Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Фармакологическое исследование тилорона в эксперименте.

На правах рукописи

4852956

БОНДАРЕНКО ДМИТРИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

Фармакологическое исследование тилорона в эксперименте

14.03.06 - Фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

1 5 СЕН 2011

ПЯТИГОРСК 2011

4852956

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской

Федерации

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Ивашев Михаил Николаевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Колодийчук Елена Владимировна

кандидат фармацевтических наук Сергеева Елена Олеговна

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова» Минздравсоцразвития России

Защита состоится «18» октября 2011 года в 900 часов на заседании диссертационного совета Д.208.069.01 по защитам диссертаций при ГБОУ ВПО «Пятигорская ГФА» Минздравсоцразвития России (357532, Ставропольский край, Пятигорск, пр. Калинина, 11).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Пятигорская ГФА» Минздравсоцразвития России (357532, Ставропольский край, Пятигорск, пр. Калинина, 11).

Автореферат разослан «26» августа 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Е.В. Компанцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. На рубеже XX и XXI веков регистрируется прогрессивный рост заболеваемости дерматозами. Болезни кожи и подкожной клетчатки, по данным Федеральной службы государственной статистики, занимают в Российской Федерации третье место по количеству диагнозов, установленных впервые в жизни [Адаскевич В.П., Козин В.М., 2009 г.; Бутов Ю.К., Скрипкин Ю.С., 2009 г.]. По результатам зарубежных исследований, 10% первичных обращений к врачам общей практики обусловлены дерматологическими заболеваниями [Томас П. Хэбиф., 2008 г.]. Одним из клинических проявлений сосудистой и неврологической патологии являются ише-мические и нейротрофические расстройства кожи преимущественно нижних конечностей. Хроническими облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей страдает около 2-3% населения планеты [Dormandy J., 1999 г.]. У большого количества этих больных возникают трофические нарушения кожи нижних конечностей. По данным Американской Ассоциации диабетоло-гов настоящее время в мире насчитывается более 150 миллионов больных сахарным диабетом. При длительно существующем сахарном диабете почти у 80% лиц наблюдаются различные дерматозы, связанные с нарушением макро и микроциркуляции, диабетической полинейропатией, снижением защитной функции кожи. При различных этиологии и патогенезе, клинических проявлениях и течении дерматозы имеют общий патогенетический механизм - значимые отклонения в иммунной реакции организма. Клетки эпидермиса и дермы участвуют в продукции иммунорегуляторных цитокинов, которые контролируют все последовательные этапы адекватной защитной реакции кожи до полной или частичной репарации. В системе цитокинов особое значение имеют интерфероны, выполняющие роль мессенджеров межклеточного взаимодействия иммунокомпетентных клеток, регулируя интенсивность и продолжительность иммуновоспапительного ответа [Симбирцев A.C., 2004 г.].

В настоящее время при лечении дерматозов традиционно используются нестероидные противовоспалительные препараты, регене^нты и репа-ранты для местного и системного применения, однако инду... i интерферона и заменители компонентов крови не применяются.

Одним из самых эффективных индукторов эндогенного интерферона у человека является тилорон - низкомолекулярный синтетический индуктор интерферона ароматического ряда, относящийся к производным флуоренона. Тилорон стимулирует образование в организме интерферонов а, Р и у. Кроме того, он активирует стволовые клетки костного мозга, стимулирует гуморальный иммунитет увеличивая продукцию и уменьшает степень имму-нодепрессии, восстанавливает соотношения Т-супрессоров и Т- хелперов, обладает прямым противовирусным действием в отношении практически всех вирусных инфекций (рабдо-, того-, миксовирусы), в том числе онкогенных, проявляет противовоспалительный , радиопротективный эффекты [Ершов Ф.А., Киселёв О .И., 2005 г.; Филиппова Т.О., Головенко Н.Я., 2006 г.]. Способность перфторана - перфторуглеродного соединения, адсорбировать и отдавать большие количества газов, улучшат, метаболизм и газообмен на уровне тканей, может иметь лечебный эффект при дерматозах обусловленных локальным нарушением артериального кровотока и иннервации. Перфторан улучшает периферический кровоток и микроциркуляцию тканей ликвидируя гипоксию и ишемию. Использование его противоишемических и мембрано-протекторных свойств позволяет предотвращать гибель клеток различных органов, определенное время находившихся в условиях неадекватного кровообращения или полного его отсутствия, воздействуя на одни из основных патофизиологических процессов - ишемию и гипоксию.

Представляется актуальным исследование терапевтической активности тилорона на экспериментальных моделях дерматозов в виде монотерапии и в комбинации с перфтораном.

Цель исследования: Изучение противовоспалительной и репаратив-ной активности тилорона при различных путях введения в виде монотерапии и в комбинации с перфтораном на экспериментальных моделях патологии кожи.

Задачи исследования:

1. Провести исследования по определению ЛД50 и категории токсичности тилорона при ректальном, подкожном и внутримышечном введении согласно международной системы классификации токсичности веществ ОНБ

(Globally Harmonized lntegrated Classification System for Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures: Acute toxicity hazard categories).

2. Разработать экспериментальные модели химически индуцированного облигатными раздражителями простого контактного дерматита и патологических изменений кожи при денервации и нарушении кровоснабжения.

3. Провести исследование противовоспалительного и репаративного эффекта тилорона при различных путях введения на экспериментальных моделях патологии кожи.

4. Определить эффективность комбинации тилорона с перифокаль-ным подкожным обкалыванием перфтораном на экспериментальных моделях патологии кожи.

5. На основании полученных данных сформулировать рекомендации по клиническому применению тилорона при патологии кожи.

Научная новизна исследования. Ввиду отсутствия литературных данных впервые определены ЛД50 и категория токсичности тилорона при ректальном, подкожном и внутримышечном введении по международной системе классификации токсичности веществ GHS соответствующие 3 категории токсичности.

Разработаны новые экспериментальные модели простого контактного дерматита и патологических изменений кожи при денервации и нарушении кровоснабжения, которые могут быть рекомендованы для неклинических исследований лекарственных препаратов.

Разработана оригинальная методика трансабдоминальной катетеризации тонкого кишечника для длительного энтерального введения исследуемых веществ.

Проведено исследование противовоспалительного и репаративного эффекта тилорона при различных путях введения в виде монотерапии и в комбинации с подкожным перифокальным обкалыванием перфтораном на экспериментальных моделях патологии кожи. Впервые доказан" терапевтическая эффективность тилорона при наружном, подкожном . кокишечном введении в виде монотерапии и в комбинации с перфтораном на эксперимен-

тальной модели патологии кожи, вызванной нарушением иннервации и кровоснабжения.

Научно-практическая значимость исследования. Выполненное исследование по изучению эффективности различных лекарственных форм ти-лорона на экспериментальной модели патологии кожи, вызванной нарушением кровоснабжения и иннервации, является обоснованием целесообразности проведения их клинических испытаний. Разработанные экспериментальные модели простого химического контактного дерматита, патологических изменений кожи при локальном нарушении артериального кровотока и иннервации пригодны для изучения ранозаживляющих эффектов, как физических агентов, так и фармакологических веществ. Разработанная методика трансабдоминальной катетеризации тонкого кишечника может быть использована в практике физиологических исследований и неклинического испытания знте-ральных лекарственных средств. Полученные данные о синергизме терапевтического эффекта комбинации тилорона с перифокальным подкожным обкалыванием перфтораном при патологии кожи могут служить основанием для дальнейших клинических исследований. Выявленный достоверный терапевтический эффект трансабдоминального введения тилорона в тонкий кишечник, является обоснованием разработки кишечнорастворимых (защищенных) пероральных лекарственных форм тилорона. Можно предположить увеличение эффективности защищенных пероральных форм тилорона и при других патологических состояниях. Доказана неэффективность мази тилорона при экспериментальном простом контактном дерматите и пероральных и инъекционных форм тилорона при ожоговой ране.

Внедрение результатов исследования в практику. Результаты проведённых исследований включены в план НИР кафедры биологии, физиологии и патологии, биохимии и микробиологии ПятГФА (акты об использовании результатов НИР, составленные на основе информационного письма «Фармакологическое исследование тилорона в эксперименте» от 20 апреля 2011 года).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. ЛД50 тилорона при однократном внутримышечном введении явля-

ется 180 мг/кг при однократном подкожном введении 300 мг/кг, при ректальном введении 800 мг/кг. Тилорон при ректальном, внутрибрюшинном, подкожном и внутримышечном введении относится к 3 категории токсичности в соответствии с международной системой классификации токсичности веществ GHS.

2. Разработанные экспериментальные модели простого контактного дерматита, патологии кожи при нарушении артериального кровотока и иннервации, трансабдоминального тонкокишечного катетера могут быть рекомендованы для физиологических и неклинических исследований.

3. Тилорон при наружном, подкожном и тонкокишечном введении оказывает выраженное противовоспалительное и репаративное действие на экспериментальной модели патологии кожи, вызванной нарушением кровоснабжения и иннервации.

4. Доказана неэффективность мази тилорона при экспериментальном простом контактном дерматите, пероральных и инъекционных форм тилорона при ожоговой ране, внутрижелудочного введения водного раствора тилорона при патологии кожи, вызванной денервацией и нарушением кровоснабжения.

5. Выявленный достоверный терапевтический эффект трансабдоминального введения тилорона в тонкий кишечник при экспериментальной патологии кожи служит обоснованием разработки кишечнорастворимых (защищенных) пероральных лекарственных форм тилорона.

6. Выявлен синергизм при комбинированном использовании тилорона и перфторана при патологии кожи.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ Пятигорской государственной фармацевтической академии, филиала Учреждения Российской Академии Наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (ФИБХ) и Пущинского Государственного Университета (ПущГУ).

Апробация работы и публикация результатов нес... аания. Материалы диссертации доложены на Второй научно-практической конференции

с международным участием «Достижения клинической фармакологии в России» (Москва, 2009), 14-ой Международной Путинской школе-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010), XVII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2010), III Международной научно-практической конференции «Наука и современность -2010» (Новосибирск, 2010), II Конгрессе Международного общества клинических фармакологов и фармацевтов стран СНГ (Москва, 2010), Конференции "Информация о лекарственных средствах - качественному использованию лекарств" (Казань, 2010).

По результатам исследования опубликовано 10 работ, в том числе 4 в изданиях рекомендуемых ВАК.

По результатам исследования получен патент «Способ ускорения заживления кожных повреждений, вызванных денервацией и нарушением кровоснабжения», регистрационный № 2423971, от 20.07.2011 г. Авторы Бонда-ренко Д.А., Мурашев А.Н., Межбурд Е.В.

Объём и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 142 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, 4 главы собственных исследований, в том числе описание материалов и методов, результаты исследования, обсуждение и выводы. Список литературы, состоит из 102 отечественных и 32 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 28 таблицами и 22 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования. Исследования проводились на половозрелых самцах и самках белых мышей серии CD -1, массой 21-27 грамм и аутбредных половозрелых самцах белых крыс серии Sprague-Dawley (далее SD), массой 500-600 грамм. Основные правила содержания и ухода соответствовали нормативам, указанным в руководстве Guide for Care and Use of Laboratory Animals, Стандартным Операционным Процедурам лаборатории биологических испытаний гор. Пущино. Животные были получены из НПП «Питомник лабораторных животных» Филиала ИБХ РАН гор, Пущино. Всего

в экспериментах использовано 297 животных (81 мышь,216 крыс).

В экспериментах использовался тилорон (компания Sigma-Aldrich, США) в виде водного 0,4% раствора для перорального и парентерального введения и 1% мази (состав: тилорон - 1г, ПЭО-4СЮ - 39,2г (80%), ПЭО-1500 - 9,8г (20%)). Исследуемые лекарственные препараты предоставлены ЗАО «Биологические исследования и Системы» г.Пущино.

Исследования проводились в соответствии с GLP-правилами, ГОСТ Р53434-2009 «НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ «ПРИНЦИПЫ НАДЛЕЖАЩЕЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ПРАКТИКИ», Стандартными Операционными Процедурами лаборатории.

Определение максимальной толерантной дозы и класса токсичности тилорона при однократном ректальном, подкожном и внутримышечном введении с последующим расчётом ЛД50 было выполнено на 53 белых половозрелых самцах мышей серии CD-I. Вещества вводили однократно ректально, подкожно и внутримышечно в объеме 10 мл/кг. Дозы для введения каждому животному рассчитывали на основании данных массы тела, полученных непосредственно перед введением. Исследование токсичности проводилось в диапазоне 800-400 мг/кг с шагом в арифметической прогрессии 100 мг/кг. Для подкожного введения тилорона стартовая доза была 300 мг/кг, внутримышечно 200 мг/кг, ректально 800 мг/кг. Максимальной толерантной дозой являлась доза препарата, при введении которой выживали 100% мышей, а её увеличение на 20% вызывала гибель хотя бы 1-го животного из пяти. После введения разных доз препарата регистрировали интегральные показатели (отклонения в состоянии здоровья, вес животных, потребление корма и воды). Объективное определение влияния на одни из основных функций центральной нервной системы - спонтанную двигательную активность и эмоциональное состояние мышей проводили в течение трех минут в «открытом поле» актометра Opto-Varimex с компьютеризированной системой Auto-Track System фирмы Columbus Instruments (США). Регистрировались горизонтальная и вертикальная двигательная активность, время замирания, эпизоды грумин'' дефекации и уринации. Тестирование осуществлялось до введения npeu_t i и затем на 1, 7 и 13 день после введения. Животных наблюдали 14 дней после введения

препарата. Каждые сутки в течение двух недель, регистрировалось количество погибших и выживших животных. На 15 сутки после введения осуществлялась некропсия выживших животных.

Моделирование простого контактного дерматита было выполнено на 8 самцах белых половозрелых мышей серии CD-I нанесением на кожу растворов формальдегида различной концентрации. Аппликации проводили 5% водным раствором формальдегида 7-кратно через день, затем с 18 дня исследования через день 7-кратно наносился 10% водный раствор формальдегида.

Патологические изменения кожи ступни задних лап у крыс SD при денервации и нарушении кровоснабжения вызывали путем нейротомии боль-шеберцового нерва и наложения лигатуры на подколенную артерию.

Ожоговая рана наносилась термостатируемой плашкой диаметром 7 мм в течение 10 сек., что позволяло моделировать ожог третьей А степени.

Ход экспериментов контролировался световой микроскопией исследовательским микроскопом Olympus ВХ60 с фотографированием и обработкой полученных данных компьютерной планиметрией программой Image Tool v2.0.

Основным объектом для неклинических исследований являются крысы. Анатомические размеры этих животных технически не позволяют вводить в неизмельченном виде кишечнорастворимые формы препаратов. В доступных нам публикациях, кроме классической фистулы кишечника по способу И.ПЛавлова, не найдено описания методов трансабдоминальной катетеризации тонкого кишечника, что послужило основанием для разработки методики установки трансабдоминального дуоденального катетера для длительного энгерального введения лекарственных препаратов. В брюшинной области делали продольный разрез кожи длиной около Зсм. Выделяли участок тонкого кишечника на расстоянии 2см от желудка, в его нижней части специальной иглой делали прокол. В образовавшуюся фистулу вводился катетер специальной формы (рис.1).Эластичные «ушки» позволяли безопасно, не растягивая края отверстия, ввести его через фистулу и зафиксировать там, а внешний ободок препятствовал дальнейшему проникновению катетера в кишечник. Контуры фистулы обшивались и стягивались кисетным швом. Катетер фикси-

ровался швами к брюшным стенкам и выводился под кожей в межлопаточную область.

Рисунок 1 - Строение катетера и его схематическое расположение в стенке двенадцатиперстной кишки (1. Эластичные «ушки» катетера;

2. Внешний ободок катетера; 3. Стенка двенадцатиперстной кишки.)

Исследование противовоспалительного эффекта тилорона при простом контактном дерматите проведено на 20 мышах серии CD-I поровну разделенных на основную и контрольную группы, что позаолило получить статистически значимые данные. Контрольной точкой начала эксперимента служила площадь поражения кожи в 100 мм2. В основной группе животным наносили на область дерматита мазь тилорона, в контрольной группе гидрофильную мазевую основу полиэтиленоксидов. Общая длительность экспериментов составляла шесть недель. Критериями оценки эффективности аппликаций мази тилорона были динамика изменения площади воспаления и сроки заживления. Максимальная площадь поражения развилась к 27-му дню эксперимента, регресс воспаления начался с 28-го дня и завершился к 42-му дню исследования. Заживление происходило в течение 12-16 дней после прекращения обработки пораженного участка формалином.

Эксперимент по исследованию эффективности и сравнительному анализу заживляющей активности различных лекарственных форм тилорона при патологии кожи, вызванной нарушением иннервации v • оснабжения, проведен на 70 самцах крыс SD. Введение лекарственных препаратов начинали при площади поражения кожи 200 мм2 в среднем на 10-11 день после появ-

1

ления патологии. В экспериментальных группах наносилась мазь тилорона до полного выздоровления, по схеме проведено десять подкожных обкалываний очага поражения инъекционной формой тилорона, по базовой схеме зондом в желудок 10 раз вводился водный раствор тилорона. В контрольных группах в качестве плацебо использовались мазевая основа, подкожное обкалывание физиологическим раствором, зондовое введение в желудок дистиллированной воды, а также интактные животные. Количество мази составляло 0,03 г (0,3 мг тилорона) на одну аппликацию, при подкожном и внутрижелудочном введении тилорон вводился в дозе 3 мг/кг.

Исследование терапевтической эффективности трансабдоминального введения тилорона в двенадцатиперстную кишку при нейротрофических расстройствах кожи были выполнены на 20 аутбредных самцах крыс вргадие-Бат\1еу. При достижении площади поражения близкой к 180-190мм2 производилась катетеризации тонкой кишки. Отправной точкой начала применения фармакологических веществ служила площадь пораженной кожи, составлявшая около 200 мм2, в среднем развивающаяся на 10-11 сутки, после появления патологии. Животным из группы, получавшей препарат через катетер в кишечник, вводился водный раствор тилорона в дозе Змг/кг. Контрольной группе через катетер в кишечник вводилась дистиллированная вода в объеме 10 мл/кг. Первые два дня введения производились ежедневно, далее через 2 дня на третий. Курс составлял 10 введений.

Исследования терапевтической активности тилорона в комбинации с перфтораном при патологии кожи бьии выполнены на 70 самцах крыс Применять лекарственные препараты начинали при исходной площади поражения кожи 200 мм2, в среднем развивающейся на 10-11 сутки после появления патологии. Рекомендуемой минимальной дозой перфторана для людей является 5 мл/кг, в перерасчете на вес крыс однократная доза перфторана составляет 2,5 мл. В первой группе производилась аппликация мази тилорона, во второй - подкожное перифокальное обкалывание, в третьей - в очаг поражения подкожно и дорзально внутримышечно вводилась эмульсия перфторана, в четвертой - комбинировали нанесение мази тилорона с парентеральным введением перфторана. В контрольных группах в первом случае были интакт-

ные животные, во втором - на кожу наносилась мазевая основа, в третьем -подкожно вокруг зоны поражения вводился физиологический раствор. Аппликации тилорона проводились до полного выздоровления. Первые три дня инъекции тилорона производились ежедневно, далее через день, курс состоял из 10 обкалываний. Эмульсия перфторана вводилась в разовой дозе 2,5 мл ежедневно в течение 3 дней.

Для всех данных была применена описательная статистика: подсчитаны среднее значение и стандартная ошибка среднего, которые вместе со значением N представлены в итоговых таблицах. Для определения достоверности межгрупповых различий данные проанализированы тестом MannWhitney для непараметрических данных. Статистический анализ проводился программой Statistica ver. 7.0. в среде Windows (критерий Стыодента). Для статистической оценки различий использовали ANOVA с последующим применением рангового теста Дункана. Различия считали статистически значимыми при Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Определение острой токсичности тилорона при ректальном, подкожном и внутримышечном введении. Установлено, что максимальная толерантная доза тилорона при однократном внутримышечном введении составляет 90 мг/кг. Максимальной толерантной дозой при однократном подкожном введении является 150 мг/кг. При ректальном введении максимальная толерантная доза 400 мг/кг. Величина ЛД50 тилорона при внутримышечном введении составила 180 мг/кг, при подкожном введении 300 мг/кг, при ректальном введении 800 мг/кг. Актометрические исследования, проведенные с целью объективизации эффектов тилорона на психомоторное поведение животных, показали, что при внутримышечном введении отмечалось дозозависимое угнетение поведения и снижение спонтанной (горизонтальной) двигательной активности с последующим их восстановлением на следующие сутки. Не имелось достоверных отличий между контрольными и подопытными группами в динамике поведения и двигательно" активности при подкожном и ректальном введении тилорона, оцениь„» х по тесту «открытое поле». В дальнейшем при двухнедельном наблюдении состояние

и поведение животных не отличалось от контроля. У мышей не выявлено изменений прироста массы тела, потребления корма и воды, отсроченных признаков нейротоксичности. Исходя из полученных цифр ЛД50 в соответствии с международной системой классификации токсичности веществ СНБ тилорон при внутримышечном, подкожном и ректальном введении относится к 3 категории токсичности.

Методики моделирования экспериментальных моделей дерматозов. Результаты исследований показали, что дерматит, вызванный водным раствором формальдегида, сопровождался существенными изменениями кожного покрова характерными для простого контактного дерматита. Как следует из представленного рисунка (рис.2), максимальная площадь поражения развилась к 27-му дню эксперимента, регресс воспаления завершился к 45-му дню исследования. мм2

«з т

Рисунок 2 - Динамика размеров площади контактного дерматита(р<0,05)

При патологии кожи, вызванной денервзцией и нарушением кровоснабжения, через 4-5 дней в области голени и подошвенной поверхности стопы стала отмечаться гиперемия и отёк. В последующем в центре участка поражения возникли очаги отслойки эпидермиса. К 14-16 дню эксперимента площадь поражения, гиперемия кожи и десквамация рогового слоя достигли максимального развития, которое сохранялось на протяжении 7-9 дней.

ммг

Рисунок 3 - Динамика изменения площади пораженной кожи (р<0,01), вызванной денервацией и нарушением кровоснабжения

В последующие дни отмечается регресс воспалительных процессов с исходом к 50-52 дню в дистрофически изменённую кожу (рис.3).

Изучение терапевтической активности различных лекарственных форм тилорона на экспериментальных моделях патологии кожи.

Различий в характере изменения площади поражения и сроках заживления при простом контактном дерматите в основной и контрольной группах статистически достоверно при использовании мази тилорона не выявлено. Таким образом, в результате проведенного исследования не получено данных свидетельствующих о терапевтическом эффекте мази тилорона при экспериментальном простом контактном дерматите.

С целью проверки эффективности различных форм тилорона при лечении ожогов кожи проводилось подкожное обкалывание вокруг ожога 0,4% раствором тилорона и курсовое введение зондом в желудок раствора тилорона. Исследования были выполнены на 48 аутбредных белых половозрелых самцах крыс серии SD. В контрольных группах ожог перифокально подкожно обкалывался физиологическим раствором, и давалась вода. В качестве критериев ранозаживляющего эффекта использовались сроки заживления, динамика изменений площади поражения. Заживление ожога про. ю к 20 дню, как в экспериментальных, так и контрольных группах. Достоверных отличий в

динамики изменений площади раневой поверхности между экспериментальными и контрольными животными не было. Таким образом, тилорон на модели ожоговой раны при парентеральном и пероральном применении не продемонстрировал терапевтического эффекта.

Следующей задачей исследования являлось выявление эффективности и сравнительный анализ заживляющей активности испытуемого объекта тилорон при введении зондом в желудок водного раствора, при подкожном введении вокруг пораженной поверхности инъекционной формы и при аппликациях на пораженную поверхность мази на модели патологии кожи задней конечности крыс вызванной нарушением кровоснабжения и иннервации (рис.4).У животных группы «Контроль без воздействия» на 4-5 день эксперимента площадь поражения достигла максимального значения, т.е. покрывала всю поверхность стопы, и сохранялась на протяжении 7-9 дней. В последующие дни отмечается регресс воспалительных процессов с исходом к 40-42 дню эксперимента в дистрофически изменённую кожу. У животных из группы «Мазь» получавших аппликации тилорона после трех дней роста на четвертый наблюдалось снижение площади поражения с полным излечением на 14 день. Данные группы «Мазеобразующая основа» незначительно отличались от данных группы «Контроль без воздействия». У животных из группы «Обкалывание» получавших подкожные инъекции тилорона после трех дней роста на четвертый наблюдалось снижение площади поражения с полным излечением на 18 день. Данные группы «Обкалывание-контроль» были сходны с данными группы «Контроль без воздействия».

Y

4

дни

-^—Контроль без воздействий —А—Тилорон-мазь -А-Мазеобразующая основа —'Тилорон-обкалывание -©-Физиологический раствор -И-Тилорон зондом в желудок -В-Вода зондом в желудок

Примечание: * - Р<0,05 (ANOVA - Duncan) Рисунок 4 - Динамика изменення площади поражения кожи в зависимости от путей введения тилорона Данные групп «Тилорон зондом в желудок» и «Вода зондом в желудок», получавших водный раствор тилорона и дистиллированную воду соответственно, были сходны с данными группы «Контроль без воздействия».

Проведенные исследования выявили достоверную терапевтическую эффективность тилорона в форме мази и парентерального раствора, в сравнении с интактными животными и контрольными группами, по^ авшими плацебо, при патологии кожи вызванной нарушением кровосьа^.. ния и иннервации. Более выраженный лечебный эффект имели аппликации мази тилоро-

на. Внутрижелудочное введение тилорона по сравнению с контрольной группой не продемонстрировало терапевтического эффекта.

Предыдущий этап исследования, на котором животным препарат вводился внутрижелудочно, не дал результатов отличимых от контрольных и интактных животных. Поэтому на следующем этапе исследования in vivo на модели индуцированных нейротрофических расстройств кожи тилорон вводился через трансабдоминальный катетер непосредственно в тонкий кишечник. В контрольной группе использовалась дистиллированная вода. У животных из контрольной группы, которым через катетер вводилась дистиллированная вода, повреждение кожи заживлялось на 7 неделе с момента возникновения. В то же время, у животных, получавших водный раствор тилорона, рост площади поражения прекращался к 4 дню с момента начала введения, и наблюдалось снижение площади поражения с полным излечением кожи на 18 день.

Проведенные исследования выявили достоверный терапевтический эффект водного раствора тилорона при трансабдоминальном введении в тонкий кишечник в сравнении с интактными животными и контрольными группами, получавшими плацебо, при экспериментальной патологии кожи. Вероятно, это можно объяснить отсутствием пресистемной элиминации в желудке, вызывающей изменение степени ионизации лекарств и их деструкцию.

Исследование терапевтической активности тилорона в комбинации с перфтораном при патологии кожи. Эффекты совместного применения тилорона с перфтораном изучены на экспериментальных моделях патологии кожи, вызванной нарушением иннервации и кровоснабжения (рис.5). При аппликациях мази тилорона выздоровление наступало на 14 день, при подкожном обкалывании тилороном зоны поражения выздоровление происходило на 18 день, при сочетании внутримышечного и подкожного введения перфторана патологический процесс завершался на 12 день, комбинация мази тилорона и парентерального введения перфторана приводило к излечению на 8-9 день. Во всех контрольных группах спонтанное выздоровление наступало к 40-42 дню с исходом в дистрофически изменённую кожу.

Дни

—♦—интактные -»—мазь-тилорон

-В-мазь-контроль —й—обкалывание тилорон

-©-обкалывание перфторан -д-обкалывание-контроль —©-перфторан+мазь

Примечание: # - Р<0,05 (ANOVA - Duncan) Рисунок 5 - Данные по срокам заживления кожи при совместном применении тилорона и перфторана

Таким образом, проведенное исследование продемонстрировало, что совместное применение мази тилорона и парентерального введения перфторана существенно сокращало сроки излечения по сравнению с монотерапией тилороном на экспериментальной модели патологии кожи.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Максимальная толерантная доза тнлорона при однократном внутримышечном введении 90 мг/кг. Максимальная толерантная доза тилорона при однократном подкожном введении 150 мг/кг. Максимальная толерантная доза тилорона при ректальном введении 400 мг/кг. Величина ЛД50 тилорона при внутримышечном введении составила 180 мг/кг, при подкожном введении 300 мг/кг, при ректальном введении 800 мг/кг. Исходя из полученной величины ЛД50 в соответствии с международной системой классификации токсичности веществ GHS тилорон при внутримышечном, подкожном и ректальном введении относится к 3 категории токсичности.

2. Разработанные методики моделирования простого химического контактного дерматита на мышах CD-I путем кожных аппликаций водных растворов формальдегида и патологических изменений кожи ступни задних лап у крыс SD при перерезке большеберцового нерва и перевязке подколенной артерии позволяют создавать модели патологии, пригодные для изучения ранозажив-ляющих эффектов как физических агентов, так и фармакологических веществ при проведении неклинических испытании.

3. На экспериментальной модели ожоговой раны у крыс SD не выявлено достоверного ранозаживляющего действия инъекционной и пероральной форм тилорона.

4. Исследование, проведенное на мышах серии CD-I, не выявило терапевтической эффективности мази тилорона при экспериментальном простом контактном дерматите.

5. При внутрижелудочном введение тилорона крысам серии SD не получено достоверного терапевтического эффекта на модели патологии кожи вызванной нарушением иннервации и кровоснабжения по сравнению с контрольной группой.

6. Выявлен достоверный терапевтический эффект тилорона в форме мази и парентерального раствора при патологии кожи у крыс серии SD, вызванной денервацией и нарушением кровоснабжения. Более выраженную эффективность имели аппликации мази тилорона.

7. Разработана оригинальная методика трансабдоминальной катетеризации тонкого кишечника крыс для курсового введения лекарственных средств. Предложенная методика трансабдоминальной катетеризации тонкого кишечника может быть использована в практике физиологических исследований и неклинического испытания энтеральных лекарственных средств.

8. Проведенные исследования выявили достоверный терапевтический эффект водного раствора тилорона при трансабдоминальном введении в тонкий кишечник в сравнении с интактными животными и контрольными группами, получавшими плацебо, при патологии кожи у крыс серии SD вызванной де-нервацией и нарушением кровоснабжения. Полученные результаты являются теоретическим обоснованием разработки кишечнорастворимых (защищенных) пероральных лекарственных форм тилорона. Можно предположить увеличение эффективности защищенных пероральных форм тилорона и при других патологических состояниях.

9. При совместном применении перифокального подкожного обкалывания перфтораном с аппликациями мази тилорона на экспериментальной модели патологии кожи при нарушении кровоснабжения и иннервации у крыс серии SD получено статистически достоверное сокращение сроков излечения по сравнению с монотерапией тилороном в виде мази и парентерального раствора.

Список публикаций по теме диссертации

1. Пат. RU 2423971 Российская Федерация, С1. Способ ускорения заживления кожных повреждений, вызванных денервацией и нарушением кровоснабжения/ Д.А. Бондаренко [и др.]. (РФ). -№2010122024/15; заявл. 01.06.2010.

2. Определение острой токсичности тилорона при ректальном введении (1 этап исследования) / Д.А. Бондаренко [и др.] // Клинич. фармакология и терапия - 2009. - №6 (доп.) - С. 256-257.

3. Моделирование патологических состояний кожи у крыс и мышей / Д.А. Бондаренко [и др.] // Цитокины и воспаление. - 2010. - Т.9, № 4. - С. 28-31.

4. Бондаренко, Д.А. Исследование спонтанной двигательн' ивности мышей CD-I при различных способах введения препарата тилорон / Д.А. Бондаренко, И.А.Дьяченко // Клинич. фармакология и терапия - 2010. - Т.19., №6. -

С. 65-66.

5. Бондаренко, Д.А. Модель патологии кожи для доклинических испытаний препаратов / Д.А. Бондаренко // Биомедицина. - 2010. - №5. - С. 69-70.

6. Бондаренко, Д.А. Модель трофических изменений кожи для эксперимент тального изучения лекарственных средств / Д.А. Бондаренко // Наука и современность -2010: сб. материалов 3 Междунар. науч.-пракг. конф. 5 июня 2010 г. - Новосибирск: НГТУ, 2010. - 4.2. - С. 227-230.

7. Бондаренко, Д.А. Современные методы надлежащей лабораторной практики в доклинических исследованиях лекарственных средств / Д.А. Бондаренко II Экология и здоровье: сб. науч. тр. - Ессентуки: Федерация ЮНЕСКО России, 2008.-Вып. 12. - С. 187-190.

8. Бондаренко, Д.А. Исследование терапевтического эффекта тилорона при различных способах введения при патологии кожи / Д.А. Бондаренко // Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине: сб. тр. 1 Междунар. науч.-пракг. конф. 23-26 нояб. 2010 г. - СПб.: Изд-во Политехи, ун-та, 2010.-Т.2. - С. 18-19.

9. Бондаренко, Д.А. Терапевтическая активность тилорона при различных способах введения при патологии кожи / Д.А. Бондаренко // Экология и медицина: современное состояние, проблемы и перспективы: материалы Междунар. науч.-практ. конф. 2-3 нояб. 2010 г. -М., 2010. - С. 52-54.

10. Бондаренко, Д.А. Модели патологических состояний кожи у крыс и мышей / Д.А. Бондаренко // Биология - наука XXI века: тез. докл. 14 Междунар. Пущинской школы-конф. молодых учёных 19-23 апр. 2010 г. - Пущино: ПНЦ РАН, 2010. -Т.1. - С. 106-107.

11. Бондаренко, Д.А. Модели создания патологических состояний кожи у крыс и мышей / Д.А. Бондаренко; под ред. И.А. Алешковского [и др.] // JIO-МОНОСОВ-2010: материалы Междунар. молодежного науч. форума [Электронный ресурс]. — М.: МАКС Пресс, 2010. — 1 электрон, опт. диск (CD-ROM); 12 см.

Автор выражает искреннюю признательность и благодарность:

> заведующему терапевтическим отделением №2 «МУЗ Городская больница №2» г.Пятигорска, A.A. Бондаренко;

> научному сотруднику Филиала Учреждения Российской Академии Наук Института биоорганической химии им. Академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова,

Д.И. Скобцову за консультативную помощь при выполнении работы и обсуждении полученных результатов.

БОНДАРЕНКО ДМИТРИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

Фармакологическое исследование тилорона в эксперименте

14.03.06 - Фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати «23» августа 2011 г., формат 60 х 84 1/16 Бумага книжно-журнальная. Печать - ротапринтная. Усл. печат. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ № 723

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ПЯТИГОРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (357532, Г ПЯТИГОРСК, ПР. КАЛИНИНА, И)

Актуальность проблемы

На рубеже XX и XXI веков регистрируется прогрессивный рост заболеваемости дерматозами, что делает актуальным разработку новых методов их лечения. Дерматозы - собирательное обозначение, объединяющее различные врождённые и приобретённые патологические состояния кожи, обусловленные как экзогенными, так и эндогенными причинами. В современной' литературе описано около 2000 дерматозов. В зависимости от нозологической формы изменения кожи могут иметь локальный или распространенный характер; протекать остро либо хронически с рецидивирующим или непрерывно прогрессирующим течением [3]. Особенно быстрый рост распространенности дерматозов регистрируется в индустриально развитых странах. Болезни кожи и подкожной клетчатки, по данным Федеральной службы государственной статистики, занимают в Российской Федерации третье место по количеству диагнозов, установленных впервые в жизни. По результатам зарубежных исследований, 10% первичных обращений к врачам общей практики обусловлены дерматологическими заболеваниями. В США каждый тринадцатый пациент посещает врача в связи с кожными заболеваниями [95]. Причём в структуре кожной патологии отмечается тенденция к значительному удельному росту хронических дерматозов. По литературным данным в 4867% течение дерматологических заболеваний носит хронический характер с фазами обострений или персистирующую подострую форму [34]. Тенденция к хронизации и торпидности течения заболеваний объясняется появлением новых этиологических факторов и снижением иммунологического статуса в популяции [2].

В клинической практике врачи часто сталкиваются с контактной гиперчувствительностью кожи, которая проявляется в виде воспаления, возникающего после непосредственного воздействия на кожу различных экзогенных химических веществ: дерматотоксичностью обладают многочисленные химические вещества, применяемые на производстве, в сельском хозяйстве, быту, фармацевтике. Контактный дерматит встречается у 10% населения, т.е 650 млн. людей. Показатель заболеваемости контактным дерматитом в разных странах варьирует в зависимости от степени индустриализации и воздействия различных химических факторов' [95]. Одним из клинических проявлений сосудистой и неврологической патологии являются ишемические и нейротрофические расстройства кожи преимущественно- нижних конечностей. Рост сосудистых и неврологических заболеваний в промышленно развитых странах в последнее время принимает характер пандемии, приобретая в связи с этим особо актуальную медицинскую и социальную роль. Хроническими облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей страдает около 2-3% населения планеты. В США и Западной Европе данный диагноз установлен у 6,3 млн. лиц. При этом* действительное число данных больных 18,5 млн.(9,5% населения старше 50 лет). У большого количества этих больных возникают трофические нарушения кожи [110].

Примерно в половине случаев, при первом обращении больного по поводу диабета, у него уже имеются признаки трофических изменений нижних конечностей. При длительно существующем сахарном диабете почти у 80% лиц наблюдаются различные дерматозы, связанные с нарушением обмена веществ, снижением защитной функции кожи и нарушением микроциркуляции. В настоящее время в мире насчитывается более 150 миллионов больных сахарным диабетом. При сахарном диабете 2 типа поражение артерий нижних конечностей встречается в 3-5 раз чаще; чем у людей без сахарного диабета. Течение атеросклероза при сахарном диабете гораздо агрессивнее, частота критической ишемии нижних конечностей значительно выше, чем в остальной популяции. Поражение сосудов при сахарном диабете делится на макроангиопатию (артерии) и микроангиопатию (капилляры и артериолы). Снижение движения крови в микрососудистом русле на фоне поражения, как магистральных артерий, так и капилляров, приводит к развитию некроза участков тканей кожи стопы. Трофические нарушения кожи голеней и стоп при сахарном диабете возникают как в результате диабетических ангиопатий, так и вследствие поражения нервов — диабетической полинейропатии. Одновременное наличие патологии сосудов, диабетического поражения нервов, трофических расстройств стопы обусловили появление специфического термина - "диабетическая стопа". Усугубляет этот процесс снижение иммунитета и присоединяющаяся инфекция. По данным Американской «Диабетической Ассоциации различные* формы диабетической стопы развиваются у 70% больных диабетом [Л 08].

За*, последнее время( для, решения проблемы дерматозов предложено много новых высокоэффективных препаратов, существенно повысивших лечебные возможности врача, однако в ряде клинических форм отмечается резистентность к проводимой терапии [34].

Увеличение числа больных, их социальная дезадаптация придают особую научно — практическую и социальную значимость-вопросам лечения дерматозов. Это диктует необходимость постоянного поиска новых препаратов, применение которых позволит повысить качество терапии. В современной клинической практике существенно возросли требования к качеству лекарственных препаратов, используемых в терапии дерматозов: Они должны активно воздействовать на этиологию и патогенез заболевания, хорошо переноситься, иметь высокий профиль безопасности, обладать длительным действием, не требующим'многократного применения, и не ограничивать .социальную и профессиональную активность пациента и, как следствиеэтого, существенно улучшать качество жизни [37]. При этом неотъемлемой частью комплексного лечения дерматозов, а иногда и наиболее важным направлением является наружная терапия. Топические препараты, непосредственно воздействуя на очаг поражения, эффективно дополняют системное лечение. При наружном нанесении достигается максимально интенсивное влияние на патологический очаг, с незначительными системными проявлениями, а, следовательно, минимальными побочными действиями [93].

Цель исследования:

Изучение противовоспалительной и репаративной активности тилорона при различных путях введения на экспериментальных моделях патологии кожи.

Основные задачи исследования:

1. Провести исследования по определению ЛД50 и категории токсичности тилорона в соответствии с международной системой классификации токсичности веществ GHS (Globally Harmonised Integrated Classification System for Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures: Acute toxicity hazard categories) [117].

2. Разработать экспериментальные модели химически индуцированного облигатными раздражителями простого контактного дерматита и нейротро-фических изменений кожи.

3. Провести исследование противовоспалительного и репаративного эффекта тилорона при различных путях введения на экспериментальных моделях патологии кожи.

4. Определить эффективность комбинации тилорона с перифокальным подкожным обкалыванием перфтораном на экспериментальных моделях па--тологии кожи.

5. На основании полученных данных сформулировать рекомендации по клиническому применению тилорона при патологии кожи.

Научная новизна

Ввиду отсутствия литературных данных впервые определены ЛД50 и категория токсичности тилорона при ректальном, подкожном и внутримышечном введении по международной системе классификации токсичности веществ GHS соответствующие 3 категории токсичности. Разработаны новые экспериментальные модели простого контактного дерматита и патологических изменений кожи при денервации и нарушении кровоснабжения, которые могут быть рекомендованы для неклинических исследований лекарственных препаратов. Разработана оригинальная методика трансабдоминальной катетеризации тонкого кишечника для длительного энтерального введения исследуемых веществ. Проведено исследование противовоспалительного и репаративного эффекта тилорона при различных путях введения в виде монотерапии и в комбинации с подкожным перифокальным обкалыванием перфтораном на экспериментальных моделях патологии кожи.

Впервые доказана терапевтическая 'эффективность тилорона при наружном, подкожном и тонкокишечном введении в* виде монотерапии и в комбинации с перфтораном на экспериментальной, модели* патологии кожи, вызванной нарушением иннервации и кровоснабжения:

Научно-практическая значимость исследования

Выполненное исследование по изучению эффективности различных лекарственных форм тилорона на экспериментальной модели патологии кожи вызванной нарушением кровоснабжения и иннервации является обоснованием целесообразности проведения их клинических испытаний. Разработанные экспериментальные модели простого химического контактного дерматита, патологических изменений кожи при локальном нарушении артериального кровотока,и иннервации пригодны для изучения ранозаживляющих эффектов, как физических агентов, так и фармакологических веществ. Разработанная методика трансабдоминальной катетеризации тонкого кишечника может быть использована в практике физиологических исследований и неклинического испытания энтеральных лекарственных средств. Полученные данные о синергизме терапевтического эффекта комбинации тилорона с перифокальным подкожным обкалыванием перфтораном при патологии кожи могут служить основанием для дальнейших клинических исследований. Выявленный достоверный терапевтический эффект трансабдоминального введения тилорона в тонкий кишечник, является обоснованием разработки ки-шечнорастворимых (защищенных) пероральных лекарственных форм тилорона. Можно предположить увеличение эффективности защищенных пероральных форм тилорона и при других патологических состояниях. Доказана неэффективность мази тилорона при экспериментальном простом контактном дерматите и пероральных и инъекционных форм тилорона при ожоговой ране.

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты проведённых исследований включены в план НИР кафедры биологии, физиологии и патологии, биохимии и микробиологии* ПятГ-ФА (акты об'использовании результатов НИР, составленные на основе информационного письма «Фармакологическое исследование тилорона в эксперименте» от 20 апреля 2011 года). Основные положения, выносимые на защиту:

1. ЛД50 тилорона при однократном внутримышечном введении является1 180 мг/кг, при однократном подкожном введении 300 мг/кг, при ректальном введении 800 мг/кг. Тилорон при ректальном, подкожном и внутримышечном введении относится к 3 категории токсичности в соответствии с международной системой классификации токсичности веществ GHS.

2. Разработанные экспериментальные модели простого контактного дерматита, патологии кожи при нарушении артериального кровотока^ и иннервации, трансабдоминального дуоденального катетера могут быть рекомендованы для физиологических и неклинических исследований.

3. Тилорон при наружном, подкожном и дуоденальном введенииюказыва-ет выраженное противовоспалительное и репаративное действие на экспериментальной модели патологии кожи, вызванной нарушением кровоснабжения и иннервации.

4. Доказана неэффективность мази тилорона при экспериментальном простом контактном дерматите, пероральных и инъекционных форм тилорона при ожоговой ране, внутрижелудочного введения водного раствора тилорона при патологии кожи вызванной денервацией и нарушением кровоснабжения.

5. Выявленный достоверный терапевтический эффект трансабдоминального введения тилорона в тонкий кишечник, при экспериментальной патологии кожи, служит обоснованием разработки кишечнорастворимых (защищенных) пероральных лекарственных форм тилорона.

6. Выявлен синергизм при комбинированном использовании тилорона и перфторана при патологии кожи.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук

Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ Пятигорской государственной фармацевтической академии, в филиале Учреждения Российской Академии Наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (ФИБХ) и Пущинском Государственном Университете (Пущ-ГУ).

Апробация работы и публикации результатов исследования

Материалы диссертации доложены на Второй научно-практической конференции с международным участием «Достижения клинической фармакологии в России» (Москва, 2009 г.), 14-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, ' • 2010 г.), XVII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2010 г.), II Конгрессе Международного общества клинических фармакологов и фармацевтов стран СНГ (Москва, 2010 г.), Конференции "Информация о лекарственных средствах - качественному использованию лекарств" (Казань, 2010 г.).

По результатам исследования опубликовано 10 работ, в том числе 4 в изданиях рекомендуемых ВАК, также планируется публикация в 2011 году статьи «Исследование терапевтической активности тилорона в различных формах» в рекомендованном ВАК журнале «Цитокины и воспаление».

По результатам исследования получен патент, регистрационный № 2423971 «Способ ускорения заживления кожных повреждений, вызванных денервацией и нарушением кровоснабжения». Авторы Бондаренко Д.А., Му-рашев А.Н., Межбурд Е.В.Опубликован 20.07.2011 года. Объём и структура работы

ВЫВОДЫ

1. Максимальная толерантная доза тилорона при« однократном внутримышечном введении 90 мг/кг. Максимальная толерантная.доза тилоро-на при однократном подкожном? введении 150 мг/кг. Максимальная толерантная доза тилорона при ректальном введении 400 мг/кг. Величина ЛД50 тилорона при внутримышечном введении составила 180мг/кг, при подкожном введении ЗООмг/кг, при ректальном введении; 800мг/кг. Исходя из полученной величины. ЛД50 в: соответствии, с: международной: системой классификации токсичности; веществ ОНБ тилорон при внут-' римышечиом. подкожном и ректальном введении относится к 3 категории токсичности.

2. Разработанные методики моделирования, простого химического контактного дерматита на мышах СБ-1 путем кожных аппликаций; водных растворов формальдегида и патологических изменений кожи > ступни задних лап у крыс ББ при перерезке бол ьшеберцового нерва и перевязке подколенной' артерии позволяют создавать модели патологии пригодные для изучения ранозаживляющих эффектов, как физических агентов, так: ш фармакологических веществ при проведении неклинических испытаний.

3. На экспериментальной модели ожоговой раны у крыс БВ не выявлено достоверного ранозаживляющего действия инъекционной: и перораль-ной форм тилорона.

4. Исследование, проведенное на мышах стока СО-1, не выявило терапевтической эффективности мази тилорона при экспериментальном простом контактном дерматите.

5. При внутрижелудочном введение тилорона крысам стока БЕ): не получено достоверного терапевтического эффекта на модели патологии кожи вызванной; нарушением кровоснабжения и иннервации у крыс стока по сравнению с контрольной группой.

6. Выявлен достоверный терапевтический эффект тилорона в форме мази и парентерального раствора на модели патологии кожи вызванной нарушением кровоснабжения и иннервации у крыс стока ЭБ. Более выраженную эффективность имели аппликации мази тилорона.

7. Разработана оригинальная методика трансабдоминальной катетеризации двенадцатиперстной кишки крыс для курсового введения лекарственных средств. Предложенная методика трансабдоминальной катетеризации тонкого кишечника может быть использована в практике физиологических исследований и неклинического испытания энтеральных лекарственных средств.

8. Проведенные исследования выявили достоверный терапевтический. эффект водного раствора тилорона при трансабдоминальном введении в двенадцатиперстную кишку в сравнении с интактными животными и контрольными группами, получавшими плацебо, при патологии кожи вызванной денервацией и нарушением кровообращения у крыс серии БР. Полученные результаты являются теоретическим обоснованием разработки кишечнорастворимых (защищенных) пероральных лекарственных форм тилорона. Можно предположить увеличение эффективности защищенных пероральных форм тилорона и при других патологических состояниях.

9. При совместном применении перифокального подкожного обкалывания перфтораном с аппликациями мази тилорона на экспериментальной модели патологии кожи у крыс стока 80 получено статистически достоверное сокращение сроков излечения по сравнению с монотерапией тилороном в виде мази и парентерального раствора.

На основании проведенных исследований можно рекомендовать:

1. Проведение клинических исследований мази тилорона и парентеральной формы тилорона при нарушении иннервации и кровоснабжения кожи.

2. Разработку кишечнорастворимых (защищенных) лекарственных форм тилорона для перорального применения с целью повышения его биодоступности.

3. Клиническое испытание комбинированного применения мази тилорона и перифокального парентерального введения перфторана при патологии кожи.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенного исследования было установлено, что максимальной толерантной дозой испытуемого объекта тилорон при однократном внутримышечном введении является доза 90 мг/кг, при однократном подкожном введении испытуемого объекта тилорон максимальная толерантная дозировка 150 мг/кг, величина максимальной толерантной дозы испытуемого объекта тилорон при ректальном введении составляет 400 мг/кг. Величина ЛД50 тилорона при внутримышечном введении составила 180мг/кг, при подкожном введении ЗООмг/кг, при ректальном введении 800 мг/кг. Ак-тометрические исследования, проведенные с целью объективизации эффектов тилорона на психомоторное поведение животных, показали, что при внутримышечном введении отмечалось дозозависимое угнетение поведения и снижение спонтанной (горизонтальной) двигательной активности с последующим их восстановлением на следующие сутки. Не имелось достоверных отличий между контрольными и подопытными группами в динамике поведения и двигательной активности при подкожном и ректальном введении тилорона, оцениваемых по тесту в ОП.

Исходя из полученной величины ЛД5о в соответствии с международной системой классификации токсичности веществ GHS (Globally Harmonised Integrated Classification System for Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures: Acute toxicity hazard categories) тилорон при внутримышечном, подкожном и ректальном введении можно отнести к 3 категории токсичности.

ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМ ТИЛОРОНА НА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МОДЕЛЯХ ПАТОЛОГИИ КОЖИ

4.1. ИССЛЕДОВАНИЕ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ТИЛОРОНА НА МОДЕЛИ ОЖОГОВОЙ РАНЫ

Одной из задач хирургов и травматологов является поиск и применение новых методов и подходов в лечении-и восстановлении повреждений кожных покровов различной этиологии в целях ускорения репаративных процессов, что в итоге будет способствовать скорейшему выздоровлению пострадавших. Тилорон обладает иммуномодулирующим, противовоспалительным, бактерицидным действием и таким образом, возможно, может стимулировать регенераторные процессы в целом, укорачивая сроки эпителизации-раны. Учитывая выше изложенное, можно понять, что актуальность данного исследования, несомненно, имеет место. Биологическая активность тестируемого препарата по стимуляции регенераторных процессов в области повреждения тканей, исследовалась на модели ожоговой раны у крыс в сравнении с контрольными животными, аналогичные раны которых обрабатывались физиологическим раствором5. Предполагаемый эффект тестируемого препарата определялся по выбранным критериям, характеризующим репаративный процесс в> целом и в сравнении с течением репарации раны у животных из контрольной группы. В" качестве основных критериев оценки течения процесса заживления раны использовались сроки заживления раны, площадь раны в выбранные временные точки.

Цель исследования — сравнительный анализ ранозаживляющей активности субстанции тилорон при введении зондом в желудок и при подкожном введении вокруг раневой поверхности на экспериментальной модели ожога у крыс 8Б.

4.1.1. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ЖИВОТНЫЕ

Исследования были выполнены на 48 аутбредных белых половозрелых самцах крыс стока БО массой 300-350 грамм. К началу введения веществ | возраст животных составлял 11-12 недель. Прибывшие животные до начала исследования были помещены в отдельную комнату содержания на период адаптации при групповом содержании в клетках. Во время этого периода у животных контролировали проявление признаков отклонения в состоянии здоровья. Животных распределяли по группам, используя в качестве критерия массу тела. Начальная средняя масса тела была одинаковой в каждой группе, и индивидуальная масса животных не отличалась более чем на 10% от средней массы животных одного пола (табл.16).