Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое изучение семян чернушки дамасской (Nigella damascena L.), выращенной в условиях Ставропольского края

На правах рукописи

МАШИРОВА СВЕТЛАНА ЮРЬЕВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ СЕМЯН ЧЕРНУШКИ ДАМАССКОЙ (ТЧЮЕЬЬА ОАМА8СЕ№А Ь.), ВЫРАЩЕННОЙ В УСЛОВИЯХ СТАВРОПОЛЬСКОГО КРАЯ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

005532736

О 5 СЕН 2013

Пятигорск —2013

005532736

На правах рукописи

МАШИРОВА СВЕТЛАНА ЮРЬЕВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ СЕМЯН ЧЕРНУШКИ ДАМАССКОЙ (1МШЕЬЬА БАМАБСЕКА Ь.), ВЫРАЩЕННОЙ В УСЛОВИЯХ СТАВРОПОЛЬСКОГО КРАЯ

14.04.02 — фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Пятигорск - 2013

Диссертационная работа выполнена в Пятигорском медико-фармацевтическом институте - филиале государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: Орловская Татьяна Владиславна

доктор фармацевтических наук, доцент

Официальные оппоненты: Яковлев Геннадий Павлович

доктор биологических наук, профессор, ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Минздрава России, зав. кафедрой фармакогнозии

Гаврилин Михаил Витальевич

доктор фармацевтических наук, профессор, ГБОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России, зав. кафедрой фармацевтической химии и фармакогнозии

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «24» сентября 2013 г. в 1400 часов на заседании Диссертационного Совета Д 208.088.01 при ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Минздрава России (197376, г. Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, д.14, лит. А).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Минздрава России по адресу: 197227, г. Санкт-Петербург, пр. Испытателей, д. 14).

Автореферат разослан «17» августа 2013 г.

Учёный секретарь диссертационного совета Д.208.088.01, кандидат фарма цевтических наук, доцент

/ -........

с-'' / Марченко Наталья Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Несмотря на достаточно высокие темпы развития мировой фармацевтической индустрии, для России остается острым вопрос внедрения в медицинскую практику отечественных препаратов. Одним из путей решения данной проблемы, является развитие фитохимиче-ских производств, для которых необходимо наращивать научный потенциал в сфере получения и расширения сведений о химическом составе лекарственного растительного сырья (JIPC), фармакологической активности и развития сырьевой базы.

Пищеварительные ферменты — одна из наиболее часто используемых в гастроэнтерологии групп лекарственных средств. Нарушения процессов пищеварения различной степени выраженности выявляют практически при всех заболеваниях пищеварительного тракта [Охлобыстин A.B., 2012].

Применение препаратов, содержащих панкреатин, на первый взгляд, кажется более физиологичным. Но по некоторым данным преимуществом лекарственных препаратов растительного происхождения является отсутствие в составе животного белка и компонентов желчи, что делает возможным назначение данных ферментных препаратов при аллергиях, а также в тех случаях, когда присутствие желчных кислот крайне нежелательно [Сереброва С.Ю., 2006].

Нигедаза - ферментный препарат липолитического действия, полученный из семян чернушки дамасской (Nigel/a damascena L.), используется, как в отечественной, так и в зарубежной медицинской практике. Однако, после распада СССР, сырьевая база чернушки дамасской осталась в Украине и в настоящее время производство данного препарата в России затруднено из-за дефицита сырья. Перспективным направлением увеличения заготовок отечественного сырья является расширение его сырьевой базы. Поэтому Ставропольским НИИ сельского хозяйства, проведены интродукционные исследования по введению чернушки дамасской в промышленную культуру в регионе Ставропольского края.

Для фармацевтического производства необходимо предусматривать внедрение малоотходных технологий, что будет способствовать повышению

3

рентабельности и снижению себестоимости фитопрепаратов. Это возможно за счет выявления дополнительных групп биологически активных соединений (БАС) и расширения возможности медицинского применения [Орловская Т.В., 2011].

В мировой литературе есть достаточно сведений о фармакологической активности различных групп БАС, в частности, жирного масла, углеводов, компонента эфирного масла - тимохинона, но химические исследования данных групп БАС носят фрагментарный характер, так как в большей мере проводились только в отношении ферментов.

В тоже время, с учетом возможности получения из данного сырья различных комплексов биологических веществ, необходимо разработать нормативную документацию, учитывающую различные пути использования и современные требования, предъявляемые к стандартизации ЛРС.

Таким образом, углубленное фитохимическое изучение семян Nigella ¿атаясепа является актуальным и позволит расширить рамки их медицинского использования.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось комплексное фитохимическое исследование и установление фармакологической активности различных фармацевтических субстанций, полученных из семян Nigella йатазсепа.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи'.

1. Проанализировать современное состояние исследований по химическому составу, биологическим и фармакологическим свойствам N1%е11а с1атаясепа.

2. Изучить химический состав семян Nigella йатазсепа, выращенной в Ставропольском крае по группам биологически активных соединений: углеводы, липиды, пептиды, эфирные масла, ферменты, а также макро- и микроэлементы.

3. Определить критерии оценки подлинности и качества семян Ы'^еИа

<1атавсепа для включения их в нормативную документацию.

4

4. Провести фармакологический скрининг фракций, полученных из семян М-gella <1атазсепа.

5. Разработать нормативную документацию на лекарственное сырье «Чернушки дамасской семена».

Научная новизна. В результате проведенных исследований экспериментально подтверждена возможность использования семян Nigella (¡атаясепа в качестве источника трех целевых групп БАС: ферментов, жирного и эфирного масел, что доказывает перспективу расширения ее использования в медицинской практике.

Впервые с помощью современных физико-химических методов (ВЭЖХ, ГЖХ, ГХ-МС, электрофореза и др.) проведено систематическое фотохимическое изучение семян Н'щеНа (¡атаБсепа, выращенных в Ставропольском крае. Данные исследования показали возможность комплексного использования сырья при его промышленной переработке.

Впервые определен качественный и количественный состав углеводов (выход углеводов составил около 3,55%). Проведен анализ физико-химических характеристик пектинов.

Изучен липидный комплекс семян Nigella с1ата.^сепа (содержание составляет до 30 %), выращенной в Ставропольском крае, методами ГЖХ, спектро-фотометрии и ГХ-МС и определены физико-химические показатели жирного масла.

В результате анализа пептидных фракций (содержание составило от 0,84% до 1,94%) методом эксклюзионной ВЭЖХ идентифицированы пептиды и определено их количество.

Методом ГЖХ и физико-химическими методами установлены показатели подлинности эфирного масла (содержание составляет до 3%). Разработана методика определения тимохинона в эфирном масле методом ВЭЖХ.

Подтверждена липолитическая активность (~9,5 ЛЕ/мг) и впервые установлена протеолитическая активность белков семян Nigella с1ата$сепа (-17,6 ЕД/мг).

Методом атомно-абсорбционной спектроскопии определен набор макро-и микроэлементов в семенах Иі^еііа сіатсисепа (27 элементов).

На основании морфолого-анатомического исследования определены анатомические признаки, позволяющие проводить диагностику семян Nigella сіатаясепа (цельное сырье, порошок).

Разработаны числовые показатели, регламентирующие качество сырья.

Проведены фармакологические скрининговые исследования различных субстанций на основе исследуемого сырья, результаты которых могут быть использованы при получении новых фитопрепаратов, обладающих антибактериальным, ранозаживляющим, гиполипидемическим, гепатозащитным, желчегонным и диуретическим действиями.

Теоретическая и практическая значимость. Теоретическая значимость исследования вытекает из новизны полученных результатов и заключается в получении новых сведений о химическом составе и фармакологической активности различных групп БАС, выделенных из семян М%еїїа сіатаїсепа. В результате проведенной работы показана возможность использования исследуемого вида растительного сырья в комплексных малоотходных технологиях получения современных лекарственных фитопрепаратов. Данные, полученные в ходе фармакологических исследований, являются экспериментальным обоснованием для дальнейшего углубленного изучения различных фармацевтических субстанций.

Практическая значимость исследования заключается в том, что в результате фитохимического и фармакологического исследования доказана возможность использования отечественного сырья Nigella йатаБсепа для производства ферментного препарата «Нигедаза», а также в качестве источников эфирного и жирного масел, обладающих антибактериальной, ранозаживляющей, гиполи-пидемической, гепатозащитной и желчегонной активностями.

Предложен новый вид ЛРС для включения в Государственную фармакопею России XII издания.

Разработаны нормы качества и методики стандартизации семян Nigella йатаэсепа в соответствии с современными требованиями и пути использования, которые включены в проект фармакопейной статьи (ФС).

Для определения подлинности и качества семян Nigella йатахсепа разработаны и предложены методики ТСХ-анализа, ГЖХ и спектрометрии.

Разработана методика ВЭЖХ для количественного определения тимохи-нона в эфирном масле семян М/^еНа сктшьсепа и проведена валидационная оценка по параметрам специфичность, линейность, прецизионность.

Результаты комплексного фитохимического исследования NigeПa йата-эсепа, выращенной на базе Ставропольского НИИ сельского хозяйства позволили подготовить для передачи в Государственную комиссию по испытанию и охране селекционных достижений РФ новый сорт этой культуры.

На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:

> Фармакопейная статья (ФС) «Чернушки семена» (проект для включения в Государственную фармакопею России XII издания);

> Инструкция по сбору и сушке «Чернушки семена» (утверждена ГНУ ВИЛАР Россельхозакадемии 27.07.2012 г.);

Результаты диссертационных исследований используются в учебных процессах на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России и кафедрах фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России и ГБОУ ВПО ДВГМУ Минздрава России.

Методологическая основа, объекты и методы исследования. Методологической основой настоящей диссертационной работы послужили научные подходы к расширению номенклатуры отечественного официального ЛРС с использованием ресурсосберегающих технологий на основе комплексного фитохимического изучения.

Объектом исследования служили высушенные, измельченные семена

чернушки дамасской {NigeUa йатаьсепа Ь.) семейства лютиковых — Напипси/а-

сеае, заготовленные в период их полного созревания (2006-2010 гг.) от расте-

7

ний, выращенных на территории Ставропольского края (ГНУ «Ставропольский НИИСХ» РАСХН, г. Михайловск).

Фитохимические исследования проводились с использованием комплекса различных физико-химических методов: хроматография колоночная (КХ), тонкослойная (ТСХ), бумажная (БХ), газожидкостная (ГЖХ), газожидкостная хро-мато-масс-спектрометрия (ГХ-МС), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), электрофорез, спектрометрия в УФ, видимой и ИК- областях, атомно-абсорбционная спектроскопия (ААС) и др.

Скрининговые микробиологические и фармакологические исследования включали изучение антибактериальной, ранозаживляющей, гиполипидемиче-ской, гепатозащитной, желчегонной и диуретической активностей.

Положения, выносимые на защиту: на защиту выносятся следующие положения, характеризующиеся научной новизной:

1. Результаты фитохммического исследования семян Ы'^еИа сктюхсепа, выращенной в Ставропольском крае по группам биологически активных соединений: липиды, эфирные масла, углеводы, пептиды, ферменты, а также макро- и микроэлементы.

2. Результаты по разработке критериев подлинности и показателей качества растительного сырья.

3. Результаты скринингового фармакологического исследования биологически активных комплексов семян чернушки дамасской.

Степень достоверности и апробация результатов. Оценка степени достоверности научных результатов определяется большим объемом проанализированной информационной базы, комплексностью и детальностью исследования, использованием большого количества современных физико-химических методов анализа, математико-статистической обработкой полученных результатов.

Материалы исследования доложены и обсуждены на региональных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической

продукции» (г. Пятигорск, 2011 г., 2012 г.).

8

Публикации. Основные положения диссертации отражены в 10 научных работах, в том числе 5 статьях в журналах, входящих в перечень рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций, рекомендованных ВАК РФ.

Связь задач исследований с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ПМФИ - филиала ВолгГМУ Минздрава России по зарегистрированной теме: «Фармакогностическое исследование дикорастущих и культивируемых растений с целью расширения сырьевой базы и внедрения в медицинскую практику» (№ Гос. регистрации 01201354514).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 145 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Объекты и методы исследования», трех глав экспериментальной части, общих выводов, списка литературы и приложения. В тексте содержится 31 таблица, 32 рисунка. Список цитируемой литературы включает 187 источника, из них — 39 на иностранных языках.

В первой главе рассмотрены ботаническая, фармакогностическая и медико-биологическая характеристика рода ТЯ'^еИа. Во второй главе приведены основные материалы и методы исследований, используемые в экспериментальной работе. В третьей главе приведены результаты морфолого-анатомического исследования исследуемого сырья. В четвертой главе отражены результаты фотохимического анализа семян Nigella ¿/ата.чсепа. Пятая глава посвящена изучению фармакологической активности некоторых фитосубстанций, полученных из семян АЧ^еНа йатаэсепа. В разделе «Основные результаты и выводы» приведены заключительные результаты и выводы по проделанной работе. Приложение включает проект ФС на сырье «Чернушки дамасской семена», Инструкцию по сбору и сушке «Чернушки семена», акты о внедрении результатов диссертационной работы и материалы изучения «острой» токсичности.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность исследования, определены цель и задачи исследования, показаны научная новизна и практическая значимость.

Глава 1. Ботаническая, фармакогностическая и медико-биологическая характеристика Nigella йатаьсепа

В данной главе приводятся обобщенные сведения, основанные на анализе литературных источников, касающиеся характеристики видов рода Nigella, степени изученности химического состава, применения в традиционной и научной медицине, и изучения возможности культивирования и агротехники Л%е//а сіатаясепа.

Глава 2. Объекты и методы исследования

Глава посвящена описанию объектов и методов исследования, использованных в морфолого-анатомических, фотохимических и фармакологических экспериментах.

Глава 3. Морфолого-анатомические исследования семян Г^іцеИа (Іапш.чсепа

Для определения подлинности проводили морфолого-анатомическое изучение по следующей схеме: описание внешних признаков цельного сырья и в виде порошка; общая схема и фрагмент поперечного среза; микрофотографии анатомо-диагностических признаков на соответствующих срезах цельного сырья и фрагментов порошка.

На поперечном срезе семян видна трехслойная семенная кожура в виде темно-бурой полосы, эндосперм и зародыш (Рисунок 1). При большом увеличении различаются слои семенной кожуры. Первый слой - однослойный эпидермис. Эпидермис состоит из крупных, плотно сомкнутых, радиально вытянутых клеток с равномерно-утолщенными стенками. Клетки эпидермиса слабоизвилистые, прямоугольные клетки чередуются с клетками треугольной формы. В местах расположения морщинок клетки эпидермиса имеют коническую форму к вершине оттянутые в сосочек. Второй слой - бесструктурный, расположенный под эпидермисом, состоит из тонкостенных паренхимных бесцветных палисадоподобных спавшихся клеток. Третий слой - пигментный, состоит

10

из тангентально вытянутых клеток, имеющих неравномерные утолщения и содержащих коричневый пигмент. Толщина слоя составляет 2-4 ряда по периметру семян, в области морщинок расширяется до 6 рядов. Клетки эндосперма многоугольные, тонкостенные, содержат алейроновые зерна и капли жирного и эфирного масел. Зародыш состоит из двух семядолей с корешком.

В ходе исследовательской работы было выявлено, что диагностика измельченного сырья не вызывает затруднений во фракциях 0,5-1,0 и 0,31-0,5 мм.

Рисунок 1 - Микрофотография фрагмента поперечного среза семени (увел. х250): 1 — эпидермис, 2 - бесструктурный слой, 3 - пигментный слой, 4 - внутренний эпидермис кожуры семени, 5 - клетки паренхимы

Глава 4. Фитохимическое изучение семян /\igella (¡атавсепа Углеводы. Методами фракционирования и осаждения выделили углеводные фракции: растворимые в холодной воде углеводы (ВРПС-Х); растворимые в горячей воде углеводы (ВРПС-Г); пектиновые вещества (ПВ) и гемицел-люлозу (ГЦ). Полученные осадки исследовали на наличие отдельных групп углеводов. Результаты свидетельствуют, что во всех углеводных фракциях присутствуют полисахариды и восстанавливающие сахара. Галактурониды обнаружены во всех фракциях, кроме гемицеллюлозной, крахмал - только в водорастворимых и кислых фракциях. Углеводные фракции после кислотного гидролиза, были подвергнуты анализу методом БХ и ГЖХ. Результаты гравимет-

рического и хроматографического анализа углеводных фракций приведены в таблице 1.

Таблица 1 - Содержание и моносахаридный состав полисахаридов_

Фракции углеводов Выход, % к сырью Соотношение моносахаридных остатков

Юга Ху1 Ага Мап ас Ся/

ВРПС-Х 0,37-0,57 сл. 3,56 17,48 - 34,8 32,5

ВРПС-Г 0,37-0,55 сл. 6,14 43,87 - 6,11 31,0

ПВ 0,38-0,52 сл. 10,5 21,87 - 25,82 сл.

ГЦ 2,97-3,37 6,14 43,87 2,45 31,1 + сл.

В семенах Nigella с1атахсепа преобладает гемицеллюлоза, преимущественно состоящая из ксилозы и маннозы, в водорастворимых фракциях преобладающими являются арабиноза, глюкоза и галактоза, при этом ВРПС-Х представляют собой глюкогалактаны, а ВРПС-Г - арабиногалактаны (Таблица 1).

В гидролизате ПВ наряду с нейтральными моносахаридами, БХ была идентифицирована уроновая кислота.

Титриметрическим методом определено содержание в ПВ Nigella <1ата-Бсепа свободных (Кс) 10,2% и этерифицированных (Кэ) 3,4% карбоксильных групп соответственно. Содержание полигалактуроновой кислоты составило 34,6±1,5%.Степень этерификации (X) при этом составляет 25,0%. Следовательно, ПВ относятся к низкоэтерифицированным пектиновым веществам.

Таким образом, учитывая достаточно высокий выход углеводов в семенах Nigella с1ата-\сепа (-3,55%), полисахариды можно считать перспективными в отношении фармакологических исследований и учитывать их в качестве целевого продукта при комплексной переработке сырья.

Липиды. Установили оптимальные параметры выделения жирного масла: время экстракции - 4,5-5 часов, соотношение экстрагент : сырье - 1:15, степень измельченности — до размеров частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 3 мм. Средний выход жирного масла из семян первого года хранения составил 51,82%, второго года хранения - 30,69%, а третьего -12,67%. Таким образом, сырье М'щеИа йатаБсепа для получения жирного масла

можно рекомендовать со сроком годности 2 года и содержанием жирного масла не менее 30%.

Для идентификации состава жирных кислот использовали метод ГЖХ. Предварительно липиды гидролизовали 10 %-ным раствором калия гидроксида в метаноле (1:5; 30 мин., 40° С).

Из полученных данных видно (Таблица 2, рисунок 2), что жирнокислот-ный состав семян Т^і^еііа сіатахсепа характеризуется высоким содержанием ли-нолевой кислоты (47,44%), олеиновой 25,66 (%) и пальмитиновой (14,65%).

39 '

36

33

30

27

24

а 21

-12

-|----—í-1-1-1- І I -і-1—

3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36

Время, мин

Рисунок 2 - Хроматограмма смеси метиловых эфиров жирных кислот семян чернушки дамасской

Таблица 2 - Жирнокислотиый состав липидов (%)

№ пика Время удерживания метилового эфира, мин Содержание, % Числовой символ Результаты идентификации кислоты

1 7.725 1-І 0? і 6:0 IUI 1ЬМ1ШШОВС1Я

2 8.7')] (1.15 lí.. і im н.чиголоиновая

3 14,593 1,75 18:0 стеариновая

V 16.503 25 '.<> 18:1 олеиновая

5 : 20.037 V 1 47,44 18:2 ниш 1евая

6 28,524 5.97 20:0 арахиновая

7 34,274 4,38 20:2 эйкозадиеновая

Для идентификации сопутствующих веществ в жирном масле использовали метод газожидкостной хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС, таблица 3).

Жирное масло семян 'Ы'щеИа с!ата.чсепа представлено 30 компонентами, включая производные ретинола, токоферола, стеролы и их эфиры.

Таблица 3 - Компонентный состав липидов семян чернушки дамасской

№ пика Наименование компонента Время удерживания, мин Содержание, % в масле

1 Бензойная кислота 3,69 2,45

2 Глицерин 3,82 5,00

3 Фенилуксусная кислота 4,20 0,55

4 Не идентифицирован 5,42 3,14

5 Не идентифицирован 6,54 0,27

6 6-Эудесмен-4-а-ол в,16 1,28

7 Не идентифицирован 6,86 1,22

8 Метокси-амино-бензойная кислота 7,52 0,71

9 Не идентифицрован 7.84 5,09

10 Не идентифицрован 8,65 0,69

11 Азелаиновая кислота 11,02 0,25

12 Гексадеценол 11,08 0,35

13 Миристиновая кислота 11,69 0,51

14 Гексадеценовая кислота 14,14 0,50

15 Пальмитиновая кислота 14,46 12,04

1Г> Лип о )епая ки слита 16,63 24,2ь

17 Олеиновая кислота 1.6.98 ... 7.44

18 С'КМриНПНОЯ 1.7,08 . .' 5.27

О )ймиа.-|НсТ!«) <:!Я кис има 1Ч.Н0 Ш; :л 1

20 Эйкозановая кислота 19,26 0,54

21 Пальмитиновый моноглицерид 20,65 0,50

22 Пальмитиновый диглицерид 21,02 2,24

23 Олеиновый моноглицерид 22,43 2,97

24 Олеиновый диглицерид 22,82 8,05

25 Не идентифицрован 23,01 0,65

26 Не идентифицрован 24,68 0,52

27 Токоферол ацетат 26,89 2,83

28 Не идентифицирован 27,47 0,86

29 Р-ситостерол 28,33 1,09

30 9, 19-Циклоланостенол-ацетат 29,73 0,68

Всего идентифицировано 87,59

Белки, пептиды, аминокислоты. Выход белка в семенах с1ата-

всепа составил 20,03±0,02% (метод Кьельдаля, ГФ XII).

Количественное определение пептидов в анализируемых образцах сырья проводили спектрофотометрическим методом (метод Каар-Каля). Содержание пептидного комплекса составляет в среднем от 0,84% до 1,94%.

Методом аминокислотного анализа изучен состав пептидов. В пептидах Ш%е11а с/атахсепа идентифицированы по 6 незаменимых аминокислот, что в сумме составляет 14,23% (34,50% от общей суммы пептидов). Основными по содержанию в пептидах семян Nigella (Латазсепа являются глутамин, аспарагин и лейцин (в порядке убывания). Также, экстракты пептидов исследованы методом гель-электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ, рисунок 3) для определения гомогенности и молекулярной массы. В семенах чернушки дамасской зафиксированы низкомолекулярные пептиды с молярными массами от 10 до 28 кДа. Массы других пептидов варьировали от 67 кДа до 25 кДа. Исходя из литературных данных, можно предположить, что пептиды с М.м. около 10 кДа — относятся к так называемым липидпереносящим белкам и соответствуют данным для известных антимикробных пептидов.

В результате изучения пептидов методами электрофореза и эксклюзион-ной ВЭЖХ (Рисунок 4, таблица 4) установлено, что разделение пептидного экстракта проходит идентично, но при анализе пептидных фракций методом ВЭЖХ не только уточнена молярная масса каждого пептида, но и определено их количественное содержание, что позволяет решать вопросы, связанные с идентификацией, контролем чистоты и количественным определением.

Таблица 4 - Результаты анализа пептидов методом ВЭЖХ

Время удерживания, мин Содержание, % Молярная масса, Да

6,75 5,30 67811

9,39 0,65 52179

13,06 68,32 36215

15,73 7,39 27753

16,88 10,99 24756

18,69 5,78 20678

24,27 1,56 11872

эычий сывороточный альбумин 67000 Да

яйЗ 8 -

' ' ■ Хемотрипсиноген 25000 Да

Ингибитор трипсина | ß У 20000 Да

Лактоальбумин 14000 Да

Рисунок 3 —

Электрофореграмма пептидов семян чернушки дамасской

мар - белки-маркеры, 1 — фотография, 2 — схема

Norm.

5 10 15 20 25 min

Рисунок 4 — Хроматограмма ВЭЖХ пептидов семян чернушки дамасской

Ввиду высокой биологической активности пептидов данный класс можно рассматривать как перспективный для создания на их основе новых отечественных высокоэффективных лекарственных средств.

Эфирные масла. Для выделения эфирного масла использовали метод 2 -Клевенджера. Время перегонки составляло 3 часа. Содержание эфирного масла в исследуемых образцах сырья составило 2-3%.

Спектр поглощения спиртового раствора эфирного масла в УФ-свете имеет характерную полосу поглощения с максимумами 216+2 нм (А=2,84), 254 нм (А=1,33) и 296±2 нм (А=1,68), что соответствует спектру СО тимохино-на (Рисунок 5).

ТІ т

Рисунок 5 — Спектр поглощения:

Рисунок 6 - Хроматограмма эфирного масла семян чернушки дамасской

В эфирном масле семян Nigella с1ата$сепа методом ГЖХ/МС обнаружен 21 компонент, 10 из которых идентифицировали, что составляет 90,64% от суммы эфирного масла. Доминирующим компонентом является /ьцимол (61,83%) (Таблица 5, рисунок 6).

Таблица 5 - Компонентный состав эфирного масла чернушки дамасской

Наименование компонента Время удерживания, мин Содержание, %

1 а-пинен 3,025 0,06

2 камфен 3,911 1,44

3 (3-пинен 5,425 0,28

4 лимонен 6,722 1,86

5 не идентифицирован 9,824 0,43

6 не идентифицирован 12,172 0,31

7 не идентифицирован 13,701 0,29

8 не идентифицирован 15,247 0,15

9 не идентифицирован 16,327 0,37

10 у-терпинен 17,237 2,31

11 р-цими I 18,804 . 61,S3 .

12 не идентифицирован 21,118 1,25

13 теряннолей 22,462 13,<>4

14 терпинеол-4 24,531 5,56

15 не идентифицирован 26,451 0,32

16 не идентифицирован 27,864 3,53

17 не идентифицирован 28,734 0,13

18 тимол 30.594 2,83

19 карвакрол 31,818 1,06

20 не идентифицирован 34,831 0,31

21 не идентифицирован 37,352 1,73

Для количественного определения тимохинона в эфирном масле 1<!ще11а сіатавсепа разработали методику ВЭЖХ с установлением валидационных характеристик по параметрам специфичность, линейность, прецизионность. Относительное стандартное отклонение (!^Г)) результатов анализа составило 7,15%, что с учетом сравнительно низкого содержания вещества, говорит о достаточно низких значениях случайной погрешности полученных результатов, разрешение с ближайшим пиком составляет 1,5 (должно быть не менее 1,2), площадь пика тимохинона в эфирном масле равна 838,24 (п=3). При расчетах

по уравнению градуировочного графика содержание тимохинона в эфирном масле составляет 0,003%.

Ферменты. В результате проведенного анализа были получены следующие результаты: липолитическая активность семян Nigella с1атазсепа составила 8,47-10,53 ЛЕ на 1 мг сырья.

Определение протеолитической активности сырья проводили по модифицированной методике, которая составила 16,25-18,95 ЕД/мг. Необходимо отметить, что ферментный препарат растительного происхождения «Карипазин», который близок по действию к трипсину и химотрипсину содержит не менее 3,5 ПЕ, а «Лизоамидаза» бактериального происхождения - не менее 0,7 ПЕ. Таким образом, установленная протеолитическая активность семян чернушки дамасской открывает возможности использования данного сырья для промышленной переработки, в качестве средств, улучшающих метаболические процессы.

Макро- и мнкроэлементный состав. Методом полуколичественного спектрального анализа в семенах N1§е11а сЗатазсепа определили 27 элементов, из которых 11 являются эссенциальными и 2 — условно эссенциальными. Выявлена следующая закономерность уменьшения содержания эссенциальных и условно эссенциальных элементов-металлов: К> Р> М §> С а> N а>Т 1 > В а> Mn>Sr>Zn>V=Cu>Cr>Pb>Zr=Ni>Ga>Sc>Ag>Y. Расчет коэффициентов биологического поглощения показал, что накопление семенами из почвы меди, цинка, хрома, стронция, свинца, марганца и циркония достаточно низкое (КПБ<0,1). Наиболее активно поглощаются, но не концентрируются — макроэлементы и гафний.

Установлено, что все исследуемые образцы сырья соответствуют по показателю содержания тяжелых металлов требованиям ГФ РФ XII изд.

С точки зрения радиологической безопасности исследуемые образцы растительного сырья не представляют опасности, так как накапливают до 1% Сб-137 и 0,15-0,30% 8г-90 от допустимого нормативной документацией уровня.

Обоснование норм качества «Чернушки дамасской семена»

В результате фитохимического и товароведческого анализов пяти партий сырья семян Nigella сіатачсспа установлены числовые показатели, которые включены в проект ФС (Таблица 6).

Таблица 6 - Числовые показатели «Чернушки дамасской семена» (цельные)

Наименование показателя Пределы полученных значений, % Рекомендуемое значение показателя, %

Липолитическая активность 8,47-10,53 не менее 8,0 ЛЕ

Количество эфирного масла 2,05-3,45 не менее 1,5 %

Количество жирного масла 51,82-30,69 не менее 30 %

Влажность 5,48-7,59 не более 7 %

Зола общая 8,06-10,12 не более 12 %

Зола нерастворимая в 10 % НС1 1,05-1,45 не более 2 %

Органические примеси 0,15-2,05 не более 3 %

Минеральные примеси 0,01-0,17 не более 1 %

Других частей 0,0-0,04 не более 0,5 %

Анализ образцов семян Nigella damascena, заготовленных в период их полного созревания (2006-2010 гг.) от культивируемых растений на территории Ставропольского края по параметрам числовых показателей показал, что срок годности составляет 4 года для сырья, предназначенного для получения препарата «Нигедаза» и 2 года — для получения эфирного и жирного масла.

Глава 5. Изучение фармакологической активности

На данном этапе работы в качестве объектов исследования использовали порошок семян, жирное масло, эфирное масло, сухие экстракты, полученные из семян Nigella damascena экстрагированием спиртом этиловым 40% и водой, с последующим удалением растворителя и сушкой.

Все исследуемые фармацевтические субстанции Nigella damascena относятся по классификации токсичности КС. Hodge и L.H. Sterner к 5 классу соединений - практически не токсичным (значения LD50 во всех случаях более 5000 мг/кг).

Изучение антибактериального действия выявило преимущественно активность спиртового извлечения и эфирного масла. Максимальную активность проявляло эфирное масло.

Проведенные экспериментальные исследования показали, что жирное масло Ище11а с/атахсепа стимулирует репаративную регенерацию кожи при ее термическом повреждении и по эффективности действия превосходит облепи-ховое масло.

Лечебно-профилактическое введение жирного масла в дозе 100 мг/кг привело к достоверному, по сравнению с контролем, снижению содержания холестерина в сыворотке крови на 29 %.

В группе животных, получавших сухой экстракт в дозе 200 мг/кг, отмечали восстановление до нормального уровня содержания холестерина в крови, а также достоверное уменьшение концентрации Р- и ире-Р-липопротеидов и триглицеридов на 39% и 31% соответственно.

Применение жирного масла Nigella скипахсепа на фоне острого тетрах-лорметанового гепатоза сопровождалось достоверным уменьшением гипер-ферментемии (снижение активности аланинаминотранферазы (АлАт) и щелочной фосфатазы (ЩФ) на 27% и 42% соответственно), интенсивности билируби-немии (снижение концентрации общего и прямого билирубина на 31% и 47% соответственно), уменьшением количества холестерина в крови (на 43%) и триглицеридов (ТРГ) в печени (на 46%). Показатель, характеризующий выраженность свободно-радикальных процессов (ТБК-активные продукты) в печени достоверно не отличался от контрольных значений.

При лечебно-профилактическом введении крысам сухого экстракта в дозе 200 мг/кг такие показатели, как активность ЩФ, содержание прямого билирубина в сыворотке крови остались на уровне значений контрольной группы животных, поскольку достоверно от них не отличались, активность же АлАт даже была достоверно ниже на 51% уровня контроля. У крыс данной опытной группы, также отмечалось достоверное снижение ТБК-активных продуктов и ТРГ в

печени на 47% и 28% соответственно, снижение холестерина и ТРГ в крови соответственно на 36% и 38%.

В группе животных, получавших жирное масло, отмечали достоверное увеличения количества желчи на 27%.

Введение возрастающих доз эфирного масла привело к достоверному увеличению желчной секреции при использовании доз 200 мг/кг и 400 мг/кг.

Установлено, что введение водного извлечения в дозах, превышающих 4 мл/кг, привело к увеличению выделяемой мочи у здоровых животных.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Химические исследования чернушки дамасской в большей мере проводились только в отношении ферментов. Хорошо изучены приемы возделывания, интродукции, агротехники, что позволяет ввести чернушку дамасскую в промышленную культуру. Установленная фармакологическая активность позволяет рекомендовать ее для использования в терапии заболеваний, в том числе социально значимых. Поэтому чернушка дамасская является перспективным лекарственным растением для введения в отечественную медицинскую практику и включения в ГФ РФ XII издания.

2. Проведено комплексное фитохимическое изучение с использованием комплекса различных физико-химических методов, в результате, которых выделены и изучены углеводы, липиды, эфирное масло, пептиды, установлена ферментная активность и макро- и микроэлементный состав.

— Выделены и изучены различные фракции полисахаридных комплексов семян Н'щеИа ¿атаэсепа-. ВРПС-Х (выход составил от 0,37% до 0,57%), ВРПС-Г (от 0,37 % до 0,55 %), ПВ (0,38-0,52 %) и ГЦ (2,97-3,37%). Изучен их качественный и количественный моносахаридный состав методом ГЖХ. Определены физико-химические характеристики пектинов.

— Изучен липидный комплекс семян NigeUa скипаьсепа, выращенной в Ставропольском крае, с определением физико-химических показателей жирного масла. Установлен компонентный состав нейтральных липидов методом ГЖХ (основными по содержанию являются жирные кислоты: линолевая (47,44 %), олеиновая (25,66 %) и пальмитиновая (14,65 %). Методом ГХ-МС идентифицированы 30 компонентов, среди которых производные ретинола, токоферола и ситостерина.

— Разработана методика экстракции пептидов из семян Nigella с1атахсвпа, на основе которой получены пептидные экстракты и установлен их аминокислотный состав (содержание пептидного комплекса составило от

0,84 до 1,94%). Методами гель-электрофореза и ВЭЖХ определены молекулярные массы пептидов и их количество.

- Изучен химический состав эфирного масла семян N¡£6 На с/ата.чсепа, выращенной в Ставропольском крае, методом ГЖХ (содержание составляет до 3 %). Установлены показатели подлинности эфирного масла. Разработана методика определения тимохинона в эфирном масле методом ВЭЖХ с валидационной оценкой.

- Подтверждена липолитическая активность (9,5 ЛЕ/мг) и впервые установлена протеолитическая активность белков семян Nigella с!атазсепа (17,6 ЕД/мг).

- Методом атомно-абсорбционной спектроскопии определен набор макро-и микроэлементов в семенаxNigella с/атаясепа (27 элементов).

3. По итогам проведенных фитохимических и фармакологических исследований в качестве приоритетных групп биологически активных комплексов и перспективных в отношении создания на их основе фармацевтических субстанций, обладающих фармакологической активностью определили: ферменты, эфирные и жирные масла.

- Разработаны числовые показатели, определены микробиологическая чистота, содержание тяжелых металлов и радионуклидов, регламентирующие качество сырья «Чернушки дамасской семена».

- На основании морфолого-анатомического исследования уточнены морфологические и выявлены диагностически значимые анатомические признаки, позволяющие проводить диагностику семян й.атаясепа цельного сырья и в виде порошка.

4. Проведены фармакологические скрининговые исследования различных субстанций на основе исследуемого сырья, что может являться рекомендацией для получения новых фитопрепаратов, обладающих антибактериальным, ранозаживляющим, гиполипидемическим, гепатозащитным, желчегонным и диуретическим действием. Исследование острой токсичности, показало, что данные субстанции относятся к классу практически нетоксичных.

5. На основании проведенных исследований разработаны проекты нормативной документации: ФС «Чернушки дамасской семена», Инструкция по сбору и сушке сырья «Чернушки дамасской семена».

Заключение

Экспериментально обоснована возможность использования семян Nigella йатаБсепа, выращенной в Ставропольском крае, в качестве источника БАС, относящихся к различным классам соединений и обладающих фармакологической активностью.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Изучение химического состава некоторых пищевых растений, культивируемых в Ставропольском крае / С.Ю. Маширова [и др.] // Вопросы бнол., мед. и фармац. химии. — 2012. — № 4. — С. 44-47.

2. Маширова, С.Ю. Изучение компонентного состава липидов семян чернушки посевной и чернушки дамасской / С. Ю. Маширова, Т.В. Орловская // Научные ведомости Белгородского гос. ун-та. Сер.: Медицина. Фармация». - 2012. - № 4 (123). - Вып. 17. - С. 223-226.

3. Маширова, С.Ю. Изучение углеводов Nigella sativa и Nigella damascena / С.Ю. Маширова, T.B. Орловская, P.K. Рахманбердыева // Химия природ, соединений. -2012. -№ 3. - С. 414-415.

4. Орловская, Т.В. Морфолого-анатомическое изучение семян чернушки посевной (Nigella sativa L.) и чернушки дамасской (Nigella damascena L.) / Т.В. Орловская, С.Ю. Маширова // Традиционная медицина. -2012. — № З.-С. 54-57.

5. Маширова, С.Ю. Изучение гепатозащитоной и желчегонной активности фитосубстанций чернушки дамасской / С.Ю. Маширова // Современные проблемы науки п образования. — 2013. — №. 2. — URL: www.science-education.ru/108-8588.

6. Ефремова, М.П. Экспериментальные исследования общетоксических свойств жирных масел чернушки дамасской и посевной / М.П. Ефремова, С.Ю. Маширова, A.B. Сергеенко // Сб. науч. тр. «Экология и здоровье». -2010.-Вып. 14.-С. 127-131.

7. Ефремова, М.П. Изучение влияния жирных масел чернушки дамасской и посевной на ЦНС и актопротекторный эффект в эксперименте / М.П. Ефремова, С.Ю. Маширова, A.B. Сергеенко // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. — Пятигорск, 2012. — Вып. 67.-С. 328-329.

8. Маширова, С.Ю. Исследование пептидов семян чернушки посевной и чернушки дамасской / С.Ю. Маширова, Т.В. Орловская // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. — Пятигорск, 2012. - Вып. 67. - С. 83-86.

9. Маширова, С.Ю. Товароведческие показатели семян чернушки посевной и чернушки дамасской / С.Ю. Маширова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. — Пятигорск, 2012.-Вып. 67.-С. 79-81.

10. Маширова, С.Ю. Элементный состав семян чернушки посевной и чернушки дамасской / С.Ю. Маширова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. — Пятигорск, 2012. — Вып. 67. — С. 81-83.

МАШИРОВА СВЕТЛАНА ЮРЬЕВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ СЕМЯН ЧЕРНУШКИ ДАМАССКОЙ (МСЕЬЬА ВАМА8СЕ^ Ь.), ВЫРАЩЕННОЙ В УСЛОВИЯХ СТАВРОПОЛЬСКОГО КРАЯ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати «18» июня 2013 г. Формат 60x84/16 Бумага книжно-журнальная. Печать ротапринтная. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ № 2135 Отпечатано в типографии издательства ООО «РИА-КМВ». 357500. г. Пятигорск, ул. Февральская, 54 тел. (8793) 33-36-56, факс (8793) 39-09-03.