Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое изучение свежесобранного сырья отдельных представителей рода Artemisia L. и гомеопатических матричных настоек из него

Союнова Жанна Атамаммедовна

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ СВЕЖЕСОБРАННОГО СЫРЬЯ ОТДЕЛЬНЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА ARTEMISIA L. И ГОМЕОПАТИЧЕСКИХ МАТРИЧНЫХ НАСТОЕК ИЗ НЕГО

14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

-6 ОКТ 2011

Москва-2011

4855292

Диссертационная работа выполнена в Институте гомеопатии и натуротерапии Федерального научного клинико-экспериментального центра традиционных методов диагностики и лечения Росздрава

Научный руководитель:

Доктор фармацевтических наук, Киселева Татьяна Леонидовна профессор

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук, Прокофьева Вера Ивановна профессор

Доктор фармацевтических наук Лякина Марина Николаевна

Ведущая организация: ГОУ ВПО Курский Государственный медицинский университет

Защита диссертации состоится октября 2011 г. в 14.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 208.040.09 при Первом МГМУ им. И.М. Сеченова по адресу: Москва, Никитский бульвар, д. 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Первого МГМУ им. И.М. Сеченова по адресу: 117998 Москва, Нахимовский проспект, 49

Автореферат разослан « /Э » сентября 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 208.040.09

доктор фармацевтических наук, Садчи'ко'ва Наталья Петровна профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В современной мировой гомеопатии используются препараты из свежесобранного сырья четырех видов рода полынь: Artemisia absinthium (препарат Absinthium), A. vulgaris (препарат Artemisia vulgaris), A. abrotanum (препарат Abrotanum) и A. cina (препарат Cina). Гомеопатические патогенезы этих препаратов существенно различаются. Поэтому при изготовлении последних особую актуальность приобретает дифференциальная диагностика исходного сырья и гомеопатических матричных настоек (ГМН) из него. Внешние признаки и химический состав Artemisia cina существенно отличаются от других представителей этого рода; ареал вида находится за пределами РФ. Поэтому практический интерес представляет дифференциальная диагностика трех отечественных близкородственных видов: A. absinthium, A. vulgaris и A. abrotanum.

На сегодняшний день нормативная документация (НД) на свежесобранное сырье всех трех видов полыни и ГМН из него отсутствует, поэтому, начиная с 2000 года, они не входят в Государственный реестр лекарственных средств (JIC) России. За рубежом гомеопатические препараты всех видов полыни применяются в современной медицинской практике. В связи с этим актуальной является разработка характеристик подлинности и показателей качества, а также методик их определения для свежесобранного сырья и ГМН разных видов полыни, используемых в отечественной гомеопатии.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является фармакогностическое изучение свежесобранного сырья полыни горькой, полыни божье дерево и полыни обыкновенной, а также ГМН из него для расширения отечественной сырьевой базы и арсенала гомеопатических JIC.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести информационно-аналитическое исследование для установления степени изученности морфолого-анатомического строения, химического состава и уровня стандартизации исследуемых видов сырья и ГМН из него.

2. Изучить морфологические особенности и анатомическое строение свежесобранного сырья 3 видов полыни в сравнительном аспекте и выявить диагностические признаки каждого из видов сырья.

3. Провести фитохимическое изучение, разработать методики проведения качественных реакций и ТСХ для изучаемых видов полыни и ГМН из него.

4. С помощью разработанных методик провести анализ всех исследуемых объектов в сравнительном аспекте.

5. Выявить характеристики подлинности, позволяющие провести дифференциальную диагностику близкородственных видов свежего сырья разных видов полыни и ГМН из него.

6. Разработать методики количественного определения биологически активных веществ (БАВ) в сырье изучаемых видов полыни и ГМН из него.

7. Разработать числовые показатели для оценки качества лекарственного растительного сырья (JIPC) изучаемых видов полыни, и показатели качества ГМН из него.

8. Разработать проекты НД на свежесобранное сырье и матричные гомеопатические настойки трех изучаемых видов полыни, удовлетворяющей современным требованиям, предъявляемым к документации такого уровня.

Научная новизна. На основании макро- и микроскопического анализа свежесобранного сырья установлены его морфолого-анатомические диагностические признаки, позволяющие провести дифференциальную диагностику близкородственных видов рода полынь (Artemisia L.).

Обоснован выбор групп БАВ для качественного и количественного определения свежесобранного сырья п. горькой, п. божье дерево и п. обыкновенной и ГМН из него. С учетом принципа сквозной стандартизации разработаны соответствующие методики.

С помощью разработанных методик качественных реакций и метода тонкослойной хроматографии (ТСХ) в исследуемом сырье полыни определены терпеноиды, флавоноиды, дубильные вещества и фенолкарбоновые кислоты (ФКК), кумарины и полисахариды. Выявлены различия в составе БАВ в сырье в зависимости от вида полыни. Впервые изучен терпеноидный состав ГМН 3-х видов полыни в сравнительном аспекте.

Обоснована целесообразность выбора и разработаны методики количественно определения различных групп БАВ в свежесобранном сырье 3-х видов полыни и ГМН из него. Впервые разработаны пока-

затели подлинности и критерии оценки качества свежесобранного сырья п. горькой, п. божье дерево, п. обыкновенной и ГМН из него.

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны и представлены на утверждение в установленном порядке:

• 3 проекта ФС на свежесобранное сырье: «Полыни божье дерево трава свежая - Artemisia abrotanum herba recens»; «Полыни горькой трава свежая - Artemisia absinthium herba recens»; «Полыни обыкновенной корневища и корни свежие - Artemisia vulgaris rhizomata et radices recens»

• 3 проекта ФС на ГМН: «Полыни божье дерево настойка матричная гомеопатическая - Tinctura materna homoeopathica Abrotanum»; «Полыни горькой настойка матричная гомеопатическая -Tinctura materna homoeopathica Absinthium»; «Полыни обыкновенной настойка матричная гомеопатическая - Tinctura materna homoeopathica Artemisia vulgaris».

Основные положения, выдвигаемые на защиту. На защиту выносятся:

• Результаты морфолого-анатомического изучения свежесобранного сырья п. горькой, п. обыкновенной и п. божье дерево и разработки характеристик подлинности сырья и ГМН из него.

• Методические подходы и результаты разработки методик качественного и количественного анализа БАВ в сырье трех изучаемых видов полыни и матричных настоек из него.

• Результаты разработки критериев оценки качества, норм их содержания и установления сроков годности ГМН и исходного сырья 3-х видов полыни.

• Результаты разработки проектов ФС на свежесобранное JIPC 3-х видов рода Artemisia L. и 3-х ГМН из него с учетом современных требований к качеству лекарственных средств и исходного JIPC.

Апробация работы. Основные положения проведенных исследований доложены и обсуждены на III и IV Российских гомеопатических съездах (М., 2007 и 2009 г.), Международном форуме «Интегра-тивная медицина 2008» (М., 2008 г.), I Российском фитотерапевтиче-ском съезде (М., 2008 г.), III Международном конгрессе «Фитотерапия и народная медицина эпохи Авиценны» (Таджикистан, Душанбе,

2008 г.), Научной конференции «Достижения здравоохранения Туркменистана в эпоху Великого возрождения» (Туркменистан, Ашгабат,

2009 г), IV Международном форуме «Индустрия Здоровья» (М., 2011), II Съезде натуротерапевтов России (М., 2011).

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведена аналитическая и статистическая обработка, научное обоснование и обобщение полученных результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах и их внедрения в практику.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 3 и 6 паспорта фармакогнозии.

Связь задач исследований с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в рамках тематики и плана ФНКЭЦ ТМДЛ МЗ СР РФ «Фармакогностическое изучение некоторых видов полыни и ГМН из него» (Договор с МЗ СР РФ № 208/062/001 от 2006 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 научных работ, из них 5 в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 159 страницах и содержит 50 табл., 41 рисунка; состоит из введения, пяти глав, выводов, списка использованной литературы и приложения. Библиографический указатель включает 183 источников литературы, из них 21 зарубежных.

Во введении раскрыта актуальность темы, определены цели и задачи исследования, сформулированы научная новизна и практическая значимость работы. В 1 главе представлены результаты информационно-аналитических исследований по степени изученности объектов: морфолого-анатомических характеристик, химического состава, фармакологической активности и медицинского применения; методов анализа основных действующих веществ и анализу уровня стандартизации.

В «Экспериментальную часть» включен раздел «Объекты и методы исследования» и главы 2-5,' посвященные описанию экспериментальной работы и обсуждению результатов. В разделе «Объекты и методы исследования» приведены данные об объектах исследования, используемых методах, приборах и реактивах, другие сведения методического характера. Глава 2 посвящена морфолого-анатомическому изучению свежесобранного сырья п. горькой, п. божье дерево и п. обыкновенной. Впервые подробно описаны внешний вид и диагностически значимые микроскопические признаки свежесобранного сырья 3-х видов полыни. В главе 3 излагаются результаты фотохимического исследования свежесобранного сырья изучаемых представителей рода Artemisia L. и ГМН из него. Приводятся данные по разработке методик качественного определения основных групп БАВ изучаемых объектов, а также их обоснование. В главе 4 приводятся результаты разработки методик количественного определения суммы БАВ в свежесобранном сырье и ГМН из него. Глава 5 посвящена стандартизации свежесобранного сырья некоторых представителей рода Artemisia L. и ГМН из него.

Результаты экспериментов обработаны статистически, обобщены в таблицах, проиллюстрированы графиками и рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили образцы опытных партий свежесобранного сырья п. горькой, п. божье дерево, п. обыкновенной, заготовленного в 2006-2009 гг. в Краснодарском крае, Московской, Тульской, Калужской, Курской и Новосибирской областях и ГМН из него. ГМН готовили по ОФС 42-2700-06 «Настойки гомеопатические матричные», метод 3.

Использованные методы анализа, реактивы, масса средней и аналитической проб для проведения анализа сырья, приведены в соответствующих разделах ГФ XI и XII изданий. В частности, микроскопический анализ проводили в соответствии со статьей ГФ XI «Техника микроскопического анализа» (В.2., с. 277-285) на микроскопе Olympus СХ41 (Япония) с окуляром 19х, с объективами 4х, 10х, 20х, 40х и ЮОх и фотокамерой Olympus DIGITAL CAMERA С-3000 ZOOM (Япония). Фитохимические исследования проводили с ис-

пользованием современных физико-химических методов: УФ- и ИК-спектрофотометрия, ГЖХ-МС, ВЭЖХ, а также ТСХ. Валидацию аналитических методик проводили в соответствии с ГОСТ Р ИСО 57253-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 3. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений».

Морфолого-анатомическое изучение свежесобранного сырья п. горькой, п. божье дерево и п. обыкновенной

Впервые изучены и описаны в сравнительном аспекте морфоло-го-анатомические признаки травы и подземных органов 3-х видов полыни и выявлены их отличительные диагностические признаки, позволяющие дифференцировать близкородственные виды сырья, используемые, в том числе, в гомеопатии. На основании полученных в результате выполнения настоящей работы экспериментальных данных, составлены итоговые таблицы, имеющие практическое значение при диагностике исследуемых видов сырья (табл. 1-4).

Установлено, что сырье изучаемых видов рода полынь имеет существенные различия по ряду внешних признаков, которые могут быть использованы для их дифференциальной диагностики по форме, размеру, цвета листа и характеру его опушения; характеру ветвления, опушению и цвету стебля (табл. 1-2).

К анатомо-диагностическим признакам листьев п. горькой нами отнесены: наличие устьичного аппарата и крупных овальных эфиро-масличных железок, расположенных в 2 ряда и 4 яруса, по обе стороны листовой пластинки; многочисленные Т-образные волоски. К анатомо-диагностическим признакам листьев п. божье дерево отнесены: часто встречающийся устьичный аппарат аномоцитного типа по обе стороны листовой пластинки, наличие неспецифических паренхим-ных клеток с эфирным маслом (табл. 3).

К анатомо-диагностическим признакам корневищ и корней п. обыкновенной отнесены: толстый слой перидермы; многоугольная и округлая форма клеток паренхимы; сгруппированные волокна твердого луба под вторичной ксилемой; сильно развитая флоэма; клетки запасающей паренхимы, формирующие своеобразный "замыкающий слой" годичных колец (табл. 4).

Таблица 1

Сравнительная таблица внешних признаков свежих листьев 3-х видов рода Artemisia L.

Морфологии, признак Результаты исследования, имеющие диагностическое значение

A. absinthium A. vulgaris А. аЬго1апит

Форма листьев Черешковые - треугольно-округлой формы, дважды-трижды перисторассечен-ные на линейно-продолговатые и тупозао-стренные дольки. Без черешков - тройчатые, пери-стораздельные С очень коротким черешком или без него, эллиптические или яйцевидные, перисторассеченные на линейно-ланцетные, крупнозубчатые или лопастные доли, со слегка завернутыми вниз краями Черешковые - овальные глубоко рассеченные на узко-линейные дольки, мелкие - дважды перисторассеченные с узколинейными сегментами

Размеры Дл. 4-12 см, шир. 3-7 см Дл. 5-10 см, шир. 3-7 см Дл. 4-8 см, шир. 3-6 см

Характер жилкования Сетчатое Сетчатое Сетчатое

Характер края Цельный Цельный Цельный

Опушение Густое с обеих сторон Сверху голые или негусто паутинисто-волосистые; снизу беловойлочные Отсутствует

Цвет Серовато-зеленый Сверху зеленый, снизу серовато-белый из-за обильного войлочного опушения Синевато-зеленый

Запах Ароматный Ароматный Ароматный

Вкус Пряно-горький Пряно-горький Пряно-горький

Сравнительная характеристика внешних признаков свежей травы 3-х видов рода Artemisia L._

Морфологический Результаты исследования, имеющие диагностическое значение

признак A. absinthium A. vulgaris А. аЬго1апиш

Форма Ребристый Ребристый Ребристый

л ц и Характер ветвления Коротковетвистый Многократноветвистый в верхней части Неветвящийся

Ю и Опушение Густое Прижатоопушенный Голый

и Цвет Серовато-зеленый Красновато-фиолетовый Буроватый

Расположение Очередное Очередные Очередные

Сложность лист, пласт. Простые Простые Простые

Листья Форма Стеблевые: черешковые, округло-треугольные, дважды или трижды перисторассе-ченные. Верхушечные: сидячие, цельные или трехраз-дельные Эллиптические, перисторас-сеченные на крупнозубчатые или лопастные доли. Листья в соцветиях трех- или пяти-рассеченные; верхние: цельные, ланцетные Нижние: овальные, глубоко рассеченные на узколинейные дольки;средние: дважды перисторассечен-ные с узколинейными сегментами; верхние: тройчатые до цельных

Характер жилкования Сетчатое Сетчатое Сетчатое

Характер края Цельный Цельный Цельный

Опушение Густое с обеих сторон листа Сверху голые или негусто волосистые; с нижней стороны беловойлочные Голые

Цвет Серовато-зеленые Сверху зеленые, снизу серовато-белые Синевато-зеленые

Таблица 2 (продолжение)

Цветки Соцветие A. absinthium A. vulgaris А. аЬго1апиш

Шаровидные корзинки, образующие метельчатое соцветие Продолговатые корзинки, образующие метельчатое соцветие Шаровидные корзинки, образующие узкое густое метельчатое соцветие

Листочки обертки Продолговато овальные, наружные почти одинаковой длины с внутренними, по спинке вогнутые, по краю широкопленчтые По краю пленчатые, наружные яйцевидные, заостренные; внутренние длиннее, эллиптические, тупые Наружние - травянистые, продолговато-эллиптичес-кие; внутренние - эллиптические, по краю пленчато окаймленные; обертка слабо и коротко-волосистая

Строение цветка Цветоложе выпуклое, покрыто белыми лентообразными, чешуйчатыми пленками. Цветки мелкие, наружные трубчатые - пестичные, внутренние воронко-видные - обоеполые Краевые пестичные с узкотрубчатым венчиком; средние - обоеполые с 5 лопастями. Тычинок 5 с пыльниками. Пестик с нижней од-ногнездной завязью и 2 отогнутыми наружу рыльцами Краевые пестичные, в числе 8; венчик узкотрубчатый, двузубчатый. Лопасти рыльца выставляющиеся, линейные, усеченные, обычно более или менее изогнутые; цветов диска в 14-16, венчик трубчатый, точечно-железистый

Размеры Корзинки диаметром 2,5-4,0 мм Корзинки длинной 3-4 мм и шириной 1,5-3,0 мм Корзинки диаметром 2,0-2,5 мм

Опушение Нет Нет Нет

Цвет Желтый Красноватый Желтый

Запах Ароматный Ароматный Ароматный

Вкус Пряно-горький Пряно-горький Пряно-горький

Сравнительная характеристика анатомического строения листьев 3-х видов рода Artemisia L._

Микроскопический признак Результаты исследования, имеющие диагностическое значение

A. absinthium A. vulgaris А. аЬго1апит

Клетки эпидермиса Верхний эпидермис С извилистыми стенками С извилистыми стенками С извилистыми стенками

Нижний эпидермис То же То же То же

Устьичный аппарат Верхний эпидермис Клетки окружены 3-5 клетками (аномоцитный тип) Нет Клетки окружены 3-5 клетками (аномоцитный тип)

Нижний эпидермис То же Клетки окружены 3-5 клетками (аномоцитный тип) То же

Эфиромасличные вместилища Верхний эпидермис Нижний эпидермис Эфиромасличные железки Неспециализированные паренхиматозные клетки

Овальные Редко расположенные по листовой пластинке

То же Овальные То же

Волоски Верхний эпидермис Т-образные Т-образные; головчатые; простые Нет

Нижний эпидермис То же Т-образные; головчатые; простые и войлочные То же

Таблица 4

Сравнительная характеристика анатомического строения корней 3-х видов рода Artemisia L.

Анатомическая структура Латинское название вида полыни

A. absinthium A. vulgaris А. аЬго1апиш

Перидерма Состоит из прямоугольных клеток, образующих тонкий слой Состоит из прямоугольных клеток, расположенных в несколько рядов и образующих толстый слой Состоит из рыхлого и толстого слоя темно-коричневых клеток,

Коровая паренхима Клетки крупные; вытянуты по ширине Толстый слой клеток многоугольной или округлой формы Тонкий слой клеток округлой формы

Вместилища Располагаются в связи с первичной флоэмой; рассеяны во вторичн. флоэме Располагаются в связи с первичной флоэмой Располагаются в связи с первичной флоэмой

Перицикл Имеется Имеется Имеется

Твердый луб Слабо развит Волокна сгруппированы в комплексы под ВК Волокна сгруппированы в комплексы под ВК, образуя кольца

Флоэма Имеется Сильно развита Имеется

Камбий Имеется Заметен толстым и темным кольцом Имеется

Вторичная ксилема (ВК) Имеется Клетки запасающей паренхимы формируют своеобразный "замыкающий слой" годичных колец Сильно развита

Первичная ксилема Имеется Имеется Имеется

Фитохимическое изучение свежесобранного JIPC полыни и ГМН

из него

В результате информационно-аналитического исследования нами установлено, что доминирующими группами БАВ в JIPC изучаемых видов полыни являются флавоноиды, эфирные масла, сесквитер-пеновые лактоны, кумарины и фенолкарбоновые кислоты. Поэтому при разработке характеристик подлинности и показателей качества ГМН и исходного сырья (с учетом принципа сквозной стандартизации) нами были разработаны методики качественного и количественного определения именно этих групп БАВ.

При разработке методики качественных реакций предложена стадия предварительного фракционирования исследуемых матричных настоек с применением растворителей различной полярности, и последующим обнаружением БАВ в органической и неорганической фазах.

Экспериментальные данные, полученные в ходе разработки показателей подлинности (качественные реакции и ТСХ), сведены нами в итоговую таблицу (табл. 5), имеющую диагностическое значение при анализе сырья 3-х исследуемых видов полыни и ГМН из него в сравнительном аспекте.

С помощью метода ГЖХ-МС определен компонентный терпе-ноидный состав ГМН из сырья изучаемых видов полыни, основанный на сравнении времен удерживания и полных масс-спектров с соответствующими данными библиотеки масс-спектрометрических данных каталогов Wiley 275 и др.

Впервые изучен терпеноидный состав подземных частей полыни обыкновенной. В отличие от литературных данных, указывающих на наличие только двух компонентов терпеноидной природы, нами обнаружено и идентифицировано 10 компонентов с 95 % вероятностью.

В ГМН изучаемых видов полыни, обнаружены компоненты-маркеры, имеющие диагностическое значение при исследовании их подлинности по терпеноидному составу: а-пинен, сесквифилландрен эвгенол, кариофиллен, p-мирцен, туйон. Для количественного определения компонентов в эфирном масле необходимо проведение дополнительного исследования с применением стандартов.

/

Рис. 1. Хроматограммы ГМН из сырья

/

разных видов полыни, полученные методом ГЖХ-МС: 1 — ГМН п. горькой; 2 - ГМН п. божье дерево; 3 - ГМН п. обыкновенной (корневища и корни); 4 - ГМН п. обыкновенной (трава) Анализатор: Газо-

/

вый хроматограф Agilent 5890

с масс-спектрометрическим детектором серии 5973 («Agilent Technologic», США); Колонки Innowax 19091N- 133

Впервые в сравнительном аспекте методом ВЭЖХ изучен компонентный состав фенолкарбоновых кислот (ФКК) в ЛРС и ГМН 3-х видов полыни. Идентифицированы: хлорогеновая, кофейная, кумаро-илхинная, дикофеоилхинная и др. кислоты. Впервые изучено соотношение изомеров 3-кофеоилхинной (3-С>СА), 4-кофеоилхинной (4-С)СА) кислот по отношению 5-кофеоилхинной (5<)СА). С использованием разработанного метода показано, что основным компонентом группы фенолокислот в водно-спиртовых экстрактах из свежесобранного сырья изучаемых видов полыни и ГМН из него является 5-С>СА (основной изомер хлорогеновой кислоты), обладающей, по литературным данным, антимикробным, противовирусным, антиоксидант-ным и противомутагенным действием.

Определение количественного содержания БАВ в свежесобранном ЛРС полыни и ГМН из него В результате проведенного информационно-аналитического исследования, а также собственных экспериментальных исследований, установлено, что в сырье п. горькой и п. божье дерево содержатся следующие группы БАВ: флавоноиды, кумарины, дубильные вещества, органические кислоты, эфирные масла и др. В соответствии с действующими Методическими рекомендациями Росздравнадзора по стандартизации лекарственных средств (2008 г), алкалоиды и эфирные масла, содержащиеся в ЛРС, используемом в гомеопатии, подлежат обязательному количественному нормированию.

Результаты разработки характеристик подлинности (качественные реакции и ТСХ) свежесобранного сырья

A. absinthium, A. vulgaris и A. abrotanum и ГМН из него

Характеристики подлинности Результаты исследования, имеющие диагностическое значение

ЛРС ГМН

1.Кач. р-ции A. absinthium A. vulgaris A. abrotanum A. absinthium A. vulgaris A. abrotanum

1.1. На флавонои-ды (цианидиновая проба) Окраска раствора Окраска эфирной фракции:

Розовая Отриц. Насыщ. краен. Фиол.-розовая Отриц. Интенс.-красн.

Окраска водной фракции:

Фиол.-розовая Отриц. Интенс,-красн.

1.2. На кумарины с ИаОН, последующим проведением диазо-реакции Окраска раствора после добавления 5 % раствора NaOH:

Желтая Темн.-желтая Желтая Желтая Темн.-желтая Желтая

Окраска раствора после добавления диазореактива

Корич.-красн. Темно-краен. Красн.-оранж. Корич.-красн. Темно-краен. Красн.-оранж.

1.3. На сесквитерп. лактон абсинтин с №2|Те(СМ)5>Ю] Красно-оранж. окр., перех. в тёмно-бордов. Отриц. Отриц. Красно-оранж. окр., перех. в тём-но-бордов. Отриц. Отриц.

1.4. А. На полисахариды с 95% спиртом. Б. Восстанавливающ. сахара с р-вом Фел-линга А. Хлопьевидн. сгустки, вып. в осадок при стоянии. Б. Оранж. краен, осадок А. Хлопьевидн. сгустки, вып. в осадок при стоянии. Б. Оранж. краен, осадок

2. Гистохим. р-ции: А: С р-ром 12 (на от-сутств. крахмала). Б: С 20% р-ром а-нафто ла или тимола (инулин). В: С раствором аммиака (слизь) ЛРС ГМН

А. Реакция от-риц. Б. Красн-фиол. или оранж.-краен, окр. В. Желтое окраш.

З.ТСХ

3.1. Флавоноиды — этилацетат: муравьиная кислота: вода -80:10:10 0,18; 0,40; 0,50; 0,55; 0,95 1У: 0,21; 0,25; 0,30; 0,40; 0,55; 0,72; 0,90; 0,95 ЯЕ 0,18; 0,40; 0,50; 0,55; 0,95 Ш: 0,21; 0,25; 0,30; 0,40; 0,55; 0,72; 0,90; 0,95

3.2. ФКК- ацетон: метиленхлорид - 5:95 - И!: 0,38; 0,46; 6,5; 7,8 - - ЯГ: 0,38; 0,46; 6,5; 7,8 -

3.3. Терпеноиды — толуол : уксусная кислота : ацетон - 80 : 10 : 10 Л«: 0,17; 0,24; 0,52; 0,62; 0,66; 0,93; 1,43 1^,: 0,17; 0,24; 0,52; 0,57; 0,62; 0,66; 0,78; 0,93; 1,43

3.4. Кумарины А. Этилацетат - бензол - 1:2. Б. Н-бутанол: ледяная уксусная кислота : вода - 68 : 16 : 16 А. М 0,15; 0,23; 0,33 А. 111: 0,15; 0,23; 0,33 А. ЯГ: 0,15; 0,23; 0,52 А.Ш: 0,15; 0,23; 0,33 А.ЯГ: 0,15; 0,23; 0,33 А-И!: 0,15; 0,23; 0,52

- - Б. ИГ: 0,45; 0,55; 0,90; 0,98 - - Б. Ый 0,45; 0,55; 0,90; 0,98

Поэтому нами была предпринята попытка выделения эфирных масел из ЛРС изучаемых видов полыни с водяным паром (по фармакопейной методике) из навески 50 г в течение 4 часов. В результате экспериментального исследования были получены следовые количества эфирного масла, не достаточные для его достоверного количественного определения, что согласуется с данными литературы. Поэтому включение в НД методики количественного определения эфирного масла мы сочли нецелесообразным.

В сырье п. горькой и п. обыкновенной алкалоиды нами обнаружены не были. Неоднозначные данные приводятся в литературе об алкалоидном составе п. божье дерево. Исходя из библиографических данных, единственный алкалоид, препаративно выделенный из полыни божье дерево, - абротанин - кристаллическое двутретичное основание, структурная формула которого СН21022К2.

Поэтому нами была предпринята попытка количественного определения алкалоидов с помощью адаптированной методики количественного определения алкалоидов неизвестного строения в высушенном сырье (Г.Н. Бузук, Т.М. Медведева, 1983 г). При анализе сырья полыни на содержание алкалоидов воспроизводимые результаты получены не были. В частности, положительные результаты дал только образец 2009 г., собранный в Курской области: слабовыра-женные осадки в случае с фосфорномолибденовой и пикриновой кислотой. Поэтому дальнейшую разработку методики количественного определения алкалоидов мы сочли нецелесообразной.

Доминирующей группой БАВ в сырье п. горькой и п. божье дерево являются флавоноиды. Поэтому нами были разработаны методики количественного определения суммы флавоноидов, а показатель содержания суммы флавоноидов предложен в качестве одного из критериев доброкачественности ЛРС п. горькой и п. божье дерево, а также ГМН из него.

Сырьем п. обыкновенной в гомеопатии являются подземные органы, собранные поздней осенью и в начале зимы, когда накопление флавоноидов минимально, но, по данным литературы, возрастает содержание ФКК. Поэтому в качестве одного из критериев доброкачественности сырья и ГМН п. обыкновенной нами предложено содержание суммы ФКК.

Для количественного определения суммы флавоноидов в сырье и ГМН нами предложен спектрофотометрический метод после реакции

комплексообразования со спиртовым раствором А1С1з. Результаты исследований по обоснованию выбора рабочего стандартного образца представлены на рисунке 2. В качестве стандарта выбран раствор СО рутина (Х= 410±2 нм), максимум спектра поглощения комплекса которого со спиртовым раствором АЮз близки с таковым извлечения из свежесобранного сырья п. горькой (Я=402±2 нм), п. божье дерево (Х.=408±2 нм) (рис. 2).

УФ-спектры продуктов реакции комплексообразования с 3 % спиртовым р-ром А1С13: 1 -нарингенин; 2 - лютеолин-7-гликозид; 3 - кверцетин; 4 -рутин; 5 - водно-спиртовое извлечение п. божье дерево; 6 - водно-спиртовое извлечение п. горькой.

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в ЛРС полыни горькой и полыни божье дерево представлены в таблице 6. Ошибка опытов с добавками СО рутина (в трех повторностях) - соответственно ± 2,0 % и ± 1,3 %.

Таблица 6

Метрологические характеристики методик количественного определения суммы флавоноидов в свежесобранном сырье п. горькой

и п. божье дерево

Вид сырья п f X S Р (%) t(P,f) Ах е, % ej, %

П.горькая 7 6 1,09 0,0153 95 2,45 0,0374 ±3,43 ±1,98

II. божье дерево 7 6 2,14 0,0168 95 2,45 0,0412 ±1,92 ±1,И

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в ГМН из сырья п. горькой и п. божье дерево представлены в таблице 7.

Рис. 2.

Wavelength (nm)

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в ГМН полыни горькой и полыни _^ _ божье дерево_____

Объект исследования п f X S Р(%) T(P;f) Ах S3, %

П.горькая 7 6 0,61 0,008 95 2,45 0,0196 ±3,21 ±1,85

П. божье дерево 7 6 0,89 0,0137 95 2,45 0,0335 ±3,77 ±2,17

Отсутствие систематической ошибки методик доказано при помощи опытов с добавками СО рутина при проведении анализа в трех повторностях и составляет не более ±3,1 % и ± 2,9 % для ГМН п. горькой и п. божье дерево соответственно, что находится в пределах ошибки единичного определения.

Разработана спектрофотометрическая методика количественного определение ФКК в ЛРС и ГМН из свежесобранного сырья п. обыкновенной. При изучении водно-спиртовых извлечений и ГМН п. обыкновенной было обнаружено, что их спектры в УФ области совпадают со спектром хлорогеновой кислоты (максимум при 330±2 нм, второстепенный максимум при 300±2 нм) (Рис. 3), поэтому было решено проводить определение суммы ФКК в изучаемых объектах в пересчете на хлорогеновую кислоту.

УФ-спектры: 1 - СО хлорогеновой кислоты; 2 -ГМН п. обыкновенной; 3 -водно-спиртового извлечения из свежесобранного сырья п. обыкновенной; 4 -растворитель (плацебо).

Рис. 3.

200

300

400

Wavelength (nm)

Относительная ошибка единичного определения разработанной методики количественного определения суммы ФКК в пересчете на хлорогеновую кислоту и абсолютно сухое сырье п. обыкновенной не превышает ± 2,4 %, а для ГМН ± 3,2 % (табл. 8). При проведении анализа в трех повторностях соответственно ± 1,4 % и 1,8 %. Для подтверждения отсутствия систематической ошибки проведены опыты с

добавками хлорогеновой кислоты. При проведении анализа в трех повторностях ошибка опытов с добавками находится в пределах ошибки единичного определения и составляет соответственно ± 2,3 % и 2,9 %.

Таблица 8

Метрологические характеристики методик количественного определения суммы ФКК в свежесобранном ЛРС и ГМН п. обыкновенной

Объект исследования п Г X Б Р (%) 0 Ах е, % е* %

ЛРС п. обыкновенной 7 6 1,24 0,0120 95 2,45 0,0295 ±2,37 ± 1,37

ГМН п. обыкновенной 7 6 0,85 0,0111 95 2,45 0,0272 ±3,19 ± 1,84

С помощью методов валидации показано, что методики количественного определения флавоноидов и ФКК в изучаемых объектах воспроизводимы.

Разработка показателей качества и установление сроков годности ЛРС и ГМН 3-х видов полыни На основании результатов анализа 9 лабораторных серий ГМН и исходного сырья различных сроков и мест заготовки, для определения доброкачественности нами предложены критерии оценки качества и нормы их содержания, представленные в таблице 9.

На основании результатов экспериментальных исследований в процессе естественного хранения срок годности ГМН из свежесобранного сырья 3-х видов полыни установлен 2 года. Условия хранения: в защищенном от света месте при температуре не выше 25°С во флаконах из стекломассы оранжевого светозащитного стекла с винтовой горловиной, навинчивающими пластмассовыми крышками по ОСТ 64-2-87-91.

Таблица 9

Результаты анализа 9 лабораторных серий ГМН и исходного сырья ___3-х видов полыни_

Критерии оценки качества ЛРС Но рмы содержания, %

А. аЬэтЙпит А. аЬго1апиш А. уи^апв

Сумма флавоноидов не менее 0,8 не менее 1,5 -

Сумма ФКК - - не менее 0,5

Таблица 9 (продолжение)

Влажность не менее 60 не менее 60 не менее 55

Зола не более 13 не более 13 не более 9

Зола, нераств. в 10 % р-ре HCL не более 3 не более 1 не более 4

Органич. примесь не более 1 не более 0,5 не более 0,5

Минер, примесь не более 1 не более 0,5 не более 2

Критерии оценки качества ГМН

Сумма флавоноидов не менее 0,5 не менее 1,0 -

Сумма ФКК - - не менее 0,3

Плотность 0,900-0,920 0,895-0,915 0,900-0,920

Сод. тяжелых Ме не более 0,001 не более 0,001 не более 0,001

Сухой остаток не менее 1,8 не менее 2,3 не менее 1,5

Микробиол. чистота категория 4 Б категория 4 Б категория 4 Б

Примечание к таблице 9: рекомендуемые нормы содержания влажности были определены с учетом сроков годности свежесобранного сырья (24 часа).

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. В связи с отсутствием современной НД на ГМН и исходное сырье 3-х видов полыни, используемых в гомеопатии, проведено их фармакогностическое изучение. При морфолого-анатомическом исследовании свежесобранной травы и подземных органов A. absinthium, A. vulgaris, A. abrotanum выявлены их диагностические признаки и составлены сравнительные таблицы, имеющие практическое значение для достоверной идентификации исследуемых видов сырья.

2. Проведено фитохимическое изучение сырья 3-х исследуемых видов полыни и ГМН из него. С использованием качественных реакций и ТСХ подтверждено наличие в них основных групп БАВ. Экспериментально разработанные показатели подлинности (качественные реакции, ТСХ), сведены в итоговую таблицу, имеющую диагностическое значение при анализе сырья. Впервые в сравнительном аспекте методом ГЖХ-МС изучен качественный состав терпеноидной фракции ГМН из сырья A. absinthium, A. vulgaris, A. abrotanum; методом ВЭЖХ - качественный

состав фенолкарбоновых кислот ГМН и исходного сырья 3-х видов полыни.

3. Разработаны спектрофотометрические методики количественного определения суммы флавоноидов в свежесобранной траве п. горькой и п. божье дерево и ГМН из него в пересчете на рутин. Разработана методика количественного определения фенолкарбоновых кислот в свежесобранных корневищах и корнях и ГМН п. обыкновенной в пересчете на хлорогеновую кислоту.

4. Разработанные характеристики подлинности и доброкачественности свежесобранного сырья и ГМН из него, включены в проекты ФС: «Полыни горькой трава свежая», «Полыни божье дерево трава свежая», «Полыни обыкновенной корневища и корни свежие», «Полыни горькой гомеопатическая матричная настойка», «Полыни божье дерево гомеопатическая матричная настойка», «Полыни обыкновенной гомеопатическая матричная настойка».

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Киселева T.JI., Цветаева Е.В., Устынюк JI.A., Союнова Ж.А., Горошко O.A. Разработка методики проведения ТСХ для обнаружения флавоноидов и ку-маринов в матричных настойках из сырья различных видов полыни. // Традиционная медицина. 2007. - №3(10). - С. 34-39.

2. Союнова Ж.А., Киселева T.JI., Цветаева Е.В., Устынюк Л.А. Разработка методик определения подлинности матричных настоек из сырья различных видов представителей рода Artemisia L. Публикация 1: Качественные реакции. / Сб. науч. тр. III Российского гомеопатического съезда, г. Москва, 19-21 октября 2007 г. - М.: Изд-во ФНКЭЦ ТМДЛ Росздрава, 2007. - С. 401-411.

3. Союнова Ж.А., Киселева Т.Л., Устынюк Л.А., Горошко O.A. Разработка методик определения подлинности матричных настоек из сырья различных видов представителей рода Artemisia L. Публикация 2: Получение хроматографического портрета методом ТСХ. / Сб. науч. тр. III Российского гомеопатического съезда, г. Москва, 19-21 октября 2007 г. - М.: Изд-во ФНКЭЦ ТМДЛ Росздрава, 2007. -С. 411-417.

4. Фролова Л.Н., Союнова Ж.А., Киселева Т.Л. Лечебное применение некоторых видов полыней в народной и официальной медицине разных стран. // Традиционная медицина. - 2008. - № 3 (14). - С. 49-56.

5. Фролова Л.Н., Киселева Т.Л., Цветаева Е.В. Союнова Ж.А., Люй Годун. Морфолого-анатомическое изучение сырья Artemisia vulgaris L. - Полыни

обыкновенной, применяемого в традиционной медицине России и Китая // Традиционная медицина. - 2008. - № 4 (15). - С. 44-50.

6. Союнова Ж.А., Киселева T.JI. Химический состав лекарственного растительного сырья некоторых представителей рода Artemisia L. / Сб. науч. тр. 1-го Российского фитотерагтевтического съезда, Москва, 14-16 марта 2008 г., - М.: Изд-во ФНКЭЦ ТМДЛ Росздрава, 2008. - С. 256 -262.

7. Союнова Ж.А. Разработка качественных реакций для обнаружения алкалоидов в гомеопатических матричных настойках из различных видов полыней / Сб. науч. тр. Международного форума Интегративная медицина 2008, г. Москва, 6-8 июня 2008 г. - М.: Изд-во ФНКЭЦ ТМДЛ Росздрава, 2008. - С. 161-164.

8. Фролова Л.Н., Союнова Ж.А., Киселева Т.Л. Лечебное применение полыни божье дерево в народной и официальной медицине разных стран. / Сб. науч. тр. III Международного конгресса Фитотерапии и народной медицины эпохи Авиценны, г. Худжант, 31 мая 2008 г. - Худжант: Изд-во Академии наук Республики Таджикистан, 2008. - С. 252-255.

9. Киселёва Т.Л., Фролова Л.Н., Союнова Ж.А., Коновалова Е.В., Мельникова Н.Н., Цветаева Е.В. Морфолого-анатомическое изучение свежесобранного сырья Artemisia absinthium L. - полыни горькой, применяемой в гомеопатии // Традиционная медицина. - 2009. - № 1 (16). - С. 20-24.

10. Союнова Ж.А., Киселева Т.Л., Чаузова А.В. Разработка методов количественного определения биологически активных веществ в гомеопатических матричных настойках из свежесобранного сырья некоторых представителей рода Artemisia L. / Сб. науч. тр. междунар. науч. конф. достижения здравоохранения Туркменистана в эпоху великого возраждения, г. Ашхабат, Туркменистан, 21-23 июля 2009 г. - Ашх.: Изд-во Министерства Здравоохранения Туркменистана, 2009. - С. 274.

11. Союнова Ж.А., Чаузова А.В., Киселева Т.Л., Куркова М.В., Горошко О.А. Разработка методик количественного определения суммы флавоноидов в гомеопатической матричной настойке из свежесобранного сырья полыни божье дерево / Сб. науч. тр. IV Российского гомеопатического съезда, г. Москва, 24 октября 2009 г. - М.: Изд-во ФНКЭЦ ТМДЛ Росздрава, 2008. - С. 87-90.

12. Чаузова А.В., Союнова Ж.А., Киселева Т.Л., Куркова М.В., Горошко О.А. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в гомеопатической матричной настойке из свежесобранного сырья полыни горькой / Сб. науч. тр. IV Российского гомеопатического съезда, г. Москва, 24 октября 2009 г. - М.: Изд-во ФНКЭЦ ТМДЛ Росздрава, 2009. - С. 94-97.

13. Киселева Т.Л., Союнова Ж.А., Чаузова А.В. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в свежесобранном сырье полыни божье дерево / Сб. науч. тр. Нучно-практичекой конференции «Гомеопатия в современной клинической практике» г. Москва, 23 октября 2010 г. - М.: Изд-во НО Профессиональная ассоциация натуротерапевтов, 2010. - С. 190194.

14. Союнова Ж.А., Киселева Т.Л., Чаузова А.В. Хромато-масс-спектрометрическое изучение терпеноидного состава ГМН из сырья некоторых представителей рода Artemisia L. / Сб. науч. тр. Нучно-практичекой конференции «Гомеопатия в современной клинической практике» г. Москва, 23 октября 2010 г. - М.: Изд-во НО Профессиональная ассоциация натуротера-певтов, 2010.-С. 190-194.

15. Киселева Т.Л., Союнова Ж.А., Чаузова А.В. Сравнительное изучение компонентного состава фенолкарбоновых кислот в свежесобранном сырье отдельных представителей рода Aretemisia L. и ГМН из него // Фармация. -2012. - № 1 (8). - С. (в печати).

16. Союнова Ж.А., Киселева Т.Л., Медведев Ю.В. Изучение состава фенолкарбоновых кислот отдельных представителей рода Artemisia L. методом ВЭЖХ-МС// Сборник научных трудов II Съезда натуротерапевтов России «Современная натуротерапия с позиций доказательной медицины» и Научно-практической конференции «Средства и методы традиционной китайской медицины в России», г. Москва, 19-20 апреля 2011 г. - М.: Издательство Профессиональной ассоциации натуротерапевтов, 2011. - С. 29-30.

17. Teneshayeva А.К, Soyunova J.A., Kiseleva T.L., Determenation method of biologically active substances in matrix tinctures out of varius wormwood species // Turkmenistan lukmançylygy. - 2008. - № 6 (40). - P. 35-38.

18. Frolova L.N., Kiseleva T.L., Karpeev A.A., Soyunova J.A., Tsvetayeva E.V., Lu Guodong. Morphologo-anatomic study of Artemisia vulgaris L - wormwood raw material used in traditional medicine of Russia and China. 6th International symposium on TCM and 10th International symposium on acupuncture and moxibus-tion: Collection of papers. -University of Traditional Chinense Medicine, International University of Traditional Chinense Medicine, English edition, 2008. - P. 292.

Список сокращений:

БАВ биологически активные вещества

ГФ Государственная фармакопея

ГМН гомеопатическая матричная настойка

ЛРС лекарственное растительное сырье

Л С лекарственные средства

НД нормативный документ

СО стандартный образец

ТСХ тонкослойная хроматография

ФС Фармакопейная статья

ФКК фенолкарбоновые кислоты

Формат 60x90/16. Заказ 1453. Тираж 100 экз.

Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов.

Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, ул. Кедрова, д. 15, тел. 774-26-96