Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Фармакологическая коррекция последствий воздействия токсических факторов при беременности (экспериментальное исследование).

На правах рукописи

ЯКОВЛЕВА Ольга Александровна

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ КОРРЕКЦИЯ ПОСЛЕДСТВИЙ ВОЗДЕЙСТВИЯ ТОКСИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология 14.01.01 - акушерство и гинекология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2010

1 7 ИЮН 2010

004605837

Работа выполнена в Военно-медицинской академии имени С.М.Кирова

Научные руководители: доктор медицинских наук профессор Петр Дмитриевич Шабанов доктор медицинских наук Владимир Васильевич Русановский

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук Павел Васильевич Родичкин доктор медицинских наук профессор Наталья Игоревна Тапильская

Ведущее учреждение:

Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова

Защита диссертации состоится «22» июня 2010 года в 13.00 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 215.002.07 при Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова (194044, Санкт-Петербург, ул. акад. Лебедева, д. 6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова

Автореферат разослан «_» мая 2010 г.

Ученый секретарь совета

доктор медицинских наук профессор Борис Николаевич Богомолов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В последние годы пристальное внимание исследователей привлекают проблемы нейробиологии развития. Традиционным направлением этих исследований является изучение нейромедиаторных систем, поскольку нейромедиаторы имеют качественно различные функции в течение онтогенеза нервной системы (Амстиславская М.Г., 2007; Байрамов A.A., 2008). Во взрослом организме медиаторы осуществляют передачу сигналов между клетками, однако в развивающейся нервной системе те же медиаторы могут образовывать морфогенетические градиенты, важные для формирования и дифференцировки различных областей нервной системы и нейромедиаторных систем соответственно (Угрюмов М.В., 2008).

Менее изучено развитие в онтогенезе общебиологических внутриклеточных процессов, таких, как перекисное окисление липидов (ПОЛ) и антиоксидантные системы (Шабанов П.Д. и др., 2009). Вместе с тем, именно эти процессы осуществляют важнейшие функции поддержания гомеостаза нервных клеток. Еще менее изучены механизмы, посредством которых процессы ПОЛ и антиоксидантные системы вовлекаются в ответ на воздействие различных токсических и психогенных факторов в раннем онтогенезе.

Среди токсических факторов, достаточно часто воздействующих на развивающийся организм, в частности, при беременности, следует выделить этанол и никотин, которые будущие матери употребляют как бытовые стимуляторы. Однако именно эти токсические воздействия в раннем онтогенезе могут привести к последующим поведенческим девиациям в подростковом и пубертатном периодах (Мещеров Ш.К., 2006). Возникает закономерный вопрос о возможностях предупреждения подобных нарушений с помощью различных фармакологических агентов, потенциально способных уменьшить токсическое воздействие этанола на развивающийся организм. В качестве таких средств рассматриваются растительные адаптогены, например, экстракты из элеутерококка колючего, травы полисциаса, корня женьшеня (Бурмистров С.О., 1990; Чуваев И.В., 1993), пептидные нейропротекторы (Воронина Т.А., 2007), некоторые синтетические средства антигипоксической направленности (Шабанов П.Д., 2008). К последним можно отнести новый отечественный препарат трекрезан (триэтаноламмониевую соль 2-метилфеноксиуксусной кислоты), представляющий собой высокоэффективное фармакологическое средство с адаптогенным и иммуностимулирующим действием (Казимировская В.Б. и др., 1996; Жумашева А.Б., 2009), и метапрот (2-этилтиобензимидазол, бемитил), обладающий антигипоксической, нейропротекторной и повышающей работоспособность активностью (Шабанов П.Д., 2008).

Целью настоящей работы явилось изучение процессов перекисного окисления липидов и системы антиоксидантной защиты мозга эмбрионов и

потомства при нормальном онтогенезе и после внутриутробного действия этанола у крыс, а также фармакологическая коррекция последствий воздействия токсических факторов при беременности.

В задачи исследования входило:

1. Изучить уровень ПОЛ и системы антиоксидантной защиты мозга эмбрионов и потомства при нормальном онтогенезе у крыс;

2. Изучить уровень ПОЛ и системы антиоксидантной защиты мозга эмбрионов и потомства после внутриутробного действия этанола у крыс;

3. Изучить состояние ферментов антиоксидантной защиты, уровней восстановленного глутатиона и ПОЛ мозга эмбрионов при острой алкогольной интоксикации и действии ацетальдегида у крыс;

4. Изучить действие трекрезана и метапрота на активность антиоксидантной системы и уровень ПОЛ мозга эмбрионов и потомства при внутриутробной алкоголизации у крыс;

5. Изучить действие трекрезана и метапрота на активность антиоксидантной системы и уровень ПОЛ мозга половозрелых крыс, алкоголизированных с 21-го дня жизни.

Научная новизна работы. Доказано, что процессы ПОЛ (малоновый диальдегид) и антиоксидантные системы (восстановленный глутатион, активность супероксиддисмутазы и каталазы) активно развиваются в третий триместр беременности крыс. В раннем постнатальном периоде (до 21-го дня жизни) их активность продолжает возрастать, за исключением каталазы, активность которой в постнатальном периоде падает. При алкоголизации беременных самок активируются процессы ПОЛ и системы антиоксидантной защиты в мозге эмбрионов. Следствием алкоголизации беременных самок является снижение числа родившихся крысят в помете, а также их массы тела и мозга, которые остаются пониженными вплоть до 7 недель постнатального развития. Этанол не только при хроническом, но и при однократном введении индуцирует повышение процессов ПОЛ с одновременным снижением уровня восстановленного глутатиона в мозге эмбрионов в третий триместр беременности. Отмена алкоголизации в конце беременности не полностью восстанавливает показатели ПОЛ и активность антиоксидантных систем в ранний постнатальный период (7-21-49 дни жизни). Сходная закономерность наблюдается и при отмене алкоголизации на 21-й день постнатального развития. Синтетический адаптоген трекрезан и антигипоксант метапрот, назначаемые в период внутриутробного развития и в ранний постнатальный период одновременно с алкоголизацией, уменьшают нарушения ПОЛ и активности антиокислительных систем как у эмбрионов, так и у крысят в постнатальный период (7-21-49 дни жизни). При этом наибольшую противоалкогольную активность проявляет трекрезан. Кроме того, трекрезан и, в меньшей степени, метапрот восстанавливают процессы перекисного окисления липидов и активность антиокислительных систем в мозге половозрелых крыс, хронически потреблявших этанол с 21-го дня жизни.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные экспериментальные данные о нарушениях процессов ПОЛ и антиоксидантных систем под влиянием этанола в период беременности и лактации у крыс позволяют рассматривать эти показатели как важный дополнительный диагностический критерий возможного повреждения мозга в период гестации или ранний постнатальный период. Экспериментально доказано, что синтетический адаптоген трекрезан и, в меньшей степени, антигипоксант метапрот, назначаемые в период внутриутробного развития и в ранний постнатальный период одновременно с алкоголизацией, уменьшают нарушения ПОЛ и активности антиокислительных систем как у эмбрионов, так и у крыс в постнатальный период. Это позволяет рекомендовать трекрезан и метапрот для углубленного клинического исследования в качестве средств, обладающих антитератогенной активностью у беременных. Наконец, полученные данные о развитии процессов ПОЛ и антиоксидантных систем в онтогенезе расширяют теоретические и практические представления о формировании (созревании) нервной системы в раннем онтогенезе, что следует учитывать в педиатрической практике и при изучении девиантных форм поведения у подростков и в пубертатном периоде.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Системы ПОЛ (малоновый диальдегид) и антиоксидантные системы (восстановленный глутатион, активность супероксиддисмутазы и каталазы) активно развиваются в третий триместр беременности крыс и в раннем постнатальном периоде (до 21-го дня жизни), достигая значений, типичных для половозрелых особей.

2. Алкоголизация беременных самок активирует процессы ПОЛ и системы антиоксидантной защиты в мозге эмбрионов и потомства (до 7 недель жизни). Однократное введение больших доз этанола и ацетальдегида беременным самкам также способно индуцировать повышение процессов ПОЛ с одновременным снижением уровня восстановленного глутатиона в мозге эмбрионов.

3. Отмена алкоголизации в конце беременности или на 21-й день постнатального развития не полностью восстанавливает показатели ПОЛ и активность антиоксидантных систем в ранний постнатальный период вплоть до 7 недель.

4. Синтетический адаптоген трекрезан и, в меньшей степени, антигипоксант метапрот, назначаемые в период внутриутробного развития и в ранний постнатальный период одновременно с алкоголизацией, уменьшают нарушения ПОЛ и активности антиокислительных систем как у эмбрионов, так и у крысят в постнатальный период. Этот тип действия трекрезана и метапрота характерен и для половозрелых крыс, хронически потреблявших этанол с 21-го дня жизни.

Апробация и публикация материалов исследования. Материалы диссертации доложены на 4-й международной научной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2006); на XX съезде физиологического общества им. И.П.Павлова (Москва, 2007), на заседании Санкт-Петербургского научного общества фармакологов (2008).

Апробация диссертации прошла на межкафедральном заседании кафедры фармакологии и кафедры акушерства и гинекологии Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова.

Реализация результатов работы. Диссертационная работа выполнена в рамках плановой темы НИР Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова. Оригинальные авторские подходы методического характера реализованы в научно-исследовательской деятельности и учебном процессе кафедр фармакологии, нормальной физиологии и акушерства и гинекологии Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 4 статьи (1 статья в журнале, рекомендованном ВАК) и 5 тезисов.

Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 153 страницах машинописного текста, иллюстрированы 12 таблицами и 6 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы. Библиографический указатель содержит 413 наименований, в том числе 262 отечественных и 151 иностранных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Общий дизайн исследования. Экспериментальные исследования выполнены на кафедре фармакологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова. Объектом исследования служили 74 половозрелые белые крысы самки Вистар массой 200-250 г. и 624 эмбриона и крысят самцов и самок разного возраста (эмбрионы 13-17 дня беременности, крысята в возрасте 1, 3 и 7 недель). Самки в течение всего периода беременности содержались на специальной диете, включавшей сухой брикетированный корм и 20%-ный раствор этанола в качестве единственного источника жидкости. Часть животных (23 крысы, 1-я группа) брали в опыт на 13-17 дни беременности, другую часть (29 крыс, 2-я группа) переводили на обычный питьевой режим на 20-й день беременности, в 3-й группе (22 крысы) животные потребляли этанол до конца лактации и вскармливания потомства

(период включал 21 день постнатального развития), в 4-й группе крысят алкоголизировали 20%-ным раствором этанола с 21-го дня жизни до половозрелое™ (до возраста 95-100 дней). Помет каждой самки составлял 812 крысят. В опытах оценивали массу мозга и тела эмбрионов и массу мозга и тела потомства. На 21-й день после рождения самок из 3-й группы отсаживали и крысят переводили на обычный рацион питания и потребления жидкости (воды). В опыт брали крысят самцов на 7-й, 21-й и 50-й дни постнатального развития.

Потомство половозрелых самок (возраст 95-100 дней) после отмены этанола на 20-й день беременности (2-я группа) тестировали на предпочтение потребления этанола и воды. Тестирование проводили в течение 10 дней в индивидуальных клетках при добровольном выборе между водой и 10%-ным раствором этанола.

В выборе животных, их содержании и подготовке к эксперименту руководствовались современными требованиями (Трахтенберг И.М. и др., 1991). Животных содержали в виварии в стандартных условиях освещения и питания. Исследования осуществлялись в соответствии с требованиями «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. В.П.Фисенко. М.: МЗ РФ, 2000».

Биохимические методы исследований. В цельном мозге эмбрионов и мозге взрослых крыс, замороженных в жидком азоте, определяли показатели перекисного окисления липидов и активности антиоксидантных систем.

О состоянии антиоксидантной системы мозга судили по активности СОД и содержанию восстановленного глутатиона в 10%-ном гомогенате мозга в 25 ммолярном трис-НС1 с 175 ммолярном КС1 буфере (рН 7,4). Активность СОД оценивали методом Е.Е. Дубининой и соавторов (1983) по степени ингибирования восстановления нитросинего тетразолия в присутствии феназинметасульфата и НАДН и относили к содержанию белка в пробах, которое определяли унифицированным методом О.Н. Ьо\угу и соавторов (1951). Содержание восстановленного глутатиона определяли по его реакции с избытком аллоксана (Путилина Ф.Е., 1982). Уровень ПОЛ ткани определяли методом содержания продуктов ПОЛ (малоновый диальдегид), реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (Стальная И.Д., 1977). Диеновые конъюгаты экстрагировали из навески ткани мозга массой 100 мг смесью гептана и изопропанола в соотношении 1:1 в объеме 2 мл и определяли по методу И.Д. Стальной (1977).

Фармакологические средства. В работе использовали адаптоген и иммуномодулятор трекрезан и антигипоксант метапрот (бемитил). Трекрезан (триэтаноламмониевая соль 2-метилфеноксиуксусной кислоты) создан в Иркутском институте органической химии СО РАН, прошел доклинические и клинические испытания и с 1994 г. разрешен к широкому применению. Препарат выпускается отечественной промышленностью в виде таблеток по 0,2 г (ЗАО «Витанта», Санкт-Петербург). Трекрезан представляет собой малотоксичное соединение, обладает различными

положительными свойствами, защищая организм от стресса (иммобилизационного, болевого, гиподинамического), ускоряет заживление поврежденных тканей (печень, миокард, мышцы), защищает внутренние органы от повреждающего действия токсинов, СВЧ-облучения, инфекционного фактора, проявляет выраженную антиоксидантную активность (Казимировская В.Б. и др., 1996).

Метапрот (2-этилтиобензимидазола гидробромид, бемитил) является производным бензимидазола - соединения, близкого по строению к пуриновым основаниям нуклеиновых кислот - аденину и гуанину. Выпускается отечественной промышленностью в виде капсул по 0,125 г и 0,25 г ЗАО «Фармпроект» по лицензии ЗАО «Антивирал» (Санкт-Петербург). Метапрот обладает репаративным действием, основанным на способности препарата активировать естественно протекающие в организме реакции протеинсинтеза. В лечебной практике метапрот используется в неврологии, психиатрии, кардиологии, кардиохирургии, токсикологии, отоларингологии, терапии, хирургической патологии кишечника и заболеваний верхних дыхательных путей. Назначают метапрот в качестве лечебно-реабилитационного средства для ускорения восстановления работоспособности и физической выносливости при астенических состояниях, угнетении иммунитета, нарушениях энергетического и пластического обмена (Шабанов П.Д., 2008, 2010). В качестве препарата неистощающего типа действия метапрот используется у здоровых лиц при утомлении, для повышения физической работоспособности и усиления процессов адаптации в экстремальных условиях (гипоксия, перегревание, психоэмоциональный стресс и др.).

В экспериментах трекрезан и метапрот вводили крысам в виде 0,05%-ного питьевого раствора, который смешивали с 20%-ным раствором этанола, потребляемым крысами в качестве единственного источника жидкости. Оптимальная эффективная доза трекрезана и метапрота составила 10 мг/сутки на крысу, или 50 мг/кг массы тела в сутки. Контрольные группы животных получали в эквивалентном объеме физиологический раствор. Структура и объем исследования представлены ниже:

1. Изучение уровня ПОЛ и системы антиоксидантной защиты мозга эмбрионов и потомства при нормальном онтогенезе и после внутриутробного действия этанола (20 взрослых крыс, 170 эмбрионов и крысят в возрасте 1-7 недель);

2. Изучение состояния ферментов антиоксидантной защиты, уровней восстановленного глутатиона и ПОЛ мозга эмбрионов при острой алкогольной интоксикации и действии ацетальдегида (18 взрослых крыс, 152 эмбриона);

3. Изучение действия трекрезана и метапрота на активность антиоксидантной системы и уровень ПОЛ мозга эмбрионов и потомства при внутриутробной алкоголизации (18 крыс, 156 эмбрионов и крысят в возрасте 1-7 недель);

4. Изучение действия трекрезана и метапрота на активность антиоксидантной системы и уровень ПОЛ мозга половозрелых крыс, алкоголизированных с 21-го дня жизни (18 крыс, 146 крысят в возрасте 1-7 недель);

Статистическая обработка результатов исследования. Выборка для каждой группы животных составила не менее 10 крыс (эмбрионов). Математическую обработку результатов исследования проводили на персональном компьютере с использованием стандартного пакета программ STATISTICA for Windows по общеизвестным методам вариационной статистики с оценкой статистической значимости показателей и различий рассматриваемых выборок по t-критерию Стьюдента при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Изучение уровня перекисного окисления липидов и системы антиоксидантной защиты мозга эмбрионов и потомства при нормальном онтогенезе и после внутриутробного действия этанола

Влияние внутриутробного действия этанола на развитие потомства и предпочтение к алкоголю у крыс. Содержание беременных самок крыс на диете, содержащей 20%-ный этанол, приводит к изменению ряда общих и биохимических показателей эмбрионов и потомства крыс. В наших исследованиях внутриутробное действие этанола задерживало развитие, о чем свитетельствует снижение массы тела и мозга (14-17-дневные эмбрионы) на 14-19% (р<0,05). Отставание развития наблюдается и у потомства. При этом масса мозга и тела потомства самок, находившихся в условиях алкоголизации, была достоверно ниже контрольных величин вплоть до 21 дня постнатального развития (возраста 7 недель). Кроме того, наблюдали снижение числа крысят в потомствах крыс, получавших этанол во время беременности, до 8±1 против 11±1 в контроле, что указывает на увеличение внутриутробной гибели зародышей.

Тестирование на предпочтение воды и этанола потомства в возрасте 95-100 дней показало, что интактные крысы потребляют 29±5% раствора этанола от общего объема выпитой жидкости. Потомство алкоголизированных в период беременности крыс этого же возраста потребляло 45±6% раствора этанола от общего объема выпитой жидкости (Р<0,05).

Таким образом, полученные данные подтверждают наличие эмбриотоксического действия этанола у крыс, находившихся в условиях полупринудительной алкоголизации в период беременности, отмеченное и в других исследованиях (Кругликов Р.И., Майзелис М.Я., 1987; Бичевая Н.К., 1996; Ганапольский В.П., 2004).

Перекисное окисление липидов и активность системы антиоксидантной защиты мозга эмбрионов и потомства при нормальном онтогенезе. В данном разделе изучены особенности формирования и реализации систем перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты мозга эмбрионов и потомства при нормальном онтогенезе.

Динамика изменений уровня малонового диальдегида в раннем онтогенезе и у половозрелых крыс представлена в табл. 1.

Таблица 1

Динамика уровня малонового диальдегида в мозге эмбрионов и потомства крыс при нормальном онтогенезе

Дни развития Содержание малонового диальдегида в мозге (мкмоль/г белка)

Внутриутробное развитие

13-й день 0,22±0,05

14-й день 0,25±0,06

15-й день 0,31±0,06

16-й день 0,44±0,09

17-й день 1,73±0,21

Постнатальное развитие

7-й день (1 неделя) 6,57±0,22

21-й день (3 недели) 7,01±0,23

49-й день (7 недель) 3,52±0,19

98-й день (14 недель) 3,20±0,21

Видно, что уровень малонового диальдегида на 13-16-й дни внутриутробного развития малы и составляют 0,22-0,44 мкмоль/г белка. С 17-го дня гестации содержание малонового диальдегида начинает резко возрастать. Максимальные значения этого показателя наблюдали на 7-й и 21-й дни постнатального развития (6,57-7,01 мкмоль/г белка) с дальнейшим снижением вдвое через 7 недель до уровня 3,52±0,19 мкмоль/г белка, который сохранялся на этом уровне у половозрелых крыс.

Активность антиоксидантных систем оценивали по уровню восстановленного глутатиона и активности каталазы и СОД. Данные этих наблюдений представлены в табл. 2.

Внутриутробное действие этанола сопровождается рядом изменений со стороны антиокислительных систем.

Динамика активности СОД в целом повторяет динамику изменений малонового диальдегида. С развитием мозга эмбриона активность СОД возрастает от 0,46±0,07 на 13-й день до 1,71±0,28 А/мг белка на 17-й день пренатального развития. После рождения активность СОД продолжает расти, достигая максимума (3,76±0,40 А/мг белка) к концу 3-й недели

постнатального развития. В дальнейшем активность СОД несколько снижается и составляет у половозрелых крыс 1,41±0,24 А/мг белка, то есть близка к уровню новорожденных животных. Аналогичную с СОД картину наблюдали и в отношении восстановленного глутатиона. Уровень восстановленного глутатиона равномерно возрастает в период пренатального развития эмбриона (с 12,51±2,06 мкмоль/г на 13-й день до 19,57±4,01 мкмоль/г на 17-й день беременности) и продолжает расти после рождения, достигая максимума (31,04±7,11 мкмоль/г) в период половозрелости.

Таблица 2

Динамика уровня восстановленного глутатиона и активностей каталазы и супероксиддисмутазы в мозге эмбрионов и потомства крыс при нормальном

онтогенезе

Дни развития Восстановленный глутатион (мкмоль/г) Катал аза (мкмоль Н202/ мин-мг белка) Супероксидди смутаза (А/мг белка)

Внутриутробное развитие

13-й день 12,51±2,06 27,84±1,92 0,46±0,07

14-й день 14,07±2,91 38,17±2,19 0,56±0,09

15-й день 17,23±3,63 34,58±2,21 0,74±0,12

16-й день 19,02±3,06 33,13±1,89 1,37±0,22

17-й день 19,57±4,01 32,38±1,77 1,71±0,28

Постнатальное развитие

7-й день (1 неделя) 21,52±4,83 10,24±1,37 2,52±0,36

21-й день (3 недели) 27,06±6,03 8,63±1,18 3,76±0,40

49-й день (7 недель) 24,11±5,08 5,44±1,11 2,78±0,36

98-й день (14 недель) 31,04±7,11 4,21 ±0,82 1,41 ±0,24

Напротив, активность каталазы претерпевает динамику, прямо противоположную СОД и восстановленному глутатиону. На 13-й день беременности в мозге эмбрионов регистрируется активность, равная 27,84±1,92 мкмоль Н2О2/ мин-мг белка. В дальнейшем, на 14-17-й дни беременности активность каталазы колеблется в пределах 38,17-32,38 мкмоль Н202/ мин-мг белка. После рождения активность фермента снижается почти в 4 раза до 10,24±1,37 мкмоль Н202/ мин-мг белка на 7-й день постнатального развития и продолжает падать до 4,21±0,82 мкмоль Н202/ мин-мг белка у половозрелых крыс.

Обобщая приведенные данные, следует подчеркнуть, что в раннем постнатальном периоде (7-21-й дни) у крыс складывается стабильный статус антиоксидантной системы и уровня ПОЛ.

Перекисное окисление липидов и активность системы антиоксидантной защиты мозга эмбрионов и потомства при алкоголизации матерей. Содержание беременных крыс на диете,

содержащей этанол, меняет показатели ПОЛ и антиоксидантных систем (табл. 3).

Таблица 3

Динамика уровня малонового диальдегида и активностей каталазы и супероксиддисмутазы в мозге эмбрионов крыс при алкоголизации беременных самок

Дни развития Малоновый диальдегид (мкмоль/г белка) Каталаза (мкмоль П202/ мин-мг белка) Супероксиддисмутаза (А/мг белка)

Нормальный онтогенез (контроль)

13-й день 0,22±0,05 27,84±1,92 0,46±0,07

14-й день 0,25±0,06 38,17±2,19 0,56±0,09

15-й день 0,31±0,06 34,58±2,21 0,74±0,12

16-й день 0,44±0,09 33,13±1,89 1,37±0,22

17-й день 1,73±0,21 32,38±1,77 1,46±0,19

Алкоголизация

13-й день 0,23±0,05 22,88±2,56 0,70±0,10

14-й день 0,32±0,05* 44,81±2,89* 0,90±0,07*

15-й день 0,40±0,06 38,38±2,43* 0,72±0,11

16-й день 0,65±0,08* 37,72±1,71* 1,63±0,21*

17-й день 2,28±0,24 40,54±2,19* 1,81±0,19*

Примечание. *р<0,05 по отношению к контролю.

Во-первых, начиная с 14-го дня эмбриогенеза, на 12-20% повышаются уровни малонового диальдегида (ПОЛ), которые сохраняются повышенными до 17-го дня беременности. При отмене этанола на 20-й день беременности содержание малонового диальдегида возвращается к норме. При сохранении потребления этанола до конца лактации уровень малонового диальдегида сохраняется повышенным на 16-21%.

Одновременно с повышением уровня малонового диальдегида в мозге алкоголизированных эмбрионов на 14-17-е сутки развития на 14-29% была повышена активность каталазы, что указывает на вероятность повышенного образования перекиси водорода в мозге при алкоголизации. Перекись водорода является высокотоксичным промежуточным продуктом восстановления кислорода, запускающего и поддерживающего ПОЛ.

Внутриутробная алкоголизация также инициировала повышение активности СОД на 15-40%, что проявлялось на 14-й, 16-й и 17-й дни развития (р<0,05). Интересно отметить, что повышенные значения СОД оставались и после отмены алкоголя на 7-21-49-й дни постнатального развития (табл. 4). При этом на 7-й и 21-й дни постнатального периода уровень активности СОД превышал соответствующие контроли на 32-36%

и

(р<0,01). Это указывает на выраженную активацию супероксид-генерирующей системы мозга этанолом. По-видимому, данные изменения наименее подвержены компенсации после отмены алкоголизации.

Таблица 4

Динамика уровня малонового диальдегида, восстановленного глутатиона и активностей каталазы и супероксиддисмутазы в мозге потомства крыс, рожденных от алкоголизированных беременных самок

Дни постнатального развития Малоновый диальдегид (мкмоль/г белка) Каталаза (мкмоль Н202/мин-мг белка) Супероксид- дисмутаза (А/мг белка) Восстановленный глутатион (мкмоль/г)

Нормальный онтогенез (контроль)

7-й день 6,57±0,22 10,24±1,37 2,52±0,36 21,52±4,83

21-й день 5,14±0,23 8,63±1,18 3,76±0,40 27,06±6,03

49-й день 3,52±0,19 5,44±1,11 2,78±0,36 24,11±5,08

Алкоголизация самок в период беременности

7-й день 6,29±0,24 12,72±2,18 3,33±0,32** 19,51±4,07

21-й день 4,09±0,23 8,19±1,28 5,12±0,29* 28,05±5,52

49-й день 3,31±0,18 5,13±1,19 3,82±0,29 23,09±5,38

Примечание. *р<0,05; **р<0,01 по отношению к контролю.

Нельзя исключить, что одной из причин повышения уровня ПОЛ в мозге эмбрионов является уменьшение содержания восстановленного глутатиона. На 15-й день эмбриогенеза мы регистрировали снижение уровня восстановленного глутатиона на 13% (р<0,05). В мозге потомства, не потреблявшего этанол после рождения, содержание восстановленного глутатиона нормализовалось к 7-му дню постнатального развития, не подвергаясь в дальнейшем изменениям. Если алкоголизацию не отменяли при вскармливании крысят, то уровень восстановленного глутатиона в мозге 7-дневных крысят возрастал на 34% (р<0,01; табл. 5). Данное увеличение содержания восстановленного глутатина свидетельствует об определенной напряженности функционирования антиоксидантной системы и повышении свободнорадикальных реакций, которые обеспечивают активацию системы ПОЛ в мозге в исследованные сроки наблюдений.

Таблица 5

Динамика уровня малонового диальдегида, восстановленного глутатиона и активностей каталазы и супероксиддисмутазы в мозге потомства крыс, рожденных от самок, алкоголизированных в период беременности и вскармливания, а также после отмены этанола на 21-й день постнатального

развития

Дни постнатального развития Малоновый диальдегид (мкмоль/г белка) Катал аза (мкмоль н2о2/ мин-мг белка) Супероксид-дисмутаза (А/мг белка) Восстановленный глутатион (мкмоль/г)

Нормальный онтогенез (контроль)

7-й день 6,54±0,22 14,52±2,58 2,57±0,33 21,52±4,83

21-й день 5,11±0,23 8,28±1,32 2,66±0,31 27,06±6,03

49-й день 3,49±0,19 5,22±1,14 2,72±0,30 24,11±5,08

Алкоголизация самок в период беременности и вскармливания

7-й день 7,76±0,25** 13,88±2,14 2,73±0,30 29,38±4,72**

21-й день 7,69±0,23** 8,62±1,39 4,38±0,27* 28,96±5,06

Отмена алкоголя

49-й день | 3,82±0,19 | 4,81±1,43 | 3,80±0,28* | 20,56±4,89

Примечание. *р<0,05; **р<0,01 по отношению к контролю.

Исходя из приведенных данных, можно констатировать, что повышенный уровень свободнорадикального окисления липидов в мозге эмбрионов, вызванный алкоголизацией, не в полной мере компенсируется повышением активности антиоксидантных ферментов (каталазы и СОД).

Одной из причин активации ПОЛ, как показано в исследованиях С.О. Бурмистрова (1990), является сниженный уровень восстановленного глутатиона в тканях. Наши опыты также подтверждают, что возможной причиной повышенного уровня ПОЛ в мозге эмбрионов при алкоголизации может быть сниженное содержание восстановленного глутатиона. Продолжение алкоголизации потомства после рождения сопровождается сохранением повышенной активности свободнорадикальных механизмов. Об этом в данном случае свидетельствует повышенный уровень ПОЛ и восстановленного глутатиона.

Перекисное окисление липидов и активность системы антиоксидантной защиты мозга эмбрионов при острой алкогольной интоксикации и действии ацетальдегида. Обзор литературы показывает,

что отдельные признаки эмбриотоксичности развиваются уже при эпизодическом или даже однократном действии этанола (Бурмистров С.О., 1990; Бичевая Н.К., 1996; Ганапольский В.П., 2004). Поэтому нами было исследовано влияние алкогольной интоксикации на ПОЛ и систему антиоксидантной защиты при однократном внутрибрюшинном введении беременным крысам (14-й день беременности) этанола в дозах 1 и 3 г/кг.

Однократное введение этанола (1 г/кг) беременным крысам на 39% повышало содержание малонового диальдегида и почти вдвое - активность СОД через 1 ч после введения алкоголя (табл. 6). Содержание восстановленного глутатиона и активность каталазы также возрастали, но в меньшей степени. Через 3 ч после введения этанола эти изменения сохранялись, хотя были выражены существенно меньше, и практически полностью возвращальсь к норме через 24 ч.

Сходное, но более выраженное действие на активность СОД оказывал этанол в дозе 3 г/кг. При этом максимальные изменения активности системы антиоксидантной защиты и ПОЛ наблюдали не через 1 ч, а через 3 ч после введения. Так, вместо повышения содержание малонового диальдегида через 1 ч уменьшалось на 20%, а через 3 ч - даже на 82% (р<0,01) при возрастании СОД на 69% и 116% соответственно.

Таблица 6

Влияние острого введения этанола беременным крысам на уровни малонового диальдегида, восстановленного глутатиона и активность каталазы и супероксиддисмутазы в мозге 14-дневных эмбрионов

Время после введения Малоновый диальдегид (мкмоль/г белка) Каталаза (мкмоль Н2Ог/ мин-мг белка) Супероксид-дисмутаза (А/мг белка) Восстановленный глутатион (мкмоль/г)

Контрольные животные

1 ч 0,25±0,06 38,22±2,19 0,56±0,09 14,07±2,83

Зч 0,29±0,05 37,67±2,08 0,57±0,08 15,12±3,06

24 ч 0,27±0,06 38,87±1,88 0,58±0,08 16,02±3,21

Этанол 1 г/кг

1 ч 0,25±0,06 39,08±2,12 1,04±0,10* 16,06±2,58

3 ч 0,35±0,05** 41,17±2,68 0,88±0,09* 19,61±3,17

24 ч 0,29±0,07 39,89±1,94 0,64±0,09 15,49±3,01

Этанол 3 г/кг

1 ч 0,20±0,06 41,57±2,21 0,95±0,09* 17,01±3,19

Зч 0,04±0,02** 48,58±3,22* 1,23±0,10** 22,55±3,07*

24 ч 0,24±0,05 40,24±2,14 0,70±0,10 18,38±3,29

Примечание. *р<0,05; **р<0,01 по отношению к контролю.

Последний факт (снижение ПОЛ через 3 ч после введения этанола 3 г/кг), по-видимому, связан с нарушением этанолом функции плаценты и

снабжения тканей зародыша кислородом. В этом случае нарушается деятельность окислительно-восстановительных реакций и нормальное восстановление кислорода, приводящее к нарушению ПОЛ. Кроме того, нельзя исключить, что в высокой дозе этанол сам способен стимулировать процесс образования ОН-радикалов, что может снижать интенсивность свободнорадикального окисления липидов.

Таким образом, этанол в дозе 1 г/кг активирует, а в дозе 3 г/кг подавляет свободнорадикальное окисление липидов в мозге 14-дневных эмбрионов. При этом повышение активности СОД указывает на усиленное образование супероксидных радикалов.

Известно, что токсические эффекты этанола на плод могут быть связаны с токсическим действием основного метаболита этанола -ацетальдегида. Нами исследовано влияние ацетальдегида при внутриамниотическом введении на содержание малонового диальдегида и активность антиоксидантных систем (СОД, каталаза, восстановленный глутатион) мозга 14-дневных эмбрионов.

Внутриамниотическое введение ацетальдегида (1,76 мг/зародыш, или 4 мкмоль/зародыш), сходно с этанолом (1 г/кг массы) повышало содержание малонового диальдегида в мозге на 55-69% через 1,5-3 ч после введения токсиканта (табл. 7). Параллельно регистрировали падение активности СОД, особенно выраженное через 3 ч после введения ацетальдегида. Этот факт связан, по-видимому, с повреждающим действием высокореактивного ацетальдегида на фермент, следствием чего и является повышение ПОЛ. Другой причиной активации ПОЛ может быть снижение в мозге эмбрионов под действием ацетальдегида уровня восстановленного глутатиона на 1618%.

Таблица 7

Влияние ацетальдегида при внутриамниотическом введении беременным крысам на уровни малонового диальдегида, восстановленного глутатиона и активность каталазы и супероксиддисмутазы в мозге 14-дневных эмбрионов

Время после введения Малоновый диальдегид (мкмоль/г белка) Каталаза (мкмоль Н2О2/ мин-мг белка) Супероксид-дисмутаза (А/мг белка) Восстановленный глутатион (мкмоль/г)

Контрольные животные

1,5 ч 0,25±0,06 37,18±2,21 0,56±0,09 14,07±2,82

Зч 0,29±0,05 38,74±2,04 0,57±0,08 15,12±2,06

Ацетальдегид 1,76 мкг/зародыш

1,5 ч 0,42±0,06* 38,89±2,18 0,42±0,06 11,75±1,58

Зч 0,45±0,05* 40,87±2,28 0,33±0,07* 12,31±2,17*

Примечание. *р<0,05 по отношению к контролю.

Изменение уровня ПОЛ и восстановленного глутатиона происходят при неизменной активности каталазы и сниженной активности СОД. Не исключено, что в данном случае не происходит активации свободнорадикальных продуктов. Следовательно, действие ацетальдегида в целом совпадает с эффектами этанола в дозе 1 г/кг, то есть с алкогольной интоксикацией животных. Это с высокой степенью уверенности позволяет утверждать, что токсические эффекты этанола на процессы ПОЛ и системы антиоксидантной защиты обусловлены ацетальдегидом.

Фармакологическая коррекция последствий внутриутробной алкоголизации, оцененная по уровню перекисного окисления липидов и системы антиоксидантной защиты мозга эмбрионов и потомства

Влияние трекрезана и метапрота на перекисное окисление липидов и активность системы антиоксидантной защиты мозга эмбрионов и потомства при внутриутробной алкоголизации. Природные и синтетические антиоксиданты представляют собой пример возможного использования при нарушении процессов ПОЛ в мозге эмбрионов при внутриутробной алкоголизации. Так, показано (Бурмистров С.О., 1990; Чуваев И.В., 1993), что экстракты элеутерококка и родственного растения РоНвааз АНаАэНа защищают плод при алкоголизации беременных самок крыс. Подобным действием могут обладать и синтетические антиоксиданты, такие как метапрот (бемитил), трекрезан и другие. Несмотря на хорошие результаты, полученные с растительными антиоксидантами, все же остается не всегда решимой проблема их стандартизации, дозирования, традиций применения. Синтетические антиоксиданты просты с химической точки зрения, удобны в применении (таблетки, капсулы), не обладают выраженными побочными эффектами (Шабанов П.Д., 2008).

Нами выбраны два синтетических антиоксиданта - метапрот и трекрезан - для изучения возможностей нормализации нарушенной алкоголизацией системы ПОЛ и антиоксидантной системы у крыс. В этих опытах 0,05%-ный раствор метапрота или трекрезана добавляли в 20%-ный раствор этанола, которым алкоголизировали беременных самок крыс. Расчетная доза препаратов, которые получали крысы, была равна 50 мг/кг/сутки (крыса в среднем потребляет около 20 мл, в которых содержится 10 мг/сутки вещества на крысу).

Антиалкогольное действие трекрезана в наших опытах проявлялось увеличением числа крысят в пометах алкоголизированных пренатально крыс (табл. 8).

Таблица 8

Влияние внутриутробной алкоголизации и синтетических антиоксидантов на число новорожденных крысят в пометах

Группы крыс Число новорожденных крысят в пометах

Контроль (без алкоголизации) 11±1

Внутриутробная алкоголизация беременных крыс 8±1*

Алкоголизация + трекрезан 10±1#

Алкоголизация + метапрот 9±1

Примечание. *р<0,05 по отношению к контролю; #р<0,05 по отношению к группе алкоголизированных крыс.

Из таблицы видно, что в контрольной группе (без алкоголизации) число новорожденных крысят составило 11±1 на помет. Алкоголизация беременных самок с 1-го дня беременности снижала число новорожденных крысят до 8±1 (р<0,05). Трекрезан и, в меньшей степени, метапрот, вводимые на протяжении беременности алкоголизированным крысам, восстанавливали число новорожденных крысят до 10±1 и 9±1 соответственно.

Как уже отмечалось выше, внутриутробная алкоголизация крыс задерживала постнатальное развитие потомства, оцененное по массе тела и массе мозга, вплоть до 49-го дня развития (дефицит массы составил -1520%). В группах крыс, получавших этанол и трекрезан или этанол и метапрот, уже к 21-му дню постнатального периода крысята не отличались от контрольных по массе тела и массе мозга.

Влияние трекрезана и метапрота на перекиеное окисление липидов и активность системы антиоксидантной защиты мозга потомства, рожденного от самок, алкоголизированных в период беременности и лактации.

Полученные морфометрические данные были подтверждены и в биохимических исследованиях (табл. 9). Так, трекрезан в целом нормализовал вызванные этанолом изменения в активности ПОЛ и антиокислительных систем. Наиболее чувствительными показателями при этом оказались содержание малонового диальдегида и активность СОД при отсутствии значимых изменений в содержании восстановленного глутатиона и активности каталазы. В наших опытах трекрезан снижал повышенную алкоголизацией продукцию малонового диальдегида на 14-й и 15-й дни эмбриогенеза, а повышенную активность СОД - на 13-14-15-й дни развития

эмбрионов. Данный факт указывает на выраженное антиоксидантное действие трекрезана, проявляемое в период эмбриогенеза.

Таблица 9

Влияние трекрезана и метапрота на динамику уровня малонового диальдегида и активностей каталазы и супероксиддисмутазы в мозге _эмбрионов крыс при алкоголизации беременных самок_

Дни развития Малоновый диальдегид (мкмоль/г белка) Катал аза (мкмоль Н202/ мин-мг белка) Супероксиддисмутаза (А/мг белка)

Алкоголизация

13-й день 0,23±0,05 22,88±2,57 0,70±0,10

14-й день 0,32±0,05 44,76±2,87 0,90±0,07

15-й день 0,40±0,06 38,37±2,42 0,72±0,11

16-й день 0,65±0,08 37,67±1,66 1,63±0,21

17-й день 2,28±0,24 40,49±2,18 1,81±0,19

Алкоголизация + Трекрезан

13-й день 0,22±0,05 26,36±1,82 0,52±0,08*

14-й день 0,27±0,06* 50,17±2,09 0,69±0,09*

15-й день 0,30±0,06* 44,12±1,87* 0,96±0,13*

16-й день 0,45±0,09* 34,89±1,77 1,30±0,21

17-й день 1,71±0,18* 37,77±1,89 1,63±0,19

Алкоголизация + Метапрот

13-й день 0,21±0,05 26,87±1,92 0,63±0,09

14-й день 0,29±0,05 40,88±2,04 0,79±0,09

15-й день 0,35±0,06 40,09±1,83 0,66±0,11

16-й день 0,49±0,09* 36,46±2,03 1,33±0,20

17-й день 2,03±0,19 38,71±1,77 1,56±0,20

Примечание. *р<0,05 по отношению к алкоголизированным крысам. Метапрот в условиях наших исследований был менее активен, чем трекрезан. Он снижал лишь повышенное алкоголем содержание малонового диальдегида на 16-й день эмбриогенеза. Показатели антиоксидантных систем (активность СОД, каталазы, содержание восстановленного глутатиона) имели лишь тенденцию к положительным изменениям, хотя статистически достоверных результатов мы не отметили.

В постнатальный период (7-21-49-й дни) жизни крысят, рожденных от алкоголизированных в период беременности самок (отмена этанола на 20-й день беременности), показатели ПОЛ (содержание малонового диальдегида) и антиоксидантных систем, за исключением СОД, в мозге крысят существенно не отличались от контрольных животных. Активность СОД потомства, рожденного от алкоголизированных в период беременности крыс, была на 28-36% повышена во все исследуемые сроки. Трекрезан, назначенный в период алкоголизации крыс, нормализовал активность СОД в мозге 21-дневных крысят (табл. 10). На 7-й и 49-й дни жизни активность

СОД оставалась достоверно повышенной в сравнении с контролем, хотя отмечена явная тенденция к ее снижению. Сходное, но менее выраженное действие проявил и метапрот, также снижавший повышенную активность СОД в исследуемые сроки. При этом достоверное снижение активности СОД регистрировали и на 21 -й, как и в случае с трекрезаном, и на 49-й дни жизни крысят.

Таблица 10

Влияние трекрезана и метапрота на динамику уровня малонового диальдегида, восстановленного глутатиона и активностей каталазы и супероксиддисмутазы в мозге потомства крыс, рожденных от

Дни постнатального развития Малоновый диальдегид (мкмоль/г белка) Катал аза (мкмоль н2о2/ мин-мг белка) Супероксид-дисмутаза (А/мг белка) Восстановленный глутатион (мкмоль/г)

Алкоголизация

7-й день 6,29±0,24 12,66±2,18 3,33±0,32 19,61±4,07

21-й день 4,09±0,23 8,24±1,29 5,12±0,29 28,05±5,52

49-й день 3,31±0,18 5,14±1,18 3,82±0,29 23,09±5,38

Алкоголизация + Трекрезан

7-й день 5,84±0,20 11,43±2,56 3,15±0,32 18,63±4,73

21-й день 4,81±0,21 8,09±1,37 3,38±0,33* 24,08±5,07

49-й день 2,79±0,18 5,27±1,03 3,55±0,33 21,96±5,71

Алкоголизация + Метапрот

7-й день 6,12±0,19 12,42±2,19 3,22±0,35 20,81±5,19

21-й день 5,24±0,22 8,47±1,37 3,85±0,36* 28,12±5,77

49-й день 3,66±0,20 4,87±1,33 3,02±0,30* 25,52±6,22

Примечание. Отмена этанола на 20-й день беременности. *р<0,05 по отношению к группе алкоголизированных крыс.

Важной особенностью изменений ПОЛ и антиокислительных систем мозга потомства крыс (7-21-й дни жизни), алкоголизированных в пре- и постнатальный период, явилось существенное повышение уровня малонового диальдегида, восстановленного глутатиона и активности СОД при практически неизменном уровне активности каталазы. Повышенный уровень малонового диальдегида и активности СОД регистрировали и после отмены потребления этанола животными на 21-й день постнатального развития (после окончания периода лактации и вскармливания крысят). В наших опытах трекрезан нормализовал повышенные значения малонового диальдегида и восстановленного глутатиона в мозге потомства крыс при сохранении потребления этанола в постнатальный период (7-й и 21-й дни

жизни). Активность СОД, повышенная на 21-й день жизни, под действием трекрезана нормализовалась в мозге 49-дневных крысят (табл. 11).

Таблица 11

Влияние трекрезана и метапрота на динамику уровня малонового диальдегида, восстановленного глутатиона и активностей каталазы и супероксиддисмутазы в мозге потомства крыс, рожденных от самок, алкоголизированных в период беременности и вскармливания, а также после

отмены этанола

Дни постнатального развития Малоновый диальдегид (мкмоль/г белка) Каталаза (мкмоль Н202/ мин-мг белка) Супероксид-дисмутаза (А/мг белка) Восстановленный глутатион (мкмоль/г)

Алкоголизация самок в период беременности и вскармливания

7-й день 7,76±0,25 13,86±2,07 2,73±0,30 29,38±3,56

21-й день 7,69±0,23 8,56±1,38 4,38±0,27 28,96±5,06

49-й день 4,22±0,19 4,77±1,39 3,80±0,28 20,56±4,89

Алкоголизация + Трекрезан

7-й день 7,09±0,20* 12,77±2,27 3,10±0,32 24,13±2,81*

21-й день 6,51±0,19* 9,04±1,38 4,32±0,30 21,10±3,17*

49-й день 3,92±0,21 4,79±1,03 2,53±0,27* 17,37±3,61

Алкоголизация + Метапрот

7-й день 6,99±0,16* 14,16±2,08 2,69±0,31 24,95±4,17

21-й день 6,18±0,20* 8,77±1,07 4,11±0,27 22,35±3,44*

49-й день 3,89±0,17 5,52±1,04 2,94±0,24* 19,37±4,28

Примечание. Отмена этанола на 21-й день постнатального развития. *р<0,05; **р<0,01 по отношению к контролю.

Сходное с трекрезаном действие проявил и метапрот. Так, препарат, вводимый в период алкоголизации вместе с этанолом, нормализовал повышенную активность СОД в мозге 49-дневных крысят, устранял повышенное содержание малонового диальдегида и восстановленного глутатиона на 21-й день жизни животных. В случае восстановленного глутатиона трекрезан проявлял свое нормализующее действие уже на 7-й день постнатального развития.

Таким образом, трекрезан и метапрот в целом оказывали благоприятное действие на постнатальное развитие крысят в период 7-49 дней их жизни. Это действие проявлялось как при алкоголизации в период лактации, так и после отмены алкоголя. Наиболее выражено положительное действие трекрезана и метапрота сказывалось на активности СОД и содержании малонового диальдегида и восстановленного глутатиона. При этом трекрезан в одинаковых дозах был несколько активнее метапрота. В то же время следует отметить, что повышенная активность СОД при

алкоголизации сохраняется достаточно долго, и что отмена алкоголя лишь несущественно снижает эту активность. Данный биохимический показатель остается достаточно ригидным к действию исследованных препаратов (трекрезана и метапрота) на фоне алкоголизации, но его чувствительность повышается после отмены этанола.

Изучение антиоксидантных свойств трекрезана и метапрота у половозрелых крыс. В данном разделе исследований крыс самцов алкоголизировали в течение 3 месяцев, начиная с 21-го дня жизни (окончания периода лактации). Часть из них получала 0,05%-ный раствор трекрезана или метапрота. На 90-й день жизни животных декапитировали, выделяли мозг и определяли в нем уровени малонового диальдегида и восстановленного глутатиона, а также активность СОД и каталазы. Данные этой серии исследований представлены в табл.12

Таблица 12

Влияние трекрезана и метапрота на показатели перекисного окисления липидов и систему антиоксидантной защиты в мозге половозрелых алкоголизированных крыс

Показатели Интактные животные Алкоголизация Трекрезан Метапрот

Диеновые конъюгаты, мкмоль/г 21,14±0,38 29,44±0,66* 22,11±0,18# 24,02±0,26#

Малоновый диальдегид, мкмоль/г 3,49±0,09 9,10±0,12* 5,08±0,11*# 7,04±0,23*#

Восстановленный глутатион, мкмоль/ 34,96±0,35 20,56±0,23* 30,47±0,18*# 25,26±0,17*#

СОД, А/мг белка 2,32±0,08 3,02±0,07* 2,45±0,06# 2,84±0,05*#

Каталаза, мкмоль НгОг/мин-мг белка 4,51±0,37 6,5б±0,15* 6,32±0,17* 5,92±0,14*#

Примечание. *р < 0,05 в сравнении с группой интактных животных; #р < 0,05 в сравнении с группой алкоголизированных крыс.

Видно, что алкоголизация на 39% повышала содержание диеновых коньюгатов и почти в 3 раза малонового диальдегида, на 41% снижала уровень восстановленного глутатиона, на 30% повышала активность СОД и на 45% - активность каталазы в мозге.

Трекрезан восстанавливал исходный уровень диеновых коньюгатов и активность СОД, существенно уменьшал содержание малонового диальдегида и повышал уровень восстановленного глутатиона и активность каталазы. Метапрот был несколько менее активен в сравнении с трекрезаном, однако проявил четкую тенденцию к восстановлению всех измененных

алкоголизацией показателей. Их уровни немного не достигали контрольных значений.

Таким образом, трекрезан и метапрот восстанавливают нарушенные алкоголизацией показатели ПОЛ и антиоксидантных систем в мозге половозрелых крыс.

ВЫВОДЫ

1. Системы перекисного окисления липидов (малоновый диальдегид) и антиоксидантные системы (восстановленный глутатион, активность супероксиддисмутазы и каталазы) активно развиваются в третий триместр беременности крыс. В раннем постнатальном периоде (до 21 дня жизни) их активность продолжает возрастать, за исключением каталазы, активность которой в постнатальном периоде падает.

2. Алкоголизация беременных самок активирует процессы перекисного окисления липидов (содержание малонового диальдегида повышается) и системы антиоксидантной защиты (активность супероксиддисмутазы и каталазы повышается) в мозге эмбрионов в третий триместр беременности.

3. Алкоголизация беременных самок снижает число родившихся крысят в помете, а также их массу тела и мозга, которые остаются пониженными вплоть до 7 недель постнатального развития.

4. Этанол (1 г/кг системно) и ацетальдегид (1,76 мг /зародыш внутриамниотически) индуцируют повышение процессов перекисного окисления липидов с одновременным снижением уровня восстановленного глутатиона в мозге эмбрионов в третий трисместр беременности.

5. Отмена алкоголизации в конце беременности не полностью восстанавливает показатели перекисного окисления липидов и активность антиоксидантных систем в ранний постнатальный период (7-21-49 дни жизни): активность супероксиддисмутазы при этом остается значительно повышенной вплоть до 7 недель. Сходная закономерность наблюдается и при отмене алкоголизации на 21-й день постнатального развития.

6. Синтетический адаптоген трекрезан и антигипоксант метапрот, назначаемые в период внутриутробного развития и в ранний постнатальный период одновременно с алкоголизацией, уменьшают нарушения перекисного окисления липидов и активности антиокислительных систем как у эмбрионов, так и у крысят в постнатальный период (7-21-49 дни жизни). При этом наибольшую противоалкогольную активность проявляет трекрезан.

7. Трекрезан и, в меньшей степени, метапрот восстанавливают процессы перекисного окисления липидов и активность антиокислительных систем в мозге половозрелых крыс, хронически потреблявших этанол с 21-го дня жизни.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Показатели перекисного окисления липидов и антиоксидантных систем могут служить важным дополнительным диагностическим критерием

возможного повреждения мозга в период беременности и в ранний постнатальный период.

2. Синтетический адаптоген трекрезан и антигипоксант метапрот следует рекомендовать для углубленного клинического исследования в качестве средств, обладающих антитератогенной активностью у беременных.

3. Полученные данные о развитии процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантных систем в онтогенезе следует учитывать в педиатрической практике при обучении дисциплинам, рассматривающим формирование (созревание) нервной системы в раннем онтогенезе.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шабанов П.Д. Модуляция пептидами самостимуляции латерального гипоталамуса у крыс при хронической алкоголизации / П.Д.Шабанов,

A.А.Лебедев, В.В.Русановский, Е.Е.Воеводин, В.П.Павленко, О.А.Яковлева // Наркология. 2006. №3. С.21-26.

2. Лебедев А.А. Блокада рецепторов кортиколиберина в миндалине астрессином устраняет подкрепляющие эффекты фенамина, морфина и лей-энкефалина на самостимуляцию мозга крыс / А.А.Лебедев, Е.Е.Воеводин,

B.Ф.Стрельцов, В.П.Павленко, В.В.Русановский, Г.В.Саблина, О.А.Яковлева, П.Д.Шабанов // Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам. Матер. 4-й междунар. конф. М., 2006. С.47.

3. Шабанов П.Д. Кортиколиберин и мозговая система подкрепления / П.Д.Шабанов, А.А.Лебедев, Е.Е.Воеводин, В.П.Павленко, В.В.Русановский, Г.В.Саблина, О.А.Яковлева // Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам. Матер. 4-й междунар. конф. М., 2006. С.80.

4. Lebedev А.А. The blockade of amigdaloid corticoliberin receptors by means of astressin diminishes the reinforcing effects of amphetamine, morphine and leu-enkephalin on self-stimulation of the rat brain / A.A.Lebedev, E.E.Voevodin, V.F.Streltsov, V.P.Pavlenko, V.V.Russanovsky, G.V.Sablina, O.A.Yakovleva, P.D.Shabanov // Biological basis of individual sensitivity to psychotropic drugs. Abstracts of 4lh Int. Conf. Moscow, 2006. P. 120.

5. Shabanov P.D. Corticolicoliberin and the reinforcing system of the brain / P.D.Shabanov, A.A.Lebedev, E.E.Voevodin, V.P.Pavlenko, V.V.Russanovsky, G.V.Sablina, O.A.Yakovleva // Biological basis of individual sensitivity to psychotropic drugs. Abstracts of 4lh Int. Conf. Moscow, 2006. P. 120.

6. Лебедев А.А. Модуляция центральных механизмов стресса в раннем онтогенезе введением кортиколиберина и белков теплового шока 70 кДа меняет поведенческие эффекты ноопепта и дилепта у половозрелых крыс / А.А.Лебедев, Г.В.Саблина, В.П.Стеценко, С.В.Марков, И.М.Воейков, Т.А.Гудашева, Р.У.Островская, О.А.Яковлева, Ш.К.Мещеров, П.Д.Шабанов // Психофармакол. и биол. наркол. 2006. Т.6. №3. С.1284-1291.

7. Авалиани T.B. Нарушение и коррекция двигательных и дофамин-зависимых форм поведения у потомства, матери которых подвергались стрессу до беременности // Т.В.Авалиани, Н.К.Белобокова, А.А.Лебедев,

B.В.Сизов, О.А.Яковлева // Психофармакол. и биол. наркол. 2006. Т.6. №3.

C.1292-1298.

8. Лебедев A.A. Модуляция центральных механизмов стресса введением кортиколиберина и БТШ 70 кДа в раннем онтогенезе / А.А.Лебедев, В.П.Стеценко, В.П.Ганапольский, С.В.Марков, И.М.Воейков, Г.В.Саблина, О.А.Яковлева, П.Д.Шабанов // XX съезд физиол. об-ва им. И.П.Павлова. М.: Русский врач, 2007. С.304.

9. Шабанов П.Д. Созревание оксидантных и антиоксидантных систем в раннем онтогенезе у крыс / П.Д.Шабанов, О.А.Яковлева, С.О.Бурмистров // Психофармакол. и биол. наркол. 2010. Т.10. №1. С.2681-2687.

Тираж 100 экз. Подписано в печать 12.05.10 г. Формат 60x84 Vie Объем 1,25 п.л. Заказ № 124

Отпечатано в типографии СПбПМА (190020, Санкт-Петербург, ул. Литовская, 2)

Актуальность исследования

В последние годы пристальное внимание исследователей привлекают проблемы нейробиологии развития. Традиционным направлением этих исследований является изучение нейромедиаторных систем, поскольку нейромедиаторы имеют качественно различные функции в течение онтогенеза нервной системы (Амстиславская М.Г., 2007; Байрамов А.А., 2008). Во взрослом организме медиаторы осуществляют передачу сигналов между клетками, однако в развивающейся нервной системе те же медиаторы могут образовывать морфогенетические градиенты, важные для формирования и дифференцировки различных областей нервной системы и нейромедиаторных систем соответственно (Угрюмов М.В., 2008).

Менее изучено развитие в онтогенезе общебиологических внутриклеточных процессов, таких, как перекисное окисление липидов (ПОЛ) и антиоксидантные системы (Шабанов П.Д. и др., 2009). Вместе с тем, именно эти процессы осуществляют важнейшие функции поддержания гомеостаза нервных клеток. Еще менее изучены механизмы, посредством которых процессы ПОЛ и антиоксидантные системы вовлекается в ответ на воздействие различных токсических и психогенных факторов в раннем онтогенезе.

Среди токсических факторов, достаточно часто воздействующих на развивающийся организм, в частности, при беременности, следует выделить этанол и никотин, которые будущие матери употребляют как бытовые стимуляторы. Однако именно эти токсические воздействия в раннем онтогенезе могут привести к последующим поведенческим девиациям в подростковом и пубертатном периодах (Мещеров Ш.К., 2006). Возникает закономерный вопрос о возможностях предупреждения подобных нарушений с помощью различных фармакологических агентов, потенциально способных уменьшить токсическое воздействие этанола на развивающийся организм. В качестве таких средств рассматриваются растительные адаптогены, например, экстракты из элеутерококка колючего, травы полисциаса, корня женьшеня (Бурмистров С.О., 1990; Чуваев И.В., 1993), пептидные нейропротекторы (Воронина Т.А., 2007), некоторые синтетические средства антигипоксической направленности (Шабанов П.Д., 2008). К последним можно отнести новый отечественный препарат трекрезан (триэтаноламмониевую соль 2-метилфеноксиуксусной кислоты), представляющий собой высокоэффективное фармакологическое средство с адаптогенным и иммуностимулирующим действием (Казимировская В.Б. и др., 1996; Жумашева А.Б., 2009), и метапрот (2-этилтиобензимидазол, бемитил), обладающий антигипопоксической, нейропротекторной и повышающей работоспособность активностью (Шабанов П.Д., 2008).

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящей работы явилось изучение процессов перекисного окисления липидов и системы антиоксидантной защиты мозга эмбрионов и потомства при нормальном онтогенезе и после внутриутробного действия * этанола у крыс, а также фармакологическая коррекция последствий воздействия токсических факторов при беременности.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ В задачи исследования входило:

1. Изучить уровень ПОЛ и системы антиоксидантной защиты мозга эмбрионов и потомства при нормальном онтогенезе у крыс;

2. Изучить уровень ПОЛ и системы антиоксидантной защиты мозга эмбрионов и потомства после внутриутробного действия этанола у крыс;

3. Изучить состояние ферментов антиоксидантной 'защиты, уровней восстановленнрго глутатиона и ПОЛ мозга эмбрионов при острой алкогольной интоксикации и действии ацетальдегида у крыс;

4. Изучить действие трекрезана и метапрота на активность антиоксидантной системы и уровень ПОЛ мозга эмбрионов и потомства при внутриутробной алкоголизации у крыс;

5. Изучить действие трекрезана и метапрота на активность антиоксидантной системы и уровень ПОЛ мозга половозрелых крыс, алкоголизированных с 21-го дня жизни.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Доказано, что процессы ПОЛ (малоновый диальдегид) и антиоксидантные системы (восстановленный глутатион, активность супероксиддисмутазы и каталазы) активно развиваются в третий триместр беременности крыс. В раннем постнатальном периоде (до 21-го дня жизни) их активность продолжает возрастать, за исключением каталазы, активность которой в постнатальном периоде падает. При алкоголизации беременных самок активируются процессы ПОЛ и системы антиоксидантной защиты в мозге эмбрионов. Следствием алкоголизации беременных самок является снижение числа родившихся крысят в помете, а также их массы тела и мозга, которые остаются пониженными вплоть до 7 недель постнатального развития. Этанол не только при хроническом, но и при однократном введении индуцируют повышение процессов ПОЛ с одновременным снижением уровня восстановленного глутатиона в мозге эмбрионов в третий триместр беременности. Отмена алкоголизации в конце беременности не полностью восстанавливает показатели ПОЛ и активность антиоксидантных систем в ранний постнатальный период (7-21-49 дни жизни). Сходная закономерность наблюдается и при отмене алкоголизации на 21-й день постнатального развития. Синтетический адаптоген трекрезан и антигипоксант метапрот, назначаемые в период внутриутробного развития и в ранний постнатальный период одновременно с алкоголизацией, уменьшают нарушения ПОЛ и активности' антиокислительных систем как у эмбрионов, так и у крысят в постнатальный период (7-21-49 дни жизни). При этом наибольшую противоалкогольную активность проявляет трекрезан. Кроме того, трекрезан и, в меньшей степени, метапрот восстанавливают процессы перекисного окисления липидов и активность антиокислительных систем в мозге половозрелых крыс, хронически потреблявших этанол с 21-го дня жизни.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Полученные экспериментальные данные о нарушениях процессов ПОЛ и антиоксидантных систем под влиянием этанола в период беременности и лактации у крыс позволяют рассматривать эти показатели как важный дополнительный диагностический критерий возможного повреждения мозга в период гестации или ранний постнатальный период. Экспериментально доказано, что синтетический адаптоген трекрезан и, в меньшей степени, антигипоксант метапрот, назначаемые в период внутриутробного развития и в ранний постнатальный период одновременно с алкоголизацией, уменьшают нарушения ПОЛ и активности антиокислительных систем как у эмбрионов, так и у крыс в постнатальный период. Это позволяет рекомендовать трекрезан и метапрот для углубленного клинического исследования в " качестве средств, обладающих ^ антитератогенной активностью у беременных. Наконец, полученные данные о развитии процессов ПОЛ и антиоксидантных систем в онтогенезе расширяют теоретические и практические представления о ' формировании (созревании) нервной системы в раннем онтогенезе, что следует учитывать в педиатрической практике и при изучении девиантных форм поведения у подростков и в пубертатном периоде.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Системы ПОЛ (малоновый диальдегид) и антиоксидантные системы (восстановленный глутатион, активность супероксиддисмутазы и каталазы) активно развиваются в третий триместр беременности крыс и в раннем постнатальном периоде (до 21-го дня жизни), достигая значений, типичных для половозрелых особей.

2. Алкоголизация беременных самок активирует процессы ПОЛ и системы антиоксидантной защиты в мозге эмбрионов и потомства (до 7 недель жизни). Однократное введение больших доз этанола и ацетальдегида беременным самкам также способно индуцировать повышение процессов ПОЛ с одновременным снижением уровня восстановленного глутатиона в мозге эмбрионов.

3. Отмена алкоголизации в конце беременности или на 21-й день постнатального развития не полностью восстанавливает показатели ПОЛ и активность антиоксидантных систем в ранний постнатальный период вплоть до 7 недель.

4. Синтетический адаптоген трекрезан и, в меньшей степени, антигипоксант метапрот, назначаемые в период внутриутробного развития и в ранний постнатальный период одновременно с алкоголизацией, уменьшают нарушения ПОЛ и активности антиокислительных систем как у эмбрионов, так и у крысят в постнатальный период. Этот тип действия трекрезана и метапрота характерен и для половозрелых крыс, хронически потреблявших этанол с 21-го дня жизни. ■

Апробация материалов исследования

Материалы диссертации доложены на 4-й международной научной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2006); на XX съезде физиологического общества им. И.П.Павлова (Москва, 2007), на заседании Санкт-Петербургского научного общества фармакологов (2008).

Апробация диссертации прошла на межкафедральном заседании кафедры фармакологии и кафедры акушерства и гинекологии Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова.

РЕАЛИЗАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ Диссертационная работа выполнена в рамках плановой темы НИР Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова. Оригинальные авторские подходы методического характера реализованы в научно-исследовательской деятельности и учебном процессе кафедр фармакологии, нормальной физиологии и акушерства и гинекологии Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова.

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 4 статьи (1 статье в журнале, рекомендованном ВАК) и 5 тезисов.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы диссертации изложены на 127 страницах машинописного текста, иллюстрированы 12 таблицами и 6 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы.

ВЫВОДЫ

1. Системы перекисного окисления липидов (малоновый диальдегид) и антиоксидантные системы (восстановленный глутатион, активность супероксиддисмутазы и каталазы) активно развиваются в третий триместр беременности крыс. В раннем постнатальном периоде (до '21 дня жизни) их активность продолжает возрастать, за исключением каталазы, активность которой в постнатальном периоде падает.

2. Алкоголизация беременных самок активирует процессы перекисного окисления липидов (содержание малонового диальдегида повышается) и системы антиоксидантной защиты (активность супероксиддисмутазы и каталазы повышается) в мозге эмбрионов в третий триместр беременности.

3. Алкоголизация беременных самок снижает число родившихся крысят в помете, а также их массу тела и мозга, которые остаются пониженными вплоть до 7- недель постнатального развития.

4. Этанол (1 г/кг системно) и ацетальдегид (4 мкмоль/зародыш внутриамниотически) индуцируют повышение процессов перекисного окисления липидов с одновременным снижением уровня восстановленного глутатиона в мозге эмбрионов в третий трисместр беременности.

5. Отмена алкоголизации в конце беременности не полностью восстанавливает показатели перекисного окисления липидов и активность антиоксидантных систем в ранний постнатальный период (7-21-49 дни жизни): активность супероксиддисмутазы при этом остается значительно повышенной вплоть до .7 недель. Сходная закономерность наблюдается и при отмене алкоголизации на 21-й день постнатального развития.

6. Синтетический адаптоген трекрезан и антигипоксант метапрот, назначаемые в период внутриутробного развития и в ранний постнатальный период одновременно с алкоголизацией, уменьшают нарушения перекисного окисления липидов и активности антиокислительных систем как у эмбрионов, так и у крысят в постнатальный период (7-21-49 дни жизни). При этом наибольшую противоалкогольную активность проявляет трекрезан.

7. Трекрезан и в меньшей степени метапрот восстанавливают процессы перекисного окисления липидов и активность антиокислительных систем в мозге половозрелых крыс, хронически потреблявших этанол с 21-го дня жизни.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Показатели перекисного окисления липидов и антиоксидантных систем могут служить важным дополнительным диагностическим критерием возможного повреждения мозга в период беременности и в ранний постнатальный период.

2. Синтетический адаптоген трекрезан и антигипоксант метапрот следует рекомендовать для углубленного клинического исследования в качестве средств, обладающих антитератогенной активностью у беременных.

3. Полученные данные о развитии процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантных систем в онтогенезе следует учитывать в педиатрической практике при обучении дисциплинам, рассматривающим формирование (созревание) нервной системы в раннем онтогенезе.