Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Фармакологические свойства нового антиоксидантного комплекса на основе природных флавоноидов

ОВЧИННИКОВА ОЛЬГА ЮРЬЕВНА

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НОВОГО АНТИОКСИДАНТНОГО КОМПЛЕКСА НА ОСНОВЕ ПРИРОДНЫХ ФЛАВОНОИДОВ

14.03.06 -фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Волгоград 2010

004601031

004601031

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, доцент

Косолапов Вадим Анатольевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Хоронько Владимир Владиленович доктор биологических наук, Перфилова Валентина Николаевна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Саратовский Государственный Меди-

цинский Университет им. В.И. Разумовского Росздрава»

Защита диссертации состоится «_»_2010 г. в_часоз на заседании диссертационного совета Д 208.069.02 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава» (4000131, г. Волгоград, пл. павших борцов, 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава » (4000131, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1.

Автореферат разослан «_»_2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор медицинских наук, профессор

А. Р. Бабаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Многие распространенные болезни и осложнения связаны с дефицитом в организме человека эндогенных антиоксидантов - веществ, препятствующих накоплению избыточного количества свободных радикалов [Harman, 2006; Аниси-мов, 2008]. Дисбаланс показателей антиоксидантной и прооксидантной систем, приводит к нарушению регуляций клеточного гомеостаза, что индуцирует, в частности, процесс преждевременного старения [Зенков и соавт., 2001; Хавинсои и соавт., 2003; Дубинина, 2006], способствует развитию различных заболеваний. Для старения характерным является определенный "спектр" патологий: атеросклероз [Климов, Никульчева, 2001; Ланкин, 2004]; сердечно-сосудистые заболевания [Коган, 2002; Мирозоян, 2003; Ка-пелько, 2009]; дисфункции мозга [Плотников, 2000; Дамулин, 2009], сахарный диабет [Дедов, 2003; Балаболкин, Клебанова, 2004; Bloomgarden, 2006] и др. В основе этих нарушений лежат процессы каскадной, свободно-радикальной окислительной модификации липидов, белков и ДНК [Подколзин, 2000; Владимиров, 2006; Slemmer, 2008].

Другим фактором, усугубляющим процессы старения, по мнению ряда ученых является чрезмерное употребление алкогольных напитков [Molina, Brooke, 2007; Сиволап, Савченко, 2008]. Алкоголь нарушает течение всех биохимических реакций организма, а это в свою очередь ведет к изменениям в структуре и работе всех органов [Тю-ренков, 2002; Нужный, 2006]. Токсическое влияние алкоголя на организм многообразно, однако одним из основных его проявлений является цепь нарушений, связанных со свободно-радикальным (СРО) и перекисным окислением липидов (ПОЛ) биомембран.

Антиоксидантные средства способны регулировать процессы свободнорадикаль-ного окисления, создавая оптимальные условия для нормального метаболизма и функционирования клеток и тканей в условиях окислительного стресса. Перспективным является создание комплексов веществ с антиоксидантыми свойствами [Сторожок, 2002; Pryor et al., 2006], имеющих широкий спектр антиоксидантных эффектов и ряд преимуществ перед монопрепаратами, в частности с целью геро- и алкогольпротекции.

При создании комплексов с антиоксидантой направленностью важно соблюдать сбалансированность состава, включая в него компоненты, действующие как в липидной, так и в водной фазах, влияющие как на процессы липопероксидации, так и на радикало-образование [Отвитый, Шуленин, 2005]. Основой таких компонентов могут стать био-антиоксиданты (БАО), как наиболее безопасные вещества.

3

На основании вышеперечисленного и опираясь на ранее опубликованные работы [Овчинникова, 2005], была спланирована дальнейшая работа по расширенному изучению фармакологических свойств антиоксидантного комплекса, состоящего из экстракта гребней винограда, токоферола, ретинола, аскорбиновой кислоты, глутатиона, экстракта корня солодки, янтарной кислоты, а также микроэлементов селена, магния и цинка, и возможности его использования для коррекции окислительно-восстановительных процессов, стабилизации метаболических изменений и уменьшения различных патологических процессов.

Диссертационная работа выполнена в рамках Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения» (№ ГР 01. 2001 16045), является составной частью научно-исследовательской программы «Поиск, разработка и фармакологическое изучение веществ, проявляющих антиоксидантные свойства» (№ ГР 01. 2006 09439), включенной в план НИР Волгоградского государственного медицинского университета. Тема работы утверждена на заседании Учёного Совета Волгоградского государственного медицинского университета (протокол № 9 от 12.10.2005 г.).

Целью исследования является изучение действия нового антиоксидантного комплекса на основе флавоноидов у крыс с дефицитом эндогенных антиоксидантов и интоксикацией алкоголем, определение его нейротропной активности и токсических свойств.

Для достижения указанной цели представляется необходимым решение следующих задач:

1. Исследовать антиоксидантную активность нового комплекса in vitro с детализацией спектра антирадикальных воздействий;

2. Изучить влияние комплекса на поведенческую активность, систему гемореологии и свертывания крови и показатели атерогенеза у крыс с экспериментальным дефицитом эндогенных антиоксидантов;

3. Детализировать механизмы влияния комплекса на показатели экспериментального дефицита эндогенных антиоксидантов по изменению морфологических показателей и параметров перекисного окисления липидов;

4. Установить действие комплекса на выживаемость крыс при острой алкогольной интоксикации и показатели выраженности и динамики наркотического действия этанола;

5. Изучить влияние нового комплекса на основные медиаторные системы мозга с определением возможного спектра кейротропной активности;

6. Исследовать показатели острой токсичности разработанного комплекса.

Научная новизна. Впервые были получены сведения о влиянии нового комплексного вещества на показатели перекисного окисления липидов и свободно-радикальных процессов in vitro. Впервые были получены данные об активности нового комплекса при экспериментальном дефиците эндогенных антиоксидантов по влиянию на поведенческие реакции, функции памяти, реологические функции крови, обмен липидов, а также изучены механизмы этих эффектов у крыс с дефицитом эндогенных антиоксидантов. Было установлено влияние нового антиоксидантного комплекса на выживаемость крыс при введении высоких доз этанола, а также выраженность и динамику наркотического действия этанола. Впервые были получены сведения об общей нейротропной активности данного комплекса и его токсических свойствах.

Научно-практическая значимость. Полученные данные свидетельствуют о целесообразности создания и использования натуральных антиоксидантиых комплексных веществ при свободно-радикальной патологии. Были получены данные о наличии у композиции на основе природных флавоноидов геропротективных эффектов по влиянию на индекс атерогенности липидов крови и улучшению ее реологических свойств, и установлены механизмы геропротекторного действия. Была экспериментально доказана возможность использования композиции с целью алкогольпротеи.ции при острой и хронической алкоголизации. Выявленные антиоксидантные, антирадикальные и другие сопряженные эффекты композиции на основе природных флавоноидов определяют перспективность проведения дальнейших фармакологических и токсикологических исследований комплекса с целью создания на его основе нового антиоксидантного средства.

Реализация результатов исследования. Выявленные фармакологические эффекты и их возможные механизмы учитываются в экспериментальной работе лаборатории фармакологии антиоксидантиых средств НИИ фармакологии Волгоградского государственного медицинского университета. Результаты работы используются в лекционных курсах на кафедрах фармакологии, фармацевтической химии, фармакологии и биофармации ФУВ Волгоградского государственного медицинского университета, кафедре фармакологии Ростовского государственного медицинского университета.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработанный комплекс обладает выраженной антиоксидантной активностью с широким спектром антиоксидантных эффектов;

2. Комплекс улучшает гемореологические и коагуляционные свойства крови, оказывает кардио- и эндотелиопротективное действие у крыс с экспериментальным дефицитом эндогенных антиоксидантов;

3. Новый антиоксидантный комплекс проявляет алкогольпротективные свойства при экспериментальной острой и хронической алкоголизации;

4. Разработанный комплекс относится к малотоксичным веществам (класс IV токсических веществ в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76).

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на X региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2005), на 64-ой открытой итоговой конференции молодых ученых и студентов ВолГМУ (Волгоград, 2006), на межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным ¡счастием (Саратов, 2006), на V научной конференции "Практикующий врач" (Римини, 2006), на II (XI Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции (Москва, 2007), на V конференции молодых ученных России «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ (из них одна в центральной печати).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 211 страницах машинописного текста, иллюстрирована 25 рисунками и 37 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (главы 2-7), обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 240 отечественных и 140 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Материалы. В качестве объекта изучения была выбрана композиция на основе натуральных флавоноидов экстракта гребней винограда (кверцетин, ругни, протцианидины, катехины и др.) и солодки (ликвиртин, изокверцетин, глицирризин и др.) [Корульуин, 2008] с включением антиоксидантов, витаминов и микроэлементов (Таблица I).

Выбор компонентов, входящих в состав комплекса, осуществлялся на основании их способности связывать свободные радикалы и замедлять окислительно-восстановительные процессы, восстанавливать естественные антикосиданные ферментативные системы, восполнять недостаток витаминов, обладающих антиоксидантной активностью и микроэлементов. Количественный состав композиции определялся, исходя из суточной потребности каждого компонента для человека.

Таблица 1 - Содержание компонентов в составе композиции.

№ Название компонента Масса, мг Спецификация Суточная норма для человека, мг*

1. Сухой экстракт гребней винограда 100 R6BSE-030822 100

2. Сухой экстракт солодкового корня 10 Рег.№ 72/334/14 100

3. Витамин Е 10 Рег.К: 71/945/35 10

4. Витамин А 5 Рег.№ 71/566/40 1

5. Аскорбиновая кислота 25 ФС 42-2668-95 70

6. Восстановленный глутатион 1,5 CAS 70-18-80 50

7. Натрия селенит 0,02 CAS 10102-18-8 0,07

8. Янтарная кислота 50 CAS 110-15-6 200

9. Цинка окись 5 Per. № 72/267ДО 15

* [Петров, Спасов, 2007]

Согласно руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ [Хабриев,2005], исследуемая композиция вводилась перо-рально в дозе 50 мг/кг, что соответствует 1/100 от LDS0 для данной композиции, а в исследованиях in vitro также в дозах 25 и 5 мг/л. Для сравнения в экспериментах in vitro использовали аскорбиновую кислоту (Chemapol, Чехия) в концентрации, в которой она входит в состав комплекса, т.е. 2,5 мг/л, а также 1,25 и 0,5 мг/л, а в опытах in vivo чистый экстракт гребней винограда в дозе 40 мг/кг.

Эксперименты проводились на 370 половозрелых нелинейных белых крысах обоего пола, массой 150 - 450 г. Все животные содержались в стандартных условиях вивария

кафедры фармакологии ВолГМУ с естественным световым режимом на полнорационной сбалансированной диете (ГОСТ Р 50258-92) с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997), а также правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 3 51000.396 и 51000.4-96). Все исследования были одобрены Комитетом по этической экспертизе испытаний ВолГМУ (протокол №10 от 28.03.09).

Методы исследования. Антиоксидантная (АО) активность комплекса на основе комплекса флавоноидов изучалась in vitro. Изучение антиоксидантных свойств проводили на модели аскорбат-индуцируемого перекисного окисления липидов (ПОЛ) [Панкин и др., 1975], где скорость перекисных процессов оценивали по накоплению продуктов ПОЛ в реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) (Fluka, Швейцария). Антиради-калъпая активность (АРА) изучалась по способности веществ инактивировать свободный стабильный радикал 2,2-дифенил-1-пикрил-гидразил (ДФПГ*) (Sigma, США) [Glavind, 1963]. Для изучения АО активность веществ также использовали метод Fe2t-индуцированной хемилюминееценции желточных липопротеидов (ЖЛП) [Фархутдинов, Лиховских, 1995]. Для исследования АРА соединений дополнительно применялся метод люминол-зависимой хемилюминееценции [Семешко, Фархутдинов, 2002], а также модель окисления 2,2'-азобис(2-метилпропионами;дин) дигидрохлорида (АБАП) (Fluka, Швейцария) [Клебанов и др. 2001]. Измерение хемилюминееценции проводилось на хе-милюминомере «ХЛ-003» (Уфа, Россия). Фиксировался суммарный показатель светимости, который выражался в условных единицах.

Исследования с экспериментальным дефицитом эндогенных антиоксидантов проводились на 90 старых крысах, массой 300-450 гр., возрастом на момент начала эксперимента 24 месяца, и 30 молодых, массой 150-230 г. возрастом 6 месяцев. Молодые животные получали стандартную диету AIN-76 (ICN Biomedicals, США) и дистиллированную воду. В группах старых крыс моделировали дефицит эндогенных антиоксидантов, для чего в течение Зх месяцев содержали животных на безантиоксидантной диете «Tocoferol defficient diet» (ICN Biomedicals, США). Старым крысам 3 месяца вводили изучаемую композицию (50 мг/кг 2 раза/день перорально) или чистый экстракт гребней винограда (40 мг/кг 2 раза/день перорально).

В конце 3-го месяца исследований у крыс прижизненно определяли концентрацию токоферола в сыворотке крови, взятой из подъязычной вены, затем животных умерщвляли согласно «Международным рекомендациям по проведению медико-биологических исследований с использованием животных». Предварительно из брюшной вены забиралась кровь для исследований. После этого проводили паталого-алатомическое вскрытие животных с оценкой состояния внутренних органов, в которых проводилось изучение перекисного окисления липидов и морфологические исследования. В крови оценивали реологические параметры, перекисное окисление липидов, а также показатели липидно-го обмена (уровень холестерина, триглицеридов и липопротешюв высокой плотности (ЛПВП)).

При определении влияния комплекса на функциональный статус крыс при ускоренном старении изучали реакцию свободного поведения крыс в тесте «открытое поле» {Буреш, Бурешова, 1991], спонтанную двигательную активность с помощью актометра («Ugo Basile», Италия) и влияние комплекса на мнестические функции по воспроизведению условной реакции пассивного избегания (УРПИ) [Буреш, Бурешова, 1991].

Изучение влияния комплекса на гемореологические свойства крови проводили по оценке вязкости крови [Добровольский, 1989] и плазмы [Муравьев и др., 1998], дефор-мабельности эритроцитов, показателей эритроцитарного гемолиза [Викулов и др., 2001] на анализаторе крови реологическом АКР-2 (МП «Комед» и НИИ физико-химической медицины, Россия). Оценку агрегации тромбоцитов, индуцированной 5мкм АДФ, проводили на двухкаиальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов (модель 220 LA, НПФ "Биола", Россия) по методу [Born, 1962] в модификации [Габбасов и др., 1989].

Изучение свертывающей системы крови проводили, на гемокоагулометре («SOLAR», Россия). Общую коагулящюнпую способность крови, оценивали по величине тромбинового времени (ТВ), активированного парциального тромбопластинового времени (АПТВ), протромбинового времени (ПТВ) и уровню в крови фибриногена (ФГ) с использованием наборов реактивов производства «Технология - стандарт» (Россия) и растворимых фибрин-мономерных комплексов [Баркаган, Момот, 1999].

Степень атерогенеза у старых животных определяли по содержанию триглицири-дов (ТР. общего холестерина (ХС) и липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) с использованием стандартных наборов (Biocon, Германия). На основании полученных дан-

ных с целью оценки степени нарушения липидного обмена рассчитывали содержание липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и индекс атерогенности (ИА).

Для изучения влияния комплекса на процессы перекисного окисления липидов и уровень антиоксидантов у старых крыс с дефицитом антиоксидантов определяли уровень вторичного продукта ПОЛ - малонового диальдегида (МДА) [Гаврилов и др., 1987]. Fe2+ - индуцированную хемилюминесцениию в плазме крови и гомогенатах тканей по методу [Фархутдинов, Лиховских, 1995]. Измерения проводили на хемилюмино-метре ХЛ-03 (Уфа, Россия). Оценивали активность глутатионпероксидазы по методу [Моин, 1986] с использованием дитионитробензойной кислоты (реактив Эллмана) (MP Biochemedicals, США). Концентрацию а-токоферола в сыворотке крови определяли по методу [Черняускене и соавт., 1984] флюориметрическим методом на спектрофлюори-метре MPF-3A (Hitachi, Япония).

Для анализа морфометрических показателей* производили забор миокарда, аорты, почек, ткани головного мозга, на роторном микротоме изготавливали срезы. Цифровой камерой Pixera (Австрия, 1,4 мегапикселей) на бгое микроскопа Micros (Австрия) производилась микрофотосъемка препаратов. Для количественного морфометрического изучения и подсчета показателей использовалась система компьютерного анализа цветового изображения «ВидеоТестМорфо-4» (Россия, СПб). Определялась оптическая плотность липофусцина в кардиомиоцитах, толщшш интимы аорты, объемная доля саркоплазмы кардиомиоцитов. Оценку степени дистрофических и некробиотических изменений нейронов головного мозга производили [Чубунидзе,1972] путем подсчета неизмененных, слабоизмененных, грубоизмененных и отсутствующих нейронов.

Изучение алкоголъпротективных свойств комплекса проводилось на 60 нелинейных крысах-самках массой 250 -300г. в соответствии с Методическими рекомендациями [Нужный, 2002 г]. Влияние композиции на выживаемость крыс при введении токсических доз этанола (10 г/кг) регистрировали по количеству летальных случаев. Для определения влияния композиции на выраженность и динамику наркотического действия этанола в дозе 4 г/кг оценивали реакцию свободного поведения в тесте "открытое поле"

* Выражаем благодарность коллективу кафедры патолог ической анатомии ВолГМУ за помощь в проведении исследований.

(ОП) (Буреш др, 1991], на максимальную выраженность наркотического действия этанола, которую оценивали в баллах, по специальной шкале, и на интегральную выраженность наркотического действия (сумма баллов за сутки) [Нужный, 2002].

Для изучения возможных центральных механизмов действия композиции на основе комплекса природных флавоноидов изучалось влияние на основные нейромедиаторы [Андреева, 2005]. Эксперименты проводились на 140 крысах - самках массой 250 -300г. Влияние на моноаминергические системы мозга изучалось в тестах с фенамином, апо-морфином. клофелином и 5-гидрокситриптофаном: холинергическое действие изучалось по изменению эффектов ареколина и никотина. Острую токсичность соединений изучали на 25 крысах-самцах и 25 крысах-самках массой 140-230г. при пероралыюм введении. Показатель LDjo рассчитывали по методу Личфилда-Вилкоксона [Беленький, 1959].

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ Statistics 6,0 (StatSoft, США) и Excel 2007 (MS Office 2007, США) с применением парного критерия Стьюдента (/), непараметрического критерия Манна-Уитни, критерия Шефе, точного метода Фишера [Реброва, 2006].

Результаты исследований и их обсуждение Для подтверждения антиоксидантной активности комплекса на первом этапе исследований нами были проведены эксперименты in vitro, основанные на ингибировании окисления различных субстратов с последующим определением продуктов окисления.

При изучении влияния комплекса на реакции аскорбат-зависимого ПОЛ было выявлено, что изучаемый комплекс в исследованном диапазоне концентраций оказывал дозозависимое ингибирующее влияние на образование продуктов перекисного окисления липидов. Процент ингибирования для композиции в дозе 50 мг/ кг составлял 62,4 % (р<0,001). Статистически значимый эффект наблюдался и при уменьшении терапевтической дозы в 2 раза, когда процент ингибирования равнялся 38,9 % (р<0,05). На реакциях железо (II) индуцированной хемилюминесценции липидов было установлено, что изучаемая композиция во всех представленных концентрациях препятствует ПОЛ, о чем свидетельствовало снижение суммарной светимости в дозе 50 мг/л на 85,13% (р<0,001), а в дозе 25 мг/л - на 65,15% (р<0,001). Аскорбиновая кислота в данной модели исследования во всех изучаемых концентрациях не показала выраженного антиоксидантого эффекта. По всей видимости, это объясняется тем, что механизм ее действия in vitro обусловлен антирадикальной активностью, а антиоксидантные свойства регистрируются in

vivo и связаны с восстановлением токоферол-радикала в активную форму, как было установлено [Halliwell, 1994].

При изучении взаимодействии композиции со стабильным радикалом ДФПГ. было установлено, что процент ингибирования композиции в дозе 50 мг/кг составил 99,2% для спиртового раствора и 88,6% для водного раствора комплекса флавонои-дов. При уменьшении терапевтической дозы антиоксидантного комплекса в 2 и 10 раз процент ингибирования также менялся, и для жирорастворимой фракции составил 98,8 % и 44,3 % соответственно. У водорастворимой фракции в концентрациях 25 мг/кг процент ингибирования равнялся 87,4 % а в дозе 5мг/л - 59,2%. Аскорбиновая кислота также показала достаточно выраженное антирадикальное действие, что в целом соответствует литературным данным о преимущественном антирадикальном действии аскорбата in vitro. Расчетная величина ИК50 для водорастворимой фракции равнялась 2,62 (R2 0,93), а для жирорастворимой фракции 6,12 (R2 0,92)

Влияние на люминол-зависимую ХЛ свидетельствует о способности композиции на основе комплекса флавоноидов в широком диапазоне доз ингибировать образование активных форм кислорода. (АФК). Максимальный эффект композиции проявлялся в дозе 50 мг/л, процент ингибирования в данной дозе составлял 83,86% (р<0,001). Аскорбиновая кислота в концентрации 2,5 мг/л оказала действие на 77,41% (р<0,001). Таким образом, влияние на люминол-зависимую ХЛ свидетельствует о способности композиции на основе комплекса природных флавоноидов в широком диапазоне доз ингибировать образование АФК. При этом изучаемый комплекс превосходит по эффективности отдельно взятую аскорбиновую кислоту

При оценке антирадикального действия веществ на первичные и вторичные радикалы было зарегистрировано увеличение длительности латентного периода ХЛ при АБАП-индуцированной ХЛ. Латентное время развития медленной вспышки в опытной группе в дозе 5 мг/л увеличилось больше чем в 4 раза, в дозе 25 мг/л - более чем в 7 раз, а в дозе равнялось 50 мг/л - более чем в 8,5 раз.

Комюзиция

-о - Аскорбиновая хи слота

водорасторимый пероксильный ROO" радикал

ДФПГ-жирораств.

ОН' + люминол-рад.

ДФПГ-водор аств.

липопероксильный LOO* радикал

Рис. 1. Спектр антиоксидантной активности композиции и аскорбиновой кислоты in vitro. По осям отложены - Lg ИК50

Таким образом, при изучении антиоксидантной активности комплекса на широком спектре моделей in vitro было показано, что исследуемая композиция проявляет выраженное антиоксидантное и антирадикальное действие (Рис.1).

При изучении влияния комплекса на морфо-функциональный статус крыс с экспериментальным дефицитом эндогенных антиоксидантов, в тесте «открытое поле» ь группе старых крыс на безантиоксидантной диете, к Зму месяцу исследований было показано достоверное уменьшение грумминга на 81,5%. У старых крыс, получавших изучаемую композицию и препарат сравнения, этого не происходило, а наметилась тенденция к увеличению на 54,5% и 91,7% соответственно, по отношению к исходным величинам. Остальные показатели в «открытом поле» колебались, но достоверных отличий выявлено не было. Та же тенденция прослеживалась и при исследованиях актометрии.

Время вхождения в темную камеру в тесте УРПИ достоверно не отличалось на момент обучения, хотя и было у старых животных несколько большим по сравнению с молодыми. При воспроизведении УРПИ можно отметить, что старые контрольные животные практически сразу забывали о выученном задании по сравнению с молодыми контрольными крысами, о чем свидетельствует незначительное увеличение латентного периода вхождения в темную камеру, за весь период исследований, по отношению к периоду обучения (Рис.2). Изучаемый комплекс способствовал большему увеличению латентного времени вхождения. Так максимальное увеличение на 239,1% (р<0,05), наблю-

далось через 60 дней по сравнению с началом обучения, что свидетельствует о способности композиции влиять на процессы памяти. По сравнению с чистым экстрактом гребней винограда достоверных различий получено не было.

| 900

О Конгрол|>(Молодые крысы)

ф

Я Старые крысы

й Старые крысы + Комплекс

□ Старые крысы + Экстракт гребней винограда

о с

Дни воспроизведения

Рис.2. Изменение памятного следа у экспериментальных крыс, получавших безантиоксидантную диету и композицию на основе комплекса природных флавоноидов (50 мг/кг 2 р/сутки) и экстракт гребней (40 мг/кг 2 р/сутки) в течение 3-х месяцев (М±т).

При исследовании гемореологического статуса у старых крыс, получавших изучаемый комплекс, при скорости сдвига 300с"1 происходило снижение вязкости крови на 6,58%. В группе крыс, получавших безантиоксидантую диету и препарат сравнения, при той же скорости наблюдалось снижение вязкости крови на 4,1% по сравнению со старым контролем.

Изучаемый комплекс оказывал значительное влияние на вязкость взвеси отмытых эритроцитов, определяющую степень их деформируемости. При скорости сдвига 300с"1 в группе старых крыс, не получавших комплекс., происходило статически значимое увеличение вязкости взвеси эритроцитов на 9,6% (р<0,05), а в группе старых леченых животных вязкость снижалась и достигала примерно тех же значений, что и в группе молодых контрольных крыс. Так же увеличение вязкости взвеси эритроцитов на 32,2% (р<0,05) в группе старых нелеченных животных по сравнению с молодым контролем наблюдалось и при скорости сдвига Зс"1. В группе крыс, получавших изучаемую композицию, при такой же скорости сдвига было зафиксировано снижение показателей на 22,7% (р<0,05), по сравнению со старой контрольной группой. При этом комплекс превышал эффекты чистого экстракта гребней винограда по данному виду активности, у которого отличия были статически не значимы по отношению к старому контролю.

Снижение средней скорости фильтрации взвеси эритроцитов у старых нелеченных животных носило достоверный характер и составило 23,3% (р<0,05) по сравнению с молодым контролем (Рис.3). Под воздействием изучаемой композиции происходило увеличение данного параметра на 25,4% (р<0,05) по сравнению со старым не леченым контролем. Препарат сравнения по данному показателю значительно уступал комплексу.

Немаловажным реологическим параметром является индекс доставки кислорода тканям (ИДК). Так у старых крыс, не получавших изучаемую композицию, отмечена тенденция к снижению данного параметра на 4,5%. Под влиянием изучаемого антиокси-дантного комплекса происходило восстановление данного показателя, при этом препарат сравнения практически не оказывал эффекта на ИДК.

Ещё одной гемореологической характеристикой является резистентность клеток крови к воздействию неблагоприятных факторов. Одним из методов, позволяющих определить изменение данного параметра, является изучение кислотной резистентность эритроцитов (КРЭ1. В результате, было обнаружено, что в группе старых контрольных крыс по сравнению с молодыми животными наблюдается тенденция к снижению КРЭ на 12,8%. Применение комплекса повышало КРЭ на 20,6%. Чистый экстракт гребней винограда, используемый в качестве сравнения, значительно уступал комплексу (11,9%), и отличия от старого контроля не являлись достоверными (Рис.3).

2 10

§ *

е- 5

1 о

ае

2 -5

-20 -25

IÜ1 ¡! ' 1 121

вп

:': идк

КРЭ Iii £ . _ _________

Ш Старые

И Старые + Комплекс

О Старые + Эктракт гребней вкноградя

*

СФЭ

Рис 3, Изменение (Д %) гемореологических параметров в крови экспериментальных крыс получавших безантиоксидантную диету и композицию на основе комплекса природных флавоноидов(50 мг/кг 2 р/суткн) и экстракт гребней (40 мг/кг 2 р/сутки) в течение 3-х месяцев (М±т). * - данные достоверны по отношению к Контролю, (р<0,05).** - данные достоверны по отношению к группе «Старые», (р<0,05).

Изучение влияния композиции на агрегацию тромбоцитов показало, что в группе старых нелеченных крыс происходило увеличение АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов в 6 раз (р<0,05) по сравнению с молодым контролем (Таблица 2), а в груп-

пе крыс, получавших изучаемый комплекс, агрегация снижалась на 74,3% (р<0,05) по сравнению со старыми контрольными крысами, что свидетельствует о снижении тром-богенпого потенциала, и как следствие уменьшение риска внутрисосудистого тромбо-образования.

Таблица 2 - Агрегация тромбоцитов молодых (контрольных) и старых крыс на безантиоксидантой диете, получавших композицию на основе комплекса природных флавоноидов (50 мг/кг 2 р/сутки) в течение 3-х месяцев (М±т).

Группы животных Агрегация тромбоцитов, индуцированная 5мкм АДФ (&%)

Контроль (Молодые крысы) 5,68 ±1,71

Старые крысы 34,08 ± 2,95* (+600%)

Старые крысы + Комплекс 8,75 ± 3,57* (+54,0%)

Примечание: * - р<0,05 по отношению к Контролю; в скобках дано изменение показателя по отношению к Контролю (Молодые).

При изучении антиатерогенных свойств композиции было установлено, что у старых крыс на безантиоксидантной диете происходило увеличение общего холестерина на 111,8% (р<0,05), и снижение содержание ЛПВП - 34,9% (р<0,05), что ведет к повышению показателя индекса атерогенности в 2,5 раза. В группе старых леченых композицей крыс индекс атерогенности в сравнении с группой старого контроля понижался на 81,9% (р<0,05), за счет снижения уровня ЛПНГ1 на 45,95% (р<0,05), с одновременным увеличением содержания ЛПВП на 34,6% (р<0,05). При этом изучаемый комплекс значительно превосходил по действию препарат сравнения (Рис. 4).

а Старые крысы

Я Старые крысы + Комплекс

ш Старые крысы + Экстракт гребней винограда

ЛПНП

ЛПВП

ИА

Рис.4. Изменение (Л %) параметров липидного обмена в крови экспериментальных крыс получавших безантиоксидантную диету и композицию на основе комплекса природных флавоноидов(50 мг/кг 2 р/сутки) и экстракт гребней (40 мг/кг 2 р/сутки) в течение 3-х месяцев (М±т). * - данные достоверны по отношению к Контролю, [ —критерий Стьюдента (р<0,05). **- данные достоверны по отношению к группе «Старые», X -критерий Стьюдента (р<0,05).

Таким образом, в ходе исследования было показано, что изучаемый комплекс, изменял показатели памяти, нормализовал гемореологические параметры и снижал степень атерогенеза у старых животных.

При изучении механизмов действия комплекса на крыс с дефицитом эндогенных антиоксидантов оценивали содержание в крови и гомогенатах тканей головного мозга и печении МДА и параметры Ре2+ - индуцированной хемилюминесценции. Было установлено, что в группе старых крыс, находящихся на безантиоксидантной диете, отмечалось статистически значимое увеличение уровня МДА в тканях и плазме крови по сравнению с молодыми контрольными животными. Наибольшие изменения были выявлены в печени, где уровень этого продукта достоверно повысился на 37,7% (р<0,05). Композиция на основе комплекса природных флованоидов снижала образование данного продукта ПОЛ. Наиболее выраженное снижение уровня МДА отмечалось в плазме крови, где его количество падало на 36,5% (р<0,05) ниже уровня в группе старых контрольных животных (Рис.4). В печени содержание МДА у старых крыс, получавших композицию, уменьшилось лишь на 13,4% по сравнению с группой старых нелеченных крыс. В ткани мозга исследуемая композиция также уменьшала уровень МДА, достоверно снижая его количество на 15,6% (р<0,05) по отношению к группе старых контрольных крыс. В группе крыс, получавших чистый экстракт гребней винограда в качестве сравнения, содержание МДА статистически значимо не отличалось от крыс получавших комплекс.

во

£ во с

| 40

а 20

г -го э

о

£ -« О

О -€0

В Старые крысы С Старые крысы +■ Комплекс

С; Ста рые крысы + Экстра кт гребней винограда

Плазма крови

Рис. 4. Изменение содержание малонового диальдегида в органах экспериментальных крыс (Д% к контролю), получавших безантиоксидантную диету и композицию на основе природных флавоноидов(50 мг/кг 2 р/сутки) и экстракт гребней (40 мг/кг 2 р/сутки) в течение 3-х месяцев (М±ш). * - р<0,05 по отношению к Контролю, **- р<0,05 по отношению к группе «Старые».

При изучении железо(Щ-индуцированной хемилюминесценции образцов плазмы и гомогенатов тканей было показано, что у старых крыс контрольной группы изменения

показателей хемилюминесценции свидетельствовали об усилении ПОЛ. Так, в плазме крови спонтанная светимость повышалась на 272,3% (р<0,05), в печени - на 26,4%, оставаясь неизменной в мозге. Показатель суммарной светимости 5 также повышался в плазме на 52% (р<0,05) и в печени на 38% (р<0,05), демонстрируя повышение способности липидов старых крыс к окислению (Рис.5). 13 мозге при этом отмечалась лишь тенденция к увеличению этого генерализованного показателя. Также в группе старых контрольных крыс отмечапась тенденция к увеличению накопления гидроперекисей липидов, о чем свидетельствовало увеличение амплитуды быстрой вспышки п в плазме. В свою очередь, композиция на основе растительных флавоноидов снижала спонтанную светимость в плазме на 47,8% , печени на 52,2% по сравнению со старыми контрольными животными. Суммарная светимость под влиянием композиции на основе комплекса природных флавоноидов в плазме также снижалась на 11,63% по отношению к старым контрольным крысам. При этом в печени отмечалась лишь тенденция к уменьшению суммарной светимости под влиянием композиции на 5,19% по отношению к группе старого контроля. Чистый экстракт гребней винограда по влиянию на показатели ХЛ немного уступал комплексу по эффективности, снижая показатели спонтанной светимости в плазме на 31,3%, я печени - 26,8%. Суммарная светимость в этой же группе уменьшилась в плазме на 6,2%, в печени на 1,9%

П Старые крысы

И Ста1ые крысы + Комплекс

О Старые крысы + Экстракт гребней винограда

Рис. 5. Изменение показателей Яе (И)- индуцированной \емилюминесценции плазмы крови экспериментальных крыс (Д %) находящихся на безантиоксидантной диете, получавших композицию на основе комплекса природных флавоноидов (50 мг/кг 2 р/сутки) в течение Зх месяцев Примечание: 8 - суммарная светимость, Ь - амплитуда быстрой вспышки. * - р<С,05 по отношению к Контролю.

Антиоксидантная система оценивалась го активности глутатионпероксидазы. а также по уровню одного из основных неферментативных антиоксидантов - а-

токоферола. Так в плазме старых контрольных крыс, находившихся на безантиокси-дантном рационе, происходило значимое снижение активности ГП на 68,4% по сравнению с молодой контрольной группой. У старых крыс, леченных в течение Зх месяцев композицией на основе комплекса природных флавоноидов, происходило восстановление активности ГГ1. Так в плазме этот показатель повысился на 304,6% (р < 0,05), в печени на 7,8% (р < 0,05), в мозге на 82,7% (р < 0,05) по отношению к нелеченным старым крысам. Препарат сравнения практически не влиял на данный показатель (Рис.6).

© Старые крысы

О Старые крысы + Комплекс

О Старые крысы + Экстракт гребней винограда

Плазма крови

Печень

Мозг

Рис.6. Изменение активности глутатионпероксидазы у экспериментальных крыс (Л %). * - р<0,05 по отношению к Контролю. **- р<0,05 по отношению к группе Старые.

При исследовании концентрации эндогенного токоферола в крови было установлено, что у старых нелеченных животных его количество в крови достоверно снижалось на 40,5% (р<0,05). Композиция на основе флавоноидов, повышала уровень эндогенного антиоксиданта по сравнению с контрольными старыми крысами на 79,1% (р<0,05), полностью нормализуя этот показатель. В группе крыс, получавших чистый экстракт 1реб-ней винограда, было зафиксировано восстановление уровня токоферола по сравнению с группой старых нелеченных крыс лишь на 29,4%.

При оценке изменения морфологических показателей при старении было зафиххи-ровано снижение объемной доли саркоплазмы кардиомиоцитов в группе старых нелеченных крыс на 8,8% (р<0,05), по сравнению с молодым контролем. При этом комплекс и препарат сравнения, статистически значимо увеличивали объемную долю саркоплазмы кардиомиоцитов на 14% и 18,5% (р<0,05), соответственно, по сравнению с контрольной группой старых животных и приводили к нормализации данных показателей.

щ,

*

** **

о Старые

О Старь|е + Комплекс С]] Старые* Экстракт гребней

Объемная доля саркоплазмы кардиомиоцитов

*

Толщина интимы аорты

Оптическая плотность липофусцина

Рис.7. Изменение (Д %) объемной доли саркоплазмы кардиомноцитов, толщина интимы аорты и оптической плотности липофусцина экспериментальных крыс в процентах по отношению к контролю. * -р<0,05 по отношению к Контролю; **- р<0,01 по отношению к группе «Старые крысы».

При исследовании аорты было выявлено, что толщина интимы для группы старых крыс, получавших только безантиоксидантпую диету, уменьшилась на 15,3% (р<0,05) по отношению к молодому контролю. В группе животных, получавших диету и комплекс антиоксидантов, толщина интимы аорты увеличилось на 37,1% по сравнению со старой контрольной группой. Так же достоверные показатели увеличения толщины интимы аорты были зафиксированы в группе старых крыс, получавших чистый экстракт гребней винограда.

При проведении морфологического исследования миокарда на предмет выявления признаков дефицита витамина Е изучалась оптическая плотность продукта ПОЛ липофусцина в цитоплазме кардиомноцитов, которая была максимально выражена в контрольной группе старых животных, и дефицит составил 159,27% по сравнению с молодым контролем. При этом изучаемый комплекс аналогично препарату сравнения приводил к снижению данного показателя на 7,7% (р<0,001) по сравнению со старым контролем.

При изучении влияние комплекса на нейроны головного мозга было показано что, наибольший процент поражения нейронов в группе старых контрольных крыс был зафиксирован в продолговатом мозге (25-30%), наименьший в мозжечке (7-8%). В группе животных, получавших изучаемый комплекс, было зафиксировано минимальное коли-

чество пораженных нейронов по всем отделам головного мозга. В этом он превосходил препарат сравнения практически в 2 раза.

Таким образом, комплекс на основе растительных флавоноидов в эксперименте обладает способностью нормализовать процессы ПОЛ за счет снижения уровня МДА, восстановления активности глутатионпероксидазы и концентрации токоферола. Также изучаемая композиция предотвращает дистрофические изменения в миокарде, снижает образование в тканях маркера старения липофусцина, нормализует показатели толщины интимы аорты и склерозирования сосудов, а также уменьшает повреждение нейронов головного мозга.

На следующем этапе изучались алкогольпротективные свойства комплекса на основе флавоноидов. Так при изучении влияния композиции на выживаемость крыс при введении высоких (10 г/кг) доз этанола нами было установлено, что 50% смертность в контрольной группе была зафиксирована уже через 48 часов после начала эксперимента. К окончанию эксперимента процент выживаемости в контрольной группе составил 12,5%. В группе животных, получавших не только алкоголь, но и изучаемую композицию, процент выживаемости был значительно выше, чем в контрольной группе. Так 100% выживаемость фиксировалась даже через 48 часов от начала эксперимента. На 3-й сутки данный процент снизился до 87,5% (р<0,05) и дальнейшей гибели отмечено не было (Таблица 3).

Таблица 3 - Влияние композиции на основе комплекса флавоноидов на выживаемость крыс при введении высоких доз этанола.

Часы после начала эксперимента Количество выживших (п) и Выживаемость живот

Контроль(этанол) Композиция + этанол

п % п %

Исход 8 100 8 100

24 8 100 8 100

48 4 50 8 100

72 3 37,5 7 87,5

96 1 12,5 7 87,5'

120 1 12,5 7 , 87,5' !

Примечание; * - р<0,001 по отношению к контролю (метод Фишера).

Для оценки влияния комплекса на выраженность и динамику наркотического действия этанола в дозе 4 г/кг оценивалась реакция свободного поведения в тесте "открытое

поле", максимальная и интегральная выраженность наркотического действия этанола.

В тесте открытого поля в контрольной группе ко 2 часу от начала эксперимента отмечалось статистически значимое снижение горизонтальной двигательной активности (Рис. 8) на 26,9 % (р<0,05). Максимальное статистически значимое снижение данного показателя на 60,1% (р<0,05) произошло к 10 часу.

В группе крыс, получавших изучаемую композицию, максимальное снижение показателей горизонтальной двигательной активности на 54,1 % от исходных значений было зафиксировано через 6 часов. К концу эксперимента, горизонтальная двигательная активность в опытной группе восстановилась на 97,6%.

Рис. 8, Изменение горизонтальной активности в тесте «Открытое поле» у экспериментальных крыс (Д%) * - изменения, статистически значимые по отношению к контролю (/-критерия Стыодента с поправкой Бонферони, р<0,05); « - данные статистически значимые по отношению к исходу в группе контроля (критерий Шефе, р<0,05);

Количество актов грумминга в контрольной группе снизилось примерно в 2 раза, уже через 2 часа после начала исследований. Максимальное снижение было зафиксировано через 6 часов на 86% (р<0,05). Данный показатель практически полностью восстановился к окончанию эксперимента.

Увеличение актов грумминга в опытной группе, происходило уже к 4 часу от начала исследований, на 18,5% (р<0,05), (Рис.9). Увеличение продолжалось до момента окончания исследований, и составило 145,9% от исходных показателей.

—♦— Коктроль(Этаиол) —■— Комплекс + Этанол

часы от начала эксперимента

0 2 4 6 8 10 24

часы от начала исследования

Рис.9. Изменение показателей грумминга в тесте «Открытое поле» у экспериментальных крыс (Д%). * -изменения, статистически значимые по отношению к контролю (¿-критерия Стьюдента с поправкой Бонферони, р<0,05); # - данные статистически значимые по отношению к исходу в группе контроля (критерий Шефе, р<0,05);

Исходный наркотический эффект этанола для обеих групп животных был примерно одинаков, и для контрольной группы составил 1,14 баллов, а для животных, получавших алкоголь вместе с композицией, равнялся 1,29 баллу. При этом максимальный эффект этанола наблюдался в контрольной группе через 4 часа введения и равнялся 2,43 балла, что на 64,5% (р<0,05) больше чем в группе крыс, получавших изучаемую композицию. Снижение наркотического действия алкоголя в контрольной группе на 12,3% от исходных значений было зафиксировано только к 10 часу от начала исследования. Через сутки действие алкоголя в контрольной группе снизилось на 74,6% от начальных значений. В опытной же группе снижение наркотического действия этанола от исходных значений было зафиксировано уже к 4 часу, на 77,5% (р<0,05), и через 10 часов действие алкоголя полностью прекратилось. Интегральная выраженность наркотического действия этанола в группе крыс получавших композицию была на 53, 9% ниже, чем в контрольной группе (Таблица 4).

Таблица 4 - Влияние композиции на основе комплекса флавоноидов на наркотический эффект этанола (в баллах).

Часы исследования Группы животных

Контроль Комплекс

Исход 1,14 ±0,26 1,29± 0,18

2 2,29 i 0,18 1,29 ±0,18

4 2,43 ± 0,20 1,00 ±0,31»

6 1,43 ±0,20 0,57*0,20*

8 1,29 ±0,18 0,41 ±0,21*

10 1,00 ±00,0 0

24 0,29 ±0,18 0

Всего за сутки. 9,87±1,2 4,55±1,07*

Примечание: * - изменения, статистически значимые по отношению к контролю (р<0,05).

С целью изучения возможного влияния композиции на функционирование основных медиаторных систем был проведен анализ нейрофармакопогического взаимодействия с различными нейромедтторами in vivo. При изучении влияния комплекса на до-фаминергическую систему было показано, что исследуемая композиция увеличивала время латентного периода в два раза, но снижала период беспокойства (на 57%) и длительность стереотипии (на 15%), вызванной психостимулятором фенамином, тем самым, оказывая негативное влияние на эффекты активации дофаминергических и норад-ренергических систем фенамином.

При этом композиция не оказывала действия на гипотермический эффект апо-морфина, что указывает на отсутствие у данного соединения влияния на постсинаптиче-ские дофаминовые рецепторы. Отсутствие изменения гипотермического действия малых доз клофелина позволило исключить у изучаемой композиции норадренергические влияния. При этом показанное ранее в тесте фенаминовой стереотипии негативное действие композиции на норадренергические системы можно объяснить ее мембраностаби-лизирующими свойствами.

При изучении действия композиции на эффекты 5-гидрокситриптофана, у комплекса на основе растительных флавоноидов не было выявлено активности в отношении серогониновых рецепторов.

При изучении влияния комплекса флавоноидов на центральную М-холииергичсскую передачу было обнаружено, что композиция не оказывала влияния на тремор, вызванный введением М-холиномиметика ареколина. что позволяет сделать вывод об отсутствии у нее центрального М-холинергического действия.

Для изучения возможного влияния соединения комплекса флавоноидов на Н - хо-линергическую систему была использована модель развития тремора, индуцированного никотином. Так было показано, что изучаемая композиция статистически значимо снижала время никотинового тремора на 55,2%, то есть влияла на центральную Н- холинэр-гическую передачу.

При изучении острой токсичности было установлено, что величина LD50 для композиции на основе комплекса природных флавоноидов у крыс при пероралыюм введении составляет > 5000 мг/кг.

У животных после введения высоких доз изучаемой композиции не отмечалось изменений рефлекторных реакций на внешние раздражители - звуковых, тактильных, болевых. Не отмечались изменения функционального состояние вегетативной нервной системы (размера зрачка, птоз верхнего века, уринации, дефекации, саливации, пило-эрекции, характер и частота дыхания, цвет кожи). Не было отмечено изменения тонуса тела и конечностей. Скорость и характер воспроизведения рефлексов так же не изменялись. Гибель животных при пероральном введении не наблюдалась как в течение первых четырех часов после введения препарата, так и в последующие Зсуток наблюдения.

На основании проведенных исследований, антиоксидантный комплекс, можно отнести к малотоксичным соединениям в соответствии с классификацией токсичности веществ [Березовская, 2003; ГОСТ 12.1.007-76].

Таким образом, на основании проведенных исследований было установлено, что композиция обладает широким спектром антиоксидантных свойств, основанных на инактивации различных форм свободных радикалов, а применение веществ в комплексе обладает наибольшей активностью по сравнению с отдельными компонентами. При проведении исследований in vivo на старых животных с дефицитом токоферола, было показано, что изучаемый комплекс проявил высокую эффективность как, потенциальный геропротектор влияя на реологические свойства крови, липидный обмен, нормализуя значения параметров ПОЛ и морфологических изменений при старении. При исследовании ал кого л ь л роте кти вн о го действия композиции было установлено, что изучае-

мый комплекс увеличивал выживаемость крыс при введении им летальной дозы алкоголя, приводил к достоверному уменьшению наркотического эффекта этанола, то есть обладал некоторыми антиалкогольными свойствами. Изучение центральных механизмов нейротропного действия композиции показало, что изучаемый комплекс проявлял некоторые свойства ингибитора норадренергической передачи и блокировал Н - холинерги-ческую передачу в ЦНС. Исходя из величины LD50 при пероральном введении, композицию на основе комплекса природных флавоноидов можно отнести к классу 4 малотоксичных соединений в соответствии с классификацией токсичности веществ.

ВЫВОДЫ:

1. В результате изучения фармакологических свойств нового комплекса на основе флавоноидов гребней винограда, солодкового корня, а также токоферола, аскорбиновой кислоты была доказана перспективность использования натуральных антиоксидант-ных комплексов с широким спектром АО активности с целью улучшения показателей при состояниях, связанных с дефицитом эндогенных антиоксидатнов и интоксикации алкоголем.

2. Комплекс оказывает выраженное антиоксидантное и антирадикальное действие на широком спектре моделей in vitro в дозах 50 и 25 мг/кг. Максимальный антиоксидан-тый эффект проявляется в терапевтической дозе 50мг/кг.

3. Комплекс в дозе 50мг/кг перорально оказывает защитное действие у крыс с дефицитом эндогенных антиоксидатнов, на фоне токоферол - дефицитной диеты. Он улучшает реологические свойства крови, снижая вязкость крови и эритроцитов и уменьшая АДФ - индуцированную агрегацию тромбоцитов на 74,3%. Также композиция уменьшает уровень атерогенных ЛПНП в крсви старых животных на 45,9% и увеличивает ЛПВП на 34,6%, что приводит к снижению ИА на 52,6%.

4. В механизмах защитной активности комплекса у старых крыс на безантиоксидантоей диете можно выделить влияние на уровень ПОЛ и эндогенных антиоксидантов. Изучаемый комплекс в дозе 50 мг/кг перорально снижает МДА в плазме крови старых крыс на 43,5% и в мозге на 15,6%, увеличивает активность ГП крови на 304,6% и мозга на 82,3%, восстанавливает уровень токоферола в крови. Кроме того, композиция предотвращает дистрофические изменения в миокарде, снижает образование в тканях

липофусцина, нормализует толщину интимы аорты, снижает склерозирование сосудов и уменьшает повреждение нейронов головного мозга у старых животных.

5. Комплекс в дозе 50 мг/кг перорально проявляет алкогольпротективные свойства при острой и хронической алкоголизации. Он повышает выживаемость крыс при введении им летальной дозы алкоголя на 75% по сравнению с контролем и уменьшает наркотические эффекты этанола на 53,9%.

6. Изучаемый комплекс при пероралыюм введении в дозе 50 мг/кг проявляет незначительное центральное симпатолитическое и Н-холиноблокирующее действие. Комплекс не оказывает влияния на передачу импульсов в центральных дофаминергиче-ских, серотонергических и М-холинергических синапсах.

7. Разработанный комплекс по уровню острой токсичности (свыше 5000 мг/кг при пероралыюм введении) может быть отнесен к 4 классу малотоксичных соединений.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Изучение функционально - поведенческой активности крыс на фоне введения комплекса природных биофлавоноидов // X Региональная конференция молодых исследователей Волгоградской области, 8-11 ноября 2005 г.: Тезисы докладов / Под ред. Проф. М.Е. Стаценко. / Издательство ВолГМУ: Волгоград, 2005. - С. 35-36.

2. Исследование взаимодействия ареколина и никотина с М- и Н-холинорецепторами на фоне приема композиции из растительных биофлованоидов // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины: материалы 64-й открытой итоговой научной конференции молодых ученых и студентов / Под общей ред. акад. В.И. Петрова. - Волгоград: Изд-во ВолГМУ, 2006 - С. 136.

3. К вопросу применения биологических ангиоксидантов природного происхождения в клинической практике // «Практикующий врач», V научная конференция, 9-16 сентября 2006, Римини (Италия) / Фундаментальные исследования. - 2006- №6- С. 29.

4. Изучение взаимодействия композиции из растительных биофлованоидов на адре-нергические и дофаминергические рецепторы // Молодежь и наука: итоги и перспективы: материалы межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием / Саратов: Изд-во СарГМУ, 2006. - С. 99.

5. Дофаминергические и адренергические эффекты композиции растительных биофлавоноидов // Материалы II (XI Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции, 15 марта 2007 г. / Москва, Журнал Российского Государственного медицинского Университета.- 2007. -Аг° 2,- С. 299.

6. Исследование протективных свойств комплекса растительных биофлавоноидов на фоне этанольной интоксикации. // «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины»,V конференция молодых ученных России с международным участием / Москва. - ММА им. Сеченова. - 2008,- С. 319.

Подписано в печать 16.03. 2010 г. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Усл. печ. л. 1,2. Тираж 100 экз. Заказ 875.

Волгоградское научное издательство 400011, Волгоград, ул. Электролесовская, 55.

Актуальность проблемы.

Многие распространенные болезни и осложнения связаны с дефицитом в организме человека эндогенных антиоксидантов - веществ, препятствующих накоплению избыточного количества свободных радикалов [Harman, 2006; Анисимов, 2008]. Дисбаланс показателей антиоксидантной и прооксидантной систем, приводит к нарушению регуляций клеточного гомеостаза, что индуцирует, в частности, процесс старения [Зенков и соавт., 2001; Хавинсон и соавт., 2003; Дубинина, 2006], способствует развитию различных заболеваний. Для старения характерным является определенный "спектр" патологий: атеросклероз [Климов, Никульчева, 2001; Ланкин, 2004]; сердечно-сосудистые заболевания [Коган, 2002; Мирозоян, 2003; Капелько, 2009]; дисфункции мозга [Плотников, 2000; Дамулин, 2009], сахарный диабет [Дедов, 2003; Балаболкин, Клебанова, 2004; Bloomgarden, 2006] и др. В основе этих нарушений лежат процессы каскадной, свободно-радикальной окислительной модификации липидов, белков и ДНК [Подколзин, 2000; Владимиров, 2006; Slemmer, 2008].

На процессы старения, по мнению ряда ученых, влияет чрезмерное употребление алкогольных напитков [Molina, Brooke, 2007; Сиволап, Савченко, 2008]. Алкоголь нарушает течение всех биохимических реакций организма, а это в свою очередь ведет к изменениям в структуре и работе всех органов [Тю-ренков, 2002; Нужный, 2006]. Токсическое влияние алкоголя на организм многообразно, однако одним из основных его проявлений является цепь нарушений, связанных со свободно-радикальным (СРО) и перекисным окислением липидов (ПОЛ) биомембран. Известно, что алкоголь и его метаболиты патологически ускоряют процессы ПОЛ в организме, истощая естественные защитные (антиоксидантные) ресурсы [Зенков, Ланкин, 2001], что ведет к возникновению различных патологий и проявлению физических признаков преждевременного старения.

Исходя из выше изложенного и учитывая важную роль СРО в возникновении патологических состояний, сопровождающих старение и алкоголизм, коррекция этих процессов, является актуальной задачей современной медицины [Подколзин, Донцов, 2001; Меныцикова, 2006; Нисрин, 2009].

Так как антиоксидантные препараты регулируют процессы свободнора-дикального окисления, создавая оптимальные условия для нормального метаболизма и функционирования клеток и тканей в условиях окислительного стресса, создание геропротективных и алкогольпротективных комплексов веществ с антиоксидантыми свойствами является перспективным [Сторожок, 2002; Ргуог ег а1., 2006]. Это обусловлено тем, что механизм действия комплексных соединений достаточно разнообразен. Так одни антиоксидантные вещества перехватывают свободные радикалы, другие обрывают цепи свобод-норадикальных реакций, третьи восстанавливают окисленные соединения [Смирнов, 2002; Зенков, 2006].

Так же, при создании комплексов с антиоксидантой направленностью важно соблюдать сбалансированность состава, включая в него компоненты, действующие как в липидной, так и в водной фазах, влияющие как на процессы липопероксидации, так и на радикалообразование [Оковитый, Шуленин, 2005]. Следует отметить, что особо эффективным является создание именно комплексных препаратов, содержащих различные группы антиоксидантов (флаво-ноиды, витамины С, Е и селен и др.). При этом значение имеет не только сум-мация эффектов антиоксидантых компонентов комплекса, но и их синергетиче-ское действие с усилением положительных влияний, связанное с наличием в организме единой системы антиоксидантной защиты. Основой таких компонентов могут стать биоантиоксиданты (БАО), как наиболее безопасные вещества.

Таким образом, на основании вышеперечисленного и опираясь на ранее опубликованные работы [Овчинникова, 2005], была спланирована дальнейшая работа по расширенному изучению фармакологических свойств антиоксидант-ного комплекса, состоящего из экстракта гребней винограда, токоферола, ретинола, аскорбиновой кислоты, глутатиона, экстракта корня солодки, янтарной кислоты, а также микроэлементов селена, магния и цинка, и возможности его использования для коррекции окислительно-восстановительных процессов, стабилизации метаболических изменений и уменьшения различных патологических процессов.

Диссертационная работа выполнена в рамках Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения» (№ государственной регистрации 01. 2001 16045), является составной частью научно-исследовательской программы «Поиск, разработка и фармакологическое изучение веществ, проявляющих антиоксидантные свойства» (№ государственной регистрации 01. 2006 09439), включенной в план НИР Волгоградского государственного медицинского университета. Тема работы утверждена на заседании Учёного Совета Волгоградского государственного медицинского университета (протокол № 9 от 12.10.2005 г.). Все исследования были одобрены комитетом по этической экспертизе испытаний (протокол №10 от 28.03.09.).

Целью является изучение действия нового антиоксидантного комплекса на основе флавоноидов у крыс с дефицитом эндогенных антиоксидантов и интоксикацией алкоголем, определение его нейротропной активности и токсических свойств.

Для достижения указанной цели представляется необходимым решение следующих задач:

1. Исследовать антиоксидантную активность нового комплекса in vitro с детализацией спектра антирадикальных воздействий;

2. Изучить влияние комплекса на поведенческую активность, систему гемо-реологии и свертывания крови и показатели атерогенеза у крыс с экспериментальным дефицитом эндогенных антиоксидантов;

3. Детализировать механизмы влияния комплекса на показатели экспериментального дефицита эндогенных антиоксидантов по изменению морфологических показателей и параметров перекисного окисления липидов;

4. Установить действие комплекса на выживаемость крыс при острой алкогольной интоксикации и показатели выраженности и динамики наркотического действия этанола;

5. Изучить влияние нового комплекса на основные медиаторные системы мозга с определением возможного спектра нейротропной активности;

6. Исследовать показатели острой токсичности разработанного комплекса.

Научная новизна работы. Впервые были получены сведения о влиянии нового комплексного вещества на показатели перекисного окисления липидов и свободнорадикальных процессов in vitro. Впервые были получены данные о ге-ропротекторной активности нового комплекса по влиянию на поведенческие реакции, функции памяти, реологические функции крови, обмен липидов, а также изучены механизмы этих эффектов у старых крыс с дефицитом витамина Е. Было установлено влияние нового антиоксидантного комплекса на выживаемость крыс при введении высоких доз этанола, а также выраженность и динамику наркотического действия этанола. Впервые были получены сведения об общей нейротропной активности данного комплекса и его токсических свойствах.

Научно-практическая значимость работы. Полученные данные свидетельствуют о целесообразности создания и использования, натуральных анти-оксидантных комплексных веществ с целью геропротекции и алкогольпротек-ции. Были получены данные о наличии у композиции на основе природных флавоноидов геропротективных эффектов по влиянию на индекс атерогенности липидов крови и улучшению ее реологических свойств, и установлены механизмы геропротекторного действия. Была экспериментально доказана возможность использования композиции с целью алкогольпротекции при острой и хронической алкоголизации. Выявленные антиоксидантные, антирадикальные и другие сопряженные эффекты композиции на основе природных флавоноидов определяют перспективность проведения дальнейших фармакологических и токсикологических исследований комплекса с целью создания на его основе нового антиоксидантного средства.

Реализация результатов исследования. Выявленные фармакологические эффекты и их возможные механизмы учитываются в экспериментальной работе лаборатории фармакологии антиоксидантных средств НИИ фармакологии Волгоградского государственного медицинского университета. Результаты работы используются в лекционных курсах на кафедрах фармакологии, фармацевтической химии, фармакологии и биофармации ФУВ Волгоградского государственного медицинского университета, кафедре фармакологии и клинической фармакологии Ростовского государственного медицинского университета.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработанный комплекс обладает выраженной антиоксидантной активностью с широким спектром антиоксидантных эффектов;

2. Комплекс улучшает гемореологические и коагуляционные свойства крови, оказывает кардио- и эндотелиопротективное действие у крыс с экспериментальным дефицитом эндогенных антиоксидантов;

3. Новый антиоксидантный комплекс проявляет алкогольпротективные свойства при экспериментальной острой и хронической алкоголизации;

4. Разработанный комплекс относится к малотоксичным веществам (класс IV токсических веществ в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76).

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на X региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2005), на 64-ой открытой итоговой конференции молодых ученых и студентов ВолГМУ (Волгоград, 2006), на межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием (Саратов, 2006), на V научной конференции "Практикующий врач" (Римини, 2006), на II (XI Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции (Москва, 2007), на V конференции молодых ученных России «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ (из них одна в центральной печати).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 211 страницах машинописного текста, иллюстрирована 25 рисунками и 37 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (главы 2-7), обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 240 отечественных и 140 зарубежных источников.

ВЫВОДЫ:

1. В результате изучения фармакологических свойств нового комплекса на основе флавоноидов гребней винограда, солодкового корня, а также токоферола, аскорбиновой кислоты была доказана перспективность использования натуральных антиоксидантных комплексов с широким спектром АО активности с целью улучшения показателей при состояниях, связанных с дефицитом эндогенных антиоксидатнов и интоксикации алкоголем.

2. Комплекс оказывает выраженное антиоксидантное и антирадикальное действие на широком спектре моделей in vitro в дозах 50 и 25 мг/кг. Максимальный антиоксидантый эффект проявляется в терапевтической дозе 50мг/кг.

3. Комплекс в дозе 50мг/кг перорально оказывает защитное действие у крыс с дефицитом эндогенных антиоксидатнов, на фоне токоферол-дефицитной диеты. Он улучшает реологические свойства крови, снижая вязкость крови и эритроцитов и уменьшая АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов на 74,3%. Также композиция уменьшает уровень атерогенных ЛПНП в крови старых животных на 45,9% и увеличивает ЛПВП на 34,6%, что приводит к снижению ИА на 52,6%.

4. В механизмах защитной активности комплекса у старых крыс на без-антиоксидантоей диете можно выделить влияние на уровень ПОЛ и эндогенных антиоксидантов. Изучаемый комплекс в дозе 50мг/кг перорально снижает МДА в плазме крови старых крыс на 43,5% и в мозге на 15,6%, увеличивает активность ГП крови на 304,6% и мозга на 82,3%, восстанавливает уровень токоферола в крови. Кроме того, композиция предотвращает дистрофические изменения в миокарде, снижает образование в тканях липофусцина, нормализует толщину интимы аорты, снижает склерозирование сосудов и уменьшает повреждение нейронов головного мозга у старых животных.

5. Комплекс в дозе 50мг/кг перорально проявляет алкогольпротективные свойства при острой и хронической алкоголизации. Он повышает выживаемость крыс при введении им летальной дозы алкоголя на 75% по сравнению с контролем и уменьшает наркотические эффекты этанола на 53,9%.

6. Изучаемый комплекс при пероральном введении в дозе 50 мг/кг проявляет незначительное центральное симпатолитическое и Н-холиноблокирующее действие. Комплекс не оказывает влияния на передачу импульсов в центральных дофаминергических, серотонергических и М-холинергических синапсах.

7. Разработанный комплекс по уровню острой токсичности (свыше 5000 мг/кг при пероральном введении) может быть отнесен к 4 классу малотоксичных соединений.

7.3. Заключение.

На основании проведенных экспериментальных исследований антиокси-дантного комплекса следует, что данный состав можно отнести к нетоксичным соединениям в соответствии с классификацией токсичности веществ.

ГЛАВА 8. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Известно что, свободно-радикальное окисление липидов непрерывно протекает в норме во всех тканях живых организмов, и свободно-радикальные процессы при их низкой интенсивности являются необходимым звеном метаболизма, обеспечивающим нормальную жизнедеятельность [Оковитый, 2003; Меныцикова, 2008; Белая, 2009].

Но с другой стороны, увеличенное образование свободных радикалов в организме и связанное с этим усиление процессов пероксидации липидов сопровождается рядом нарушений в свойствах биологических мембран и функционировании клеток [Воейков, 2004; Щевцов, 2005].

Значение свободно - радикального окисления в суммарном виде можно представить следующим образом: в норме:

• необходимое звено метаболизма, обеспечивающее нормальную жизнедеятельность [Владимиров, 19984Габитова,2006];

• модификация физико-химических свойств биологических мембран [Дубинина, 2001];

• защитные функции, окисление чужеродных соединений, микробицидное действие [Журавлев,2007];

• обмен веществ, аккумуляция и биотрансформация энергии [Курашвили, 2003];

• влияние на иммунитет, передачу информации [Меныцикова,2006]; при патологии:

• универсальная неспецифическая основа патогенеза различных заболеваний [Балаболкин, 2005; Ивашкин, 2005];

• нарушение проницаемости, структуры, функции биомембран [Владимиров, 2002];

• повреждение белков, липидов, нуклеиновых кислот и т.д. [Подкол-зин,2000; Владимиров, 2006];

• нарушение биоэнергетики, регуляторных и защитных функций [Аппик,

2001; Терехина, 2005];

• общетоксическое и канцерогенное действие [Чеснокова, Понукалина,

2006].

Основным субстратом ПОЛ являются полиненасыщенные жирные кислоты и липопротеины, входящих в состав клеточных мембран. Окисление липи-дов приводит к нарушению нормальной упаковки мембранного бислоя, что может вызвать повреждение мембраносвязанных белков [Ланкин, 2004; Журавлев, 2008]. Поврежденные мембраны утрачивают энергетический потенциал, электровозбудимую функцию, контроль за ионными потоками и медиаторными системами, и как следствие возникают патологические (воспалительные, ней-родегенеративные, злокачественные) изменения в тканях, что, в конце концов, приводит к развитию многих заболеваний и в итоге к гибели организма [Кара-жаева, 2003; Ланкин, 2004].

Хорошо известный факт выраженного дисбаланса между уровнем продукции активных форм кислорода и функциональной активностью антиокси-дантной системы, а также возможность повышения риска развития осложнений ряда заболеваний при более высокой интенсивности свободнорадикального окисления являются основой теоретического обоснования использования фармакологической коррекции избыточной интенсивности свободнорадикального окисления у пациентов с различными заболеваниями с использованием ингибиторов свободнорадикального окисления — антиоксидантов.

Таким образом, поиск и исследование веществ с антиоксидантым действием продолжает оставаться актуальным [Зенков, и др., 2001; ТЫе1г, 2001]. перспективной группой в этом отношении, являются флавоноиды, которые широко представлены в растительном мире. Одним из источников флавоноидов является виноград, содержащий несколько классов наиболее биологически активных флавоноидов,

Известно, что антиоксидантное действие флавоноидов реализуется через различные механизмы действия. Они могут реагировать, как классические фенольные радикальные ингибиторы, взаимодействуя с липидными радикалами, либо реагируя с активными формами кислорода [Folts, 2002; Барабой, 2006]. Другой путь воздействия на организм связан со способностью ингибировать липоксигеназу или же образовывать комплексы с ионами Fe 3+, которые в свою очередь активизируют процесс свободнорадикального окисления [Макаров, Селезнева, 2005; Зенков и соавт., 2003].

На моделях Ре2+"индуцированной хемилюминесценции липидов и аскор-бат - зависимого ПОЛ in vitro было показано, что композиция на основе комплекса природных флавоноидов проявляет антиоксидантый эффект, ингибируя реакции цепного окисления липидов [Шевцов, Зяблова, 2005].

При изучении механизмов действия с использованием методов ДПФГ-радикалообразования, Ре2+"индуцированной люминол-зависимой ХЛ, а также АБАП-индуцированной ХЛ, доказана способность композиции флавоноидов ингибировать образование свободных радикалов.

Антирадикальную активность на модели со свободным радикалом ДФПГ* проявили обе фракции изучаемой композиции, как жирорастворимая, в которой основными компонентами вероятно являются токоферол и ретинол, так и водорастворимая, в которой основную роль играют водорастворимые флавоноиды гребней винограда, витамин С, глутатаион. При этом в обоих случаях отмечался дозозависимый эффект. Однако наблюдаемые эффекты проявлялись в водорастворимой фракции в меньшей степени, что характерно именно для комплексных веществ. Аскорбиновая кислота также показала достаточно выраженное антирадикальное действие, что в целом соответствует литературным данным о преимущественном антирадикальном действии аскорбиновой кислоты in vitro [Макарова, Селезнева, 2005].

Изучаемая композиция оказывала ингибирующее дозозависимое влияние на образование АФК при люминол-зависимой ХЛ. При этом максимальный эффект у композиции проявлялся в терапевтической дозе 50 мг/л. Аскорбиновая кислота, взятая как отдельный препарат сравнения в концентрации, в которой она входит в состав композиции (2,5 мг/л) оказала меньший подавляющий эффект. Очевидно, это обусловлено вкладом других компонентов композиции в антирадикальное действие.

Старение организма - сложный и многогранный процесс, который зависит от множества механизмов [Анисимов, 2003; Кишкун, 2008]. Среди различных факторов, играющих важную роль в старении, безусловно, важное значение имеет процесс повреждения клеток организма свободными радикалами, при этом интенсивность окислительного метаболизма обратно пропорциональна продолжительности жизни [Luchsinger, 2003; Cardona, 2004].

Полагают, что в патогенезе многих расстройств организма при старении важная роль принадлежит оксидативному стрессу, развивающемуся в результате дисбаланса между оксидантной и антиоксидантной системами [Annuk, Zil-mer, Lind, 2001; Giordano, 2005; Подопригорова, 2007]. При этом в крови и тканях достигают высоких концентраций продукты перекисного окисления липи-дов, в частности - малоновый альдегид, дестабилизирующий клеточные мембраны [Малакян, 1999;]. Так же в литературе отмечены данные о существенном снижении при старении уровня глутатиона [Nuttal, Martin, Hitchin, 1998]. В этой связи представляется интересным изучить антиоксидантую композицию на модели экспериментального старения у крыс.

С целью выявления геропротекторной активности композиции на основе природных флавоноидов и возможного механизма ее действия, у старых крыс находящихся на безантоксидантной диете, были проведены исследования поведенческих реакций и памяти, показателей ПОЛ, а также реологических свойств крови, липидного обмена и морфологических параметров.

При проведении исследований на старых животных со смоделированным дефицитом токоферола и других антиоксидантов было установлено, что у них наступал синдром липидной пероксидации, сопровождающийся увеличением образования вторичного продукта ПОЛ - малонового диальдегида в плазме и органах крыс. Этому сопутствовало увеличение показателей хемилюминесцен-ции и снижение активности антиоксидантного фермента глутатионпероксидазы, что в целом соответствует данным литературы [Подколзин, 2000; Зенков и др., 2001].

Прием в течение 3-х месяцев композиции на основе комплекса природных флавоноидов у старых крыс статистически значимо снижал уровень малонового диальдегида во всех изучаемых структурах, приводил к некоторой нормализации показателей хемилюминесценции. Так же повышалась активность антиокислительного фермента глутатионпероксидазы в крови и органах старых крыс.

Как известно, мощным эндогенным антиоксидантом является токоферол [Наумов, Васильев, 2003; Manson, Glynn, 2008]. В наших экспериментах было доказано что у старых крыс, находящихся на безантиоксидантой диете, был существенно снижен уровень токоферола, а композиция на основе комплекса природных флавоноидов приводила к нормализации его концентрации в крови. При этом антиоксидантый комплекс по влиянию на изучаемые показатели превосходил по эффективности чистый экстракт гребней винограда, используемый в качестве препарата сравнения.

Процесс старения является важным следствием нарушения обеспечения органов и тканей человека кислородом [Soory, Mena, 2009]. Возникающая с возрастом органно-тканевая гипоксия служит причиной прогрессирования возрастных изменений, патогенетической основой и важным компонентом целого ряда заболеваний [Иванов, 2001; Коркушко, Саркисов, 2003].

Определяющая роль в обеспечении адекватного кровоснабжения, а значит и обеспечения кислородом органов и тканей организма, принадлежит системе микроциркуляции. Поэтому состояние капиллярного кровотока должно жестко синхронизировать доставку кислорода тканям относительно потребности в нем. Состоятельность указанного процесса зависит от структуры и количества микрососудов [Windberger, Bartholovitsch, 2003]. Болыноее значение в регуляции скорости капиллярного кровотока играют реологические свойства крови, такие как вязкость крови, определяемая совокупностью функционального состояния форменных элементов крови (подвижность, деформируемость, агрегационная активность эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов), осмоляр-ность крови (концентрация глюкозы и электролитов) [Ройтман, Азизова, 2001; Martini, Cabrales; 2006]. Данные литературы по изучению отдельных показателей внутрисосудистого гомеостаза у здоровых пожилых людей свидетельствуют о повышении вязкости крови, агрегационной активности ее форменных элементов [Коркушко, Лишневская, 2002].

На основании экспериментальных исследований о влиянии композиции на основе природных биофлавноидов на гемореологические параметры крови следует, что изучаемая композиция снижает показатели вязкости взвеси отмытых эритроцитов при всех скоростях сдвига. Достоверное снижение вязкости эритроцитов было зафиксировано как при скорости сдвига 300с"1, так и при Зс"1. Таким образом, изучаемая композиция оказывала значительное влияние на степень деформируемости эритроцитов, за счет изменения их вязкости и превосходил по данному виду активности экстракт гребней винограда. Что касается таких показателей, как кислотная резистентность эритроцитов, индекс доставки кислорода в ткани, скорость фильтрации взвеси эритроцитов, то для них наметилась тенденция к увеличению по сравнению с группой старых нелеченных крыс.

Не менее важную роль в нарушении внутрисосудистого гомеостаза играет и функциональное состояние тромбоцитов - важного звена гемокоагуляции [Коркушко, Саркисов, 1998; Nieswandt, 2009]. И хотя механические свойства тромбоцитов, вследствие их небольшого размера и малочисленности играют в этом процессе малую роль, агрегационная активность кровяных пластинок и их чувствительность к проагрегантам могут оказать существенное влияние на состояние кровотока на уровне микроциркуляторного русла [Муравьев, 2000; Бо-ровкова, 2009].

При изучении влияния исследуемой композиции на параметры спонтанной и индуцированной агрегации тромбоцитов, было показано, что у старых крыс, получавших только базантиоксидантую диету статистически значимо увеличивались лишь показатели индуцируемой агрегации. При этом снижение агрегации тромбоцитов у старых крыс, получавших исследуемую композицию, происходило только при АДФ индуцируемой агрегации, что может свидетельствовать о снижении тромбообразования и, как следствие уменьшении вязкости и улучшении текучести крови.

Система свертывания крови не существует в организме изолированно. Напротив, она очень тесно - функционально и биохимически, связана с другими физиологическими системами, прежде всего: иммунитета, сердечнососудистой, дыхания и т.д. Это означает, что их возрастные изменения и патология безусловно отразятся на активности гемокоагуляции и, наоборот, - патология свертывания крови обязательно скажется на функционировании других звеньев гомеостаза [Прохоров, 2007; Rak, Janusz, 2008].

Поэтому основные гемокоагуляционные компоненты можно использовать как способ ориентировочной оценки стадии или степени тяжести течения различных заболеваний [Бондарь, Пикалов, 2007; El Solh, 2007]. По этой же причине коагуляционные показатели могут быть использованы как прогностические признаки развивающейся патологии и предупреждения ее развития [Haus, Erhard, 2007; Момот, Баркаган, 2007].

В связи с этим нами было показано, что в группе старых крыс статистически значимо понижались показатели тромбинового ТВ и АПТВ. При этом композиция на основе комплекса природных флавоноидов практически не изменяла показатели коагуляционного звена гемостаза, статистически значимо снижая лишь значения ТВ и нормализуя ПТВ.

В пожилом и старческом возрасте происходят изменения во всех компонентах сердечно-сосудистой системы [Анисимов, 2003; Dukkipati, Ramnath, 2008]. В процессе старения сердце и сосуды обеспечивают полноценное питание клеток, тканей и органов с известным напряжением, что в свою очередь ускоряет в них процессы угасания. [Чермных, Н. А. Игошина, 2008; Stice, Lee, 2009] Структура сосудистой стенки меняется с возрастом у каждого человека. Основными возрастными изменениями, возникающими в крупных артериальных стволах, являются склеротические уплотнения интимы, внутренней оболочки, атрофия мышечного слоя, снижение эластичности [Дамулин, Парфенов, 2001; Кауе, Esler,2008],

В первую очередь страдают крупные артериальные стволы, особенно аорта. У пожилых и старых людей значительно уменьшается количество действующих капилляров на единицу площади. Ткани и органы перестают получать необходимое им количество питательных веществ и кислорода, а это ведет к их голоданию и развитию различных заболеваний [Гуревич, 2002; Rodríguez-Mañas, El-Assar, 2008].

Нарастание риска развития патологических состояний при старении, таких как ишемическая болезни сердца, атеросклероз, артериальная гипертензия и т.д., во многом связывают с нарушением липидного состава крови (с гипер-липидемией) [Титов, 2000; Svilaas, Strandberg, 2008]. Отложение липидов в стенке сосудов вызывает кальцификацию и фиброзные изменения, в результате, артериальные стенки становятся суженными, ригидными и жесткими, делая кровоток в тканях более затрудненным [Климов, 2007; Constance, 2009].

Уровень ЛПВП отражает динамику движения холестерина из периферических тканей (включая сосудистую стенку) к печени, где он окисляется до желчных кислот и секретируется с желчью [Мороз, Молчанова, 2001]. ЛПНП и ЛПОНП — это средство транспорта жиров в организме к клеткам. В норме отношение липопротеинов, повышающих или понижающих уровень холестерина в мембранах, сбалансировано, и индекс атерогенности, отражающий избыток холестерина в мембранах низкий, но с возрастом он нарастает [Творогова, 2002; Шабалин, Никитин, 2002].

В результате проведенных исследований по изучению влияния комплекса на основе природных биофлавоноидав на липидный обмен, у старых крыс получавших безантиоксидантную диету было выявлено, увеличение ЛПНП в 6 раз и ИА в 2,5 раза по сравнению с молодыми контрольными крысами, что свидетельствует о повышении риска развития атерогенных процессов у старых крыс. При этом композиция на основе комплекса флавоноидов нормализовала данный дисбаланс, снижая как ЛПНП, так и ИА по сравнению со старыми нелечеными крысами.

По литературным данным при старении снижается сократительная способность миокарда, обусловленная морфологическими изменениями (кардиосклероз, очаговая атрофия мышечных волокон, увеличение количества малоэластичной соединительной ткани) и биохимическими сдвигами (снижение энергетического и минерального обмена) [Ъ^о,Напс11еу, 2002; Шабалин, 2003]. В сердце мышечные волокна частично замещаются соединительной тканью, вблизи клеточных ядер откладывается специфический бурый пигмент — маркёр старения — липофусцин [8оига, 2002; Буланов, 2006]. Он представляет собой смесь липидов и белков, связанных поперечными ковалентными связями и денатурированными в результате взаимодействия с химически активными группами продуктов ПОЛ. Липофусцин фагоцитируется, но не гидролизуется ферментами лизосом, поэтому накапливается в клетках, нарушая их функции [Коёп^иег-Сагтопа, Куашаки1, 2006]. Так же снижается интенсивность тканевого дыхания миокарда. Все это приводит к снижению сократимости миокар-диоцитов и, в конечном итоге, к развитию недостаточной функциональности миокарда [Шепелев, Корниенко, 2000].

При дальнейшей экспериментальной работе было установлено, что в группе старых нелеченых крыс происходило статистически значимое снижение саркоплазмы кардиомиоцитов и толщины интимы аорты. На фоне введения композиции на основе природных флавоноидов произошло увеличение данных показателей.

Оптической плотность одного из маркеров старения липофусцина у старых животных, не получавших композицию, статистически значимо увеличивалась по сравнению с группой молодых крыс. У леченых животных происходило снижение данного продукта перекисных процессов по сравнению с контрольными животными. Так же отмечалось снижение склерозирования сосудов и уменьшение количества пораженных нейронов, однако изменения не имели статистической значимости. При этом статистически значимые различия значений морфологических показателей между группами крыс получавшими комплекс и экстракт гребней винограда зафиксированы не были.

Алкоголизм - хроническое состояние, физиологически или психологически отмеченное зависимостью от алкоголя. Алкоголь причиняет метаболическое повреждение всех клеток организма и подавляет иммунную систему [Nava, Vendramin, 2009]. По данным литературы длительное потребление алкоголя подавляет производство печенью пищеварительных ферментов, ослабляя способность организма к усвоению белков и жиров [Trim, Schuckit, 2009]. Также ослабляется способность усваивать витамины, в том числе, атиоксидантые А, Е [Хазанов, 2002; Москаленко, 2007]. Функциональная недостаточность жизненно важных органов и систем, соматоневрологические и психические осложнения, снижение сопротивляемости организма внешним неблагоприятным воздействиям - все это является причиной преждевременного старения и высокой смертности в результате алкоголизма [Гусев, Панченко, 1997; Кахаров, 2004]. Нельзя обойти вниманием и типовой патологический процесс, разворачивающийся на фоне алкогольной интоксикации - активацию перекисного окисления липидов мембран.

Механизм ПОЛ, имеющий место при алкогольной интоксикации, изучен достаточно детально. Известно, что алкоголь и его метаболиты патологически ускоряют процессы ПОЛ в организме, истощая естественные защитные (анти-оксидантные) ресурсы [Зенков, Ланкин, 2001; Purohit, 2003]. Развитие окислительного стресса связанное с алкогольной интоксикацией, активизируется за счет снижения стационарной концентрации активных форм липидных антиок-сидантов, прежде всего витамина Е, а также селена и цинка, являющихся компонентами глутатионпероксидазы и супероксиддисмутазы [Пирожков, 2006; Ярыгина, Прокопьева, 2006]. В условиях хронического воздействия этанолом в мембранах увеличивается содержание холестерина (появляются холестериновые бляшки), меняется структура фосфолипидного слоя. Мембрана клетки утолщается и становится труднопроходимой для метаболитов (питательных веществ). Клетка оказывается не в состоянии получать питание, кроме как вместе с алкоголем [Калянова, 2002; Ра1еге, 8ага£ 2009].

В наркологии имеется немалый позитивный опыт применения антиокси-дантых препаратов, противодействующих патологически возрастающему процессу ПОЛ [Соловьёва, 1995; Кау1агазап, 8ипс1агарапсИуап,2008]. Флавоноиды и другие полифенольные соединения обладают выраженной антиоксидантной активностью, благодаря чему они оказывают мембраностабилизирующее действие [Литвиненко, 1998; Колесников, 2001; Лобанова, 2004]. Они способны существенно снижать токсические проявления алкоголя в организме человека и подавлять процесс формирования физической зависимости. АО активно влияют на метаболизм алкоголя в тканях, повышает дезинтоксикационную функцию печёночных клеток и других тканей и органов, участвующих в защитных реакциях организма [Фоменко, 1995; Доркина, Сергеева, 2007]. По данным литературы препараты на основе флавоноидов увеличивают активность альдегидде-гидрогеназы и, соответственно, предупреждают снижение ее активности при хронической алкогольной интоксикации [Нужный, Пометов, 2002].

В наших исследованиях, при изучении действия композиции на основе флавоноидов на выживаемость крыс при введении высоких доз этанола была выявлена значительная выживаемость крыс опытной группы в сравнении с контролем.

Оценка динамики выраженности наркотического действия этанола в тесте «открытое поле» показала, что применение композиции быстрее восстанавливало показатели двигательной активности и статистически значимо увеличивала количество актов груминга. Также в опытной группе максимальный наркотический эффект по сравнению с контролем был намного ниже и полное восстановление после этанольной интоксикации у крыс, получавших композицию на основе природных флавоноидов, наступало намного раньше.

При проведении фармакологического анализа взаимодействия композиции на основе природных флавоноидов с центральными нейрональными структурами были отмечены эффекты нарушения норадренергической передачи и холинолитичекое действие, что может быть связано с мембранстабилизирую-щими свойствами изучаемого комплекса. Полученные данные согласуются с результатами экспериментов по изучению влияния композиции на поведение животных в тесте «открытое поле», в котором отмечалась активация ориентировочно-исследовательской деятельности, что, по мнению ряда авторов [Колу-ев, 2006], свидетельствует о задействовании центральных компонентов норад-ренергической системы.

Результаты проводимых нами научных исследований позволяют сделать вывод о перспективности применения различных комплексных препаратов на основе растительного происхождения [Максютина, 1998; Каражаева, 2003; Макаров, 2005; 8гока, 2005]. Благодаря сбалансированному составу и низкой токсичности композиция на основе природных флавоноидов обеспечивает комплексную защиту от разрушительного действия свободных радикалов.