Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое изучение пиретрума девичьего (Pyrethrum parthenium Smith) и перспективы его применения в медицине

На правах рукописи 4859181 |

КОНОВАЛОВА ДЖАННАТ САИДОВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПИРЕТРУМА ДЕВИЧЬЕГО (PYRETHRUM PARTHENIUM SMITH) И ПЕРСПЕКТИВЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ В МЕДИЦИНЕ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ 1 О НОЯ 2011

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Пятигорск-2011

4859181

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Защита состоится «,

доктор фармацевтических наук, профессор Коновалов Дмитрий Алексеевич доктор химических наук, профессор Озеров Александр Александрович кандидат фармацевтических наук, доцент Кодониди Иван Панайотович ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Минздрав соцразвития России

2011 г. в ^ часов на заседании

Диссертационного совета Д 208.069.01 при ГБОУ ВПО Пятигорской ГФА Минздравсоцразвития России (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Пятигорской ГФА Минздравсоцразвития России.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. По данным мировой статистики, около 15% населения Земли страдает мигренью. Большинство препаратов, использующихся в России при данной патологии, имеют синтетическое происхождение. Препараты на основе растительного сырья в большинстве своем выпускаются зарубежными производителями и представлены на отечественном фармацевтическом рынке биологически активными добавками.

Пиретрум девичий в последние 10 лет очень популярное за рубежом растение, поскольку на его основе созданы эффективные препараты для профилактики и лечения мигрени. Растение широко произрастает на территории нашей страны, повсеместно встречаясь на Кавказе, однако культивируется только в качестве декоративного.

Зарубежные фармакоэпидемиологические исследования подтвердили эффективность сырья и извлечений пиретрума девичьего при мигрени. Кроме того, партенолид и спиртовые извлечения из растения показали высокую цитостатическую активность. Отдельные экспериментальные исследования установили их жаропонижающую, анальгетическую и противоопухолевую активность.

Сырье пиретрума девичьего включено в травяную фармакопею Великобритании, фармакопею США, Европейскую и Французскую фармакопеи. Несмотря на широкую популярность за рубежом, в нашей стране это растение известно лишь в народной медицине как эффективное средство для лечения мигрени, артритов и лихорадки. Президентом и Правительством России поставлена задача развития ресурсной базы для создания эффективных отечественных лекарственных средств, поэтому изучение пиретрума девичьего, произрастающего в России, является актуальной задачей.

В фармакогнозии растение считается примесью к фармакопейному сырью ромашки аптечной. Его химический состав и биологическая активность отечественными учеными практически не изучались. Поэтому научное исследование травы пиретрума девичьего как источника сырья для разработки

отечественных препаратов является актуальной проблемой.

Цель исследования: фармакогностическое изучение травы пиретрума девичьего, обоснование возможности расширения сырьевой базы для получения лекарственных средств и разработка нормативной документации (НД) на пиретрума девичьего траву.

Задачи исследования:

1. Проведение фитохимического анализа надземной части пиретрума девичьего с целью выявления основных групп биологически активных соединений (БАС).

2. Изучение возможности культивирования дикорастущего и сортового пиретрума девичьего в условиях Кавказских Минеральных Вод.

3. Морфолого-анатомическое изучение пиретрума девичьего травы и установление анатомо-диагностических признаков сырья.

4. Определение острой токсичности и предварительное изучение противовоспалительной активности спиртоводного извлечения из сырья пиретрума девичьего.

5. Разработка фармакопейной статьи предприятия (ФСП) на сырье и инструкции по сбору и сушке пиретрума девичьего травы.

Научная новизна и теоретическая значимость работы. В результате проведенных исследований описаны анатомо-диагностические признаки травы пиретрума девичьего, установлены числовые показатели сырья. Определены урожайность и запасы сырья пиретрума девичьего, произрастающего в отдельных популяциях Ставропольского края.

Проведены исследования по культивированию пиретрума девичьен, j семян дикорастущих (культивар 1) и сортовых растений (культивар 2 - сорт «Golden Ball» и культивар 3 - сорт «Snow Ball») в условиях Кавказских Минеральных Вод. Установлено, что выращенные нами культивары, так же как и дикорастущий вид, накапливают в качестве основных БАС сесквитерпеновые лактоны и флавоноиды.

В качестве главного компонента суммы сесквитерпеновых лактонов (СЛ) выделен и идентифицирован партенолид. Определено количественное содержание суммы СЛ и изучена динамика их накопления по фазам развития растения, что позволило установить оптимальные сроки заготовки сырья.

Методами бумажной, тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии идентифицировано восемь соединений фенольной природы: апигенин, кверцетин, рутин, галловая, хлорогеновая, кофейная, цикориевая и коричная кислоты, из них впервые были идентифицированы:

- флавоноиды: рутин;

- фенолкарбоновые кислоты: галловая, хлорогеновая, кофейная, цикориевая и коричная.

Изучен компонентный состав эфирного масла пиретрума девичьего. Методом газожидкостной хроматографии с последующим анализом масс-спектров идентифицировано 30 компонентов, из них 7 ранее не описанных для этого вида.

В эксперименте на животных установлено, что водное извлечение пиретрума девичьего травы по своей токсичности относится к 4 классу (по классификации К.С. Сидорова) «вещества малоопасные». На модели пролиферативного воспаления установлено, что спиртоводное извлечение сырья пиретрума девичьего снижает интенсивность экссудативной фазы и уменьшает синтез соединительной ткани, т.е. снижает пролиферацию. На модели асептического каолинового отёка показано, что спиртоводное извлечение пиретрума девичьего травы обладает выраженным противоотёчным действием, сопоставимым с действием препарата «Троксевазин».

Практическая значимость. Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов (дифференциальная спектрофотометрия), а также ТСХ-методики качественного определения флавоноидов (рутина) и сесквитерпеновых лактонов (партенолида) в сырье пиретрума девичьего.

Выполненные интродукционные исследования позволяют сделать вывод о перспективности введения в культуру пиретрума девичьего (дикорастущего и сорта «Snow Ball») в условиях Кавказских Минеральных Вод.

В результате комплексных исследований доказано, что пиретрум девичий является новым перспективным лекарственным растением, обладающим противовоспалительной активностью.

Внедрение результатов исследования. По материалам исследований составлено 2 информационных письма: 1. «Изучение влияния извлечения травы пиретрума девичьего на воспалительный процесс» (акт внедрения от 22.01.10 в учебный процесс кафедры фармакогнозии и ботаники ГОУ ВПО Курского государственного медицинского университета);

2. «Методика количественного определения суммы флавоноидов в траве пиретрума девичьего» (акт внедрения от 15.04.11 в научно-исследовательский и учебный процесс кафедры фармакогнозии и ботаники ГОУ ВПО Курского государственного медицинского университета).

3. Разработана ФСП на новый вид лекарственного растительного сырья «Пиретрума девичьего трава».

4. Разработана Инструкция по сбору и сушке пиретрума девичьего травы (на основании результатов изучения динамики накопления отдельных БАС в траве пиретрума девичьего и биологических исследований, проведенных при интродукции в условиях Кавказских Минеральных Вод).

Связь задач исследования с проблемами фармацевтических паук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО Пятигорской ГФА Минздравсоцразвь , России (номер государственной регистрации 01200112164).

Положения, выдвигаемые на защиту:

1. Результаты фитохимического изучения сырья пиретрума девичьего.

2. Результаты интродукционных исследований пиретрума девичьего.

3. Результаты изучения острой токсичности и противовоспалительной

активности сырья пиретрума девичьего.

4. Показатели подлинности и нормы качества пиретрума девичьего травы, необходимые для разработки нормативной документации. Апробация работы и публикации. Основные фрагменты диссертационной работы доложены на 62-66-ой региональных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2007-2011 гг.) и на П-ой международной научно-практической конференции «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки» (Владикавказ, 2011 г.). Работа по изучению пиретрума девичьего была представлена и прошла в финал Конкурса исследовательских проектов и научно-технических разработок молодых изобретателей в рамках реализации социально значимого Проекта «Золотой век инноваций» (Ставрополь, 2010 г.).

По теме диссертации опубликована 21 научная работа, из них 5 в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 183 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (4 главы), общих выводов, списка литературы (включающего 123 источника, в том числе 90 иностранных) и приложений, иллюстрирована 50 таблицами и 42 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Объектом исследования явилась трава пиретрума девичьего (Pyrethrum parthenium Smith, Asteraceae), произрастающая в Ставропольском крае, а также образцы сырья, выращенные из семян двух сортов: «Golden Ball» и «Snow Ball».

Для разработки методик качественного и количественного определения БАС, разработки нормативной документации и проведения морфолого-анатомического изучения использовали верхние 25-30 см надземной части растения. Заготовленное в течение 2006-2008 гг. и высушенное сырье (фаза конца бутонизации - начала цветения) представляло собой смесь цельных и частично измельченных облиственных стеблей с цветками и бутонами, не содержащую грубых частей стебля. Отбор проб проводили согласно ГФ XI и

ОФС 42-0013-03. Пробы для исследования хранили в лаборатории в соответствии с требованиями ГОСТ 17768-90.

Для получения извлечений, содержащих различные группы БАС, использовали воду очищенную (ФС 42-2619-97), спирт этиловый различной концентрации (ГОСТ 5964-93). Для обнаружения, разделения, идентификации, выделения и количественного определения БАС в исследуемом сырье использовали качественные реакции, спектральные, хроматографические, спектрофотометрические и другие общепринятые методы анализа. Эфирное масло получали гидродистилляцией (по методу 2 ГФ XI издания).

Установление числовых показателей и морфолого-анатомических признаков сырья проводили в соответствии с методиками ГФ XI и ГФ XII изданий.

Элементный состав пиретрума девичьего травы устанавливали с помощью эмиссионного спектрального анализа (метод испарения из кратера угольного электрода).

Интродукционные исследования проводили на опытно-исследовательских участках Ботанического сада Пятигорской ГФА (г. Пятигорск) и экспериментальных участках г. Ессентуки. В качестве посадочного материала пиретрума девичьего использовали семена, собранные в дикорастущей флоре и семена двух сортов: «Golden Ball» и «Snow Ball».

Срок годности сырья устанавливали на образцах, собранных в 2006 году и хранившихся в соответствии с ГОСТ 17768-90 в условиях лаборатории. Каждые полгода в пиретрума девичьего траве определяли числовые показатели сырья, необходимые для разработки НД (фармакопейной статьи предприять

Фитохнмическое исследование пиретрума девичьего травы

Изучение эфирного масла

Эфирное масло получали перегонкой с водяным паром. Установлено, что в сырье пиретрума девичьего накапливается 0,50-0,65% эфирного масла. Качественный состав эфирного масла и количественное содержание его компонентов определяли методом хромато-масс-спектрометрии (полученные

масс-спектры сравнивали с базой N181). Данные по компонентному составу эфирного масла пиретрума девичьего представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Химический состав эфирного масла пиретрума девичьего

№ Соединение Время удерживания %'

1 3-карен 3,64 0,83

2 камфен 4,02 7,42

3 а-пипен 4,67 0,57

4 а-фелландрен 4,90 1,10

5 Р-фелландрен 5,25 0,72

6 бензен, 1 -метил-4-( 1 -метилэтил)- 5,51 3,52

7 2-циклогексен-1 -ол, 1-метил-4-(1-метилэтил)-, транс 7,31 0,90

8 камфора 8,10 61,31

9 бицикло [2,1,1] гексан-5-карбоксиловой кислоты 5-метил-3-метилен метиловый эфир 8,20 0,25

10 борнеол 8,46 2,36

11 а-терпинеол 8,71 0,14

12 Ь-4-тсрпинеол 9,02 1,28

13 л-мента-1,8-диен-3-он, 11,05 0,23

14 2-циклогексен-1-метанол, 2,6,6-тримстил- 11,25 2,26

IS Ь-бориилацегаг 11,38 10,37

16 эликсен 13,46 0,56

17 копаен 13,67 0,49

18 не идентифицировано 14,30 0,32

19 ацетиловой кислоты 1,3,7-тримстилокта-2,6-диенил эфир 14,66 0,36

20 кариофиллен 14,77 0,16

21 эудссма-4( 14), 11 -диен 16,40 0,43

22 Д-кадинен 17,25 0,12

23 лонгипинокарвон 18,52 0,43

24 диэписедрен-1 -оксид 18,64 0,60

25 кариофиллен оксид 18,71 1,18

26 циклогексен, 6-(2-бутенил)-1,5,5-триметил-, (Е)- 18,95 0,22

27 З-фенил-1-пропанол ацетат 19,11 0,21

28 изовалериановой кислоты З-фенилпропиловый эфир 19,19 0,12

29 аллоаромадендрен оксид 19,69 0,07

30 (3-эудесмол 20,23 0,85

31 1,4-а-диметил-7-( 1 -метилэтилиден)-декагидронафталсн-1 -ол 20,42 0,32

Примечание: %* - содержание компонента в эфирном масле в процентах

(среднее значение, установленное при анализе шести образцов);

- соединение, впервые описанное для эфирного мама пиретрума девичьего. Качественный состав и количественное содержание компонентов

эфирного масла, полученного из отечественного сырья, отличался от описанного в зарубежной литературе. В составе эфирного масла идентифицировано 7 компонентов, ранее не описанных для зарубежных популяций пиретрума девичьего. Количественное содержание других известных компонентов также отличалось.

Изучение сесквитерпеновых лактонов

Для выделения СЛ использовали хлороформ, ацетон и спирт этиловый 90%. Наличие у-лактонного цикла подтверждали ИК-спектроскопией. Методом тонкослойной хроматографии во всех анализируемых извлечениях (хлороформное, ацетоновое и спиртовое извлечения) был обнаружен СЛ партенолид. При очистке спиртовой фракции методом Рыбалко выпадали светло-коричневые игольчатые кристаллы. При хроматографировании на пластинках «Сорбфил» в системах хлороформ-ацетон (6:1) и толуол-ацетон (17:3), после проявления ванилин-серным реактивом, выделенное вещество характеризовалось одной зоной адсорбции сине-голубого цвета со значением Яг 0,80-0,85 и 0,45-0,50 соответственно. Температура плавления выделенного вещества 114-116°С (из диэтилового эфира). Проба смешения с СО партенолида депрессии температуры плавления не дала. Хроматографические характеристики, температура плавления и ИК-спектр хлороформного раствора выделенного вещества совпадали с таковыми для СО партенолида. Вещество идентифицировано как СЛ гермакранового типа - партенолид. ТСХ-скриниг СЛ в различных образцах пиретрума девичьего показал, что содержание партенолида в сумме СЛ составляет не менее 45-50%. Хроматограмма СЛ (полуколичественное определение) показана на рисунке 1.

Для определения сроков заготовки сырья была изучена динамика накопления суммы СЛ гравиметрическим методом (рисунок 2).

Наибольшее содержание суммы СЛ в сырье пиретрума девичьего приходится на фазу конца бутонизации и начала цветения (0,74 и 0,67%). Поэтому сбор сырья необходимо проводить в этот период.

Рисунок 1 - Хроматограмма СЛ пиретрума девичьего

1 - стеблевание, 2 и 3 - начало и конец бутонизации, 4 и 5 - начало и

конец цветения, 6 - плодоношение Рисунок 2 - Динамика накопления СЛ пиретрума девичьего по фазам развития {средние данные за 2006-2008 гг.)

Изучение фенольных соединений

Методом бумажной и тонкослойной хроматографии с использованием стандартных образцов в спиртоводном извлечении пиретрума девичьего травы было установлено наличие флавоноидов и фенолкарбоновых кислот.

Для изучения фенольного состава пиретрума девичьего травы использовали также метод высокоэффективной жидкостной хроматографии

(ВЭЖХ). Результаты ВЭЖХ анализа спиртоводного извлечения (70%) пиретрума девичьего травы представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Фенольный состав пиретрума девичьего травы

Название соединения Время удерживания (мин) Содержание в сумме фенольных соединений в пересчете на воздушно-сухое сырье (%)

Рутин 4,26 25,893

Кофейная кислота 3,21 12,348

Хлорогеновая кислота 2,62 10,198

Цикориевая кислота 5,36 8,080

Галловая кислота 2,02 3,867

Коричная кислота 9,54 0,214

Кверцетин 15,80 0,093

Апигенин 21,58 0,003

(спиртоводное извлечение) методом ВЭЖХ нами было идентифицировано 8 соединений, из них 3 флавоновда (рутин, кверцетин, апигенин) и пять фенолкарбоновых кислот (галловая, хлорогеновая, кофейная, цикориевая и коричная кислоты). Установлено, что идентифицированные соединения составляли около 60% от всех соединений, обнаруженных в извлечении методом ВЭЖХ. Рутин и все фенолкарбоновые кислоты в сырье пиретрума девичьего обнаружены впервые.

Изучение аминокислотного и элементного состава Кроме основных БАС (сесквитерпеновые и фенольные соединения), в пиретрума девичьего траве с помощью химических реакций (цветные реакции, реакции осаждения и пенообразования) обнаружены и другие группы БАС, предположительно аминокислоты, полисахариды, кумарины, дубильные вещества и сапонины.

Определение содержания аминокислот проводили на аминокислотном анализаторе АА-33 (общее содержание до 9,83 г/кг сухого сырья). Идентифицировано 15 аминокислот, преобладает кислота аспарагиновая (4,09 г/кг сухого сырья).

Полуколичественный спектральный анализ золы пиретрума девичьего травы проводили методом испарения в приборе ДФС-8-1. Установлено, что в

значительных количествах накапливаются такие макроэлементы, как калий, кальций, фосфор и магний (содержание в золе достигает до 30%, 10%, 3% и 2% соответственно). Содержание токсичных элементов, таких как свинец, медь, хром не выходит за пределы допустимых концентраций, установленных СанПин. На основании полученных данных можно сделать вывод о безопасности исследуемого сырья с точки зрения содержания токсичных элементов, в том числе и тяжелых металлов.

Исследования по интродукции пиретрума девичьего в условиях Кавказских Минеральных Вод

При сравнении результатов наблюдения за культивируемыми растениями и природными популяциями установлено более раннее вступление культивируемых растений в очередную фенофазу. Результаты фенологических наблюдений пиретрума девичьего представлены в таблице 3, а морфометрические характеристики - в таблице 4.

Таблица 3 - Фенофазы пиретрума девичьего в природе и культуре

Фенофаза 2007 г. 2008 г. 2009 г.

Д К1 К2 КЗ д К1 К 2 КЗ Д К1 К 2 КЗ

Появления всходов 13.04. 20.04. 10.04. 15.04. 04.04. 08.04. 03.04. 10.04. 05.04. 11.04. 01.04. 07.04. 05.04. 10.04. 04.04. 12.04. 11.04. 16.04. 03.04. 09.04. 03.04. 09.04. 01.04. 06.04.

Фаза семядолей 20.04. 01.05. 15.04. 24.04. 08.04. 12.04. 10.04. 15.04. 11.04. 21.04. 07.04. 15.04. 10.04. 14.04. 12.04. 17.04. 16.04. 25.04. 09.04. 16.04. 09.04. 15.04. 06.04. 14.04.

Образования розетки 01.05. 16.05. 24.04. 10.05. 12.04. 28.04. 15.04. 03.05. 21.04. 03.05. 15.04. 28.04. 14.04. 30.04. 17.04. 01.05. 25.04. 07.05. 16.04. 30.04. 15.04. 02.05. 14.04. 03 05

Фаза стеблевания 16.05. 26.06. 10.05. 04.06. 28.04. 09.06. 03.05. 11.06. 03.05. 16.06. 28.04. 07.06. 30.04. 29.05. 01.05. 03.06. 07.05. 18.06. 30.04. 03.06. 02.05. 04.06. 03.05. 07.06.

Фаза бутонизации 26.06. 11.07. 04.06. 19.06. 09.06. 22.06. 11.06. 25.06. 16.06. 03.07. 07.06. 24.06. 29.05. 16.06. 03.06. 20.06. 18.06. 06.07. 03.06. 16.06. 04.06. 19.06. 07.06. 22.06.

Фаза цветения 11.07. 27.08. 19.06. 17.08. 22.06. 21.08. 25.06. 22.08. 03.07. 29.08. 24.06. 12.08. 16.06. 10.08. 20.06. 16.08. 06.07. 29.08. 16.06. 14.08. 19.06. 18.08. 22.06. 25.08.

Фаза плодоношения 27.08. 21.09. 17.08. 15.09. 21.08. 14.09. 22.08. 17.09. 29.08. 25.09. 12.08. 09.09. 10.08. 11.09. 16.08. 15.09. 29.08. 20.09. 14.08. 11.09. 18.08. 13.09. 25.08. 18.09.

Примечание: Д - дикорастущий вид, К 1 - культивар 1 (выращенный из семян

дикорастущего растения), К 2 - культивар 2 (сорт «Golden Ball»), К 3 - культивар 3 (сорт «Snow Ball»).

Таблица 4 - Морфометрические параметры дикорастущего пиретрума

девичьего и его культиваров (средние значения за 3 года)

Исследуемые образцы Высота растения, см Диаметр «куста», см Количество побегов Диаметр корзинок, см Количество корзинок одного побега

Дикорастущий 58,6±3,8 27,0±2,4 12,4±1,1 2,7±0,2 5,5±0,5

Культивар 1 62,6±3,1 31,0±2,5 13,2±1,2 2,8±0,3 6,5±0,6

Культивар 2 31,2±2,7 26,1 ±2,2 12,3±1Д 1,5±0,1 5,8±0,б

Культивар 3 74,0±4,3 37,2±2,8 14,1±1,3 2,0±0,2 6,3±0,5

Установлено, что культивар 1 (выращенный из семян дикорастущего

растения) и культивар 3 (сорт «Snow Ball») имели большие размеры (высота растения и диаметр «куста») в отличие от дикорастущего вида и культивара 2 (сорт «Golden Ball»). Однако, в отличие от культивара 1 и дикорастущего вида, растения обоих сортов имели меньший диаметр корзинок за счет отсутствия краевых цветков (что изначально закладывалось при селекции данных сортов).

Выполненные интродукционные исследования свидетельствуют о возможности введения в культуру пиретрума девичьего в условиях Кавказских Минеральных Вод с выходом воздушно-сухого сырья до 140 г/м2 у пиретрума девичьего в культуре (культивар 1) и до 150 г/мг у сорта «Snow Ball». Данные по урожайности дикорастущих популяций и культиваров пиретрума девичьего представлены в таблице 5.

Таблица 5 - Урожайность (Y, г/м2) пиретрума девичьего в природе и

культуре (средние значения за 3 года)

Образцы х(М), г 2 К*,-*)2 S.M2 т Г, г/м2

Дикорастущие:

Предгорный район 111,4 30,9 954,8 7,1 1,6 111.4±1.6

Минераловодский район 102,1 28,4 806,6 6,5 1,5 102,1- j

Культивированные:

Культивар 1 137,5 30,5 930,2 7,0 1,6 137,5±1,6

Культивар 2 117,4 29,6 876,1 6,8 1,5 117,4±1,5

Культивар 3 150,2 28,9 835,2 6,6 1,5 150,2±1,5

Предварительное фитохимическое изучение культиваров пиретрума

девичьего показало, что все они накапливают флавоноиды и сесквитерпеновые лактоны (таблица 6).

Таблица 6 - СЛ и флавоноиды в культиварах пиретрума девичьего

Годы сбора образцов Культивар 1 Культивар 2 Культивар 3

Сесквитсрпеновые лактоны (сумма сесквитерпеновых лактонов в % 1

2007 0,65-0,71 | 0,78-0,85 0,83-0,88

2008 0,76-0,83 0,69-0,74 0,80-0,85

2009 0,58-0,69 0,81-0,87 0,89-0,96

Флавоноиды (содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин в %)

2007 2,15-2,24 | 2,07-2,26 2,21-2,43

2008 2,03-2,19 2,11-2,35 2,14-2,38

2009 2,17-2,31 2,05-2,28 2,28-2,47

Примечание: образцы собраны в фазу конца бутонизации - начала цветения.

Морфолого-анатомическое изучение пиретрума девичьего травы При разработке норм качества на пиретрума девичьего траву установлены макро- и микроскопические диагностические признаки сырья. Стебли полые, ребристые, немного опушенные. Листья опушенные очередные, черешковые, дважды перисторассеченные состоят из 5-7 сегментов, каждый сегмент перисторазделенный, состоит из 5 долей, край листовой пластинки пильчатый. Корзинки, состоящие из белых язычковых и желтых трубчатых цветков, собраны в щитковидное соцветие. Цветоложе выпуклое неполое. Листочки обертки кожисто-травянистые, наружные опушенные, внутренние голые.

При микроскопическом изучении сырья установлено, что эпидермис язычкового цветка имеет сосочковидные выросты (рисунок 3) и покрыт эфирномасличными железками по типу астровых. Эпидермис листочков обвертки и листа густо покрыт устьицами аномоцитного типа, эфирномасличными железками и лентовидными волосками, которые состоят из нескольких базальных и одной длинной терминальной клетки, которая изгибается под прямым углом к оси базальной части в форме ленты. В мезофилле листа вдоль жилок обнаружены схизолизигенные вместилища (рисунок 4).

В результате морфолого-анатомического изучения пиретрума девичьего травы установлены основные анатомо-диагностические признаки сырья: сосочковидные выросты и лентовидные волоски.

1"

I

1 - сосочковидные выросты

2 - эфирномасличные железки

1 - эфирномасличные железки,

2 - лентовидные волоски, 3 - устьичный

Рисунок 3 - Верхний (А) и нижний (Б) аппарат>4 ~ схизолизигенные вместилища

При микроскопическом изучении культиваров пиретрума девичьего показано, что их анатомо-диагностические признаки соответствуют нормам, установленным для дикорастущего сырья.

Разработка норм качества на пиретрума девичьего траву

Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов (дифференциальная спектрофотометрия) в сырье. С её помощью установлено, что содержание суммы флавоноидов в различных образцах дикорастущего сырья составляет 2,29-2,41%. Предварительными исследованиями подтверждена валидность методики по критериям «линейность» и «точность» (правильность и повторяемость).

Для разработки нормативной документации (ФСП) установлены требования к качеству сырья пиретрума девичьего (таблица 7).

Показатели подлинности и нормы качества включены в нормативную документацию на сырье - «Пиретрума девичьего трава».

Числовые показатели культиваров пиретрума девичьего находятся в пределах норм, установленных для дикорастущего сырья.

эпидермис язычкового цветка пиретрума девичьего (ув. х160)

Рисунок 4 - Верхний (А) и нижний (Б) эпидермис листа пиретрума девичьего (ув. Х160)

Показатели Методы Нормы

Внешние признаки: Визуально ГФ XI, вып.1, с,256 Смесь цельных и частично измельченных тонких стеблей листьев, цветков и бутонов, не содержащая грубых частей

Микроскопия: Микроскопия ГФ XI, вып.1, с.278 Сосочковидные выросты язычкового цветка, эфирномасличные железки, лентовидные волоски, аномоцитные устьица эпидермиса листочков обвертки и стебля, а также вместилища листа

Подлинность: 1, Сесквитерпеновые лактоны 2. Флавоноиды ТСХ: 1. Система толуол-ацетон (17:3), проявитель ванилин-серный реактив 2. Система этилацетат-кислота муравьиная-вода (70:15:15), просмотр в УФ-свете при X 365 им. 1. Партенолид, сине-гол. пятно с 0,45±0,04. Допускается наличие других пятен с Лг0,18±0,01 (зел.), 0,24±0,02 (жел.), Яг 0,31±0,01 (оранж-жел.) и Яг0,75±0,05 (св-кор). 2. Рутин, пятно с Иг 0,55±0,04 (корич.). Допускаются еще три корич. пятна с Яг 0,85±0,04; 0,71±0,03; 0,35±0,02 и одно желтое пятно с 0,64±0,03.

Количественное определение: Дифференциальная спектрофотометр™ Сумма флавоноидов в пересчете на рутин не менее 2%

Числовые показатели: -экстрактивные вещества, извлекаемые водой очищенной, -влажность, -зола общая, -зола, нерастворимая в 10 % растворе кислоты хлористоводородной, -органической примеси, -минеральной примеси, -других частей, не соответствующих описанию. ГФ XI, вып.1, с.295 ГФ XI, вып.1, с.285 ГФ XII, ОФС 42-0055-07 ГФ XI, вып.1, с. 25 ГФ XI, вып.1, с. 276 ГФ XI, вып.1, с. 276 ГФ XI, вып.1, с.275 Не менее 15% Не более 10% Не более 11% Не более 3% Не более 10% Не более 2% Не более 3%

Микробиологическая чистота ГФ XII, ОФС 42-0067-07 Категория 4Б

Масса содержимого упаковки - В соответствии с ФСП не более 25 кг(«ангро»)

Упаковка - В соответствии с ФСП мешки тканевые

Маркировка - В соответствии с ФСП

Транспортирование - В соответствии с ФСП

Условия хранения - В сухом, проветриваемом, защищенном от света месте

Срок годности - 2 года

Изучение биологической активности

Изучена острая токсичность водного извлечения пиретрума девичьего травы (1Л}5о>5000 мг/кг) при консультации к.ф.н. Огановой М.А. В эксперименте на животных установлено, что водное извлечение из пиретрума девичьего травы по своей токсичности относится к 4 классу (по классификации К.С. Сидорова), т.е. является малоопасным. Проведено предварительное изучение влияния извлечения из сырья, полученного 70% спиртом этиловым (1:10), на фазы воспалительного процесса совместно с к.ф.н., доц. Кулешовой С.А. Исследования проводили на моделях пролиферативного воспаления, вызванного имплантацией инородного тела (Хабриев Р.У., 2005), и асептического каолинового отека.

На модели пролиферативного воспаления (таблица 8) показано, что спиртоводное извлечение пиретрума девичьего травы достоверно снижает величину отёка (экссудации) относительно контроля на 14%, а синтез грануляций (соединительной ткани), т.е. пролиферацию - на 31%.

Таблица 8 - Влияние спиртового извлечения пиретрума девичьего травы на фазы воспалительного процесса

Исследуемый объект

Контроль

Дроксепазин 80 мг/кг

Спиртоводное извлечение травы пиретрума девичьего" I г/кг

Вес мокрых гранулём, мг

376,33±45,12

337,17±3б,80

Вес сухих гранулём, мг

76,90^9,18

66,00±3,84

Экссудация, мг

299,63± 13,96

271,17±12,40

Пролиферация, мг

61,70±4,12

51,00±2,14

315,50±38,56

57,50±5,28

258,00±8,02*

42,50±3,08*

Примечание: - изменения достоверны относительно контроля, р<0,05; **

- доза спиртоводного извлечения в пересчете на сухой остаток.

На модели асептического каолинового отёка выявлено, что в сравнении с контролем спиртоводное извлечение пиретрума девичьего травы достоверно снижает величину экссудации в острый период на 47,2%, а в сравнении с препаратом «Троксевазин» - на 32%. Результаты исследований показали, что спиртоводное извлечение пиретрума девичьего травы обладает

противовоспалительной активностью, сопоставимой с действием препарата

«Троксевазин».

Общие выводы

1. Методом газожидкостной хроматографии с последующим анализом масс-спектров установлен компонентный состав эфирного масла пиретрума девичьего травы. Идентифицировано 30 компонентов, 7 из них - впервые: эликсен, логипинокарвон, эудесма-4(14),11-диен, |3-эудесмол, диэписедрен-1-оксид, кариофиллен оксид и аллоаромадендрен оксид.

2. Изучен качественный состав и количественное содержание основных групп БАС пиретрума девичьего травы (сесквитерпеновые и фенольные соединения). С помощью физических и физико-химических методов (ИК-спектроскопия, ТСХ, определение температуры плавления) идентифицирован сесквитерпеновый лактон - партенолид и определено его содержание в сумме СЛ. Изучена динамика накопления суммы СЛ по фазам развития растения. Установлено, что максимальное содержание суммы СЛ приходится в фазу конца бутонизации-начала цветения.

3. Методами бумажной, тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии установлено наличие 8 соединений фенольной природы: галловая, коричная, кофейная, хлорогеновая и цикориевая кислоты, апигенин, кверцетин, рутин. Из них впервые идентифицированы: флавоноиды (рутин) и фенолкарбоновые кислоты (галловая, хлорогеновая, кофейная, цикориевая и коричная). Изучен аминокислотный и элементный состав сырья, установлена его безопасность с точки зрения содержания токсичных элементов, в том числе и тяжелых металлов.

4. Показана возможность введения в культуру дикорастущего и сортового (сорт «Snow Ball») пиретрума девичьего в условиях Кавказских Минеральных Вод. В результате фенологических наблюдений за растениями в культуре установлены основные фенофазы развития растений и их морфометрические показатели. Определена урожайность воздушно-сухого сырья дикорастущих популяций и трех культиваров пиретрума

девичьего. Определены анатомо-диагностические особенности и числовые показатели культиваров пиретрума девичьего, которые соответствуют нормам, установленным для дикорастущего сырья.

5. Определены основные анатомо-диагностические признаки пиретрума девичьего травы. Установлены показатели подлинности и нормы качества сырья. Разработана спектрофотометрическая методика количественного определения суммы флавоноидов в пиретрума девичьего траве.

6. Установлено, что водное извлечение пиретрума девичьего травы по своей токсичности относится к 4 классу, т.е. является малоопасным. Показано, что спиртоводное извлечение пиретрума девичьего травы обладает противовоспалительной активностью, сопоставимой с действием препарата «Троксевазин».

7. На новый вид лекарственного растительного сырья разработана ФСП «Пиретрума девичьего трава» и «Инструкция по сбору и сушке пиретрума девичьего травы».

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Коновалова, Д.С. Анатомическое изучение пиретрума девичьего / Д.С. Коновалова, Д.А. Коновалов Н Фармация. - 2007 - № 6. - С. 19-20.

2. Коновалова, Д.С. Перспективы применения пиретрума девичьего в фитотерапии мигрени / Д.С. Коновалова, Д.А. Коновалов // Изв. Самарского науч. центра РАН. - 2007. - Т.2. - Спец. вып. - С. 168-170.

3. Коновалова, Д.С. Элементный состав надземной части пиретрума девичьего (Pyrethrum parthenium) / Д.С. Коновалова, Д.А. Коновалов // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. на- -

- Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2007. - Вып. 62. - С.70-71.

4. Коновалова, Д.С. Сравнительное морфолого-анатомическое изучение пиретрума девичьего и пиретрума цинерариелистного / Д.С. Коновалова, И.Н. Ефимов, Д.А. Коновалов // Актуальные проблемы фармации: сб. ст. межрег. науч. конф. Сев.-Осет. гос. ун-та. - Владикавказ, 2007. ~ С. 29-30.

5. Коновалова, Д.С. Анализ партенолида в траве пиретрума девичьего / Д.С. Коновалова, Д.А. Коновалов // Интеграция науки и образоват. процесса. Создание новых физиол. активных веществ: материалы Всерос. науч.-метод. конф. - Воронеж: ВГУ, 2007. - 4.1. - С. 169.

6. Коновалова, Д.С. Фотохимический анализ пиретрума девичьего / Д.С. Коновалова, Д.А. Коновалов // Краеведение в Курском крае: прошлое и современность. Межрегиональные связи: тр. Междунар. науч. краевед, конф. - Курск:КГМУ, 2007. - 4.2. - С. 118-121.

7. Коновалова, Д.С. Изучение некоторых представителей рода Pyrethrum, произрастающих на Кавказе / Д.С. Коновалова, И.В. Пшукова, Д.А. Коновалов // Естествознание и гуманизм: межвузовский сб. науч. тр. -Томск: // Томский гос. ун-т; Сибирский гос. мед. ун-т., 2007.- Т. 4, № 3. — С. 118.

8. Коновалова, Д.С. Биологически активные соединения пиретрума девичьего и перспективы их применения в медицине / Д.С. Коновалова, Д.А. Коновалов // Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2007. - 21 с. - Деп. в ВИНИТИ РАН 19.07.07, № 743-В2007.

9. Коновалова, Д.С. Товароведческие показатели травы пиретрума девичьего / Д.С. Коновалова // Университетская наука: Теория, практика, инновации: сб. тр. 73-й науч. конф. КГМУ и сессии Центрально-Черноземного науч. центра РАМН. - Курск: КГМУ, 2008. - Т. 3. - С. 94-97.

10. Коновалова, Д.С. Изучение безопасности травы пиретрума девичьего / Д.С. Коновалова, Д.А. Коновалов // Человек и лекарство: тез. докл. Рос. нац. конгр. 14-18 апреля 2008 г. - М., 2008. - С. 543-544.

П.Коновалова, Д.С. Фитохимическое изучение пиретрума девичьего, произрастающего на Северном Кавказе / Д.С. Коновалова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2008. - Вып. 63. - С. 42-43.

12.Коновалова, Д.С. Изучение компонентного состава эфирного масла пиретрума девичьего / Д.С. Коновалова, Д.А. Коновалов // Фармация из века в век: сб. науч. тр. СПХФА. - СПб., 2008. - Ч. 3. - С. 59-63.

П.Коновалова, Д.С. Аминокислотный и витаминный состав травы пиретрума девичьего / Д.С. Коновалова // Научное обозрение. - 2008. - N 3. - С.18-19.

Н.Коновалова, Д.С. Сесквитерпеновые лактоны пиретрума девичьего как биологически активные вещества / Д.С. Коновалова, Д.А. Коновалов // Экология человека. - 2008. - № 3. - С. 3-7.

15.Коновалова, Д.С. Хроматографическое изучение биологически активных соединений пиретрума девичьего/ Д.С. Коновалова, Д.А. Коновалов // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». - 2008. -№ 1.-С. 123-125.

16.Коновалова, Д.С. Фенольный состав пиретрума девичьего / Д.С. Коновалова, Д.А. Коновалов // Разработка, исследование и маркетинг новой

фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2009. - Вып. 64. - С.67-68.

П.Коновалова, Д.С Изучение острой токсичности водного извлечения пиретрума девичьего / Д.С. Коновалова, М.А. Оганова, Д.А. Коновалов // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2010. - Вып.65. - С.458-459.

18. Коновалова, Д.С. Фенологическое и морфологическое изучение пиретрума девичьего и его культиваров / Д.С. Коновалова, Ю.Б. Коновалов // Молодые ученые в решении актуальных проблем науки: сб. работ молодых ученых. -Владикавказ: Сев.-Осет. ин-т. гуманит. и соц. исс-ний, 2011. - Т. 2. - С 224227.

19. Коновалова, Д.С. Микроскопическое изучение сортовых растений пиретрума девичьего / Д.С. Коновалова, Д.А. Коновалов // Молодые ученые в решении актуальных проблем науки: сб. работ молодых ученых. -Владикавказ: Сев.-Осет. ин-т. гуманит. и соц. исс-ний, 2011. - Т. 2. - С 219223.

20. Коновалова, Д.С Количественное определение флавоноидов травы пиретрума девичьего / Д.С. Коновалова, Д.А. Коновалов // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2011. - Вып.66. - С. 117-118.

21. Коновалова, Д.С. Изучение противовоспалительной активности травы пиретрума девичьего / Д.С. Коновалова, С.А. Кулешова, Д.А. Коновалов // Научные ведомости БелГУ. -2011. -№ 4 (99). -Вып. 13/2. - С.157-159.

БЛАГОДАРНОСТИ Автор выражает свою глубокую признательность и благодарность д.ф.н., проф. Оганесяну Э.Т.; к.ф.н., доц. Кулешовой С.А.; к.ф.н. Пшуковой И.В.; к.ф.н., доц. Акопову A.A.; к.ф.н., доц. Марковой О.М.; к.ф.н. Пушкарскому С.Н.; к.ф.н. Огановой М.А.; к.ф.н. Кодониди М.И.; всем сотрудникам кафедры фармакогнозии и кафедры биологии, физиологии, их заведующим - дА", проф. Челомбитько В.А. и к.б.н., доц. Назаровой Л.Е. за оказанную помои^ консультации. Особую благодарность автор выражает своему руководителю -д.ф.н., проф. Коновалову Д.А. и своей семье за понимание и терпение.

КОНОВАЛОВА ДЖАННАТ САИДОВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПИРЕТРУМА ДЕВИЧЬЕГО (PYRETHRUM PAR THENIUM SMITH) И ПЕРСПЕКТИВЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ В МЕДИЦИНЕ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати «18» октября 2011 г. Формат 60x84/16 Бумага книжно-журнальная. Печать - ротапринтная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ №

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО

ОБРАЗОВАНИЯ

«ПЯТИГОРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (357532, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11)