Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Фармакогностическое изучение представителей рода донник

■■-я оа

4 0Н1

иа правах рукописи

КОРОЛЕВ Владимир Анатольевич

ФАРиШШОСШЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОД Л ДОННИК

I.

15.00.02. - фармацевтическая химия и фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Пермь - 1996

Работа выполнена в Курском государственном медицинском университете, Государственном научном центре лекарственных средств Украины /г.Хгрьков /

Научные руководители: доктор фармацевтических наук, профессо|

. • . Ге.ша Э.В.

доктор фармацевтических наук, профессо| Вубенчикова В.Н. Научный консультант: доктор химических наук, профессор, чле| • корреспондент инженерной академии Украины Литвинеико В.И, Официальные оппоненты: доктор фармацэвтичоскях наук, профоссо|

Фурса Я. С.

( кандидат фармацевтических наук, доцоцт

Решетникова М.Д.-

I

Ведущая организация * Московская медицинская академия

' Защита состоится "_"_1995 г в часа

на заседании диссертационного совета Д 084.70.01 по защитам диссертаций при Пермской фармацевтической академии / 614000, Г.Пермь, ул.Ленина, 48 /

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Пермской фармацевтической академии

«

Автореферат разослан ___,_1996 г.

Ученый секретарь специализированного совета, "андидат фармацевтических наук,

доцент ■. Е.В.Метелева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Современная научная медицина алроко использует лекарственные растения, арсенал которых формировался ва счет растений, применяемых в народной медицине или традиционных медицинских системах.

До настоящего времени целый рад таких растений используется на основании опыта народной медицины или только на основании фармакологической проверки. Действующие вещества, ответственные за терапевтический эффект, для них остается недостаточно выксненны-ми. а оценка качества сырья проводится по товароведческим показателям, таким как содержание золы, влаги, экстрактивных веществ. Объективные показатели содержания действующих веществ для них отсутствуют. К числу подобных об-ьектов относится трава донника лекарственного. Различные виды донников издавна используются' в на-• »

родной медицине в качептйё противовоспалительных, диуретических и др. средств. В научной медицине используются донник ле»сарственный и донник высокий в качестве мягчительного средства. Существовавшая ранее нормативно-техническая документация на траву долника *. лекарственного' на предусматривал* стандартизацию сырья по содержанию действующих веществ. Действующие вещества травы донника лекарственного до настоящего времени недостаточно изучены. В сзпаи с этим возникает необходимость разработки более совершенной нормативно •технической'документации, нормирующей качество сырья. Химический состав и биологические свойства других видов рода донник изучены недостаточно. ' •

Таким образом* углубленное изучение растений рода донник с

■1 /

точки зрения современных требований, выделение групп действующих Ееществ, их исследование с применением традиционных и новейших фигкко-х2ШЧ?ских методов, установление объективных показателей

*

Стандартизации сырьП, С* ТЗКХс ВдоСИёКПс сСоМСлшССТН ИСПОЛЬЗОВаНИл в научней медицине других видов' донника является актуальной проблемой.

Цели и задачи исследования-. Цель работы заключалась е детальном (¡ермакогносг'ческом исследования растений рода донник с выделением групп действующих Бегств, выборе методов стандартизации, диагностики и установлении районов заготовки сырья.

Для достижения цели решались следующие аадачи ; предварительное химическое исследование донника лекарственного, донника белого и донника ароматного и цзлью выягления различных групп биологически активных веществ;

- выделение в индивидуальном состоянии дошшруящ»« Kcv.no-нентоз и изучение их. структуры;

«

- разработка методик количественного определения осисгных групп биологически активных веществ;

- пересмотр и уточнение товароведческих показателей качеотва сырья; «

- установление мест произрастания, картирование и определение запасов сырья в областях Центральной России;

- проведение морфолого-анатсмического исследования представителей рода донник о целью выявления диагностических признаков для определения подлинности сырья;

- разработка проекта временной фармакопейной статьи на траву донника лекарственного.

Научьдя новизна. Проведено химическое изучение донника лекарственного, донника бзлого и донника ароматного. Определено наличие кумаринов, флавоноидов, оксикоричных кисло:', дубильных веществ, тритерпеновых соединений, азотистых оснований, аминокис-

лот, углеводов, минеральных элементов, 'каротиноидов. Разработаны методические приемы анализа качественного состава, выделения фекальных соединений и водорастворимых полисахаридов.

а

Полифенолы представлены 23 компонентами, из которых 19 вцги-лены в индивидуальном состоянии и установлена их химическая структура. Семь фенольных соединений: умбелдифзрон, скополетин, эскулетин, герниарин, кофейная, хлорогеновая кислоты и робиник из травы донника лекарственного и донника ароматного выделены впервые. Флавоноидные агликоны кемпферол и кверцетин, гликозиды -лоробин ", кверцетин- 3- О-В- Р-г алактопиранозидо- 6- О- Ь- рамнопирак о-вид, кверцетин-3-0-В-0-галактогафанозидо-7-0-а -Ь-рамнопиранозид, кверцетин-7-0-сс -Ь-рамнопирановид, кверцет ин- 3- О-В-Б- г ал акто: .и-ранозид, кемпферол- З-О-В-О-галактопиранозидо-б-О-Ь-рамно.пкрано-зид, кенпферолгЗ-0-В-0-галакгопираяозидо-7-0-й -рамноплранозгд, кемпферол-7-0-сс -Ь-рамнопиранозид, кемпферол-З-О-В-В-галактопира-нозид из растений рода донник' вьщелекы впервые.

Полисахаридные комплексы растений представлены: галактуроко-воп кислотой, галактозой, глюкозой, ксилозой, рамнозой, фруктовой, арабинозой, мальтозой; определено их количественное содержание. Полисахаридные комплексы растений рода донник исследованы впервые.

Впервые разработаны методики количественного определения сумм кумаринов и флавоноидов травы донника лекарственного и донника белого. .....

Проведено морфолого-анатомическое исследование растений изученного рода, выявлены диагностические признаки сырья, уточнена товароведческие показатели качества сырья.

Практическая значимость. Выявленные, уточненные и вновь оп-

редэленные показатели качества сырья донника лекарственного, диагностические особенности, методики количественного определенна сумм кумаринов и фшавоноидов включены в проект временной фармакопейной статьи на траву донника лекарственного. Изучены запасы травы донника лекарственного и донника белого в Курской, Орловской и Белгородской областях. Полученные данные свидетельствуют о целесообразности использования сырья донника лекарственного и донника белого в качестве -источника биологически активных лолифе-нольних И полисахарцдных веществ с противовоспалительным, раноза-живлякпфш, диуретическим и др. видами действий. \

Внедрение в практику. Разработан и подготовлен к рассмотрению проект временной фармакопейной статьи "Трава донника лекарс-

ть.лшого". В результате ресурсных исследований'установлено, что

*

ориентировочная площадь зарослей донника лекарственного с обследованном регионе составляет 636 га, донника белого - 332 га, а объем возможных заготовок составляет для донника лекарственного ^коло 140 тонн, для данника белого - около 60 тонн. \

Результаты изучения запасов донника лекарственного' и деннйка белого и карты по распространению зарослей растений в Белгородской области внедрены в' практическую работу- Белгородского облпот-ребсотаа. . ,

• Результаты исследований изучаемых видов донника используются ь научных исследованиях и учебном процессе кафедры фармакогнозии Банкирского медицинского университета и Курского государственного ».¿дищшского университета.

На защиту выносятся - результаты исследования' химического состава донника лекарственного, донника белого и донника аромат-нслэ;

- экспериментальные данные по стандартизации и разработке нормативно-технической документации на траву донника лекарствен ного; " •

- результаты морфолого-анатомического изучения;

- итоги ресурсных исследований донника лекарственного и донника белого в областях Центральной России;

- итоги предварительных фармакологических исследований.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены-.

на республиканской научной конференции "Проблемы фармации, подготовки и использования провизорских кадров"(Пятигорск,1993); научно-практической конференции посвященной 30-летию фармацевтического факультета Тюменского медицинского института (Тюмень,1994); „а международном экологическом форуме "Современные экологические проблемы провинции" (Курск,1995); 1-см Съезде Российского научного общества фармакологов "Фундаментальные исследования как основа зоздания лекарственных средств"(Волгоград,1995); региональной конференции "Актуальные проблемы медицины и фармг-деи"(Курск,1995); научно-практической конференции посвященной 50-летию Курского медицинского университета (Курск,1995), науч-ю-практической конференции посвященной 70-летию колено-венероло-•ического диспансера (Курск,1995).

Связь задач исследования Ь проблемами фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом науч-о-исследовательских работ Курского государственного медицинского ниверситета ( номер государственной регистрации (01.9.40008707).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, сданы в печать.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изло-

ж"на на 179 с границах машинописного текста и состоит из введения, ос'гора литературы (1 глава), экспериментальной части (4 главы), общих выводов, списка литературы и приложения. В тексте содержится 34 таблицы, 22 рисунка. Список цитируемой литературы содержит 1?1 источник, из них 33 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность выбранной темы,' определены цели и задачи исследования, показана научная и практическая значимость работы.

Обзор литературы представлен в первой главе у. включает крат-' кук> ботаническую хграктеристш-/ растений ро$а Донник, сведения об л-, химическом составе и применении в научной и народной медицине.

1. Изучение <качественного состаьа и выделение биологически активных веществ. \ '• 1

л

Объектами исследования служили надземные части донника • лекарственного, д.белого,, и д.ароматного заготовленные в различных {--ияаотях Центральной России и Западной Сибири. :

■. При предварительном изучении на различные группы природных сз&динений в траве донника лекарственного, донника белого и донника ароматного обнаружены фенольные соединения ( кумарииы, фла-гзйоиды, океккоричные кислоты ), полисахариды, азотистые основа-' шя, каротиноиди, дубильные вещества, алкалоиды, .тритерпеновые соединения, аминокислоты, минеральные элементы.

ИсследоЕан аминокислотный состав изученных растений. Аминокислоты 'донника лекарственного и донника белого представлены ас-

парагиновой кислотой, треонином, глутаминовой кислотой, глицшгом, валином, аланином,гистидином, аргинином; у донника ароматного дополнительно' к перечисленным, содержится тирозин и отсутствует а«а-:шн. Установлено, что аминокислоты.содержатся в свободном л связанном состоянии, при этом суммарное содержание свободных амина -атслот в изученных растения колеблется от 52,76 до 72,87 мгХ, су-гарное содержание' связанных аминокислот - от 178,73 до 201,8? !г%.

Минеральный состав изучали атомно-абсорбционным методом. Ре-ультаты анализа показали, что.надземная часть изученных растений одержит элементы, влияюпше на обменные процессы в организме

А

а, Ге, Си, Мл. Преобладающими являются из макроэлементов кал: л. из микроэлементов - марганец»

Хроматографическими методами в траве донника лекарственного, оннйка. белого й донника ароматного обнаружено не менее -23 ве-эств'фенольной Природы. На основании качественных реакций, флуо-зйценции й УФ-свете до и после обработки хромогенными реактивами веществ предварительно были отнесены к кумаринам, 5 - к оксико-тоным кислотам и 12 - к флавоноидам.

Выделение веществ осуществляли экстракцией 70%-ным ацетоном, га разделения суммы веществ на индивидуальные компоненты нами ши использованы методы избирательной экстракции, дробной крис-шлиэации, препаративной бумажной и колоночной хроматографии на шиамиде и силикагеле.

■ Йз изучаемых Объектов выделено 19 индивидуальных веществ цельной природы ( 5 кумаринов, 2 - оксикоричные кислоты, 12 -авоноидов ), основные физико-химические свойства которач при^е ни й таблице 1.

Таблица 1

Физико-химические свойства фенольных веществ донника лекарственного, д;белого и д.ароматного

j Номер ! ¡вещества! Вещество Общая . формула Т. лл. C° УФ-спектр \ max, нм Вепчика Rf

j 2.01 Кумарин j CgHeOo 67-68 -27&, 325 0,93Г

| 2.02 I Герниарин . : СюНвОз 117-118 | 250, 330 ' 0.В7Г

| £.03 j Скополетин ! с10н8о4 "204-205 230,256,298,340 0,85А ,*0,50Б, 0,61Г

2.05 j .Умбеллиферон СдНбОз . £33-234 I 218, 250, 328 0,90А,0,64Б,0,24Г

2-06 .] Зскулетин С9Н6О4 268-270 ¡230/258,306,355 0,82А,0,51Б

! .2.03 j • Хлорогеновая кислота Ci6His0çi - 203-205 325,298,240 0,63А,0,69В

| .2.11 i Кофейная ' кислота CsHe04 193-195 » 1 325,299,345 0.82А,0,28В

! 2.12 | Кемпферол CisHioOe 275-277 370,. 265 0,85А,0,10Б,0,06В

j 2.13 j Кверцегин С15Н10О7 310-312 375,270пл,255 0,68А,0,07Б

i £.14 I Робинии СЭ3Н40О19 192-194 1 350, 265 0.31А,0,79В,0,88В

Таблица 1 (Продолжение) Физико-химические свойства фенодьных веществ донника лекарственного, д.белого и д.ароматного

2.15 "Мелоробин" С33Н40О20 — ------- 1 Зб0,265пл,255 I 0,39А,0,70Б,0,78В

2.16 "Диоробин" С27Н30О16 201-203 350, 265 | 0,67Б

2.17 Кверцетин--3- (О-В-О-галактопиранозил)--7-(О-а-Ь-рамнопиранозид) С27Н30О16 360,265пл,255 0,64В '

2.18 "Биоробин" ' | С27Н30О15 221-223 350; 265 0,59В

2.19 Кверцетин-3-(0-В-0-галактопиранозил--6-0-Ь-рамнопиранозид) С27Н30О16 201-203 Зб0,265пл,255 0,54В-

2.20 "Галакторобин" 021Н2й0ц 230-233 ' 350, 265 0,33В

2.21 Кверцетин-3-(0-В-И-галактопиранозил) С.21Н20012 235-237 360,265пл,255 .0,20В

'2.22 "Рамноробин" С21Н20О10 233-236 350, 265 0,16В

} 2.23 • Кверцетин-7-(0-а -Ь-рамнопиранозид) С21Н20ОЦ 233-285 360,265пл,255 0,12В

Примечание : системы раствооителей - А - н-бутанол-уксусная кислота вода (4:1:24, В - 15Х-ный раствор уксусной кислоты, 3 - 2Х-НЫЙ ОаГ"ВОр УКСУС! ЭЙ КИСЛОТЫ, Г - ХЛОРОФОС"I -формами.

2. Химическое изучение фенольник соединений.

Установление структуры выделенных соединений проводили современными физико-химическими, методами. Окончательный вывод о структуре делали на основании сравнения физико-химических констант веществ с образцами достоверных свидетелей.

Вещества £.01, £,02, 2.03, 2,05, 2.06 на основании качественных реакций, наличия флуоресценции *в Уф-свете при обработке х[ -¡ыатограмш 10%-ныи 'спиртовым раствором щелочи, дпааотиравшшой г.ульфшшдовой кислотой отнесены к производным кумарина. При раст-' ворении их" в щелочи и последующем подкислении растворов выпадают ос.адки исходных соединений , что характеризует их как лактоны ку-

ыь,«шовой природы. Кумариновая природа исследуемых соединений

»

подтверждена также деструкцией их йодиотоводородной кислотой ц

в

среде жидкого фенола. Интенсивная голубая флуоресценция вещестр 2.03, 2.05, 2.06, усиливающаяся при действии паров аммиака, а тойо батохрошшй сдвиг максимума длиноволновой полосы в "$-спектрах при добавлении ацетата натрия на 40 ¡щ в области ЗП-340 км, выявляют свободную оксигруппу у С-7.

8 МК-спектрах'исходных соединений обнаруживаются С=0 группа и -пирона ( 1720-1730 см-1), колебания сопряженных двойных связей (1580-1730 см""1), в веществах 2.03, 2.05, 2.06 свободная оксиг-р! :па ( 3260 см-1), а в веществах 2.02 и 2.03 - дополнительно ме-тгксигруппа ( 2843, 2985 см"1), Сравнение физико-химических роиста, величин Кг в различных системах растворителей, а так»? идентичность УФ-, и ИК-спектров с достоверными образцам^ позвали ^ охарактеризовать вещество 2.01 как кумарин, 2.02 - 7 мйтокси кумарин или герниарин, 2.03 - б-метокои-?-окс;икумарии или склпо

- и -

:етин, 2.05 - 7-оксикумарин или умбеллиферон, 2.06 - 6,7-диокси-:умарин или эскулетин.

Вещества 2.08 и 2. И'по флуоресценции пятен на хрсматограше УФ-свете и качественным цветным реакциям с хлоридом железа, ди~ вотированной сульфаниловой кислотой и брймкрезоловш зеленым от-есены к фенолкарбоновым кислотам. В УФ-спектрах исследуемых ве-еств максимумы поглощения находятся при 230-240 нм и 290-330 нм, то „характерно для производных коричной кислоты. Батохромный цвиг максимума поглощения I -полосы при.добавлении циркония хло-экиси к изучаемым соединениям указывает на присутотвие в молеку-з-веществ 3,4-диоксигруппировки. Продукты щелочноко гидролиза эщества 2.03 идентифицированы с. кофейной и 0-хинной кислотой, эщества 2.11-0 3,4-диоксибензойной кислотой. С целью определена места присоединения остатка" кофейной кйслоты к О-хинной кис ете в веществе 2.08 проводили нагревание последнего с ледяной соусной кислотой. При атом образование лактона не происходило, го указывает на замещение оксигруппы й 0-5 положении Ю-хинной юлоты остатком кофейной кислоты. Сравнение физико-химических юйств изучаемых веществ о достоверными образцами хлорогеновой и хфейной кислот показало их идентичность.

Таким"образом, вещество Я.08 охарактеризовано как 5-0-кофе-1-0-хинная ( хлорогеновая ), 2.11 - 3,4-диоксикоричная ( коФей-я ) киолоты.

Вещества 2.12 и 2.13 дают положительную цианидиновую реакщы | Врианту, что позволяет отнести их к флзйоноидам агликоновой ироды. Флавоноидная природа подтверждается также ЙК-спектрами, которых отмечаются полосы поглощения в области 3255-3200 _1(фенольные оксигруппы ), 1639-1665 см'1(карбоксильная группа

г -пирона), 1615-1510 см-1( колебания ароматических колец ). Положение свободных оксигрупп доказывали на основании пряьлй и дифференциальной У<$-спектроскопии, применяя ионизирующие и комплект сообразующие реактивы. Продуктами щелочной деструкции вещества

2.12 являются ■ флороглюцин и п-оксйбензойная кислотз, вещества

2.13 - флороглюцин и протокатеховая кислота.

Ацетильные и метильные производные исследуемых веществ полностью совпали по физико-химическим свойствам с соответствующими производными кеылферолз и кверцетина.

На основании изучения свойств исходных, веществ'и их производных, а также сравнения с идентичными образцами они идентифицированы как: 2.12 - 3,5,7,4'-тетраоксифлавон или кемпферол; 2.13 ->

3,5,7,3',4' - пентаоксифлавон или квеуцеМн, '

г

Вещества 2.14 и 2.15 на основании качественных реакций и хроматографического поведения отнесены к флавоноидным гликозидам.

При полном кислотном гидролизе веществ 10Х соляной кислотой в 50% уксусной кислоте в гидролизатах обнаружили сахара П-галак-тозу, 'ь-рамнозу и агликоны: в первом случае кемлферол, во вто-. ром-кверцеуин. Препаративно-весовым методом определена процентная

' I

доля агликона в гликозидах, которая составила 38,4 и 38,6^ соответственно, что дало основание предположить наличие в молекуле выделенных веществ не менее трех углеводных заместителей, УФ-слектрофотоыетрией с добавлением ионизирующих и комплексообра-зующих реагентов установлено, что углеводные заместители в веществах находятся в 3-м и 7-м положениях, т.е, вещества 2.14 и 2.15 являются дигликоэядами.

Для доказательства структуры указанных фдавоноловых длглико-зидов нами проведен щелочной (0,5Х КОН) и ступенчатый кислотный .

0,IN не:) гидролиз. Образовывавшиеся при этом продукты выделяли репаративно/' хроматографией, • идентификации их проводили по про,-уктам полного кислотного гидролиза, с определением качественного о'става Сахаров и, процентной доли агликонов'и УФ-спектроскопией.

Из продуктов щелочного гидролиза вещества 2,14 выделены сое-инения 2.18, 2.20 из ступенчатого кислотного - вещества 2.16, ,22 и 2.12. Из щелочного гидролтаата вещества 2.15 получены сое-инения 2.19, 2.21, из ступенчатого кислотного - вещества 2.1", .23 и 2.1*3.

На основании проведенных исследований продукты расщепления зщества 2.14 идентифицированы как: вещество 2.16 - кемпфе-эл-З-галактозидо-7-рамкозид, 2.18 - кемпферол-3-галакторамнозид, ,22 - кемпферол-7-рамноэид, 2.12 - кемпферол.. Продуктами расщеп-зния вещества 2.15-являются : вещество 2.17 - кверцетин-3-гзлак-эзидо-7-рамнэзид, 2.19 - кверцетин-3-галакторамнозид, 2.23 -зерцетин-7-рамнозид, 2.13 -кверцетин.

Для установления порядка соединения Сахаров в биозной части яцеств 2.18 и 2.19 нами проведен кислотный гидролиз 0,16% HCl в >% этаноле. Из гидролизата выделили вещества 2.20 и 2.21, кото-ie охарактеризовали как кверцетин-3-0-В-0-галактозид и кемпфе-1л-3-0-в-0-галактозид соответственно..

Для установления конфигурации гликозидной связи в биозидах аду агликоном и сахарами и непосредственно между сахарами нами сведен ферментативный гидролиз веществ рутиназой из бутонов со-рьг японской. В продуктах гидролиза обнаружили агликоны кемпфе--л и кверцешн, что говорит о том, что углеводный заместитель в м положении биозидов представляет собой -O-B-D-галакто-п-б-О-Ь-рамнозид или робинобиозу.

В ИК-спектрах веществ 2.14 и 2.15 обнаружены полосу поглоще ння при 33S5-3300 скГ1(фенапьные оксигруппы), 1039-1665 см"1(кар бокошшная группа г -пирона) ,1615-1510 см-1 (колебания ароматичес ких колец). ' Кроме того наблюдаются полосы поглощения в облает 890-895 см-1 (З-В^-гапактоаил), 895-900 см"1(б-^-Ь-рамноаил) и п лоса поглощения в области 840 см"1(У-^-и-рамноаил).

В ШР-слектре вещества 2,14 обнаружены сигналы протона, 11-2', Н-6',Н-3',Н-5', Н-б, Н-8 и сигналы трех аномернцх рротоно]

ч

углеводных заместителей^ По величине химического сдвига и константы спин--спинового взаимодействия сахара идентифицированы а галактозой и двумя молекулами рамнозы, кроме того одна раыноза j галактоза непосредственно связывается о агликоном, а другая рам-ноза занимает терминальное положение, присутствие дну* молекул рамнозы подтверждается 6-ти протонным сигналом ыетильных групп.

Таким образом, по результатам исследований вещество 2.14 идентифицировали как 3- (О-В-D- галактопиранозил-6-О- L-рамнопирано-зил-7-О-а -L-раынопиранозид)- кемпферола иди робннин.

Вещество 2.15 охарактеризовано наци как 3- (O-p-D-галактопи-ралозил-6-0-1-рамнопира:озил-7-0-с< -L-рамнопираноаид)- кверцетина Учитывая тот факт, что данное соединение из растений вццелено впервые онр получило название !'Мелоробин".

3. Получение # исследование водорастворимых полисахаридов.

Водорастворимые полисахаридные комплексы (ВРПС) извлекали горячей водой из высушенного шрота,, после экстракции ловифеноль-них соединений. BRIC осаждали 96% этиловым спиртом, отфильтровывали, промывали органическим растворителем, высушивали.

Для качественного анализа поаисахарщных комплексов поскс-с, щт подвергали гидролизу 10% серной киалогсц. Хроматографическп ¡. гидролизатах обнаружены а веществ моносахаридного характера; : , а бинрза, галактоза, ксилоза, рамноза, глюкоза, Фруктоза, мальтоза, галактуроновс; кислота.

Количественное определение галактуроновой кислоты проводя.,и спектрофотометрически карбазольным методом. Содержание гала'л\< ¡ о новой кислоты в ВРИО из травы донника лекарставенного сострило 14,93%, -в доннике белом - 1,78%.

Содержание, нейтральных моносахаридов ъ ВРПС определяли дон ситометрически на денситометре ЕЙ1 после проведении гидролиза и хроматографирования в тонгаж слоях сорбента ( система рас торита -

I

лей н-бутанол-уксусная кислота-вода 3:1:1 ). Рзсчет колич;;гтве-м-ного содержания моносахаридов проводили по стандартным образцам (табл.2.).

4. Исследования по стандартизации травы донника лек-фств:;н-ного и донника белого.

Действующими веществами травы денника лекарственного и дон пика белого являются кумарини и флавоноиды. Это послужило предпосылкой к разработке.и выбору методик качественного и количественного определения суммы кумаринов и флавоноидов в указанном сырье.

Качественное обнаружение кумариноЬ проводили хроматографией в тонком слое сорбента & системе растворителей бензол--<тнл.тцетат (1:2). В качестве проявителя использовали 10,1 спиртовый раствор

щелочи. Для количественного определения суммы кумаринов иснользо-*

ван спектрофотометрическпй метод анализа, основанный на собствен-

Таблица 2.

Содержание нейтральных монос-ахаридоЕ в водорастворимйх поли-сахаридных комплексах донника лекарственного, д.белото и д. ароматного

Виды растений, и их части Моносахаридный состав, В 7. К ВРПС

Мальтоза Галактоза Фруктоза Глюкоза Арабиноза Ксилоза Рамноза

Трава донника лекарственного 5,64 13,62 15,98 18,17 11,36 ! 4,56 12,49

Трава донника белого 4,12 11,44 11,39 16,58 8,31 | 8,27 8.34

Трава донника ароматного 4,48 4,29 4,54 18,10 13,62 | 4,48 3,32

ном поглощении кумаринов в УФ-области спектра (Л шах - 310 нм). В качестве растворителя нами использован хлороформ,который способен избирательно'экстрагировать кумариновые соединения из сырья. Исследование динамики экстракции суммы кумаринов' показали, что последние максимально извлекаютя через 1,5 часа при * соотношений сырье-растворитель 1:100.

Преобладающим в суше кумаринов донников является незамещенный кумаоин, поэтому расчет содержания суммы кумаринов проводили в пересчете на последний по удельному показателю поглощения к/марина в хлороформе, который равен 355.

Для количественного определения суммы флавоноидов был разработан спектрофотометрический метод анализа с применением реакции

комплексообразования с алюминия хлоридом в среде 707. этанола. Образующийся окрашенный комплекс имеет максимум поглощения при 410 нм. При изучении условий экстракции определэно, что максимально флавоноиды извлекаются из сырья кипящим 702 'этиловым спиртом через 45 минут при соотношении сырье-растворитель 1:100.

Учитывая то, что флавоноиды в растении содержатся в форме монозидов, биозидов, дигликоэидов, с преобладанием биовидов и дигликозйдов расчет сор .-жания суммы флавоноидов- вели в пересчет на государственный стандартный образец рутина.

По предложенным методикам проанализированы 10 образцов травы донника лекарственного и д.белого. Анализы показали, что содержание суммы кумаринов в траве донника лекарственного колеблется от 0,48 до 0,94%, суммы флавоноидов - от 2,24 до 3,47%., в чраве донника белого - суммы кумаринов - от 0,34 до 0,692, суммы Флавоноидов - от 2,27 до 3,06% ( табл.3 ).

На основании этих данных установлены нормы содержания действующих веществ: в траве донника лекарственного суммы кумаринов -не менее 0,42, суммы флавоноидов - но менее 2,2%; в траве д.белого суммы кумаринов- не менее 0,32, суммы флавоноидов - не менее

При изучении динамики накопления кумаринов и флавоноидов в доннике лекарственном и д.белом установлено, что они максимально накапливаются в фазу цветения в цветках' и листьях растения.

5. Ресурсно-биологические исследования.

Применение растений рода донник в медицине делает необходимым изучение их- морфолого-анатомических признаков, Исследования

Тайд;;ца С

Сздеркг";;« суммы кумаринов и флавономдов в трава донника лекарственного и донника белого

| Номео Место сбора Содержание суммы кумариновД Содержание суммы флавонсидов, 7.

¡[образца сырья

д.белый д.лекарственный

д. лекарственный д.белый |

| 1 Курс;£ая область, пос. Золотухине 0,94 0,64 з,04 ;

Р ° Белгородская область, Корочанский р-он 0,48 0,34 ' 2,82 2,53

! 3 Брянская область, Брасовский р-он 0,53 0,44 2,73 2,73

4 Липецкая область, 0,51 0,59 2,92 3,06 |

г. Усмань

] 5 ¡1 ; Орловская область,■ Лнвеяский р-он 0,73 0,49 3,21 2.35 |

¡1 ® ! Воронежская область, окрестности Воронежа 0,84 0,65 2,99 2,54

I 7 Тульская область, '' 0,66 0,60 3,47 2,66

Веневский р-он »

8 Полтавская область, 0,75 0,36 2,24 О <г*0 1 ; / О |

1 окрестности Полтавы

1 3 Донецкая область, 0,62 0,54 3,35 2,94 |

Енакиевский р-он ' 1

110 ! Львовская область» 0,81 0,42 1 2,77 2,27 1

1 1 окрестности Львова 1

проводили общепринятыми методиками.

В результате анатомического исследования донника д^едо i,« н ного, д.белого и д.ароматного ( цветка, стебля, листа) усгансые ни следующие микродиагьостеческие признаки, котсрие аьлиютса со щш.ш для видов: '

- эпидермис верхней стороны листа слабоизашшстый, нижней более извилистостенный;

*

- устьица анамоцнтного типа;

- наличие простых одноклеточных волосков с борадавчахои ;;/■ тикулой;

- «плки листа окружены кристалпоносной обкладкой.

Отличаются изучаемые виды по следующим признакам:

- у донника лекарственного и д. ароматного на нижнем опил^ мисе листа имеются железистые волоски. В первом случае они состоят ИЗ многоклеточной НОЖКИ С многоклеточной ГОЛОВКОЙ, £0 ВКуСм многочисленные железистые волоски на о„нскяеточнай ножке с легочной головкой.

Дл1: изучения сырьевой базы донника лекарственного и д.белого были проведены ресурсоведческие исследования в областях Цеитрадь-ного района России, Установлена, что ебьем Возможных ежегодных заготовок в изученном регионе травы доншшка лекарственного составляет свыше }40 г, травы д.белого - около 60 г ( табл.1. ).

В результате фармакологических исследований лекарственны/, форм (настои, экстракты) и фракций (водораствс-рьмыз полисахарид-нив »>смплексы, суммы кумаршюв, флавоноидов) донника .-.-каротвец-ного н д.белого установлено, что последние при низкой токсичности окзацвшг противовоспалитель»юе, диуретическое, aiti иксагуляитисе, Свдативнсе и антимикробное действие.

Таблица 4.•

Запаси сырья ( травы ) донника лекарственного и д.белого в областях Центрального района России

Площадь »л росли (га) Виьрленнки биологический галас сырья (сухой Эксплуатационный гапас сырья (т) Объем ВОЗМОЖНЫХ ежегодник заготовок, (т)

1 111 НИ К ЛЕКАРСТВЕННЫЙ ,

Курская область

307,6 70,09-85,23 70, <>9 35,04

Белгородская область

23,95-29,75 " 23,45 11,97

Орлово-.ая область ' ...

— 54.3-3-66,96 54,33 27,16

Всего по региону

' ь~6,1 148.37-181, 148.37 74,18

ДОННИК БЕЛЫЙ

Курская область

1 53, С 27", 92-34,17 27,92 > 13,^6 _

Белгородская о^ласт^.

4", 5 9,60-12,02 . 9,60 4,80

Орло&ская область

129,5 21,44-26,49 21,44 10, 72

Рсчго по региону

-' Г , 0 ____ 53,96 1 29,4В

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Проведено комплексное изучение надземной части дон...на лекарственного, донника белого и донника ароматного с выделением и идентификацией основных компонентов.

2. В изученных объектах обнаружено 23 фенольнш соединенна, из которых 19 выделены в индивидуальном состоянии.

*

3. Выделенные соединения исследованы с использованием «пми-ческих и физико-химических методов. Установлено, что они представлены оксикумаринами : кумарином, умбеллифероном, скшодетннзм, 5с1сулетинсм, герниарином; оксикоричными кислотами - кофейной и хлорогеновой кислотой;' флавоноидными агликонами - кемпферолсм»

I

кверцетино'м, флавокоидными глпкозидами - робиннном, "мелоробн-ном",' кверцетин-З-О-В-О-галактопиранозидо-б-О-Ь-рамнопиранозндом, кверцетин-3-0-В-Р-галактопиранозидо-7 - 0 -а -и-рамнопираноБидом, кверцетин-7'0-«-Ь-ра»,шопирзнозидом, г .зрцатиц-З-О-В-П-галактопн-ранозидом, кемпФерол'-З-О-В-О-галактопираноаил-б-О-и-рамнопнрано-видом, 1£емпферол-3~0-В-0-гадактопиранозил-7-0-ас -Ц-раынопираноан-дом, кемпферод-У-О-а-Ь-рзмнопиранозидом, кемцферол-З-О-В-О-гал&ч-топиранозидом. Семь фенолышх соединений: умбеллиферон, скополе-тин, эскулетин, герниарин, кофейная и хлорогеновая кислоты, роби-из донника лекарственного и денника ароматного выделены впервые. Фдавоноидные агликоны кемпферол, кверцетин и флавоиоидные гдикозиды "Малоробиц", кверцетнн-З-О-В-П-галактопиранозидо-б-ОЧ.-рамнопиранозид, кворцетин-З-О-В-О-галактопираноэидо-У-О-а -Ь-рам-нрпиранозид, КБерцетин-7-0-« -Ь-рамнопираноэид, кверцетии-З-О-В-Р-галактопиранозид, кемпферод-З-О-В-О-галактоииранозидо-6-0-1.-рамнопирановид, кемпферод-3-0-В-0-галакгопнрановидо-7-0-ос -Ь-рам-

копиранозил, кемпФ?рол-7-0-л -[.-р^нопиранозид, кемпферол-3-0-Г-П-1 алактопиранозид из растении рода Донник выделены впервые.

4. Внделеиы и изучены полисахаридные комплексы надземной пасти донника лекарственного, д. белого и д.ароматного. Установлено, что основными компонентами его являются гапактуроновая кислота. галактоза, глюкоза, арабнноза, ксилоза, рамноза, фруктоза, мальтоза. Определено количественное содержание кислых и нейтральных моносахаридов. Содержание кислых Сахаров составляет - 1,78 - . 14,93%.

„ 5. Впервые разра .отаны методики спектрофотометрического определения суммы кумаринов и флавоноидов в траве донника лекарственного и д. белого, в нервом случае в пересчете на кумарин, г.п-втором на рутин; содержание суммы кумаринов в траве донника лекарственного должно быть не менее 0,4%, в траве д. белого - не менее 0,3%. Содержание суммы флавоноидов в траве донника лекарственого, и д.белого должно быть не менее Й,2

6. Проведено анатомическое исследование представителей 'рода Донник. На основании полученных данных выявлены основные диагностические и отличительные признаки ра-тений.

7. Разработан проект временной фармакопейной статьи ''Трава до"ника лекарственного", в котором уточнены "морфологические И. анатомические признаки, товароведческие показатели, впервые включены методы стандартизации по содержанию суммы кумаринов и флаво-* ноидов. • •

3. Изучены йадасы травы донника лекарственного и д. белого в Курокбй, Орловской и Белгородской областях. Составлены карты распространения зарослей изучаемых растений, имеющих промысловое значение. На территории обследованного региона возможны ежегодные

- IwO -

заготовки сырья донника лекарственного в количестве КО токи, д. белого - 60 тонн.

9. Предварительными фармакологическими исследованиями показано, что фенольные соединения донника лекарственного и д. белого обладают диуретическим, оедативным, антимикробным, антикоагуллнт-кым, противовоспалительным действие:.!; полисахаридный комплекс -противовоспалительной акт1, вностью.

По теме диссертации опубликованы следующие работы.

1. Анал1з водорозчинних пол!сахарид1в деяких л1карьских рос-дин / Ладна Л. Я. ,• Сухомл1нов Ю.А., Гелла Э.В., Королев В. А. та iH. // Перспективы создания и пр-ва лекарственных средств в Украине. - Харьков, 1993. - С.339.

2. Королев-В.А. Анализ производных коричной кислоты и аминокислот некоторых видов рода донника произрастающих в Курской области //Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины и фармации. - Курск. - 1993. - 0.149-150.

3. Фитохимическое* и иммунологическое изучение лекарственных растений /Э.В.Гелла, Г.А.Дрозд, В.Я.Яцюк, Ю.А.Сухомлинов В.А.Королев и до.//Проблемы фармации; подготовки и использования провизорских кадров. - Пятигорск, 1993. - С.19-20.

4. Королев В.А., Бубенчикова В.Н. Аминокислотный состав донников лекарственного, ароматного и белого //Актуальные проблемы фармации. - Тюмень, 1994. - С.127-128.

5.'Бубенчикова В.Н., Королев В.А. Азотистые основания донников лекарственного, белого и ароматного //Актуальные вопросы экс- ' перименталыюй и клинической медицины и Фармации. - Курск, 1995.

- С.89-90.•

6. Бубенчикова В. И., Королев В.А. разработка метода количественного определения суммы флавонондов в растениях рода донник //Актуальные вопросы экспериментальной медицины и фармации. -

Курск, 1935. - С.90-91. у

7. Бубенчикова В.Н., Королев В.А,, Кочкаров Р.И. Фотохимическое исследование некоторых представителей родов донник, буквица, копытень //Современные аспекты изучения лекарственных растений: Науч.тр. /ВНИИФ. - М., 1995. - Т.34. - С.147-151.

8. ГримоваТ.А., Бубенчикова В.Н., Королев В.А. Особенности антифлогистического действия лекарственных форм донника лекарственного и белого //Фундаментальные исследования как основа создания лекарственных средств: Тез.дом. 1-го съезда Российск.науч. общества Фармакологов. - Волгоград, 1995.'- С.124, .

9. К вопросу разработки и исследования мази "Полидон" / Э.В.Гелла, В.А. Жигулин, Т.А. Панкрушева, В.Н. Бубенчикова, В.А.Королев и др.//Современные вопросы Дерматовенерологии. -Курск, 1995. - С.33.

10. Королев Б.А., Грачева 0.Д., Бубенчиков A.A., Елецкая O.A. Анатомическое исследование растений рода донник Центрального Черноземья России //Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины и фармации. - Курск,1995. - С.99-100.

11. О возможности выращивания лекарственных растений на от--' вальных землях /В.Н.Бубенчикова, А.А.Бубенчиков, С.И.Гримальская, В.А.Королев и др. //Современные экологические проблемы провинции: Тез.докл.Меасд.экологии.форума. - Курск, 1995; - С.35-36.

12. Сенькевнч Ю.М., Набокова O.A., Королев В.А. Антифлогисти-ческзя активность жидкого экстракта донника лекарственного и его влияние на сердечно-сосудистую систему //Актуальные вопросы экс-

- ¿.О -

периментышюн и клинической медицины и фармации. - Курск, 1955. - С.115-116.

13. Бубенчиков P.A. , ' Закаран Л.М., Москоьцева Г.J1., Королев В. А, Антимикробная активность извлечений из травы донник.'! лекарственного //Актуальные проблемы медицины- и фармации. - Курск, 1996. - 0.123.

14. Е^бенчикова В.Н. ,-,Королев В. А., Бубенчиков A.A., 'Кочкаров В. И. Определение суммы фпавоноидов в траве донника лекарственного и чистеца болотного //Актуальные пролблемы фармацевтической хи-. МИИ! Науч.тр./ВШ®. - М., 1996. - Т.35. - С. 175-179.

15. Пичугин В.В., ГримоваТ.А., Бубенчикова В.Н., Королев В.А. Фармакологические свойства донника белого //Традиционная медицина: теоретические и практические аспекты: Тез.докл.2-го науч. конгр'. - Чебоксары, 1996.- - 0.94.