Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое изучение отдельных представителей рода Artemisia L.

ЛЮЙ ГОДУН

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ОТДЕЛЬНЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА ARTEMISIA L.

14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

2 8 ИЮЛ 2011

Москва-2011 г.

4851819

Диссертационная работа выполнена в ГОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор

Киселёва Татьяна Леонидовна

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор

доктор фармацевтических наук,

Раменская Галина Владиславовна Баландина Ирина Анатольевна

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Самарский Государственный Медицинский Университет Минздравсоцразвития России

Защита диссертации состоится «19» сентября 2011 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д.208.040.09 при ГОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова по адресу: 119019, г. Москва, Никитский бульвар, д. 13.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (ЦНМБ) по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49.

Автореферат разослан ¿/¿гЪС'З 2011г.

Ученый секретарь , '

Диссертационного совета /у У3 :•

доктор фармацевтических наук /( Садчикова Наталья Петровна

профессор .

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Флора некоторых регионов России и КНР по ряду позиций совпадает или характеризуется близкородственными видами растений, которые используются в медицине обеих стран. Среди таких видов имеются растения, официальные в России, но не включенные в Государственную Фармакопею (ГФ) КНР, несмотря на их широкое распространение на территории КНР и применение в Традиционной Китайской Медицине (ТКМ). Одним из таких растений является полынь обыкновенная - Artemisia vulgaris L, семейство Астровые (Сложноцветные) - Asteraceae (Compositae).

В настоящее время в РФ имеются работы, посвященные морфологическому, анатомическому и фотохимическому изучению свежесобранного сырья трава п. обыкновенной, используемого в гомеопатии. Документом, до сих пор нормирующим в РФ качество сырья трава п. обыкновенной высушенная, является устаревшая Фармакопейная Статья (ФС) 42-2094-83. Современные критерии оценки качества высушенного сырья в соответствии с ОСТ 91500.05.001-00 отсутствуют. В Китае нормативный документ (НД) на сырье п. обыкновенной отсутствует (хотя другие виды полыни официналь-ны); имеются лишь сведения об опыте применения в ТКМ, сообщения о спектре фармакологической активности и ареале п. обыкновенной.

С учётом развивающихся торговых отношений и с целью гармонизации требовании к качеству сырья в РФ и КНР целесообразной является разработка современной НД на траву полыни обыкновенной, удовлетворяющей международным требованиям, предъявляемым к такого рода документации в обеих странах.

В связи с этим актуальным является сравнительное фармакогностиче-ское изучение травы полыни обыкновенной, заготовленной в РФ и КНР.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является сравнительное фармакогностическое изучение травы полыни обыкновенной флоры России и Китая и разработка современных критериев оценки качества сырья.

Для достижения указанной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Провести информационно-аналитическое исследование библиографических данных о спектре фармакологической активности, терапевтического действия, химическом составе и методах стандартизации травы п. обыкновенной флоры РФ и КНР.

2. Провести морфолого-анатомическое исследование высушенной травы п. обыкновенной флоры РФ и КНР и выявить основные диагностические признаки, позволяющие идентифицировать сырье.

3. Изучить химический состав травы п. обыкновенной флоры РФ и КНР в сравнительном аспекте и разработать методику количественного определения биологически активных веществ (БАВ).

4. Разработать характеристики подлинности и показатели качества травы п. обыкновенной флоры РФ и КНР.

5. Провести сравнительную оценку сырья трава п. обыкновенной из РФ и КНР по характеристикам подлинности и показателям качества.

6. На основании полученных результатов дополнить ФС 42-2094-83 на траву п. обыкновенной высушенную и разработать соответствующие разделы проекта ФС на траву п. обыкновенной для включения в ГФ КНР.

Научная новизна. Впервые проведено сравнительное фармакогности-ческое изучение высушенной травы п. обыкновенной Флоры РФ и КНР: внешних и анатомо-диагностических признаков сырья, химического состава и количественного содержания флавоноидов.

Разработаны методики качественных реакций и ТСХ для определения различных групп БАВ изучаемого сырья. Разработаны: методика спектрофо-тометрического определения суммы флавоноидов, характеристики подлинности и показатели качества травы полыни обыкновенной. Впервые получены хроматографические портреты образцов и показано, что сырьё трава полыни обыкновенной из различных районов РФ и КНР аналогично по характеристикам подлинности и показателям качества.

Практическая значимость работы. На основании проведённых исследований разработаны характеристики подлинности травы п. обыкновенной, заготовленной в России и Китае, показатели качества сырья и методики их

4

определения. Разработан проект дополнений к ФС 42-2094-83 (РФ) на траву п. обыкновенной высушенную. Разработаны разделы проекта НД на траву п. обыкновенной высушенную: «Внешние признаки», «Микроскопия», «Качественные реакции», «Тонкослойная хроматография» (ТСХ), «Количественное определение», «Числовые показатели» для включения в ГФ КНР.

Основные положеиия, выдвигаемые на защиту. На защиту выносятся результаты исследований по:

-выявлению и сравнительному анализу основных морфолого-анатомических диагностических признаков высушенной травы полыни обыкновенной флоры РФ и КНР;

-изучению химического состава высушенной травы полыни обыкновенной флоры РФ и КНР;

-разработке методики количественного определения суммы флавонои-дов в траве Польши обыкновенной;

-разработке характеристик подлинности и показателей качества травы полыни обыкновенной флоры РФ и КНР;

-сравнительной оценке сырья трава Польши обыкновенной из РФ и КНР по характеристикам подлинности и показателям качества.

Апробация работы. Основные положения проведенных исследований доложены и обсуждены на I и II Российском фитотерапевтическом съездах (М. - 2008, 2010 г.г.), 6-м Международном симпозиуме по традиционной китайской медицине (Тяньзинь, КНР - 2008 г.), VII Международном конгрессе «Традиционная медицина», (М. - 2009 г.), II съезде натуротерапевтов России (М. -2011 г.).

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведена аналитическая и статистическая обработка, научное обоснование и обобщение полученных результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов

в научных публикациях и докладах и их внедрения в практику.

5

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведённого исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 5 и 6 паспорта фармацевтической химии, фармакогнозии.

Связь задач исследований с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова (номер ГР 012.00606352).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, из них 3 в ведущих изданиях, входящих в перечень ВАК.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 113 страницах и содержит 20 таблиц, 32 рисунков.

Работа состоит из введения, обзора литературы, трёх экспериментальных глав, общих выводов, списка литературы и приложения. Библиографический указатель включает 107 источников литературы, из них 28 зарубежных.

Во введении раскрыта актуальность темы, определены цели и задачи исследования, сформулированы научная новизна и практическая значимость работы. В главе 1 приведены результаты информационно-аналитического исследования библиографических данных о химическом составе, уровне стандартизации лекарственного растительного сырья, спектре фармакологической активности, применении в традиционной и современной медицинской практике п. обыкновенной, произрастающей в России и Китае.

В «Экспериментальную часть» включен раздел «Объекты и методы исследования» и главы 2-4, посвященные описанию экспериментальных исследований и обсуждению их результатов. В разделе «Объекты и методы исследования» приведены данные об объектах исследования, используемых методах, приборах и реактивах, другие сведения методического характера. Во 2 главе представлены результаты изучения внешних признаков и анатомического строения высушенной травы п. обыкновенной, произрастающей в РФ и КНР, и выявленные основные морфолого-анатомические диагностические признаки, позволяющие идентифицировать сырье. Глава 3 содержит резуль-

б

таты изучения химического состава травы п. обыкновенной, произрастающей в РФ и КНР, а также результаты разработки методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на стандартный образец (СО) рутина. Глава 4 посвящена стандартизации сырья п. обыкновенной, заготовленного в различных районах РФ и КНР. Приведены результаты сравнительной оценки сырья из РФ и КНР по характеристикам подлинности и показателям качества; обоснованы числовые показатели.

Результаты экспериментов обработаны статистически, обобщены в таблицах, проиллюстрированы графиками, рисунками и фотографиями.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Объектами исследования являлись 60 образцов высушенной травы полыни обыкновенной, заготовленной в фазу бутонизации и начала цветения в 2008-2010 гг. Из них 10 образцов заготовлено в РФ (в Ботаническом саду МГУ и в разных районах Московской, Тульской и Калужской областей); 50 образцов - в КНР (10 - в г. Шицзячжуани; 10 - в г. Лантфан - провинция Хэ-бэй; 15 - в г. Цзыбо; 15 - в г. Циндао - провинция Шандун).

Использованные методы анализа, реактивы, массы средней и аналитических проб для проведения анализа сырья приведены в соответствующих разделах ГФ СССР XI и ГФ РФ XII изданий. Микроскопический анализ проводили в соответствии со статьей «Техника микроскопического анализа» (ГФ XI, вып. 2, с. 277-285) на микроскопе Olympus СХ41 (Япония) с окуляром 19х; объективами 4х, 10х, 20х, 40х и ЮОх и фотокамерой Olympus DIGITAL CAMERA С-3000 ZOOM (Япония). Фотохимические исследования проводили при помощи общепринятых качественных реакций на отдельные группы БАВ, методов УФ-спектрофотометрии, ТСХ; спектрофотометрические измерения - на спектрофотометре модели U-2800 фирмы Hitachi (Япония).

Валидацию аналитических методик проводили в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-3-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 3. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений».

Морфолого-анатомическое изучение травы полыни обыкновенной, произрастающей в РФ и КНР

Изучены и описаны морфолого-анатомические признаки травы п. обыкновенной высушенной, позволяющие идентифицировать сырье. Установлено, что морфолого-анатомические признаки сырья из различных районов РФ и КНР аналогичны (табл.1). Отличительными особенностями п. обыкновенной (от других видов рода Artemisia L.) по внешним признакам, выявленным нами в результате экспериментальных исследований, являются: стебель прямой, жесткий, густо-олиственный, фиолетово-коричневого цвета; наличие множества мелких невзрачных зеленоватых корзинок с мелкими красноватыми цветками; сильно-рассеченные листья: сверху - зеленые и голые, снизу - беловойпочные; бальзамический, ароматный запах; пряный, горький вкус.

К диагностическим признакам анатомического строения листьев п. обыкновенной отнесены (табл. 2): аномоцитный тип устьичного аппарата; устьица крупные, овальной формы, с чечевицевидными устьичными клетками; простые многоклеточные ветвистые волоски (Т-образные); простые, тонкостенные волоски, имеющие в основании 3 короткие клетки и длинную конечную клетку (вдоль жилок); головчатые волоски с одноклеточной овальной головкой и многоклеточной ножкой (вдоль жилок); простые, тонкостенные многоклеточные волоски (по краю листа); эфиромасличные железки: крупные, овальные, с поперечной перегородкой, представляющей 2 ряда выделительных клеток. Состоят из 8, реже 6 клеток, расположенных в 2 ряда и 4 яруса на короткой одноклеточной ножке.

Таблица 1

Сравнительная характеристика внешних признаков высушенной травы полыни обыкновенной, заготовленной в РФ и КНР

Морфологические признаки Трава полыни обыкновенной Примечание

заготовленная в РФ заготовленная в КНР

Стебель Форма поперечного сечения Цилиндрический, угловато-ребристый Цилиндрический, продольно-ребристый Сырье незначительно различается по форме поперечного сечения стебля

Характер ветвления Многократновегвистый в верхней части Не может служить диагностическим признаком

Опушение Прижатоопушснный _*

Размеры: -Длина 170-200 мм 45-120 мм Сырье незначительно различается по длине стебля

Цвет Буровато-фиолетовый Фиолетово-коричневый -

Лист Расположение на стебле Очередное -

Сложность листовой пластинки Простые -

Форма Овальные, глубоко перисто-надрезанные или рассеченные с загнутыми вниз краями, доли эллиптически-ланцетные или линейно-ланцетные, более или менее глубоко надрезанные или зубчатые доли, верхние листья простые и мелкие; при-цветные - цельные, линейные Овальные, глубоко перисто-надрезанные или рассеченные с загнутыми вниз краями, доли овально-ланцетные или линейно-ланцетные, более или менее глубоко надрезанные или зубчатые; верхние листья более простые и мелкие; прицветные - цельные, линейные -

Размеры листовой пластинки: -Длина - Ширина 3-15 см 3-7 см 3-15 см 1,5-10 см Сырье незначительно различается по ширине листовой пластинки

Характер прикрепления листьев Самые нижние - черешковые, остальные - сидячие -

Опушение Сверху — голые или негусто паутинисто-волосистые. Снизу - паутинисто-войлочные -

Характер жилкования Сетчатое -

Цвет Сверху - буро-зеленый, снизу - серовато-белый из-за обильного войлочного опушения -

Тип соцветия: корзинки Яйцевидно-шаровидные или почти шаровидные, образующие узкое густое метельчатое соцветие Продолговатые обратнояйцевид-ные или эллиптические, образующие узкое густое метельчатое соцветие Сырье различается по форме корзинки

Листочки обертки По краю пленчатые; наружные - яйцевидные, заостренные; внутренние -длинные, эллиптические, тупые -

Цветки Строение отдельных цветков Срединные - обоеполые в числе 8-20, венчик узкий, бокальчато- конический, гладкий, красновато-буроватый; пыльники линейные, на довольно длинных нитях, верхний придаток остроугольный, базальные - туповато приострениые; лопасти рыльца при созревании немного выдающиеся из трубки, дуговидно изогнутые кверху расширенные, усеченные, с длинными густыми ресничками. Краевые - женские (пестичные), плодущие (в числе 7-10), с узкотрубчатым венчиком; внутренние (срединные) - обоеполые с ворон-ковидно-трубчатым венчиком (в числе 8-20), плодущие.

Размеры соцветия Длина — 3-4 мм, ширина — 1,5-3 мм Длина - 2-3 мм, ширина - 1,5-3 мм Сырье незначительно различается по размеру соцветия

Цвет соцветия Зеленый -

Цвет отдельных цветков Красноватый Розовый или красноватый Сырье незначительно различается по цвету отдельных цветков

2 ' * Тип Семянка широко веретеновидная, вверху тупая с продольными бороздками, голая, без хохолка Семянка обратнояйцевидная или яйцевидная, вверху тупая, с продольными бороздками, голая, без хохолка -

а Цвет Оливково-буроватый -

3 ^ о с? Размеры: Длина 1,2-1,7 мм 1,0-1,5 мм Сырье незначительно различается по размерам плодов

Подземные органы Тип Корневище многоглавое, почти вертикальное, одревесневающее, цилиндрическое, в верхней части утолщенное с многочисленными бурыми корнями Корневище крепкое, многоглавое, одревесневающее, в верхней части утолщенное с многочисленными бурыми корнями -

Цвет Буровато-коричневый -

Запах Бальзамический -

Вкус Пряный, горький -

Примечание. * Знак "-" означает, что морфологический признак не может служить диагностическим признаком.

Таблица 2

Сравнительная характеристика анатомического строения листьев полыни обыкновенной, заготовленных в РФ и КНР

Сравнительный признак Листья полыни обыкновенной Примечание

заготовленная в РФ заготовленная в КНР

Строение клеток эпидермиса: 1. верхний эпидермис Изодиаметрические многоугольной формы со слабоизвилистыми равномерно-утолщенными стенками Может служил, диагностическим признаком

2. нижний эпидермис Изодиаметрические многоугольной формы со слабоизвилистыми равномерно-утолщенными стенками тоже

Форма устьиц Овальная с чечевицевидными устьичиыми клетками то же

Тип устьичного аппарата 1. верхний эпидермис Аномоцитный то же

2. нижний эпидермис Аномоцитный. Устьиц больше, чем на верхней стороне листа то же

Наличие и характеристика волосков 1. верхний эпидермис 1. Простые многоклеточные ветвистые (Т-образные) (встречаются редко); 2. Простые, тонкостенные, имеющие в основании 3 короткие клетки и длинную конечную клетку; 3. Головчатые с одноклеточной овальной головкой и многоклеточной ножкой; 4. Простые многоклеточные волоски (встречаются по краю листа) тоже

2. нижний эпидермис 1. Простые многоклеточные ветвистые (Т-образные) (образуют сплошное покрытие); 2. Простые, тонкостенные, имеющие в основании 3 короткие клетки и длинную конечную клетку (встречаются по длине жилки); 3. Головчатые с одноклеточной овальной головкой и многоклеточной ножкой (встречаются по длине жилки); 4. Простые многоклеточные волоски (встречаются по краю листа) тоже

Эфиромасличные железки 1. верхний эпидермис Овальные, крупные, с поперечной перегородкой, представляющей 2 ряда выделительных клеток. Состоят из 8, реже б клеток, расположенных в 2 ряда и 4 яруса на короткой одноклеточной ножке (встречаются редко) то же

2. нижний эпидермис Овальные, крупные, с поперечной перегородкой, представляющей 2 ряда выделительных клеток. Состоят из 8, реже 6 клеток, расположенных в 2 ряда и 4 яруса на короткой одноклеточной ножке (многочисленные) тоже

Таблица 3

Качественные реакции для обнаружения биологически активных веществ полыни обыкновенной флоры РФ и КНР

Качественная реакция Результаты качественной реакции

Настой травы полыни обыкновенной флоры РФ Настой травы полыни обыкновенной флоры КНР

Флавоноиды (гликозиды)

Цианидиновая проба Слабое розовое окрашивание Слабое розовое окрашивание

Кумярины

Экспресс метод предварительного обнаружения кума-ринов предложенный Г.А. Кузнецовой 5 % раствор №ОН диазореактив (диазотиро-ваниый п-1Штроаналин) 5 % раствор ИаОН диазореактив

Темно-желтый Вишнево-красный Темно-желтый Вишнево-красный

Дубильные вещества

Реакции осаждения и цветные реакции Цветная реакция Реакция осаждения Цветная реакция Реакция осаждения

1 % р-р железоаммониевых квасцов с солью ацетата свинца в присутствии 10% уксусной кислоты 1 % р-р железоаммониевых квасцов с солью ацетата свинца в присутствии 10% уксусной кислоты

Черно-синее Осадок Черно-синее Осадок

Сексвитерпеновые лактоны

Метод гидроксамовой пробы спиртовой раствор гидроксиламина спиртовой раствор железа хлорида спиртовой раствор гидроксиламина спиртовой раствор железа хлорида

Обесцвечивание зеленого цвета Красно-фиолетовое Обесцвечивание зеленого цвета Красно-фиолетовое

Эфирные масла

Реакция конденсации с ароматическими альдегидами в альфа-положении цикла с раствором ванилина в среде концентрированной серной кислоты

Малиновое окрашивание Малиновое окрашивание

Фотохимическое изучение травы п. обыкновенной, произрастающей в РФ и КНР. Разработка характеристик подлинности

При помощи общепринятых качественных реакций ; подтверждено наличие в траве п. обыкновенной из РФ и КНР флавоноидов, дубильных веществ, кумаринов, эфирных масел, горьких веществ, относящихся к сесквитерпено-вым лактонам. Показано, что качественный состав травы п. обыкновенной из обеих стран аналогичен (табл. 3). , .

В современной медицине для профилактики и лечения многих заболеваний всё более востребованными становятся растительные лекарственные средства (JIC), содержащие свободные аминокислоты. Учитывая, что качественный аминокислотный состав является одним из характерных диагностических признаков лекарственных растений (JIP) и сырья, нами разработана методика определения суммы аминокислот травы п. обыкновенной методом ТСХ. С помощью разработанной методики проведено сравнительное изучение аминокислотного состава сырья, собранного в РФ и КНР.

Хроматографирование проводили на пластинках DC-Alufolien Kieselgel 60 F254, толщиной 0,2 мм (10x10 см и 15*10 см), фирма «Мегск», Германия. Для нанесения проб использовали микрошприцы на 10 мкл («Hamilton», Швейцария). В ходе исследования были отработаны оптимальные условия ТСХ - подобрана подвижная фаза, время насыщения камеры, время активации хроматографических пластинок, способ нанесения проб и др.

Для получения наиболее достоверной информации об аминокислотном составе высушенной травы п. обыкновенной и препаратов из нее, хромато-графированию подвергали настой, настойку на 70 % спирте, водно-спиртовые извлечения, полученные путём экстракции 40 %, 60 %, 70 %, 90 % этиловым спиртом на кипящей водяной бане с обратным холодильником.

Для проявления хроматограмм применяли 0,25 % спиртовой раствор нингидрина. Нанесение детектирующего раствора проводили опрыскиванием хроматограмм из пульверизатора. Обработку полученных хроматограмм проводили в видимом свете после проявления зон абсорбции. При проведении исследований наилучшее разделение зон абсорбции аминокислот всех

изучаемых извлечений из травы п.обыкновенной наблюдали при хромато-графировании в системе изопропанол - вода (7:3).

При проведении сравнительного хроматографического анализа исследуемых извлечений установлено, что водно-спиртовые экстракты (90 % спирт) п.обыкновенной из сырья, заготовленного в КНР и РФ, как и настои из травы разных мест заготовки, аналогичны по аминокислотному составу. Хроматограммы остальных извлечений из травы полыни из РФ и КНР (настойка на 70 % и водно-спиртовые экстракты на 40 %, 60 %, 70 % спирте) отличаются незначительно (отсутствием некоторых минорных зон на хромато-граммах). На рисунке 1 представлена схема хроматограммы настоев и настоек травы на 70 % спирте.

0.9

0.8 0.7 -0.6 0.5 0.4 0.3

о.г -

• • »

• 1 г I

• г •

• • *

• • а • О « © о о в

0 1 2 3 4 5 6 7 9 10 11 12 13

Рис. 1. Хроматограмма аминокислотного состава настойки (70% спирт) и настоя из травы п. обыкновенной флоры РФ и КНР в системе изопропанол - вода (7:3); 1-8 - растворы СО аминокислот: 1 - аргинина; 2 - гис-тидина; 3 - аспарагина; 4 - пролина; 5 - лизина; 6 - аланина; 7 - аспара-гиновой кислоты; 8 - метионина; 9 - настойка травы (КНР); 10 - настой травы (КНР); 11 - настойка травы (РФ); 12 - настой травы (РФ)

Проведение двумерной ТСХ каждого из образцов настоев, настоек и водно-спиртовых экстрактов позволило установить однородность зон адсорбции. По хроматографическому поведению (с использованием растворов стандартных образцов (СО)) идентифицированы основные аминокислоты, обнаруженные на хроматограммах. Несколько зон, предположительно отне-

15

сенных к аминокислотам, идентифицировать не удалось в связи с отсутствием соответствующих СО. Характеристика зон адсорбции растворов СО аминокислот исследуемых извлечений при ТСХ приведена в табл. 4.

В результате проведённого хроматографического анализа водных и водно-спиртовых извлечений из травы п. обыкновенной флоры РФ и КНР с использованием растворов СО аминокислот стало возможным с высокой долей вероятности констатировать наличие в исследуемом сырье следующих АК: аргинина, гистидина, аспарагина, пролина, лизина; аспарагиновой кислоты, метионина. В образцах травы отечественного происхождения не удалось обнаружить аланин, в отличие от травы полыни из КНР.

Таблица 4

Характеристика зон адсорбции растворов СО аминокислот при ТСХ в системе изопропанол - вода 7:3 (среднее значение ВД1 из 3-х определений)

Раствор СО Значение ЯГ Цвет зоны

Аргинин 0,02 розовый

Гистидин 0,07 розовый

Аспарагин 0,47 бурый

Пролин 0,54 желтый

Лизин 0,58 розовый

Аланин 0,61 розовый

Аспарагиновая кислота 0,66 фиолетовый

Метионин 0,74 розовый

Для обнаружения кумаринов хроматографированию подвергали водно-спиртовые извлечения из травы п. обыкновенной 70 % спиртом. Хромато-граммы проявляли опрыскиванием 10 % спиртовым раствором ИаОН; после просушивания просматривали в УФ свете при 365 нм (табл 5).

Из данных таблицы 5 видно, что значения М и цвета зон адсорбции на хроматограммах извлечений из травы п. флоры РФ и КНР в соответствующих системах практически совпадают. По хроматографическому поведению, значениям цвету зон в сравнении с СО кумаринов, после хроматографи-рования в 4-х системах растворителей предположительно идентифицирова-

16

ны: умбеллиферон, изоприминеоин, императорин; эскулетин, ксантотоксол, кумарин, скополетин. Контроль однородности зон проводили методом двумерной тех.

Для обнаружения флавоноидов хроматографированию подвергали водно-спиртовые извлечения 70 % спиртом из травы п. обыкновенной. Обнаружение флавоноидов осуществляли по их собственной флуоресценции в УФ свете до и после обработки хроматограмм 3 % спиртовым раствором алюминия хлорида. При просматривании хроматограммы до и после обработки А1СЬ в УФ-свете при 365 нм, обнаруживалось до 4 зон адсорбции, 2 из них с характерной для флавоноидов окраской (табл. 5). По хроматографическому поведению нами был предположительно идентифицирован кверцетин, и обнаружено две зоны абсорбции фенолкарбоновых кислот (голубой цвет зон).

В результате проведённых исследований были определены характеристики подлинности травы полыни обыкновенной флоры РФ и КНР - внешние признаки, микроскопия, качественные реакции, ТСХ (впервые были получены воспроизводимые хроматографические портреты).

Определение содержания БАВ в траве полыни обыкновенной

На первом этапе нами была предпринята попытка выделения эфирного масла из сырья с водяным паром (по фармакопейной методике) из навески 60 г в течение 5 часов. В результате экспериментального исследования были получены незначительные количества эфирного масла, не достаточные для его достоверного количественного определения, что согласуется с данными литературы. В связи с этим включение в НД методики количественного определения эфирного масла мы сочли нецелесообразным.

Поэтому, учитывая, что трава полыни обыкновенной содержит вещества флавоноидной природы, нами была разработана методика количественного определения в траве суммы флавоноидов. В ее основу положен спектрофо-тометрический метод после реакции комплексообразования со спиртовым раствором А1С1з. При выборе оптимальных условий экстрагирования было изучено влияние концентрации спирта, режимов экстракции, измельченности

Таблица 5

Результаты определения методом ТСХ кумаринов и флавоноидов в водно-спиртовых извлечениях 70 % спиртом из травы полыни обыкновенной (среднее значение из 3-х определений)

Система растворителей Водно-спиртовые извлечения 70 % спиртом из травы полыни обыкновенной Стандартные образцы кумаринов

флоры РФ флоры КНР Наименование СО Значение Rf цвет зоны абсорбции

Значения КГ, цвет зон абсорбции

Кумарины 0,02 голубой 0,03 голубой - - -

1. Бензол: ацетон -9:1 0,26 голубой 0,25 голубой умбеллиферон 0,27 голубой

0,66 красный 0,67 красный изопримииеоин 0,70 красный

0,80 желтый 0,82 желтый императорин 0,82 жёлтый

2. Бензол: этилацетат-9:1 0,02 голубой 0,03 голубой - - -

0,26 голубой 0,22 голубой - - -

0,48 розовый 0,47 розовый - - -

0,56 красный 0,57 красный - - -

0,60 красно-розовый 0,62 красно-розовый императорин 0,60 слабо-красный

0,82 светло- желтый - -

0,88 слабо-красный 0,89 слабо-красный - - -

3. Толуол: этилформиат : муравьиная кислота-5:4:1 0,51 голубой 0,47 голубой эскулетин 0,46 голубой

0,61 красный 0,63 красный ксантотоксол 0,63 красный

0,73 желто-зеленый 0,71 желто-зеленый кумарин 0.73 желто-зеленый

0,77 фиолетовый 0,80 фиолетовый императорин 0,78 фиолетовый :

4. Эфир: бензол: уксусная кислота- 5:5:1 0,05 голубой 0,07 голубой умбеллиферон 0,07 голубой

0,39 голубой 0,39 голубой скополетин 0,35 голубой

0,61 желто-зеленый 0,63 желто-зеленый кумарин 0.62 желто-зеленый

Флавоноилы 0,05 голубой 0,04 голубой

хлороформ: метанол: вода-61:32:71 0,23 голубой 0,21 голубой

0,32 желто-зеленый 0,33 желто-зеленый

0,93 желто-зеленый 0,96 желто-зеленый кверцетин 0,97 желто-зеленый

сырья и соотношение сырья и экстрагента на выход суммы флавоноидов. По результатам исследований оптимальными условиями экстракции суммы флавоноидов для количественного определения являются: измельченность сырья 5 мм; экстрагент - 70 % спирт; соотношение сырья и экстрагента 1:20; однократная экстракция на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 2-х часов.

Условия фотометрической реакции комплексообразования суммы флавоноидов извлечений из сырья со спиртовым раствором А1С13 отрабатывали по следующим параметрам: область максимального поглощения света комплексом, концентрация и количество спиртового раствора А1СЬ, необходимые для полного связывания суммы флавоноидов в комплексное соединение, зависимость светопоглощения фотометрируемых соединений от времени. По результатам исследований предложено использовать 2 мл 2 % спиртового раствора А1С13, а регистрацию оптической плотности проводить через 50 мин после добавления реактива.

Результаты исследований по обоснованию выбора рабочего СО престав-лены на рис. 2. Установлено, что максимумы поглощения продуктов реакции комплексообразования суммы флавоноидов водно-спиртового извлечения из травы полыни и раствора СО рутина с 2 %-ным спиртовым раствором А1СЬ наблюдаются при близких длинах волн (395±2 и 410±2 нм соответственно). Поэтому в качестве стандарта выбран спиртовой раствор СО рутина.

Рис. 2. УФ-спектр продуктов реакции комплексообразования суммы флавоноидов водно-спиртового извлечения из травы полыни

обыкновенной РФ (А) и КНР (В) и раствора СО рутина (С) с 2 % спиртовым раствором А1СЬ

Относительная ошибка единичного определения с 95 % доверительной вероятностью составляет ± 1,3 %, что свидетельствует о воспроизводимости методики. Относительная ошибка при проведении анализа в трех повторно-стях не превышает ± 0,7 %, поэтому в методике рекомендуется проводить анализ в трех повторностях (табл. 6). Отсутствие систематической ошибки методики подтверждено опытами с добавками СО рутина (табл. 7).

Таблица 6

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в траве полыни обыкновенной

п £ X Б Р(%) Дх

7 6 0.712 0,00362 95 2,49 0,009 ±1,27 ±0,73

Таблица 7

Результаты опытов с добавками СО рутина

Взято суммы Добавлено Суммы Ошибка

флавоноидов рутина флавоноидов (г)

(мг) (мг) должно определено абс. отн.,

быть (мг) %

0,005 0,006555 0,006477 -0,000078 -1,19

0.655 0,009 0,006559 0,006498 -0,000061 -0.93

0,014 0,006564 0,006631 +0,000067 +1,07

0,019 0,006569 0,006516 -0,000053 -0.81

С помощью методов валидации показано, что методика количественного определения суммы флавоноидов в изучаемых объектах воспроизводима. Разработка числовых показателей травы полыни обыкновенной флоры РФ и КНР Качество отечественного сырья регламентируется ФС 42-2094-83 по следующим числовым показателям: потеря в массе при высушивании - не

более 13 %; почерневших частей травы — не более 4 %; стеблей толщиной более 5 мм — не более 10 %; частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 1 мм — не более 3 %; органической примеси - не более 2 %; минеральной примеси - не более 1,5 %.

Нами был проведён анализ сырья, собранного в различных регионах РФ и КНР (5 опытно-лабораторных серий каждого образца). Показано, что числовые показатели и нормы их содержания для сырья китайского происхождения (независимо от места заготовки) совпадают с российскими, поэтому для сырья китайского происхождения нами предложены аналогичные характеристики подлинности и показатели качества.

Кроме того, на основании результатов собственных исследований и в соответствии с современными международными требованиями к качеству сырья, нами дополнительно предложены новые числовые показатели для сырья п. обыкновенной из РФ и КНР и нормы их содержания: суммы флаво-ноидов - не менее 0,5 %; золы общей - не более 11 %; золы, нерастворимой в 10 % растворе кислоты хлористоводородной - не более 2,5 %; частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм - не более 10 %.

Проведенная сравнительная оценка сырья трава п. обыкновенной из РФ и КНР по характеристикам подлинности и показателям качества, позволила установить, что сырьё п. обыкновенной, заготовленное в России и Китае, аналогично по характеристикам подлинности и показателям качества.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. В связи с отсутствием современной НД на траву полыни обыкновенной в России и Китае, проведено фармакогностическое изучение сырья из РФ и КНР. В результате морфолого-анатомического изучения определены основные диагностические признаки травы полыни обыкновенной флоры РФ и КНР. Впервые показано, что морфологические и анатомо-диагностические признаки сырья обеих стран совпадают.

2. Проведено изучение химического состава травы полыни обыкновенной флоры РФ и КНР. С использованием качественных реакций и тонкослойной хроматографии, во всех исследуемых образцах подтверждено нали-

чие основных групп биологически активных веществ в сырье: аминокислот, флавоноидов, дубильных веществ, кумаринов, эфирных масел, горьких веществ, относящихся к сесквигерпеновым лакшнам.

3. Разработана спектрофотометрическая методика количественного определения суммы флавоноидов в траве полыни обыкновенной в пересчёте на рутин. Ошибка единичного определения составляет ± 1,3 %.

4. Разработаны характеристики подлинности, числовые показатели и нормы их содержания для сырья трава полыни обыкновенной из РФ и КНР. Показано, что сырьё полыни обыкновенной обеих стран аналогично по характеристикам подлинности (внешние признаки, микроскопия, качественные реакции, ТСХ), показателям качества и нормам их содержания (суммы флавоноидов - не менее 0,5 %; влажность — не более 13 %; золы общей - не более 11%; золы, нерастворимой в 10 % растворе HCl - не более 2,5 %; почерневших частей травы - не более 4 %; стеблей толщиной более 5 мм - не более 10 %; частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм — не более 3 %; частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм - не более 10 %; органической примеси — не более 2 %; минеральной примеси — не более 1,5 %).

5. Результаты исследований включены в проект дополнений к ФС 422094-83 на траву Польши обыкновенной высушенную. Разработаны разделы «Внешние признаки», «Микроскопия», «Качественные реакции», «Тонкослойная хроматография», «Количественное определение», «Числовые показатели» для включения в проект НД на траву полыни обыкновенной для ГФ КНР X издания.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Т.Л. Киселева, И.А. Самылина, A.A. Карпеев, Ю.А. Смирнова, Е.В. Цветаева, Люй Годун. Сравнительный анализ номенклатуры лекарственного растительного сырья и производящих растений, разрешенных к медицинскому применению в РФ и входящих в ГФ КНР// Традиционная медицина.-2007.-№4.-С.24-30.

2. JI.H. Фролова, T.JI. Киселева, Е.В. Цветаева, Люй Годун. Морфолого-анатомическое изучение сырья Artemisia vulgaris L.- полыни обыкновенной, применяемого в традиционной медицине России и Китая// Традиционная медицина.- 2008,- № 4. - С. 44-50.

3. Смирнова Ю.А., Киселева T.JL, Люй Годун. Сравнительный анализ требований, предъявляемых к критериям оценки качества лекарственного растительного сырья в РФ и КНР// Сборник научых трудов I Российского фи-тотерапевтического съезда, г. Москва, 14-16 марта 2008 г.- М.: Изд-во ФНКЭЦ ТМДЛ Росздрава, 2008,- С. 254-256.

4. Люй Годун, Киселева Т.Л. Некоторые результаты изучения полыни обыкновенной Artemisia vulgaris L. в РФ и КНР. Обзор// Сборник научных трудов I Российского фитотерапевтического съезда, г. Москва, 14-16 марта 2008 г.- М.: Изд-во ФНКЭЦ ТМДЛ Росздрава, 2008,- С. 275-276.

5. Т.Л. Киселева, И.А. Самылина, А.А. Карпеев, Ю.А. Смирнова, Е.В. Цветаева, Люй Годун. Анализ номенклатуры лекарственного сырья и производящих растений, разрешенных к медицинскому применению в РФ и входящих в ГФ КНР// Фармация- 2008,- № 2.- С. 53-56.

6. Frolova L.N., Kiseleva T.L., Karpeev А.А., Soyunova J.A., Tsvetayeva E.V., Lu Guodong. Morphologo-anatomic study of Artemisia vulgaris - wormwood raw material used in traditional medicine of Russia and China. 6th International symposium on TCM and 10th International on acupuncture & moxibustion: Collection of papers.- English edition, 2008,- P. 292.

7. Т.Л. Киселева, Л.Н. Фролова, Люй Годун. Сравнительное изучение внешних признаков полыни обыкновенной, заготовленной в России и Китае/ Н.Н. Мельникова, // Сборник научных трудов VII Международного конгресса «Традиционная медицина», г. Москва, 23-25 октября 2009 г.- М.: Изд-во ФНКЭЦ ТМДЛ Росздрава, 2009,- С. 331.

8. Л.Н. Фролова, Т.Л. Киселёва, Н.Н. Мельникова, Люй Годун. Изучение анатомических диагностических признаков листьев Artemisia vulgaris L.- полыни обыкновенной, произрастающей в Китае// Сборник научных трудов VII Международного конгресса «Традиционная медицина», г. Москва, 23-25 октября 2009 г.- М.: Изд-во ФНКЭЦ ТМДЛ Росздрава, 2009.- С. 337-338.

9. Киселёва TJL, Смирнова Ю.А., Люй Годун, Хуан Луцзи, Джан Жуй-сянь, Ху Шилинь, Шао Айцюань, Джан Вэй, Ян Юйян. Совместное исследование флоры России и Китая научными учреждениями Российской Федерации и Китайской Народной Республики как путь к цивилизованной регистрации и применению препаратов традиционной китайской медицины// Сборник материалов III Международной конференции «Вопросы интеграции традиционной китайской и европейской медицины в России», г. Новосибирск, 10 октября 2010 г.- Новосибирск, 2010,- С. 30-32.

10. Люй Годун, ТЛ. Киселёва, O.A. Горошко, A.B. Чаузова, O.A. Прохоренко. Сравнительное хроматографическое изучение аминокислотного состава травы полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.), собранной на территории России и Китая// Сборник научных трудов II Российского фитотера-певтического съезда, г. Москва, 22-23 октября 2010 г.- М.: Издательство Профессиональной ассоциации натуротерапевтов, 2010.- С. 179-183.

11. Люй Годун, Т.Л. Киселёва, A.B. Чаузова, O.A. Горошко. Разработка методик количественного определения суммы флавоноидов в сырье Artemisia vulgaris L. - полыни обыкновенной, применяемой в традиционной медицине России и Китая// Сборник научных трудов II Российского фитотерапевтиче-ского съезда, г. Москва, 22-23 октября 2010 г.- М.: Издательство Профессиональной ассоциации натуротерапевтов, 2010,- С 184-187.

12. Люй Годун, ТЛ. Киселёва, A.B. Чаузова, Л.Н. Фролова. Возможности применения полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.) флоры КНР с точки зрения доказательной медицины// Сборник научных трудов II Съезда натуротерапевтов России «Современная натуротерапия с позиций доказательной медицины» и Научно-практической конференции «Средства и методы традиционной китайской медицины в России», г. Москва, 19-20 апреля 2011 г.- М.: Издательство Профессиональной ассоциации натуротерапевтов, 2011,-С. 25-26.

Список сокращений: БАВ биологически активные вещества ГФ Государственная Фармакопея ЛР лекарственные растения ЛС лекарственные средства НД нормативный документ СО стандартный образец ТКМ традиционная китайская медицина ТСХ тонкослойная хроматография ФС Фармакопейная Статья

Подписано в печать: 04.07.11

Обьем: 1,5усл.п_л. Тираж: 100 экз. Заказ № 782 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru