня 160,6 ИЕ/мл и был достоверно выше (р<0,05), чем в опытной группе. Спустя 24 ч содержание интерферона в сыворотке мышей снижалось до уровня плацебо.

Первичная оценка способности трекрезана индуцировать сывороточный интерферон в опытах на белых мышах показала, что он обладает интер-фероногенной активностью. В первые часы после внутрибрюшинного введения трекрезана вырабатывается интерферон альфа-типа, который в дальнейшем через сутки замещается гамма-интерфероном. Учитывая выявленную интерфероногенную активность трекрезана, можно рассчитывать на расширение сферы его применения и создание на его основе комплексных его использование как медицинского препарата с направленным спектром действия. По-видимому, целесообразно углубленное изучение трекрезана в связи с тем, что он индуцирует гамма-интерферон. Последний имеет гораздо более широкий спектр иммуномодулирующего действия по сравнению с другими видами интерферона.

Влияние трекрезана и комбинаций на его основе на структурные, метаболические и иммунологические изменения в легких и лимфоцитах крови крыс при остром бронхолегочном воспалении

Патоморфологические, метаболические и иммунологические изменения при экспериментальном бронхолегочном воспалении у крыс. У

крыс, получавших интратрахеально скипидар, при морфологическом исследовании макроскопически наблюдали воспалительное поражение легких с типичной инфильтрацией и точечными кровоизлияниями в ткань (рис. 1Б). В большинстве случаев патологический процесс локализовался в нижней доле правого легкого. Существенных различий между особями по распространенности патологического процесса и характеру патоморфологических нарушений не наблюдалось, что свидетельствовало о воспроизводимости и адекватности выбранной модели.

Микроскопически в легких интактных крыс межальвеолярные перегородки были обычного вида, кровеносные сосуды умеренно полнокровны, альвеолы наполнены воздухом (рис. 1В). Введение крысам скипидара вызывало утолщение межальвеолярных перегородок. Кровеносные сосуды перегородок были расширены и полнокровны. Просветы альвеол заполнялись эо-зинофильной жидкостью с нейтрофильными лейкоцитами, встречались нити фибрина. В легком отмечалось наличие экссудата смешанного характера: серозного, фибринозного, фибринозно-гнойного и гнойного (рис. 1Г). В незначительной части опытов наблюдался некроз легочной ткани. В прилежащих к некрозу альвеолах содержался преимущественно серозно-фибринозный экссудат.

Метаболические изменения при экспериментальном остром бронхолегочном воспалении у крыс проявлялись увеличением в лимфоцитах крови и ткани легких содержания лактата, АДФ и АМФ на фоне снижения содержания пирувата и АТФ.

А

Рис. 1. Вверху - внешний вид легкого: А - интактное легкое крысы, Б - легкое крысы при остром бронхолегочном воспалении; внизу - структура легкого, ув. х 100: В - интактной крысы, Г - при остром бронхолегочном воспалении.

При этом более выраженные изменения наблюдались в ткани легких. Изменения в адениннуклеотидяом пуле при остром бронхолегочном воспалении приводили к снижению величины энергетического заряда адениннук-леотидов, что свидетельствовало о развитии энергодефицита в лимфоцитах крови и ткани легких крыс. Моделируемое острое бронхолегочное воспаление у крыс вызывало угнетение лимфокинпродуцирующей функции лимфоцитов в РТМЛ с Кон-А и с ФГА, снижение активности кислороднезависимых микробицидных систем фагоцитов. На фоне бронхолегочного воспаления у крыс выявлены достоверные увеличения фагоцитарного числа и показателя завершенности фагоцитоза при снижении числа нейтрофилов, участвующих в фагоцитозе. Наряду с этим, повышались показатели спонтанного и стимулированного НСТ-теста,

Влияние трекрезана и комбинаций на его основе на выживаемост ь крыс и структурные изменения в легких при остром бронхолегочном воспалении. Частота развития летальных исходов до окончания эксперимента (то есть на 7-е сутки) на фоне острого бронхолегочного воспаления было

- ¡3 ч

'V ,

следующей. При остром бронхолегочном воспалении она составила 48% крыс, у леченных метапротом - 60%, у леченных полиоксидонием - 58%, у леченных трекрезаном - 65%, у леченных метапротом в сочетании с полиоксидонием - 78%, у леченных метапротом в сочетании с трекрезаном - 85%. При анализе не учитывали случаи гибели животных во время операции или в течение первых суток после нее, в возникновении которых фактор легочного воспаления не являлся определяющим.

Таким образом, введение в течение 5 дней крысам иммуномодуляторов и их комбинаций увеличивало выживаемость животных с бронхолегочным воспалением. На фоне применения препаратов в качестве монотерапии выживаемость крыс при остром бронхолегочном воспалении в среднем составляла 60%. При комбинировании полиоксидония и трекрезана с метапротом выживаемость животных возрастала до 78% и 85% соответственно.

Одновременно менялась микроскопическая картина ткани легких. На фоне действия трекрезана межальвеолярные перегородки были незначительно утолщены и полнокровны. Большинство альвеол заполнены воздухом. Отсутствовали некротические участки ткани. В просветах альвеол присутствует серозно-фибринозный экссудат. Аналогичные микроскопические изменения отмечали при введении полиоксидония и метапрота. При применении комбинации трекрезана с метапротом микроскопическая картина ткани легких приближалась к нормальной: межальвеолярные перегородки обычного вида, кровеносные сосуды их умеренно полнокровны, альвеолы наполнены воздухом.

Влияние трекрезана и комбинаций на его основе на метаболические изменения в легких и лимфоцитах крови крыс при остром бронхолегочном воспалении. Крысам с острым бронхолегочным воспалением на протяжении 5 дней внутрибрюшинно вводили трекрезан в дозе 25 мг/кг или препараты сравнения - метапрот (25 мг/кг) или полиоксидоний (0,75 мг/кг), а также комбинации метапрота с полиоксидонием или трекрезаном в тех же дозах. Контролем служили животные с бронхолегочным воспалением, получавшие эквивалентный объем физиологического раствора.

Введение крысам с острым бронхолегочным воспалением метапрота на 50% снижало содержание лактата в лимфоцитах крови по сравнению с не леченными животными. Количество пирувата в лимфоцитах крови крыс возрастало в 4,4 раза (табл. 7). Эти изменения свидетельствуют об уменьшении проявления лактатного ацидоза на фоне действия метапрота. При этом в лимфоцитах крови на 91% увеличивалось содержание АТФ, на 32% снижалось содержание АДФ и на 20% - АМФ (р<0,05).

На фоне действия трекрезана в лимфоцитах крови крыс с острым бронхолегочным воспалением уменьшалось содержание лактата на 40%, АДФ -на 19% и АМФ - на 13% (р<0,05). Содержание пирувата достоверно возрастало в 3 раза и АТФ - на 62%.

Таблица 7

" Влияние трекрезана и его комбинации с метапротом на показатели энергетического обмена в лимфоцитах крови и ткани легких крыс при остром бронхолегочном воспалении (М ± ш)

Показатели Группы животных

бронхо-легочное воспаление (контроль) бронхо-легочное воспаление + метапрот бронхо-легочное воспаление + трекрезан бронхо-легочное воспаление + трекрезан + метапрот

Лимфоциты крови

Лактат, мкмоль/мл 7,48±0,11 3,74±0,07* 4,49±0,14* 2,89±0,12*

Пируват, мкмоль/мл 0,04±0,01 0,20±0,01* 0,14±0,01* 0,21±0,01*

АТФ, мкмоль/мл 1,28±0,06 2,47±0,09* 2,09±0,04* 2,80±0,04*

АДФ, мкмоль/мл 1,18±0,04 0,79±0,02* 0,94±0,06* 0,77±0,03*

АМФ, мкмоль/мл 0,80±0,03 ОДЫ),01* 0,69±0,02* 0,47±0,02*

Энергетический заряд, усл.ед. 0,568 ±0,006 0,729 ±0,005* 0,678 ±0,008* 0,783 ±0,009*

Ткань легких

Лактат, мкмоль/г 8,53±0,11 3,89±0,04* 4,33±0,02* 2,90±0,10*

Пируват, мкмоль/г 0,02±0,01 0,18±0,01* 0,15±0,01* 0,28±0,01*

АТФ, мкмоль/г 1,06±0,03 2,44±0,02* 2,12±0,04* 2,98±0,03*

АДФ, мкмоль/г 1,17±0,02 0,63±0,01* 0,69±0,04* 0,51±0,02*

АМФ, мкмоль/г 0,66±0,05 0,47±0,02* 0,51 ±0,01* 0,31±0,03*

Энергетический заряд, усл.ед. 0,570 ±0,009 0,777 ±0,005 * 0,735 ±0,008* 0,844 ±0,005*

Примечание. *р < 0,05 в сравнении с контролем.

В ткани легких при действии метапрота достоверно снижался уровень лактата на 54%, содержание АДФ - на 45% и АМФ - на 29%. При этом увеличивалось содержание пирувата в 6,5 раз, АТФ - на 129% и энергетического заряда адениннуклеотидов - на 37%. На фоне действия трекрезана уровень лактата в ткани легких снижался на 49%, АДФ - на 40% и АМФ - на 22% при увеличении содержания пирувата в 5 раз и АТФ - на 98% (р<0,05). При этом величина энергетического заряда адениннуклеотидов достоверно возрастала на 30%.

Таким образом, при монотерапии острого бронхолегочного воспаления метаболические нарушения в легких и лимфоцитах крови крыс корригировали метапрот и трекрезан приблизительно в равной степени.

Применение комбинации метапрота с трекрезаном сопровождалось снижением в лимфоцитах крови содержания лактата на 61%, АДФ - на 35% и АМф - на 42% (р < 0,05). Содержание пирувата в лимфоцитах возрастало в 4,4 раза и АТФ - в 2 раза. Величина энергетического заряда адениловой системы достоверно возрастала на 38% по сравнению с контрольными животными. В ткани легких при сочетанном введении метапрота и трекрезана уровень лактата достоверно снижался на 66%, АДФ - на 55% и АМФ - на 52% на фоне увеличения содержания пирувата в 9,6 раз и АТФ - на 177% (р < 0,05). Изменение содержания адениннуклеотидов сопровождалось увеличением на 49% их энергетического заряда.

Таким образом, применение комбинаций иммуномодулятора (трекрезан) с антигипоксантом (метапрот) при бронхолегочном воспалении у крыс оказывало более выраженный эффект в лимфоцитах и ткани легких, чем монотерапия. Энергостабилизирующее действие комбинации метапрота с поли-оксидонием или трекрезаном были сопоставимы.

Влияние трекрезана и комбинаций на его основе на показатели иммунитета у крыс при остром бронхолегочном воспалении. Внутрибрюшинное введение метапрота крысам с острым бронхолегочным воспалением приводило к достоверному повышению лимфокинпродуцирующей функции лимфоцитов в реакции торможения миграции лейкоцитов с Кон-А на 19%, с ФГА - на 10% (табл. 8). Фагоцитарная активность нейтрофилов увеличивалась на 7%, при этом фагоцитарное число, равное среднему числу микробов, поглощенных одним активным нейтрофилом, и показатель завершенности фагоцитоза снижались на 10% и 8% соответственно.

Применение препаратов сопровождалось изменением кислородзависимых антиинфекционных систем лимфоцитов, характеризующих степень активации гексозомонофосфатного шунта и связанное с этим образование свободных радикалов. При введении метапрота показатели спонтанного НСТ-теста снижались по сравнению с бронхолегочным воспалением на 17%, а стимулированного НСТ-теста - на 6% (р < 0,05). Наряду с этим, происходило увеличение активности кислороднезависимых микробицидных систем фагоцитов на 4%.

Применение трекрезана у крыс с бронхолегочным воспалением сопровождалось повышением показателя РТМЛ с КонА на 26% и с ФГА - на 18%. Фагоцитарная активность увеличивалась на 12% на фоне снижения фагоцитарного числа на 16% и показателя завершенности фагоцитоза - на 17% (р < 0,05). Наряду с этим, снижались показатели спонтанного НСТ-теста на 25% и стимулированного - на 10%, при этом активность кислороднезависимых микробицидных систем фагоцитов увеличивалась на 7%.

Таблица 8

Влияние трекрезана и его комбинации с метапротом на иммунологические показатели у крыс при остром бронхолегочном воспалении (М ± т)

Группы животных

Показатели бронхо-легочное воспаление (контроль) бронхо-легочное воспаление + метапрот бронхо-легочное воспаление +трекрезан бронхо-легочное воспаление + трекре- зан + метапрот

РТМЛ с КонА, % 58,88±1,10 70,23±2,20 74,22±2,00* 80,87±2,39

РТМЛ с ФГА, % 41,36±2,40 45,47±2,50 48,88±3,00* 52,40±3,30

ФП, % 80,28±1,30 86,17±0,85 89,71±0,70* 93,75±1,06

ФЧ 18,87±0,50 17,06±0,41 15,92±0,73* 12,50±0,36

ПЗФ, % 30,71±0,79 28,27±0,9 25,35±0,96* 23,00±0,60

ЛКТ, усл. ед. 1,29±0,01 1,36±0,01 1,39±0,03* 1,48±0,01

НСТ спонтанный, Усл. ед. 0,46±0,02 0,38±0,03 0,34±0,02* 0,29±0,01

НСТ стимулированный, усл. ед. 0,68±0,02 0,64±0,02 0,60±0,03* 0,57±0,03

Примечание. РТМЛ - реакция торможения миграции лейкоцитов; Кон-А -конканавалин А; ФГА - фитогемагтлютинин; ПЗФ - показатель завершенности фагоцитоза; ФП - фагоцитарный показатель; ФЧ -фагоцитарное число; ЛКТ - лизосомально-катионный тест; НСТ - тест восстановления нитросинего тетразолия. *р < 0,05 в сравнении с контролем.

Полиоксидоний повышал лимфокинпродуцирующую функцию лимфоцитов в РТМЛ с КонА на 30%, а в РТМЛ с ФГА - на 22%. Наблюдалось увеличение фагоцитарной активности на 14%, при снижении фагоцитарного числа на 19% и показателя завершенности фагоцитоза - на 22% (р<0,05). Активность кислороднезависимых микробицидных систем фагоцитов увеличивалась на 9 % (р<0,05). Показатели кислородзависимых антиинфекционных систем лимфоцитов, характеризующие степень активации гексозомонофос-фатного шунта и связанное с этим образование свободных радикалов, в спонтанном НСТ-тесте снижались на 27%, а стимулированном - на 13% (р<0,05).

Введение крысам с острым бронхолегочным воспалением комбинации метапрота и трекрезана сопровождалось повышением показателей РТМЛ с КонА на 37% и с ФГА - на 26%. Фагоцитарная активность возрастала на 17% на фоне снижения фагоцитарного числа - на 29% и показателя завершенности фагоцитоза - на 25% (р<0,05). Снижались показатели спонтанного НСТ-

теста на 40% и стимулированного - на 19%, при этом увеличивалась активность лизосомально-катионного теста на 12%.

Сочетанное применение метапрота и полиоксидония приводило к достоверному повышению лимфокинпродуцирующей функции лимфоцитов в РТМЛ с КонА на 38% и с ФГА - на 24%. Наблюдалось увеличение фагоцитарной активности на 17%, при снижении фагоцитарного числа на 30% и показателя завершенности фагоцитоза - на 26% (р<0,05). Активность кисло-роднезависимых микробицидных систем фагоцитов увеличивалась на 11% (р<0,05). Показатели спонтанного НСТ-теста достоверно снижались на 42% и стимулированного - на 17%.

Таким образом, применение при остром бронхолегочном воспалении у крыс комбинации иммуномодулятора (трекрезан, полиоксидоний) с антиги-поксантом (метапрот) приводит к более выраженному иммунотропному действию, вследствие чего изучаемые иммунологические показатели восстанавливаются до значений, характерных для интактных животных. Исходя из полученных данных, при монотерапии исследуемые препараты можно расположить в ряд: полиоксидоний > трекрезан = метапрот (препараты расположены в порядке убывания иммунотропной активности). Применение комбинированной терапии сопровождалось более выраженным иммуномодулирую-щим действием. При этом эффекты комбинации метапрота с полиоксидони-ем или трекрезаном были сопоставимы.

ВЫВОДЫ

1. Трекрезан в экспериментальных условиях обладает низкой токсичностью (IV класс токсичности, или малотоксичное вещество) и выраженными иммуно-модулирующими свойствами, проявляемыми в отношении клеточного и гуморального иммунитета, фагоцитоза и способности стимулировать интерфероно-генез.

2. Трекрезан угнетает колониеобразующую активность полипотентных стволовых кроветворных клеток, увеличивает количество ядросодержащих клеток и стимулирует пролиферацию мононуклеарных клеток, действуя на разных этапах образования лимфоцитов из стволовой кроветворной клетки. Препарат стимулирует дифференцировку и функциональную активность более зрелых лимфоцитов, усиливая функции существующих лимфоцитов и не стимулируя появление новых, функционально незрелых лимфоидных клеток.

3. Иммуностимулирующее влияние трекрезана в отношении гуморального иммунного ответа заключается в его прямом стимулирующем влиянии на пролиферацию В-лимфоцитов и усилении продукции лимфокинов и монокинов.

4. Интерфероногенная активность трекрезана проявляется в непродолжительном повышении внутриклеточного синтеза альфа-интерферона с дальнейшей активацией синтеза гамма-интерферона.

5. Трекрезан и иммуномодуляторы сравнения (полиоксидоний, метапрот), применяемые в виде монотерапии и в сочетании друг с другом, выражено уменьшают экспериментальное острое бронхолегочное воспаление, что сопровождается снижением содержания лактата, АДФ и АМФ, увеличением содержания пирувата и АТФ в лимфоцитах крови и ткани легких. По энергостабили-зирующему действию иммуномодуляторы располагаются в следующей последовательности: трекрезан + метапрот = полиоксидоний + метапрот > метапрот « трекрезан > полиоксидоний (вещества расположены в порядке убывания активности).

6. Трекрезан и иммуномодуляторы сравнения (полиоксидоний, метапрот), применяемые в виде монотерапии и в сочетании друг с другом, повышают лимфокинпродуцирующую функцию лимфоцитов, фагоцитарную активность нейтрофилов, активность кислороднезависимых микробицидных систем фагоцитов, снижают фагоцитарное число, показатель завершенности фагоцитоза и активность кислородзависимых микробицидных систем фагоцитов при остром бронхолегочном воспалении у крыс. По выраженности иммунотропных свойств иммуномодуляторы располагаются в следующей последовательности: трекрезан + метапрот = полиоксидоний + метапрот > полиоксидоний > трекрезан ~ метапрот (вещества расположены в порядке убывания активности).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Трекрезан следует рассматривать как высоко эффективный иммуномо-дулятор, активирующий все формы иммунитета (клеточный, гуморальный, фагоцитоз).

Простое химическое строение, низкая токсичность, невысокая стоимость трекрезана позволяет использовать препарат в качестве средства выбора при назначении иммуномодуляторов (в сравнении с полиоксидонием и другими препаратами данного класса).

Повышение иммуномодулирующей активности трекрезана при комбинировании его с другими иммуномодуляторами (метапротом, полиоксидонием) позволяет достичь более высоких терапевтических результатов при первичных и вторичных иммунодефицитах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зарубина И.В. Эффективны ли иммуномодуляторы при бронхолегочном воспалении у крыс? / И.В. Зарубина, А.Ю. Рылеев, А.Б. Жумашева, А.В. Болехан, П.Д. Шабанов // Психофармакол. и биол. наркология. - 2005. - Т. 5, № 3. - С. 1017-1022.

2. Шабанов П.Д. Иммуномодулятор трекрезан / П.Д.Шабанов, ИЗ,Зарубина, А.В.Болехан, А.Ю.Рылеев, А.Б. Жумашева, В.Н. Цыган // Рус. мед. журн. 2005. - Т. 13, №20 (1361) от 23.10.2005. (50%)

3. Шабанов П.Д. Аминотиоловые и бензимидазоловые антигипоксан-ты (метаболические активаторы мозга) в практической медицине / П.Д.Шабанов, В.П. Павленко, А.Б. Жумашева, И.П. Ходченкова // Эксперим. биол. и интегральная медицина. Тез. докл. междунар. конф. - Судак, 2005. -С.24-25.

4. Болехан А.В. Антигипоксические свойства трекрезана при экспериментальной пневмонии / А.В. Болехан, А.Ю. Рылеев, И.В. Зарубина, А.Б. Жумашева, П.Д. Шабанов // Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам: материалы науч. конф. с международным участием. - М., 2006. - С. 16.

5. Шабанов П.Д. Иммуномодулятор трекрезан: профиль общей и иммунотропной активности / П.Д. Шабанов, И.В. Зарубина, А.В. Болехан,

A.Ю. Рылеев, А.Б. Жумашева, В.Н. Цыган // Лечащий врач. - 2006. - № 6. -С. 34-35.

6. Шабанов П.Д. Трекрезан как метаболический активатор, обладающий свойствами метеоадаптогена, психоэНергизатора и иммуномодулятора (теоретическое и экспериментальное обоснование) / П.Д.Шабанов,

B.П. Ганапольский, А.Б. Жумашева, А.А. Елистратов // Вестник Рос. воен,-мед. академии. - 2006. - №1 (15). - С.53-57.

7. Shabanov P.D. Antihypoxic properties of trekresan in experimental bronchopneumonia in rats / P.D. Shabanov, I.V. Zarubina, A.Yu. Ryleev,

A.B. Zhumasheva, V.P. Pavlenko, V.P. Ganapolsky // 5th Int. Congr. of Pathophysiology. Abstracts. - Beijing, China, 2006. - P.171.

8. Bolekhan A.V. Antihypoxic properties of trekresan in experimental pneumonia / A.V. Bolekhan, A.Yu. Ryleev, I.V. Zarubina, A.B. Zhumasheva, P.D. Shabanov // Biological basis of individual sensitivity to psychotropic drugs. Abstracts of 4th Int. Conf. Moscow, 2006. - P.94.

9. Шабанов П.Д. Метаболический активатор трекрезан: изучение ме-теоадаптогенных и иммуномодулирующих свойств / П.Д. Шабанов,

B.П. Ганапольский, И.В. Зарубина, А.Б. Жумашева, А.А. Елистратов // Нсй-ронауки. - 2006. - Т.2, №3(5). - С.43-48.

10. Цыган В.Н. Рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое клиническое изучение эффективности и переносимости БАД «Трамелан» в качестве иммуномодулятора и антиастенического средства в

постдетоксикационном периоде у больных с синдромом зависимости от алкоголя / В.Н. Цыган, П.Д. Шабанов, В.В. Востриков, О.Г. Шинкарева, А.Г. Соколов, Л.Б. Кузенбаева, А.Б. Жумашева, В.В. Васильченко // Мед. картотека. - 2007. - №3. - С. 1-59.

11. Жумашева А.Б. Иммуномодулирующие свойства трекрезана / А.Б. Жумашева, A.B. Болехан, П.Д. Шабанов // Психофармакол. и биол. наркология. - 2009. - Т.8, №3. - С. 2555-2559.

Тираж 100 экз. Подписано в печать 25.09.2009 г. Формат 60x84

Объем 1,1 п.л. Заказ №

Отпечатано в типографии Санкт-Петербургской государственной педиатрической медицинской академии (194100, Санкт-Петербург, ул. Литовская, 2)

Актуальность исследования

В настоящее время фармакология располагает достаточно большим арсеналом иммуномодулирующих средств, применяемых при различных видах патологии (Цыган В.Н. и др., 2008). К ним относятся препараты микробного происхождения (продигиозан, рибомунил, пирогенал, вакцина БЦЖ), пептидные иммуномодуляторы (тималин, тимоген, тимотропин, тимостимулин, т-активин, интерфероны), синтетические средства (левамизол, нестероидные анаболизанты, дибазол, трекрезан, полиоксидоний), препараты растительного происхождения (настойка эхиноцеи, иммунал, сироп корня солодки, сплат, настойки женьшеня, элеутерококка, золотого корня). Несмотря на востребованность препаратов микробного, животного и растительного происхождения, многие специалисты отдают предпочтение иммуномодуляторам относительно простого строения, полученным на основе химического синтеза. Среди новых средств этой направленности можно выделить метапрот, полиоксидоний и трекрезан (Болехан А.В., 2006).

Новый отечественный препарат трекрезан - триэтаноламмониевая соль 2-метилфеноксиуксусной кислоты — представляет собой высокоэффективное фармакологическое средство с адаптогенным и иммуностимулирующим действием. Препарат создан в Иркутском институте органической химии СО РАН, прошел доклинические и клинические испытания как адаптогенное средство и разрешен Фармакологическим комитетом МЗ РФ к широкому применению (per. № 94/151/7). Трекрезан оказывает стресспротекторное действие на моделях иммобилизационного и болевого гиподинамического стресса, ускоряет репарацию поврежденных тканей (печень, миокард, мышцы), защищает внутренние органы от повреждающего действия токсинов, СВЧ-облучения, инфекционного фактора, обладает антиоксидантной активностью (Казамировская В.Б. и др., 1996; Шабанов П.Д. и др., 2006). В то же время общий спектр фармакологической активности трекрезана, а также механизмы его действия на организм и, в частности, на иммунную систему, исследованы недостаточно и требуют уточнения (Болехан А.В., 2006). Важно отметить, что для большинства фармакологических препаратов иммуномодулирующей направленности важно не только и не столько выраженность их иммуноактивирующего действия, сколько способность устранять иммунодефициты, формирующиеся при различных заболеваниях, прежде всего, воспалительных (Хаитов P.M., 2008). К таким состояниям относят острое бронхолегочное заболевание (пневмонию), которое занимает одно из ведущих мест среди всех видов легочной патологии в стационарах общего профиля и приобретает важное медико-социальное значение, обусловленное поражением активных в трудовом отношении лиц, а также значительным экономическим ущербом вследствие потери рабочего времени по нетрудоспособности. Особую угрозу при формировании бронхолегочной патологии представляют повторяющиеся эпизоды заболевания пневмонией, свидетельствующие о супрессии иммунного ответа и развитии вторичных иммунодефицитных состояний (Чучалин А.Г., 1995, 2008). Иммунопатогенетические механизмы развития острых бронхолегочных заболеваний требуют поиска новых эффективных средств коррекции нарушений иммунного статуса. Перспективными иммуномодуляторами с широкой фармакологической активностью являются новые отечественные иммуномодуляторы трекрезан и полиоксидоний (Казимировская В.Б. и др., 1996; Пинегин Б.В. и др., 2004; Болехан А.В., 2006). В то же время данных о применении указанных средств при остром бронхолегочном воспалении сравнительно мало, а сведения об их метаболических и энергостабилизирующих свойствах практически отсутствуют.

Целью настоящей работы явилось изучение токсичности, а также иммуностимулирующих и энергостабилизирующих свойств трекрезана и возможности их усиления при комбинированном использовании иммуномодуляторов.

В задачи исследования входило:

1. Изучить острую, подострую и хроническую токсичность трекрезана в опытах на мышах, крысах, кроликах и собаках.

2. Изучить влияние трекрезана на показатели клеточного и гуморального иммунитета в модельных системах.

3. Изучить действие трекрезана и комбинаций на его основе на морфологические изменения и энергетический статус в ткани легких и лимфоцитах крови при экспериментальном остром бронхолегочном воспалении у крыс.

4. Изучить влияние трекрезана и комбинаций на его основе на показатели неспецифической резистентности фагоцитарно-макрофагальной системы и клеточного иммунитета при экспериментальном остром бронхолегочном воспалении у крыс.

Научная новизна

Доказано, что трекрезан обладает свойствами малотоксичного соединения (IV класс токсичности) при остром, подоостром и хроническом введении животными разных видов (мыши, крысы, кролики, собаки). Трекрезан мажет быть квалифицирован как типичный иммуномодулятор. Он угнетает колониеобразующую активность полипотентных стволовых кроветворных клеток, увеличивает количество ядросодержащих клеток и стимулирует пролиферацию мононуклеарных клеток, действуя на разных этапах образования лимфоцитов из стволовой кроветворной клетки. Важной особенностью действия трекрезана является его способность стимулировать дифференцировку и функциональную активность более зрелых лимфоцитов, не влияя на новые, функционально незрелые лимфоидные клетки. Кроме того, трекрезан стимулирует пролиферацию В-лимфоцитов и усиливает продукцию лимфокинов, монокинов и интерферонов. Иммуномодулирующее действие трекрезана сопоставимо с таковым или превышает активность препаратов сравнения (полиоксидония, метапрота). Все исследованные иммуномодуляторы уменьшают экспериментальное острое бронхолегочное воспаление у крыс, нормализуя энергетический обмен в ткани легких и лимфоцитах крови. Они таюке повышают лимфокинпродуцирующую функцию лимфоцитов, фагоцитарную активность нейтрофилов, активность кислороднезависимых микробицидных систем фагоцитов, снижают фагоцитарное число, показатель завершенности фагоцитоза и активность кислородзависимых микробицидных систем фагоцитов при остром бронхолегочном воспалении. Комбинированное применение трекрезана с другими иммуномодуляторами (метапрот) повышает его иммуностимулирующие свойства.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные экспериментальные данные позволяют рассматривать трекрезан как малотоксичный (безопасный) высоко эффективный иммуномодулятор, активирующий все формы иммунитета (клеточный, гуморальный, фагоцитоз). Простое химическое строение, низкая токсичность, невысокая стоимость препарата позволяет рекомендовать трекрезан в качестве средства выбора при назначении иммуномодуляторов (в сравнении с полиоксидонием и другими препаратами данного класса). Повышение иммуномодулирующей активности трекрезана при комбинировании его с другими иммуномодуляторами (метапротом, полиоксидонием) позволяет достичь более высоких терапевтических результатов при первичных и вторичных иммунодефицитах. Наконец, результаты проведенного исследования обосновывают новые возможности метаболической защиты организма при бронхолегочных воспалениях с помощью трекрезана и комбинации на его основе. При этом комбинации трекрезана или полиоксидония с метапротом наиболее предпочтительны в лечении бронхолегочных заболеваний как средства выбора для коррекции проявлений вторичного иммунодефицита и нарушений энергетического обмена.

Оптимизация указанных процессов обеспечивает полноценность лечения при бронхолегочном воспалении.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Трекрезан в экспериментальных условиях обладает низкой токсичностью и выраженными иммуномодулирующими свойствами.

2. Трекрезан оказывает иммуностимулирующее действие на все виды иммунитета. Он стимулирует пролиферацию мононуклеарных клеток, действуя на разных этапах образования лимфоцитов из стволовой кроветворной клетки, активирует дифференцировку и функциональную активность зрелых лимфоцитов, оказывает прямое стимулирующее влияние на пролиферацию В-лимфоцитов и усиливает продукцию лимфокинов и монокинов. Трекрезан обладает иннтерфероногенной активностью, повышая внутриклеточный синтез альфа-интерферона с дальнейшей активацией синтеза гамма-интерферона.

3. Трекрезан и иммуномодуляторы сравнения (полиоксидоний, метапрот) эффективны при экспериментальном остром бронхолегочном воспалении. Они уменьшают структурные повреждения ткани легких и нормализует энергетические процессы в легких и лимфоцитах крови. Действие трекрезана усиливается при его совместном применении с полиоксидонием.

4. Трекрезан и иммуномодуляторы сравнения (полиоксидоний, метапрот) усиливают процессы неспецифической защиты (фагоцитоз), клеточного и гуморального иммунитета при экспериментальном остром бронхолегочном воспалении. Иммуномодулирующее действие трекрезана усиливается при его совместном применении с полиоксидонием.

Реализация результатов работы

Диссертационная работа выполнена в рамках плановой темы НИР Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова № 4.04.133.п. 12. Оригинальные авторские подходы методического характера реализованы в научно-исследовательской деятельности и учебном процессе кафедр фармакологии, нормальной физиологии и патологической физиологии Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на Российской научной конференции «Экспериментальная биология и интегральная медицина» (Судак, 2005), 4-й международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2006), 5-м всемирном конгрессе по патофизиологии (Пекин, 2006), научных заседаниях кафедры фармакологии Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова (Санкт-Петербург, 2006, 2008).

Апробация диссертации прошла на межкафедральном заседании кафедры фармакологии и кафедры патологической физиологии Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 5 статей (1 статья в журнале, рекомендованном ВАК) и 5 тезисов.

Структура и объем работы

Материалы диссертации изложены на 143 страницах машинописного текста, иллюстрированы 27 таблицами и 11 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы. Библиографический указатель со

ВЫВОДЫ

1. Трекрезан в экспериментальных условиях обладает низкой токсичностью (IV класс токсичности, или малотоксичное вещество) и выраженными иммуномодулирующими свойствами, проявляемыми в отношении клеточного и гуморального иммунитета, фагоцитоза и способности стимулировать интерфероногенез.

2. Трекрезан угнетает колониеобразующую активность полипотентных стволовых кроветворных клеток, увеличивает количество ядросодержащих клеток и стимулирует пролиферацию мононуклеарных клеток, действуя на разных этапах образования лимфоцитов из стволовой кроветворной клетки. Препарат стимулирует дифференцировку и функциональную активность более зрелых лимфоцитов, усиливая функции существующих лимфоцитов и не стимулируя появление новых, функционально незрелых лимфоидных клеток,

3. Иммуностимулирующее влияние трекрезана в отношении гуморального иммунного ответа заключается в его прямом стимулирующем влиянии на пролиферацию В-лимфоцитов и усилении продукции лимфокинов и монокинов.

4. Интерфероногенная активность трекрезана проявляется в непродолжительном повышении внутриклеточного синтеза альфа-интерферона с дальнейшей активацией синтеза гамма-интерферона.

5. Трекрезан и иммуномодуляторы сравнения (полиоксидоний, метапрот), применяемые в виде монотерапии и в сочетании друг с другом, выражено уменьшают экспериментальное острое бронхолегочное воспаление, что сопровождается снижением содержания лактата, АДФ и АМФ, увеличением содержания' пирувата и АТФ в лимфоцитах крови и ткани легких. По энергостабилизирующему действию иммуномодуляторы располагаются в следующей последовательности: трекрезан + метапрот ~ полиоксидоний + метапрот > метапрот > трекрезан > полиоксидоний (вещества расположены в порядке убывания активности).

6. Трекрезан и иммуномодуляторы сравнения (полиоксидоний, метапрот), применяемые в виде монотерапии и в сочетании друг с другом, повышают лимфокинпродуцирующую функцию лимфоцитов, фагоцитарную активность нейтрофилов, активность кислороднезависимых микробицидных систем фагоцитов, снижают фагоцитарное число, показатель завершенности фагоцитоза и активность кислородзависимых микробицидных систем фагоцитов при остром бронхолегочном воспалении у крыс. По выраженности иммунотропных свойств иммуномодуляторы располагаются в следующей последовательности: трекрезан + метапрот ~ полиоксидоний + метапрот > полиоксидоний > трекрезан > метапрот (вещества расположены в порядке убывания активности).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Трекрезан следует рассматривать как высоко эффективный иммуномодулятор, активирующий все формы иммунитета (клеточный, гуморальный, фагоцитоз).

2. Простое химическое строение, низкая токсичность, невысокая стоимость трекрезана позволяет использовать препарат в качестве средства выбора при назначении иммуномодуляторов (в сравнении с полиоксидонием и другими препаратами данного класса).

3. Повышение иммуномодулирующей активности трекрезана при комбинировании его с другими иммуномодуляторами (метапротом, полиоксидонием) позволяет достичь более высоких терапевтических результатов при первичных и вторичных иммунодефицитах.