Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Фармакологическая коррекция ишемического поражения головного мозга крыс при окклюзии средней мозговой артерии

Р Г Б ОД 2 9ЯНВ 2004

На правах рукописи

ПОВАРОВА ОКСАНА ВИКТОРОВНА

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ КОРРЕКЦИЯ ИШЕМИЧЕСКОГО ПОРАЖЕНИЯ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС ПРИ ОККЛЮЗИИ СРЕДНЕЙ МОЗГОВОЙ АРТЕРИИ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2003

Работа выполнена на кафедре фармакологии факультета фундаментальн медицины Московского государственного университета имени М.В. Ломоносс (заведующий - доктор медицинских наук, профессор О.С. Медведев).

Научный руководитель - доктор медицинских наук, профессор Медведев 0.(

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Островская Р.У Кандидат биологических наук Шумаев К.Б.

Ведущая организация:

Российский государственный медицинский университет

Защита состоится $ / ^ ^ на заседании диссертационно

совета Д.001.024.01 в ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в ученой части ГУ НИИ фармакологии и В.В. Закусова РАМН.

Автореферат разослан «. /4» 4т.

Ученый секретарь диссертационного совета профессор медицинских наук

Вальдман Е.А.

Общая характеристика работы Актуальность проблемы. Ежегодно в России переносят инсульт более 450000— 500000 человек (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001; Верещагин Н.В., Варакин Ю.Я., 2001). Сосудистые заболевания головного мозга занимают второе место в структуре общей смертности и являются основной причиной инвалидизации трудоспособного населения (Dormán P.J., Sandercock P.A.G., 1995; Brott T., Bogousslavsky J., 2000; Kidwell C.S., et al., 2001). Все это позволяет считать инсульт проблемой медицинской и социальной значимости. В связи с этим, актуален поиск новых эффективных препаратов, оказывающих нейропротекторное действие (Топчян A.B., 1999; Оковитый C.B., Смирнов A.B., 2001; Фишер М., Шебитц В., 2001; Воронина Т.А., 2002; 2002; 2003; Мирзоян P.C., 2003; Островская Р.У., 2003; Dormán P.J., Sandercock P.A.G., 1995; STAIR 1999; Brott T., Bogousslavsky J., 2000; Kidwell C.S., et al., 2001). Несмотря на большое количество лекарственных средств (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001; Фишер М., Шебитц В., 2001), использующихся в настоящее время в практической неврологии, проводимая терапия не всегда оказывается эффективной. Одной из причин этого является неадекватность большинства экспериментальных моделей истинной клинической картине ишемического инсульта, на которых проводится тестирование новых соединений (Hunter A.J., et al.,1995; Фишер M., Шебитц В., 2001). Использованная в работе модель локальной ишемии головного мозга у крыс путем окклюзии средней мозговой артерии (ОСМА) является одной из наиболее адекватных моделей (Hunter A.J., et al., 1995), тем более что она воспроизводит типичную локализацию ишемического инсульта у людей -бассейн средней мозговой артерии (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001).

Ишемическое поражение головного мозга сопровождается последовательным развитием патобиохимических реакций глутамат-кальциевого каскада, на протяжении всех этапов которого наблюдается активизация свободнорадикальных процессов (Love S., 1999; Gigun-Suerrki Y., et al., 2002). Развивается состояние «окислительного» стресса, проявляющегося в гиперпродукции активных форм кислорода (АФК) (Медведев Ю.В., Толстой А .Д., 2000; Ланкин В.З., и соавт., 2001, 2002; Castagne V., et al., 1999; Cadenas E., et al., 2000) на фоне недостаточной работы антиоксидантной защиты, одним из компонентов которой является убихинон. С одной стороны, данное соединение является важным компонентом дыхательной митохондриалыюй цепи, с другой стороны - антиоксидант, участвующий в регенерации а-токоферола, а также способного напрямую реагировать с АФК (Медведев Ю.В., Толстой А.Д., 2000; Dallner G., Sindelar P.J., 2000; Ernster L„ Dallner G„ 1995; Nohl H., Gille L., 2002). Достаточно мало данных литературы, посвященных исследованию влияния ишемии на тканевое содержание убихинона(КтШа Y., et al., 1989; Maulik N., et al., 2000), тем более локальной ишемии головного мозга.

Одним из направлений терапии ишемического инсульта является использование лекарственных препаратов, обладающих антиоксидантным действием (Дюмаев K.M., и соавт., 1995; Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001).

Учитывая имеющиеся на данный момент сведения о тесной патогенетическо? взаимосвязи глутаматной эксайтотоксичности и гиперпродукции свободных радикалов (Викторов И.В., и соавт., 1996; Yang C.-S., et al., 1995, 1996; Lanceloi E„ et al., 1997; Gigun-Suerrki Y„ et al., 2001; Kontos H.A., 2001; Hayashi Y„ et al.. 2002) представляло интерес оценить нейропротекторное действие препаратов, влияющих на эти звенья патогенеза ишемического инсульта на модели локальной ишемии головного мозга у крыс путем окклюзии средней мозговой артерии (ОСМА).

Одним из исследуемых препаратов с преимущественно антиоксидантной активностью явился а-фенил-г-бутилнитрон (PBN), широко использующийся в аналитической и биоорганической химии в качестве «ловушки» свободных радикалов. В последние годы появились сведения о положительном нейропротекторном действии PBN (Folberqrovä J„ et al., 1995; Kuroda S.,. et al. 1996; 1999; Floyd R.A., et al., 2002; Yoshimoto Т., et al., 2001; Zhao Z„ et al. 2001). В литературе имеются сведения о стабилизирующим влиянием PBN на митохондриальную дисфункцию (Folberqrovä J., et al., 1995; Kuroda S.,. et al. 1996), ингибировании синтеза NO и провоспалительных факторов (Kotake Y.et al., 1998), блокаде кальциевых каналов (Anderson D.E., et al., 1993), обратимом ингибировании ацетилхолинэстеразы (Milatovic D., et al., 2000).

Вторым препаратом с преимущественно антиоксидантным механизмом действия, явился мексидол, производное 3-оксипиридина, синтезированный в ГУ НИИ фармакологии РАМН. Мексидол, оказывая позитивное влияние на экзогенную антиоксидантную систему защиты головного мозга (повышает активность супероксидисмутазы, глутатионзависимых ферментов, увеличивает концентрацию восстановленной формы глутатиона) и противодействуя гиперпродукции свободных радикалов (напрямую взаимодействуя с АФК), ослабляет проявление оксидативного стресса в ишемизированной ткани. В реализации нейропротективного действия мексидола играет роль его мембраностабилизирующий эффект (Дюмаев K.M., и соавт., 1995). Кроме того, вызывая репарацию структурно-функциональных нарушений в мембране и одновременно являясь модулятором ГАМК-бензодиазепинового комплекса, препарат оказывает ГАМК - позитивный эффект, тем самым, устраняя дисбаланс между тормозными и возбуждающими аминокислотами, вызванный ишемическим поражением головного мозга (Воронина Т.А.,, 2001; 2002; 2003).

Следующим препаратом, влияюшим на ГАМК-ергическую систему и восстанавливающим баланс между тормозными и возбуждающими процессами в головном мозге при ишемии (Мирзоян P.C., 2003) явилась лекарственная композиция пирролидона- 2 и пироглутаминовой кислоты, синтезированных в ГУ НИИ фармакологии РАМН и предствляющих собой циклические аналоги глутаминовой и у-аминомасляной кислот. Пирролидон за счет взаимодействия с ГАМКА-рецепторами сосудов головного мозга улучшает мозговое кровообращение, пироглутаминовая кислота в большей степени влияет на метаболизм головного мозга, стимулируя процесс захвата и утилизации глюкозы (Топчян A.B., 1999; Мирзоян P.C., 2003).

Исследовали нейропротекторное действие нооглютила (N-(5-оксиникотиноил)-Ь-глутаминовая кислота) - ноотропного препарата, синтезированного в ГУ НИИ фармакологии РАМН, являющегося модулятором АМРА рецепторов и оказывающим позитивное влияние на ГАМК-ергическую систему( Воронина Т.А., 2003; Гарибова T.JI., и соавт., 2003).

Экспериментальные исследования взаимосвязи между

свободнорадикальными процессами и глутаматной эксайтотоксичностью, являющейся отражением дисбаланса между тормозными и возбуждающими системами головного мозга при ишемии головного мозга, недостаточны (Викторов И.В., 1996; Yang C.-S., et al„ 1995, 1996; Skaper S.D., et al„ 1999; Avshalumov M.V., Rice M.E., 2001; Gigun-Suerrki Y., et al„ 2002; Hayashi Y„ et al., 2002). Это явилось основой для сравнительного исследования нейропротекторного действия перечисленных препаратов на модели локальной ишемии головного мозга у крыс.

Цель работы

Оценка модели локальной ишемии головного мозга, вызванной дистальной окклюзией средней мозговой артерии, и коррекция ишемических повреждений с помощью фармакологических веществ.

Задачи исследования

1. Оценка зоны ишемического поражения головного мозга крыс при окклюзии дистального отдела средней мозговой артерии.

2. Исследование состояния дофаминергической системы при ишемическом поражении головного мозга.

3. Изучение влияния локальной ишемии головного мозга на состояние антиоксидантной системы защиты (коэнзимов Q9 и Q10, а-токоферола).

4. Исследование нейропротекторного действия а-фенил-/-бутилнитрона, мексидола, нооглютила, комплекса пирролидона-2 и пироглутаминовой кислотой при окклюзии средней мозговой артерии у крыс.

5. Исследование защитного действия а-фенил-/-бутилнитрона в отношении антиоксидантной системы(коэгоимов Q9 и Q10, а-токоферола) головного мозга при окклюзии средней мозговой артерии у крыс.

6. Исследование фармакокинетических свойств а-фенил-г-бутилнитрона (распределение а-фенил-г-бутилнитрона в организме животного), установление взаимосвязи с его неиропротекторным действием.

Научная новизна

Впервые методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с элеюрохимическим детектированием было выявлено влияние локальной ишемии головного мозга на состояние одного из компонентов антиоксидантной системы защиты- коэнзимов Q9 и Q10, а-токоферола. При этом установлено,

что в первую очередь страдает система коэнзимов при минимальных изменениях тканевого содержания а-токоферола.

Примененная нами модель локальной ишемии головного мозга путем дистальной окклюзии средней мозговой артерии у крыс, при хорошей переносимости животными позволяет целенаправленно исследовать нейропротекторное действие препаратов в отношении поврежденных корковых структур головного мозга. Выявлены высокие нейропротекторные свойства у сс-фенил-г-бутилнитрона, который на фоне достоверного ограничения зоны ишемии также препятствовал изменениям антиоксидантной системы защиты головного мозга в виде уменьшения падения тканевого содержания коэнзимов <39, С)9+(210. Мексидол, нооглютил, комплексный препарат пирролидона-2 и пироглутаминовой кислоты при сходном протоколе введения также достоверно ограничивали зону ишемического поражения.

Несмотря на незначительные изменения подкорковых структур при данной модели локальной ишемии, в области стриатума ипсилатерального полушария методом микродиализа было выявлено достоверное повышение экстрацеллюлярного уровня диоксифенилуксусной кислоты (метаболита дофамина) на 40 мин послеоперационного периода, что может являться отражением реакции окружающей ткани, в частности дофаминергической системы, на патологические процессы, протекающие в зоне ишемии.

Впервые методом электронного парамагнитного резонанса было подтверждено внутриклеточное накопление а-фенил-Ьбутилнитрона, что в дальнейшем, по-видимому, определяет основное защитное действие данного соединения при ишемии головного мозга.

Научно-практическое значение

Полученные данные о способности РВЫ, комплекса пирролидона-2 и пироглутаминовой кислоты, нооглютила ограничивать зону ишемического поражения головного мозга позволяют рассматривать указанные препараты в качестве потенциальных средств для лечения больных с ишемическими поражениями головного мозга.

Полученные данные по влиянию локальной ишемии головного мозга на тканевое содержания коэнзимов (} могут быть в дальнейшем использованы для рекомендации включения препаратов, содержащих убихинон, в терапию больных с ишемическим инсультом.

Положения, выносимые на защиту

1. Использованная в работе модель локальной ишемии головного мозга путем окклюзии дистального отдела средней мозговой артерии у крыс, приводит к формированию локального некроза лобно-теменной области коры, что позволяет использовать данную модель для оценки защитного действия различных соединений в отношении данных структур головного мозга.

2. Локальная ишемия вызывает нарушения антиоксидантной системы защиты ипсилатералыюго полушария головного мозга, проявляющееся в снижении уровня восстановленной формы коэнзимов Q9 и Q10 при минимальных изменениях содержания а-токоферола. Уменьшение общего пула убихинонов связано с некротическими изменениями нервных клеток зоны ишемии.

3. Экстрацеллюлярное содержание дофамина в области стриатума ипсилатерального полушария при дистальной ОСМА минимально на фоне повышеного уровня его метаболита - диоксифенилуксусной кислоты, что является отражением реакции дофаминергической системы на патологические процессы, протекающие в зоне ишемии.

4. сс-фенил-/-бутилнитрон, мексидол, комплексный препарат пирролидона-2 и пироглутаминой кислоты, нооглютил достоверно ограничивают зону ишемического поражения.

5. сс-фенил-Г-бутилнитрон у крыс после дистальной ОСМА оказывает защитное действие на общий пул коэнзимов в ипсилатеральном полушарии головного мозга у крыс.

6. Отсутствие сигнала спин-аддукта ct-фенил-Г-бутилнитрона во всех микродиализных пробах может быть связано с низким его содержанием (на момент забора проб) в интерстиции ткани головного мозга и возможным депонированием данного соединения в нервных клетках, что, по-видимому, в дальнейшем определяет защитное действие соединения.

Апробация работы

Результаты работы докладывались и обсуждались на научно-практической конференции «Медицина будущего», Краснодар-Сочи, 2002; XII Международном форуме « Медико-экологическая безопасность, реабилитация и социальная защита населения», Турция, Кемер, 2002; X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2003; семинарах кафедры фармакологии факультета фундаментальной медицины МГУ; II Съезде Российского научного общества фармакологов, Москва, 2003; 3rd International Symposium "Neuroprotection and Neurorepair", Magdeburg, Germany, 2003; национальной научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека», Смоленск, 2003.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, I статья находится в печати.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, 2 глав с результатами экспериментов и их обсуждением, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 149 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы, 23 рисунка. Список литературы включает 284 наименования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на крысах-самцах линии Wistar 4-5 месячного возраста весом 300-350г, содержащихся в виварии при свободном доступе к пище (стандартный брикетированный корм) и воде, при т-22° С, 12- часовом режиме смены дня и ночи.

В исследовании были использованы следующие вещества: а-фенил-/-бутилнитрон (PBN)("Fluka", Германия), пирролидон-2 и пироглутаминовая кислота (ГУ НИИ фармакологии РАМН), нооглютил (ГУ НИИ фармакологии РАМН), мексидол (ООО "Фармасофт", Москва).

Метод локальной ишемии головного мозга

Моделирование локальной ишемии головного мозга проводилось согласно методике, предложенной Chen (Chen S.T., 1986), путем окклюзии дистального отдела левой средней мозговой артерии у крыс. У наркотизированных пентобарбиталом натрия животных (40 мг/кг, в/б) жёстко фиксировали голову в боковом положении левой стороной кверху. После разреза кожи посредине между левой ушной раковиной и левым глазом (около 2 см) раздвигали волокна височной мышцы и открывали поверхность черепа. С помощью бормашины (диаметр сверла 0,5 мм) в месте шва чешуйчатой кости с лобной делали отверстие диаметром около двух миллиметров, обнажая место пересечения средней мозговой артерии с нижней мозговой веной.

Рис.1. Схема дистальной окклюзии средней мозговой артерии:

1 - место окклюзии средней мозговой артерии;

2 - нижняя мозговая вена.

Под микроскопом (Olympus SZ-CTV) под большим увеличением(14,0х 3,3) под левую среднюю мозговую артерию подводили специальный металлический крючок. С помощью коагулятора производили окклюзию средней мозговой артерии проксимальнее места её бифуркации на фронтальную и париетальную ветви. При этом в поле зрения микроскопа наблюдалось прекращение тока крови по средней мозговой артерии выше места окклюзии. После операции рана послойно ушивалась.

Метод окраски головного мозга крыс 2,3,5-трифенилтетразолнй хлоридом (ТТХ) с количественной оценкой зоны инфаркта

Через 72 часа после ОСМА животные были декапитированы. Головной мозг извлекали из черепной коробки, готовили 5 фронтальных срезов толщиной 2 мм, которые затем помещали в бюкс с 5 мл раствора 2,3,5- трифенилтетразолий хлорида (0,5 % раствор на 0,1 М фосфатном буфере, рН =7,4). Инкубация срезов проводилась при температуре 37°С в течение 30 мин с последующей фиксацией в 7% растворе формалина(Вес1ег5оп J.B. et al., 1986; Goldlust E.J.„ et al.,1996). Применение метаболического красителя (2.3.5-трифенилтетразолий хлорид) позволило легко отдифференцировать зону инфаркта от здоровой ткани. Процесс окраски связан с тем, что ТТХ (белый порошок) в здоровой ткани, взаимодействуя с компонентами митохондриальной дыхательной цепи, восстанавливается до формазана, окрашивающего неповрежденную ткань в красный цвет. В дальнейшем срезы головного мозга крыс фотографировали цветной видеокамерой CCD IRIS (модель DXC-107AP, SONY Corporation), соединенной с микросколом (Olympus SZ-CTV). С помощью морфометрической программы MOCHA (Jandel Scientific, версия 1.2.0.0)

проводили планиметрию, определяли площадь ипсилатерального полушария (ИП) и зоны поражения (ЗП). Вычисляли объем ЗП и ИП по формуле «трапеции»: V=d [l/2[Si+Sn]+S2+...+Sj+... +Sn-i], где d - толщина среза, Sb Sn. S„_i - площадь ЗП и ИП для каждого среза, с последующим определением процента объема ЗП относительно объема ИП (Cai H., et al., 1998).

Метод экстракции коэнзимов Q<>, QI0 и а-токоферола из ткани головного

мозга крыс

Через сутки после операции OMCA сердце крысы останавливали передозировкой наркоза, извлекали головной мозг.. Каждое полушарие по отдельности (Takada M., et al.,1984; Albano C.B., et al., 2002) гомогенизировали в этаноле в соотношении 1:9 ( вес:объем). К 200 мкл гомогената добавляли 500 мкл n-гексана, тщательно встряхивали в течение 10 мин, центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин и верхний слой n-гексана отбирали в объеме 500мкл. К остатку добавляли еще 500 мкл n-гексана и повторяли процедуру экстракции и отбора экстракта. Объединенный экстракт в n-гексане упаривали досуха, растворяли в 200 мкл этанола и восстанавливали окисленную форму коэнзимов добавлением 10 мкл 5% раствора натрия тетрагидробората в этаноле.

Количественный анализ коэнзимов Q9 и Q10 и а-токоферола в экстракте гомогената тканн головного мозга крыс методом ВЭЖХ с электрохимическим детектированием

10 мкл экстракта до восстановления и 11 мкл восстановленного анализировали с помощью ВЭЖХ с электрохимическим детектированием. Использовалось оборудование фирмы "ESA", США: насос модели 580 и электрохимический детектор "Coulochem II". Разделение проводилось в обращенно-фазовом изократическом режиме элюции на колонке 150 х 4,6 мм с сорбентом С18, размер частиц 5 мкм, при скорости потока элюента 1,3 мл/мин. Подвижная фаза содержала 1,5 мл 60% перхлорной кислоты, 3 г хлористого натрия и 2% метанола в 1 л этанольного раствора. Электрохимическое детектирование осуществлялось с помощью аналитической ячейки(модель 5010) при напряжении на первой паре электродов- -50 мв и на второй - +350 мв. Время удерживания для а-токоферола, коэнзимов Q9 и Q10 составило соответственно 3,2 мин, 6,5 мин и 8,5 мин. Запись и обработка хроматографических данных велась с помощью компьютерной программы фирмы "ESA" , США. Содержание токоферола, CoQ9 и CoQIO рассчитывали по методу внешнего стандарта. Для каждого животного рассчитывали содержание восстановленной формы коэнзимов - Q9H2 и QwH2, общего содержания Q9H2+ Q10H2 и Q<jOGlu+ (Зюобщ в ишемизированном -

ипсилатеральном полушарии и выражали в процентах относительно контрольного - контралатерального полушария.

Метод микродиализа головного мозга у крыс

Крысам за сутки до операции ОСМА под наркозом (пентобарбитал натрия, 40мг/кг массы) проводили имплантацию микродиализатора в левый латеральный гипоталамус согласно расчитанным с помощью атласа координатам 1-4-7 (Paxinos G., Watson С., 1997). Для этого голову животных жестко фиксировали в стереотаксической установке, после обработки операционного поля удаляли кожный покров, при этом открывалась поверхность черепа. В соответствии с местом расположения брегмы находили точку для установки микродиализной пробы, где с помощью бормашины (диаметр бора 0,5 мм) делали отверстие ( до твердой мозговой оболочки) диаметром около 1 мм. Осторожно (чтобы не травмировать ткань головного мозга) острой иглой делали отверстие в твердой мозговой оболочке. На расстоянии 1 см от отверстия устанавливали фиксирующий винт. Фиксацию микродиализной пробы проводили с помощью акрилоксида. Во время эксперимента диализатор перфузировали раствором Рингера (148 мМ NaCl, 4.0 мМ КС1, 2.2 мМ СаСЬ, рН 7,4) со скоростью 2.5 мкл/мин с помощью перфузионного насоса «СМА-100». При этом раствор поступал внутрь полупроницаемой полшкрилонитриловой мембраны (проницаемость пор - до 10 кД, длина эффективной поверхности -3 мм) по входящему кремниевому капилляру (внешний диаметр - 0,25мм) и удалялся через выводящий капилляр (0,15мм).

Рис.3. Схема микродиализной пробы:

1 - входящий капилляр;

2 - выходящий капилляр;

3 - поддерживающий каркас;

4 - акрилоксидный цемент;

5 - кости черепа;

6 - полиакрилнитриловая полупроницаемая мембрана; 7 - стриатум.

После 1,5 часа стабилизации диализат собирали последовательными 20-минутными фракциями. Стабилизацию образцов диализата осуществляли путем добавления в каждую микропробирку 5 мкл 0,2Н раствора лимонной кислоты. Концентрацию медиаторов и их метаболитов в образцах диализата определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимическим детектированием.

Количественный анализ содержания PBN в образцах ткани головного мозга, печени, почек крыс

Крысам (п=10) за сутки до начала ОСМА проводили имплантацию микродиализатора в левый латеральный гипоталамус с координатами 1-4-7 (Paxinos G., Watson С.,1997). Во время эксперимента диализатор перфузировали раствором Рингера со скоростью 2,5 мкл/мин с помощью перфузионного насоса «СМА-100». Введение PBN проводилось однократно в/в в момент начала ОСМА в дозе 100мг/кг. Для этих животных собирали по две 20-минутные пробы диализата в интервале 60 -80 и 120- 140 мин от начала ОСМА. Через 3 часа после начала ОСМА животные были декапитированы, после чего у них брались образцы ткани обоих полушарий мозга, а также печени и почек для определения содержания в них PBN. Для определения содержания PBN в образцах ткани головного мозга, печени, почек они помещались в водный раствор муравьиной кислоты (конечная концентрация - 100 мМ) из расчёта 100 мг ткани на 1,0 мл раствора. Далее проводились размельчение и 10-минутная гомогенизация образцов в стеклянном гомогенизаторе.

Калибровочные образцы были приготовлены из размельчённой ткани с добавлением в неё PBN в количестве 1 мкг и 10 мкг, с последующей экстракцией 0,1 М муравьиной кислотой (100мг ткани на 1 мл кислоты) и гомогенизацией (Marklund N., et al., 2001).

Во всех образцах перед регистрацией их спектров ЭПР добавлением водного раствора FeS04'7H20 (конечная концентрация в реакционной среде - 100 мкМ) и Н202 (80 мМ) инициировалась реакция Фснтона.

Спектры ЭПР регистрировались на спектрометре ЭПР Х-диапазона типа Е-109Е фирмы "Varían" (США). Мощность СВЧ-излучения спектрометра составляла 10 мВт при частоте 9,15 ГГц. Амплитуда модуляции магнитного поля составляла 0,1 мТл.

Статистическая обработка результатов

Данные представлены как MEAN ± SEM (среднее ± стандартная ошибка среднего). Для сравнения внутри группы относительно исходного состояния применялся тест Wilcoxon, для межгрупповых сравнений использовался тест Mann-Whitney. Различия считались достоверными при р<0,05. Статистическая обработка экспериментальных данных осуществлялась с помощью программы Statistics for Windows 5.0

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ЗЛ.Характеристика ишемнческого поражения головного мозга крыс при необратимой дистальной ОСМА у крыс.

ЗЛЛ. Размер зоны ишемии головного мозга при окклюзии средней мозговой артерии.

Через 72 часа после окклюзии средней мозговой артерии у животных отмечали формирование зоны инфаркта. На представленных на рис,7 фронтальных срезах головного мозга крыс зона поражения выглядит более светлой в сравнении с неповрежденной тканью. На пяти срезах визуально определяется зона ишемии, при этом максимум приходится на срез № 4, соответствующий уровню - 0,26 мм от места расположения брегмы по атласу Paxinos & Watson(1997). Видно, что при дистальной ОСМА поражена лобнотеменная область коры головного мозга. Окклюзия проводилась выше места отхождения a. Lenticulostriatis, кровоснабжающей подкорковые структуры. Объем зоны поражения составляет в среднем 22,5+/- 1,55 % от общего объема ипсилатерального полушария. У ложнооперированных(п=8) и контрольных животных без окклюзии средней мозговой артерии(п=8) формирование зоны ишемии не отмечалось.

В нашем исследовании анализ зоны поражения головного мозга крыс проводился через 72 часа после ОСМА, что представляется наиболее приемлемым для оценки вклада всех факторов, в том числе продукции АФК, в формировании зоны некроза при ишемии.

3.1.2. Уровень дофамина и его метаболитов в области стриатума ипсилатерального полушария у крыс с ОСМА

Исследование проводилось на 16 животных, случайным образом разделенных на 3 группы: 1- контрольная - животные (п=5) без операции ОСМА; 2 -ложнооперированные (п=5); 3 - животные с ОСМА( п=6). В нашем исследовании проводилось мониторирование уровня дофамина и его метаболитов в предоперационный период (60 мин), момент операции (40 мин), послеоперационный период (180 мин).

Отмечалось достоверное повышение концентрации метаболита дофамина -диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) на 40 мин послеоперационного периода (рис. 4).

я к а о

с о

о ч

о •fr

И &

©

О Ч

500 450 400 ■ 350 • 300 250 200 -150 -100 50

-80 -60 40 -20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 операция ВреМЯ,мин

Рис.4. Динамика изменений экстрацеллюлярного содержания диоксифенилуксусной кислоты(ДОФУК) в ипсилатеральном полушарии: 1 - контрольные животные, п=5; 2 - ложнооперированные, п=5, 3 - животные с ОСМА, п=6, * - р<0,05 по отношению к контрольным животным.

По данным литературы как глобальная, так и локальная ишемия приводит к массивному выбросу дофамина в экстрацеллюлярное пространство (Chang C.J., et al., 1993; Kondoh Т., et al., 1994; Zhang J„ Niu X., 1994; Melani A., et al., 1999). При этом, в одних исследованиях одновременно отмечался подъем метаболитов дофамина (Kuruvilla A., et al., 1987; Hashimoto N., et al., 1994; Cheng J„ et al., 1999), в другим -их падение (Weinberger J., Nieves-Rosa J., 1987). Отсутствие в нашем исследовании достоверных изменений дофамина (р>0.05), по-видимому, может быть связано с его ускоренным метаболизмом. При дистальной окклюзии средней мозговой артерии прежде всего поражается область коры, подкорковые структуры затрагиваются в меньшей степени(СЬеп S.T., et al., 1989; Barone F.C., et al., 1995; Baker K., et al., 1998). Наши данные являются отражением реакции окружающей ткани на те патологические процессы, протекающие в зоне ишемии и оказывающие влияние на окружающие ткани за счет периинфарктной деполяризации, распространяющейся глутаматной «эксайтотоксичности» (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001; Sperk et al., 1981; Remblier et al., 1999). В данном регионе, по-видимому, произошел выброс дофамина, однако, в связи с его ускоренным метаболизмом, мы не выявили достоверного (р>0,05) увеличения содержания дофамина при наличии статистически значимых изменений(р<0.05) со стороны ДОФУК.

3.1.3. Уровень коэнзимов Q9 и О10,ос-токоферола в ткани головного мозга крыс с необратимой окклюзией средней мозговой артерией

Одним из ключевых моментов ишемического поражения головного мозга является нарушение работы дыхательной митохондриальной цепи, нарушение

её электрон- и протон-транспортной функции, что ведет к снижению синтеза АТФ, увеличению степени восстановленное™ компонентов цепи, гиперпродукции АФК (Anderson M.F., Sims N.R., 1999; Cadenas Е., Davies К.J.А., 2000; Forsmark-Andree P., et al., 1997). Коэнзим Q, являясь одним из компонентов дыхательной цепи, в восстановленной (убихинол) и полувосстановленной (убисемихинон) формах представляет собой эндогенный антиоксидант, способный нейтрализовать свободные радикалы как в результате прямой реакции с ними (Медведев Ю.В., Толстой А.Д., 2000; Dallner G., Sindelar P.J., 2000), так и за счет участия в биорегенерации другого антиоксиданта - а-токоферола (Emster L., Dallner G., 1995; Nohl H., Gille L., 2002). В нашем исследовании определяли содержание убихинола и общего пула убихинона в гомогенате головного мозга крыс через 24 часа после ОСМА, отдельно в ипсилатеральном и контралатеральном полушариях головного мозга крыс.

Таблица 1. Содержания коэнзимов Q9 и Q10, а-токоферола в ткани ипсилатерального и контралатерального полушарий головного мозга крыс(контрольная i

И.П / К.П, %

Q9H2 65,1 ±4,8**

Qütot 78,8 + 4,4**

Q10H2 63,9 ±4,5**

Qmtot 83,9+4,5**

Q9H2+ Q,oH2 64,8 ±4,7**

Qgtot + Qiotot 80,1 ±4,2**

a-tok 89 ± 5,7

Примечание: И.П. - ипсилатеральное полушарие; К.П. - контралатеральное полушарие. ** - р<0,01.

Было выявлено статистически достоверное (р<0.05) уменьшение содержания убихинола в ипсилатеральном полушарии (табл. 1). Отмечалась тенденция к уменьшению доли восстановленной формы в общем пуле убихинона в полушарии с окклюзией СМА (табл. 2). Однако, данные изменения не являлись статистически значимыми (р>0,05).

Таблица 2. Доля восстановленной формы в общем пуле коэнзимов Q9 и (210 контралатерального и ипсилатерального полушарий головного мозга крыс.

К.П. И.П.

Q9H7/Q9tot 37.5±3.6 31.9±3.9

Q10H2/ Qmtot 39.7±3.3 31.7±3.9

QgH2+QI0H2/ Q9tot + Qmtot 38.8±3.4 31.8+3.9

Примечание: К.П. - контралатеральное полушарие, И.П. - ипсилатеральное полушарие.

Выявлено достоверное уменьшение общего пула убихинона в полушарии с ОСМА (табл. 1), что может быть обусловлено деструктивными изменениями нервных клеток в зоне нарушенного кровотока.

Следует отметить, что при ишемии наблюдается два разнонаправленных процесса, определяющих содержание восстановленной формы убихинона в общем пуле: первый - повышающий - в основном за счет нарушения функции дыхательной цепи митохондрий и повышения степени восстановленности митохондриального пула коэнзима Q (Ланкин В.З. и соавт., 2001; 2002); второй - понижающий - в результате использования убихинола и убисемихинона как антиоксидантов для нейтрализации A<t>K(Ernster L., Daliner G.1995; Медведев Ю.В., Толстой А.Д., 2000; Dallner G„ Sindelar P.J., 2000; Nohl Н., Gille L„ 2002). На момент исследования - через 24 часа после операции ОСМА - у животных отмечается активизация нескольких источников продукции АФК (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001; Juurlink В.Н., 1997; Love S., 1999), что ведет к повышенной нагрузке на антиоксидантную защиту организма и истощению запасов эндогенных антиоксидантов (Ланкин В.З. и соавт.,2002; Forsmark-Andree.P., et al., 1997; Anderson M.F., Sims N.R., 2002), в том числе и восстановленных форм коэнзимов Q9h Q10.

С учетом имеющейся прямой корреляционной связи между изменениями общего пула коэнзимов и их восстановленными формами (г=0,95 для Q9; г=0,87 для Q10 и г=0.99 для Q9+Q10) можно предположить, что изменения содержания убихинола в ипсилатеральном полушарии определяются не только выраженностью «окислительного стресса», повышенной потребностью организма в антиоксидантах, но, прежде всего, имеющимися некротическими изменениями в зоне ишемии, уменьшением жизнеспособных нервных клеток.

Со стороны ct-токоферола отмечалось незначительное уменьшение содержания в ипсилатеральном полушарии - 88,3+8,3% по сравнению с контралатеральным, что не являлось статистически достоверным (р>0,05)( рис. 5). По-видимому, полному расходованию а-токоферола препятствует активная работа его системы регенерации, в том числе и коэнзима Q (Ланкин В.З. и соавт., 2001; 2002).

Таким образом, в процессе проведенных исследований на модели локальной ишемии головного мозга были выявлены достоверные изменения в системе в системе коэнзимов Q9, Q10, как одного из важнейших компонентов антиоксидантной защиты. При этом одним из направлений терапевтической защиты головного мозга при ишемии, корригирующим выявленные патологические изменения, является использование антиоксидантов.

100 ро

100 Р>0.05 |

[ 88.3

■ -i

Рис.5. Содержание сс-токоферола в контра(А) и ипсилатеральном (Б) полушариях головного мозга крыс после 24 часа после ОСМА (контрольная группа).

3.2. Фармакологическая коррекция ншемического повреждения головного мозга крыс при необратимой ОСМА.

3.2.1. Размер зоны ишемии головного мозга крыс с ОСМА, получавших а-феннл-/-бутилнитрон, мексндол, нооглютил, комплексный препарат пирролидона-2 и пироглутаминовой кислотой.

Влияние а-фенил-г-бутилнитрона на зону ишемии головного мозга крыс было исследовано через 72 часа после необратимой окклюзии левой средней мозговой артерии. Общее количество фронтальных срезов головного мозга крыс с визуально определяемым ишемическим очагом составило в среднем 3(рис.7). При этом светлая зона инфаркта на срезах занимала меньшую площадь по сравнению с контролем. Объем зоны поражения составил в среднем 12,8+/- 0,9 % от общего объема ипсилатерального полушария (рис. 6).

80

Рис.6. Размер зоны ишемии животных через 72 часа после ОСМА:

1 - контрольная группа (п=8);

2 - животные (п=8), получавшие РВИ (100мг/кг/день), ** -р <0,01.

Рис.7. Фронтальные 2- мм срезы головного мозга крыс с ОСМА: А - контрольные животные; Б -животные, получавшие РВИ. Зона ишемии указана стрелкой.

Нейропротекторное действие мексидола проявилось в ограничении зоны инфаркта до 9,5+/-0,9% относительно объема ипсилатерального полушария (рис. 8). Следует отметить, что ранее на данной модели локальной ишемии головного мозга препарат не тестировался. Препарат с успехом применяют в клинической практике у больных с нарушением мозгового кровообращения (Миронов Н.В. и соавт., 2001, 2002).

1 2

Рис. 8. Размер зоны ишемии животных через 72 часа после ОСМА:

1 - контрольная группа (п=8);

2 - животные(п=8), получавшие мексидол(100мг/кг/день), ** - р<0,01.

Нооглютил уменьшал зону поражения в 3 раза относительно контроля (22,51±1,55%), что составило 7,6±0.82% от объема ипсилатерального полушария (рис. 9). В исследованиях Гарибовой Т.Л. и соавт.(2003) на модели

геморрагического инсульта было выявлено нейропротекторное действие нооглютила в дозе 10, 20 мг/кг (внутрибрюшинно).

%

1 * *

Т

, V .у ,у.

-

1

Рис.9. Размер зоны ишемии животных через 72 часа после ОСМА:

1 - контрольная группа (п=8);

2 - животные (п=8), получавшие нооглютил (10мг/кг/день), ** - р<0,01.

%

30 !

15 10

5 0

1 * *

Т

1

Рис.10. Размер зоны ишемии животных через 72 часа после ОСМА:

1 - контрольные животные (п=8);

2 - животные(п=8), получавшие комплекс пирролидона-2 и пироглутаминовой кислоты(20мг/кг 2 раза в день),

**-р<0,01.

Комплексный препарат пирролидона-2 и пироглутаминовой кислоты в дозе 40мг/кг/день(в два приема) вызывал ограничение зоны ишемии до 14 ± 0.8% (рис. 10). В исследованиях Топчян А.В.(1998) было выявлено, что данное соединение оказывает защитное действие и при проксимальной модели локальной ишемии головного мозга у крыс, затрагивающей помимо коры и подкорковые структуры.

Таким образом, в настоящей работе была предпринята попытка сравнения нейропротекторного действия препаратов, влияющих на различные звенья патогенеза ишемии головного мозга. Каждый из препаратов обладает широким

спектром действия, при введении в первые минуты ишемии эффективно прерывает запущенные реакции глутамат-кальциевого каскада. Последующее ежедневное введение препаратов предупреждает развитие отсроченных механизмов смерти клетки (вторичная нейропротекция)(Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001). В конечном итоге, все исследуемые препараты вызывали достоверное ограничение зоны ишемии.

Уровень коэнзимов 09, 010 и сс-токоферола в ткани ипси- и контралатералыюго полушарий головного мозга крыс с ОСМА.

Через 24 часа после окклюзии дистального отдела левой средней мозговой артерии у крыс, получавших РВЫ(100мг/кг, внутривенно, однократно, в момент операции ОСМА), отмечалось незначительное падение уровня коэнзимов 09, 010, суммы О9 + 010 как их восстановленной формы, так и общего пула в ипсилатеральном полушарии по сравнению с контралатеральным( табл. 3).

Таблица 3. Соотношение содержания коэнзимов 09 и 010 , сс-токоферола в ткани ипси- и контралатерального полушарий головного мозга крыс, получавших РВЫ;__

И.П/К.П,%

контроль РВЫ

09Н2 65,1 ±4,8** 78,7 ±4,0*

О^о! 78,8 ±4,4** 92,2 ± 3,9*

0,оН2 63,9 ±4,5** 72,8 ±7,8*

0,оЮ1 83,9 ±4,5** 91,6 ±3,8

ОэН2+ ОюН2 64,8 ±4,7** 76,7 ± 5,0*

0<дос + 0шЮ1 80,1 ±4,2** 92,0 ± 3,8"

сыок 89 ± 5,7 90,8 ± 2,54

Примечание: И.П. - ипсилатеральное полушарие; К.П. - контралатеральное полушарие. * - р<0,05 относительно контралатерального полушария; # - р<0,05 относительно контрольных животных.

Следует отметить, что изменения восстановленной формы являлись статистически значимыми (р<0,05), в тоже время падение общего пула коэнзимов как в отдельности, так и в сумме не было достоверным (р>0,05). При сравнении с контрольной группой животных РВЫ достоверно предотвращал падение общего пула коэнзимов 09, 09+010 в ипсилатеральном полушарии (рис. 11) при минимальном влиянии на пул восстановленных форм коэнзимов. Сохранность общего пула коэнзимов является, по-видимому, следствием протективного действия РВЫ на зону ишемии, определяющим сохранность

большего количества жизнеспособных клеток, способных синтезировать коэнзимы. Влияние PBN на восстановленную форму коэнзимов, выполняющую основную антиоксидантную функцию, минимальна, что может быть обусловлено большей скоростью взаимодействия образующихся свободных радикалов с убихинолом и убисемихиноном по сравнению с экзогенно введенной «ловушкой» АФК. В литературе имеются данные о влиянии PBN на митохондриальную дисфункцию(Ро1Ье^го\'а J., et al„ 1995; Kuroda S., et al.,1996), представляющей собой один из источников генерации АФК. Можно предположить, что нормализация работы дыхательной митохондриальной цепи на фоне приема PBN ведет к повышению регенерации убихинона и увеличению концентрации восстановленной формы. Однако, продолжающаяся при ишемии продукция АФК требует для своей нейтрализации дополнительные антиоксиданты, тем более, что PBN преимущественно влияет на первичные АФК (Barclay L.R.C., Vinqvist M.R., 2000), а за утилизацию образующихся пероксильных радикалов в большей степени несут ответственность эндогенные

Q9 Q10 Q9+Q10total

Рис.И. Содержание общего пула коэнзимов Q в ипсилатеральном полушарии животных через 24 после ОСМА.

По оси ординат: отношение содержания коэнзимов ипсилатерального полушария к контралатеральному. По оси абсцисс:

Первые столбики из пар - контрольные животные(п=б); Вторые столбики - животные, получавшие РВМ(100мг/кг) (п=7). # - р < 0,05 относительно контрольных животных.

Изменения содержания а-токоферола в ипсилатеральном полушарии по сравнению с контралатеральным на фоне приема PBN не являлись статистически значимыми (р>0,05). В тоже время не отмечалось достоверной разницы в содержании а-токоферола в ипсилатеральном полушарии между контрольной группой и животными, получавшими PBN (р>0,05).

Таким образом, в ходе нашего исследования впервые было показано защитное действие экзогенного антиоксиданта - PBN - на уровень коэнзимов Q9, Q10 в ткани головного мозга при ишемии, проявившееся в большей степени по отношению к общему пулу коэнзимов Q9, Q10.

3.2.3. Уровень экстрацеллюлярного и тканевого содержания PBN в ипсилатералыюм полушарии, образцах ткани контралатерального полушария головного мозга, печени, почек крыс.

Методом ЭПР было выявлено, что через 3 часа после в/в введения PBN его содержание в почках составило 26,22 + 3,71мкг/г, что выше (р>0.05), чем в печени (8,80 + 2,85мкг/г) и мозге( в контралатеральном полушарии - 20,68 + 3,96 мкг/г; в ипсилатералыюм - 22,44 +1,32 мкг/г). По-видимому, это определяется тем, что основной путь выведения из организма для данного препарата, в том числе в некатаболизированном состоянии, является экскреция с мочой через почки (Chen G.M., et al„ 1990; Floyd R.A., et al. 2002). В связи с интенсивным метаболизмом PBN в печени с потерей свойств перехватывать АФК (Reinke L.A., et al., 2001) сигнал спин-аддукта PBN в этом органе был наиболее низкий. Однако, следует отметить, что содержание PBN в ткани головного мозга незначительно уступает его содержанию в ткани почек, но превышает его содержание в печени. Подобная выраженная биодоступность PBN для ткани головного мозга при использованном нами внутривенном введении препарата по сравнению с интраперитонеальным, возможно, определяет наиболее выраженное нейропротективное действие PBN (Zausinger N., 2000; Marklund S., et al., 2001). Данный факт приобретает наибольшую значимость в первые часы ишемического повреждения мозга, в период действия «терапетического окна», когда повреждения нейронов зоны «пенумбры» имеют обратимый характер и проходят при своевременном терапевтическом воздействии. Следует отметить, что не было отмечено разницы между ипсилатеральным и контралатеральным полушариями в содержании спин-аддукта PBN. С одной стороны, данный результат может свидетельствовать об одинаковом уровне продукции гидроксильного радикала в полушариях. В тоже время, по данным литературы(Бо1еп5к1 N.J.et al., 1997; Lipton P., 1999) в ипсилатеральном полушарии, прежде всего в зоне пенумбры, отмечается гиперпродукция ОН ', что должно было бы привести к повышению концентрации спин-аддукта PBN в ипсилатеральном полушарии. С другой стороны, имеются данные о воздействии гидроксильного радикала на бензольное кольцо PBN, что в присутствии ионов железа вызывает гидролиз соединения с образованием ЭПР-негативных побочных продуктов (Chamulitrat W., et al., 1995)

В ходе эксперимента было выявлено, что во всех микродиализных пробах сигнал спин-аддукта PBN отсутствовал, что может быть связано с низким его содержанием ( на момент забора проб) в интерстиции ткани головного мозга и возможным депонированием его в нервных клетках с последующим влиянием PBN на внутриклеточные процессы, в том числе запущенные HuieMHefi(Floyd R.A., Hensley К., 2000; 2002). Данное предположение подтверждается достоверной регистрацией сигнала спин-аддукта PBN после экстракции данного соединения из ткани мозга с помощью муравьиной кислоты.

Таким образом, в ходе исследования было подтверждено внутриклеточное накопление PBN, что, в дальнейшем, по-видимому, определяет ингибирующее

влияние данного соединения на процессы, запускаемые ншемией(Р1оус1 R.A., Hensley К.,2000; 2002).

Заключение

Нарушение мозгового кровообращения запускает целый ряд патобиохимических реакций, приводящих, в конечном итоге, к гибели нервных клеток ( Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001; Juurlink В.Н., Sweeney M.I., 1997; Lipton P., 1999). Одним из главных компонентов патогенеза ишемического поражения головного мозга является окислительный CTpecc(JuurIink В.Н., 1997; Love S., 1999; Gigun-Suerrki Y„ Rosenbaum Z„ Melamed E., Offen D„ 2002). Свободнорадикальные реакции, участвуя в протекании физиологических процессов в организме в HopMe(Droge W., 2002), при патологии усиливаются и приводят к деструктивным повреждениям клетки. Антиоксидантная защита, направленная на поддержание на определенном уровне образование свободных радикалов в организме, при патологии, в частности, при ишемическом инсульте, не справляется с возложенной на неё задачей. Развивается состояние дисбаланса: с одной стороны - отмечается гиперпродукция АФК (Медведев Ю.В., Толстой А.Д., 2000; Ланкин В.З. и соавт., 2001, 2002), с другой -наблюдается относительный и абсолютный дефицит компонентов антиоксидантной защиты (Islekel S., et al., 1999; Cherubini A„ et al., 2000; Anderson M.F., Sims N.R., 2002). Впервые в нашем исследовании было показано влияние локальной ишемии головного мозга на тканевое содержание коэнзимов Q9, Q10, как одного из компонентов антиоксидантной защиты. При этом выявлено резкое снижение(р<0.01) уровня восстановленной формы коэнзимов Q9, Q10 при минимальных изменениях уровня а-токоферола (р>0.05), что, по-видимому, связано с активной работой системы регенерации последнего(Ланкин В.З., и соавт., 2001; 2002). Одним из направлений нейропротекции, уменьшающим проявления окислительного стресса, является использование препаратов с антиоксидантным механизмом действия (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001; Young I.S., Woodside J.V., 1999; Gigun-Suerrki Y., et al., 2002). Одним из таких соединений стал а-фенил-/-бутилнитрон, широко использующийся в аналитической и биоорганической химии в качестве «ловушки» paдикaлoв(Floyd R.A., Hensley К, 2000; Floyd R.A., et al., 2002). По данным литературы (Kuroda S„ et al, 1999; Yang Y„ et al., 2000; Marshall J.W., et al., 2001; Yoshimoto Т., et al., 2001; Zhao Z„ et al., 2001; Lapchak P.A., et al , 2002; Sydserff S.G., et al., 2002), соединение обладает высокими нейропротективными свойствами, что получило подтверждение в наших исследованиях на модели дистальной окклюзии средней мозговой артерии у крыс. Соединение эффективно ограничивало зону ишемии, что также способствовало сохранению общего пула коэнзимов в ткани ипсилатерального полушария головного мозга животных. Следует отметить, что PBN, являясь липофильным соединением, беспрепятственно проникает через клеточные мембраны, оказывая в дальнейшем влияние на многие внутриклеточные процессы, в том числе запущенные ишемией. Отсутствие PBN в экстрацеллюлярном пространстве по нашим данным (микродиализ мозга)

может быть связано с его депонированием в нервных клетках. Данное предположение подтверждается эффективной экстракцией PBN из ткани мозга с помощью муравьиной кислоты с последующей достоверной регистрацией сигнала спин-адцукта PBN.

Нейропротекторное действие PBN определяется не только его свойствами «ловушки» свободных радикалов. Одной из точек приложения защитного действия PBN является глутаматная эксайтотоксичность (Ferger В., et al, 1998). Данный факт приобретает наибольшую значимость в связи с появившимися в последние годы в литературе данными о взаимосвязи реакций окислительного стресса и глутаматной эксайтотоксичностью ( Викторов И.В. и соавт., 1996; Yang C.-S., et al., 1995, 1996; Skaper S.D., et al., 1999; Avshalumov M.V., Rice M.E., 2001; Gigun-Suerrki Y., et al., 2002; Hayashi Y„ et al., 2002), являющейся отражением возникающего при ишемии дисбаланса между тормозными и возбуждающими аминокислотами. В данной работе на модели локальной ишемии головного мозга у крыс было проведено исследование протекторного действия препаратов с антиоксидантным (а-фенил-Г-бутилнитрон, мексидол) и преимущественно ГАМК-ергическим (комплексный препарат пироглутаминой кислоты и пирролидона-2) механизмом действия, а также нооглютила, оказывающего помимо ГАМК-позитивного, АМРА-модулирующее действие. Было выявлено, что данные вещества (а-фенил-/-бутилнитрон (100мг/кг/день), нооглютил (10 мг/кг/день), мексидол (100мг/кг/день), комплекс пирролидона-2 и пироглутаминовой кислоты (20мг/кг дважды в день)) при ежедневном введении через 72 часа после операции достоверно ограничивают зону ишемии при дистальной ОСМА.

Полученные данные о нейропротекторном действии PBN, нооглютила, комплексного препарата пироглутаминой кислоты и пирролидона-2 позволяют рассматривать их как потенциальные препараты для терапии больных с ишемическими поражениями головного мозга. Подтверждением этого стали недавно опубликованы flaniibie(Lees K.R., et al., 2001) об успешных клинических испытаниях дисульфопроизводного PBN -NXY-059 у больных с ишемическим инсультом.

Выводы

1. Использованная в работе модель локальной ишемии головного мозга, вызванная окклюзией дистального отдела средней мозговой артерии у крыс, приводит к повреждению структур лобно-теменной области коры и может быть рекомендована в дальнейшем для оценки «корковой» нейропротекции различных соединений.

2. Локальная ишемия вызывает изменения антиоксидантной системы защиты ипсилатерального полушария головного мозга. Было выявлено, что в большей степени страдает система коэнзимов при минимальных недостоверных изменениях уровня а-токоферола. Отмечалось падение не только восстановленной форма коэнзимов, но и их общего пула, что было связано с

уменьшением общего количества жизнеспособных нервных клеток в зоне ишемии.

3. Методом микродиализа головного мозга было установлено, что в ипсилатеральном полушарии в стриатуме, минимально повреждаемом при данной модели ишемии, наблюдается повышенный выброс диоксифенилуксусной кислоты, что является отражением реакции окружающей ткани, в частности, дофаминергической системы, на патологические изменения в зоне ишемии.

4. а-фенил-Ьбутилнитрон, мексидол, комплексный препарат пирролидона-2 и пироглутаминой кислоты, нооглютил в течение 3 суток у крыс после дисталыгой окклюзии средней мозговой артерии достоверно ограничивают зону ишемического поражения.

5. а-фенилч-бутилнитрон оказывает защитное действие на общий пул коэнзимов в ипсилатеральном полушарии головного мозга у крыс с ОСМА.

6. Отсутствие сигнала спин-аддукта PBN во всех микродиализных пробах может быть связано с низким его содержанием (на момент забора проб) в интерстиции ткани головного мозга и возможным депонированием данного соединения в нервных клетках, что, по-видимому, определяет в дальнейшем проявление его нейропротекторного эффекта.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. О.В. Поварова, О.С. Медведев. Сравнительная характеристика нейропротективного действия а-фснил-г-бутилнитрона(РВМ) и комплексного препарата, включающего пирролидона-2 и пироглутаминовую кислоту, на модели ишемиченского инсульта. « Медико-экологическая безопасность, реабилитация и социальная защита населения». Тезисы докл. XII Международного форума. Турция, Кермер. 2002. С. 242-243.

2. Поварова О.В., Медведев О.С. Фенил-г-бутилнитрон (PBN) и комплексный препарат, включающий пирролидон-2 и пироглутаминовую кислоту, на модели ишемического инсульта (сравнительная характеристика). Матер, научно-практической конф. «Медицина будущего». Краснодар-Сочи. 2002. С.56.

3. Поварова О.В., Медведев О.С. Сранительная характеристика нейропротективного действия сс-фенил-/-бутилнитрона(РВМ) и комплекса пирролидона-2 с пироглутаминовой кислотой. Тезисы докл. X Российского национального конгр. «Человек и лекарство». Москва. 2003.- С. 744.

4. Поварова О.В., Каленикова Е.И., Ганыпина Т.С., Мирзоян P.C., Медведев О.С. Окислительный стресс и нейропротекция при ишемическом инсульте: си-фенил-/- бутилнитрона и комплекса пирролидона-2 с пироглутаминовой кислотой. Тезисы докл. II Съезда росс. науч. общест. фармакол. Москва. 2003-С.

5. Oleg S. Medvedev, Oxana V. Povarova, Elena I. Kalenikova. Coenzyme Q in the rat brain after acute focal cerebral ischemia. Restor. Neurol. Neurosci.2002.Vol.20. № 6. P.286.

6. О.В. Поварова, Е.И. Каленикова, Е.А. Городецкая, О.С. Медведев. Антиоксиданты как нейропротекторы при ишемическом инсульте. Эксперим. клин.фармакол.2003.Т.66. №3.C.69-73.

7. О.В. Поварова, А.А. Тимошин, О.С. Медведев. Защитное действие фенил-г-бутилнитрона на модели локальной ишемии головного мозга у крыс. Бюлл.эксперим. биол. медицины. 2003. Т. 136. № 12. С.634-637.

8. Povarova O.V., Kalenikova E.I., Medvedev O.S. Mexydol decreases the infarct size after acute cerebral stroke. "Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants and human health". Smolensk. 22-25 September 2003.-P.66-67.

9. Povarova O.V., Kalenikova E.I., Medvedev O.S. Acute focal cerebral ischemia: oxidative stress and neuroprotection (phenyl-i-butyl-nitrone). "Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants and human health". Smolensk. 22-25 September 2003.-P.122-123.

Ю.О.В. Поварова, Т.Н. Гарибова, Е.И. Каленикова, И.П. Галаева, В.А. Крайнева, О.С. Медведев, Т.А. Воронина. Влияние фенил-f-бутилнитрона(РВК), мексидола и нооглютила на зону ишемического поражения головного мозга и память у крыс с окклюзией средней мозговой артерией. Эксперим. клин.фармакол. В печати.

Типография ордена «Знак почета» издательства МГУ 117234, Москва, Ленинские горы Заказ № 1545 Тираж 70 экз.

Актуальность проблемы.

Ежегодно в России переносят инсульт более 450000— 500000 человек (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001; Верещагин Н.В., Варакин Ю.Я., 2001).По имеющимся данным, инсульт занимает второе место в структуре общей смертности населения. Данная патология является основной причиной инвалидности населенияфогтап P.J., Sandercock P.A.G., 1995; Brott Т., Bogousslavsky J., 2000; Kidwell C.S., Liebeskind D.S., Starkman S., Saver J.L., 2001).

Высокая заболеваемость, частые неблагоприятные исходы, в том числе летальные, высокий процент инвалидизации трудоспособного населения - все это позволяет считать инсульт проблемой медицинской и социальной значимости. В связи с этим, актуальна задача предупреждения данного заболевания, проведения профилактических мер, предотвращающих развитие данной патологии (Де Фританс Г.Р., Богуславский Д., 2001). Для снижения летальности и процента инвалидности в популяции больных с инсультом проводится поиск новых эффективных препаратов, обладающих нейропротекторным действием (Фишер М., Шебитц В., 2001; Оковитый С.В., Смирнов А.В., 2001; Гарибова Т.Л. и соавт., 2003; Воронина Т.А., 2003; Островская Р.У., 2003; Мирзоян Р.С., 2003; Dorman P.J., Sandercock P.A.G., 1995; STAIR 1999; Brott Т., Bogousslavsky J., 2000;Kidwell C.S., et al., 2001). В настоящее время в практической неврологии используются разнообразные лекарственные средства, способствующие улучшению мозгового кровообращения, нормализующие метаболизм головного мозга при ишемии (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001; Фишер М., Шебитц В., 2001).

Однако, проводимая терапия не всегда оказывается эффективной. Одной из причин этого является неадекватность большинства экспериментальных моделей доклинических исследований истинной картине ишемического инсульта (Hunter A.J., et al.,1995; Фишер М., Шебитц В., 2001). Поэтому невозможно провести полноценное тестирование новых нейропротективных препаратов. Использованная в работе модель локальной ишемии головного мозга у крыс путем окклюзии средней мозговой артерии (ОСМА) и воспроизводящая типичную локализацию ишемического инсульта у людей (бассейн средней мозговой артерии), представляется наиболее приемлемой для решения данной задачи (Hunter A.J., et al.,1995).

Ишемическое поражение головного мозга сопровождается последовательным развитием патобиохимических реакций глутамат-кальциевого каскада (Juurlink В.Н., Sweeney M.I., 1997; Lipton P., 1999, Danbolt N.C., 2001; Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001), на протяжении всех этапов которого наблюдается активизация свободнорадикальных процессов (Love S., 1999; Gigun-Suerrki Y., et al., 2002). Развивается состояние «окислительного» стресса, проявляющееся в гиперпродукции активных форм кислорода (АФК) (Медведев Ю.В., Толстой А.Д., 2000; Ланкин В.З., и соавт., 2001, 2002; Kinuta Y., et al., 1989; Castagne V.,et al., 1999; Cadenas E., et al., 2000) на фоне недостаточной работы антиоксидантной защиты, одним из компонентов которой является убихинон. С одной стороны, данное соединение является важным компонентом дыхательной митохондриальной цепи, с другой стороны — антиоксидант, участвующий в регенерации а-токоферола, а также способный напрямую реагировать с АФК (Медведев Ю.В., Толстой А.Д., 2000; Dallner G., Sindelar P.J., 2000; Ernster L., Dallner G., 1995; Nohl H., Gille L.,. 2002). Достаточно мало данных литературы, посвященных исследованию влияния ишемии на тканевое содержание y6nxHHOHa(Kinuta Y., et al.,1989; Maulik N., et al., 2000), тем более локальной ишемии головного M03ra(Kinuta Y., et al.,1989).

Одним из направлений терапии ишемического инсульта является использование лекарственных препаратов, обладающих антиоксидантным действием (Дюмаев К.М., и соавт., 1995; Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001). Учитывая имеющиеся на данный момент сведения о тесной, патогенетической взаимосвязи глутаматной «эксайтотоксичности» и гиперпродукции свободных радикалов (Викторов И.В., и соавт., 1996; Yang C.-S., et al., 1995, 1996; Lancelot E., et al., 1997; Gigun-Suerrki Y., et al., 2001; Kontos H.A., 2001; Hayashi Y., et al., 2002) представляло интерес оценить нейропротекторное действие препаратов, влияющих на эти звенья патогенеза ишемического инсульта на модели локальной ишемии головного мозга у крыс путем окклюзии средней мозговой артерии (ОСМА).

Одним из исследуемых препаратов с преимущественно антиоксидантной активностью явился а-фенил-*-бутилнитрон (PBN), «ловушка» свободных радикалов, широко использующийся в аналитической и биоорганической химии. В последние годы появились сведения о положительном нейропротекторном действии PBN (Folberqrovd J., et al., 1995; Kuroda S.,. et al. 1996; 1999; Floyd R.A., et al., 2002; Yoshimoto Т., et al., 2001; Zhao Z., et al. 2001), одним из звеньев действия которого является его свойство связывать свободные радикалы — гидроксильный радикал (Thomas С.Е. et al.,

1996), супероксидный анион-радикал, алкоксильный радикал (Vrbjar N. et al., 1998). В литературе имеются сведения о стабилизирующим влиянием PBN на митохондриальную дисфункцию (Folberqrova J. et al, 1995; Kuroda S.et al., 1996), ингибировании синтеза NO и других провоспалительных факторов (Kotake Y. et al., 1998), блокаде кальциевых каналов (Anderson D.E., et al., 1993), обратимом ингибировании ацетилхолинэстеразы (Milatovic D., et al., 2000). Для PBN характерна большая терапевтическая широта и выраженное нейропротекторное действие, что получило подтверждение на моделях локальной ишемии мозга у различных видов животных (Folberqrova J., et al., 1995; Kuroda S., et al, 1996; 1999; Yoshimoto Т., et al., 2001; Zhao Z., et al., 2001).

Вторым исследуемым препаратом с преимущественно антиоксидантным механизмом действия, был мексидол, производное 3-оксипиридина, синтезированное в ГУ НИИ фармакологии РАМН. Мексидол, оказывая позитивное влияние на эндогенную антиоксидантную систему защиты головного мозга (повышает активность супероксидисмутазы, глутатионзависимых ферментов, увеличивает концентрацию восстановленной формы глутатиона) и противодействуя гиперпродукции свободных радикалов, ослабляет проявление оксидативного стресса в ишемизированной ткани. В реализации нейропротективного действия мексидола играет роль его мембраностабилизирующий эффект, характеризующийся уменьшением перекисного окисления липидов (ПОЛ), стабилизацией физико-химических свойств мембраны, снижением вязкости липидного слоя и увеличением текучести, мембраны (Дюмаев К.М., и соавт., 1995). Кроме того, являясь модулятором ГАМК-бензодиазепинового комплекса, препарат оказывает ГАМК - позитивный эффект, тем самым, устраняя: дисбаланс между тормозными и возбуждающими аминокислотами, вызванный ишемическим поражением головного мозга (Воронина, 2001; 2003).

Следующим препаратом, влияюшим на ГАМК-ергическую систему и восстанавливающим баланс между тормозными и возбуждающими процессами в головном мозге при ишемии (Мирзоян Р.С., 2003) была лекарственная композиция пирролидона - 2 и пироглутаминовой кислоты, синтезированных в ГУ НИИ фармакологии РАМН и предствляющих собой циклические аналоги глутаминовой и у— аминомасляной кислот. Пирролидон за счет взаимодействия с ГАМКд-рецепторами сосудов головного мозга улучшает мозговое кровообращение, пироглутаминовая кислота в большей степени влияет на метаболизм головного мозга, стимулируя процесс захвата и утилизации глюкозы (Топчян А.В., 1999; Мирзоян Р.С., 2003).

В ГУ НИИ фармакологии РАМН создан ноотропный препарат нооглютил (Ы-(5-оксиникотиноил)-Ь-глутаминовая кислота), оказывающий позитивное влияние на ГАМК-ергическую систему, а также модулирующее влияние на АМРА рецепторы. В экспериментах нооглютил проявляет антиамнестическое и противогипоксическое действие (Воронина Т.А., 2003), оказался эффективен при транзиторной ишемии (Алиев О.И., 1999), при экспериментальной черепно-мозговой травме (Новиков В.Е., Ковалева Л.А., 1997), на модели геморрагического инсульта (Гарибова Т.Л. и соавт., 2003). Вещество имеет значительную терапевтическую широту и низкую токсичность.

Экспериментальные исследования взаимосвязи между свободнорадикальными процессами и глутаматной эксайтотоксичностью», являющейся отражением дисбаланса между тормозными и возбуждающими системами головного мозга при ишемии головного мозга, недостаточны (Викторов И.В., 1996; Yang C.-S., et al., 1995, 1996; Skaper S.D., et al., 1999; Avshalumov M.V., Rice M.E., 2001; Gigun-Suerrki Y., et al., 2002; Hayashi Y., et al., 2002). Это явилось основанием для сравнительного исследования влияния перечисленных препаратов на морфо-функциональное состояние головного мозга в условиях его ишемического поражения.

Цель работы

Оценка ишемического поражения головного мозга крыс с окклюзией дистального отдела средней мозговой артерии, и коррекция повреждений с помощью фармакологических веществ.

Задачи

1. Оценка зоны ишемического поражения головного мозга крыс при окклюзии дистального отдела средней мозговой артерии.

2. Исследование состояния дофаминергической системы при ишемическом поражении головного мозга.

3. Изучение влияния локальной ишемии головного мозга на состояние антиоксидантной системы защиты (коэнзимов Q9 и Q10, а-токоферола).

4. Исследование нейропротекторного действия а-фенил-/-бутилнитрона, мексидола, нооглютила, комплекса пирролидона-2 и пироглутаминовой кислоты при ОСМА у крыс.

5. Исследование защитного действия а-фенил-/-бутилнитрона в отношении антиоксидантной системы(коэнзимов Q9 и Q10, а-токоферола) головного мозга при ОСМА у крыс.

6. Исследование фармакокинетических свойств PBN (распределение а-фенил-/-бутилнитрона в организме животного), установление взаимосвязи с его нейропротекторным действием.

Научная новизна

Впервые методом ВЭЖХ с электрохимическим детектированием были выявлены изменения одного из компонентов антиоксидантной системы защиты- коэнзимов Q9 и Q10, а-токоферола — при локальной ишемии головного мозга. При этом выявлено, что в первую очередь страдает система коэнзимов при минимальных изменениях тканевого содержания а-токоферола.

Примененная нами модель локальной ишемии головного мозга, вызванная дистальной окклюзией средней мозговой артерии у крыс, при хорошей переносимости животными позволяет целенаправленно исследовать нейропротективное действие препаратов в отношении поврежденных корковых структур головного мозга. Были выявлены высокие нейропротекторные свойства у а-фенил-/-бутилнитрона, который на фоне достоверного ограничения зоны ишемии также препятствовал изменениям антиоксидантной системы защиты головного мозга: уменьшал падение тканевого содержания коэнзимов Q9, Q10. Мексидол, нооглютил, комплексный препарат пирролидона-2 и пироглутаминовой кислоты при сходном протоколе введения на данной модели ОСМА также достоверно ограничивали зону ишемического поражения.

Изменения в подкорковых структурах при данной модели выражены незначительно, что было подтверждено нашими данными, полученными методом внутримозгового микродиализа дофамина и его метаболитов в области стриатума ипсилатерального полушария. Было выявлено достоверное повышение экстрацеллюлярного уровня диоксифенилуксусной кислоты (метаболита дофамина) на 40 мин послеоперационного периода, что может являться отражением реакции окружающей ткани на патологические процессы, протекающие в зоне ишемии.

Научно-практическое значение

Полученные данные о способности PBN, комплекса пирролидона-2 и пироглутаминовой кислоты, нооглютила ограничивать зону ишемического поражения головного мозга (PBN оказывает положительное влияние на антиоксидантную систему защиты (коэнзимы Q9 и Q10)), позволяют рассматривать указанные препараты в качестве потенциальных средств для лечения больных с ишемическими поражениями головного мозга. Полученные данные по влиянию локальной ишемии головного мозга на тканевое содержания коэнзимов Q могут быть в дальнейшем использованы для рекомендации включения препаратов, содержащих убихинон, в терапию больных с ишемическим инсультом.

115 Выводы

1. Использованная нами модель локальной ишемии головного мозга путем окклюзии дистального отдела средней мозговой артерии у крыс, приводящая к повреждению структур лобно-теменной области коры, может быть рекомендована в дальнейшем для оценки «корковой» нейропротекции различных соединений.

2. Локальная ишемия вызывает изменения антиоксидантной системы защиты ипсилатерального полушария головного мозга. Было выявлено, что в большей степени страдает система коэнзимов при минимальных недостоверных изменениях уровня а-токоферола. Отмечалось падение не только восстановленной форма коэнзимов, но и их общего пула, что, по-видимому, было связано с уменьшением общего количества жизнеспособных нервных клеток в зоне ишемии.

3. Методом микродиализа головного мозга было установлено, что в ипсилатеральном полушарии в стриатуме, минимально повреждаемом при данной модели ишемии, при минимальных изменениях допамина наблюдается повышенный выброс диоксифенилуксусной кислоты.

4. а-фенил-г-бутилнитрон, мексидол, комплексный препарат пирролидона-2 и пироглутаминой кислоты, нооглютил в течение 3 суток у крыс после дистальной ОСМА достоверно ограничивают зону ишемического поражения.

5. а-фенил-/-бутилнитрон оказывает защитное действие на общий пул коэнзимов в ипсилатеральном полушарии головного мозга у крыс с ОСМА.

6. Отсутствие сигнала спин-аддукта PBN во всех микродиализных пробах может быть связано с низким его содержанием (на момент забора проб) в интерстиции ткани головного мозга и возможным депонированием данного соединения в нервных клетках, что, по-видимому, определяет в дальнейшем проявление его нейропротективного эффекта.

Заключение

Нарушение мозгового кровообращения запускает целый ряд патобиохимических реакций, приводящих, в конечном итоге, к гибели нервных клеток ( Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001; Juurlink В.Н., Sweeney M.I., 1997; Lipton P., 1999). Одним из главных компонентов патогенеза ишемического поражения головного мозга является окислительный стресс (Juurlink В.Н., 1997; Love S., 1999; Gigun-Suerrki Y., Rosenbaum Z., Melamed E., Offen D., 2002). Свободнорадикальные реакции, участвуя в протекании физиологических процессов в организме в HopMe(Droge W., 2002), при патологии усиливаются и приводят к деструктивным повреждениям клетки. Антиоксидантная защита, направленная на поддержание на определенном уровне образование свободных радикалов в организме, при патологии ( ишемический инсульт) не справляется с возложенной на неё задачей. Развивается состояние дисбаланса: с одной стороны - отмечается гиперпродукция АФК (Медведев Ю.В., Толстой А.Д., 2000; Панкин В.З. и соавт., 2001, 2002), с другой - наблюдается относительный и абсолютный дефицит компонентов антиоксидантной защиты (Islekel S., et al., 1999; Cherubini A., et al., 2000; Anderson M.F., Sims N.R., 2002). Впервые в нашем исследовании было показано влияние локальной ишемии головного мозга на тканевое содержание коэнзимов Q9, Q10, как одного из компонентов антиоксидантной защиты. При этом выявлено резкое снижение(р<0.01) уровня восстановленной формы коэнзимов Q9, Q10 при минимальных изменениях уровня а-токоферола (р>0.05), что, по-видимому, связано с активной работой системы регенерации последнего(Ланкин В.З., и соавт., 2001; 2002). Одним из направлений нейропротекции, уменьшающим проявления окислительного стресса, является использование препаратов с антиоксидантным механизмом, действия (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001; Young I.S., Woodside J.V., 1999; Gigun-Suerrki Y., et al., 2002). Одним из таких соединений стал а-фенил-Г-бутилнитрон, широко использующийся в аналитической и биоорганической химии в качестве «ловушки» paдикaлoв(Floyd R.A., et al., 2000; 2002). По литературным данным (Kuroda S., et al , 1999; Yang Y., et al., 2000; Marshall J.W., et al., 2001; Yoshimoto Т., et al., 2001; Zhao Z., et al., 2001; Lapchak P.A., et al , 2002; Sydserff S.G., et al., 2002), соединение обладает высокими нейропротекторными свойствами, что получило подтверждение и в наших исследованиях на модели дистальной окклюзии средней мозговой артерии у крыс. Соединение эффективно ограничивало зону ишемии, что также способствовало сохранению общего пула коэнзимов в ткани ипсилатерального полушария головного мозга крыс. Следует отметить, что PBN, являясь липофильным соединением, беспрепятственно проникает через клеточные мембраны, оказывая в дальнейшем влияние на многие внутриклеточные процессы, в том числе запущенные ишемией. Отсутствие PBN в экстрацеллюлярном пространстве по нашим данным (микродиализ мозга) может быть связано с его депонированием в нервных клетках. Данное предположение подтверждается достоверной регистрацией сигнала спин-аддукта PBN после экстракции PBN из ткани мозга с помощью муравьиной кислоты.

Нейропротекторный эффект PBN определяется не только его свойствами «ловушки» свободных радикалов. Одной из точек приложения защитного действия PBN является глутаматная «эксайтотоксичность» ( Ferger В., et al , 1998). Данный факт приобретает наибольшую значимость в связи с появившимися в последние годы в литературе данными о взаимосвязи реакций окислительного стресса и глутаматной эксайтотоксичностью ( Yang C.-S., et al., 1995, 1996; Skaper S.D., et al., 1999; Avshalumov M.V., Rice M.E., 2001; Gigun-Suerrki Y., et al., 2002; Hayashi Y., et al., 2002), являющейся отражением возникающего при ишемии дисбаланса между тормозными и возбуждающими аминокислотами. Полученные нами результаты защитного действия препаратов с антиоксидантным (а-фенил-Г-бутилнитрон, мексидол) и преимущественно ГАМК-ергическим (комплексный препарат пироглутаминой кислоты и пирролидона-2; нооглютил (являющийся также АМРА-модулятором)) механизмом действия подтверждают эти данные.

Полученные данные о выраженных защитных свойствах PBN, нооглютила, комплексного препарата пироглутаминой кислоты и пирролидона-2 позволяют рассматривать их как потенциальные препараты для терапии больных с ишемическими поражениями головного мозга. Подтверждением этого стали недавно опубликованы данные об успешных клинических испытаниях дисульфопроизводного PBN -NXY-059 у больных с ишемическим инсультом(ЬееБ K.R., et al., 2001).