Фармакогностическое исследование Artemisia annua L. и Artemisia sieversiana Willd. флоры Бурятии

Соктоева, Туяна Эрдэмовна

Диссертации по медицине → Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое исследование Artemisia annua L. и Artemisia sieversiana Willd. флоры Бурятии

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Соктоева, Туяна Эрдэмовна Улан-Удэ 2011 г.

Ученая степень: кандидата фармацевтических наук

ВАК РФ: 14.04.02

Автореферат диссертации по медицине на тему Фармакогностическое исследование Artemisia annua L. и Artemisia sieversiana Willd. флоры Бурятии

На правах рукописи

Соктоева Туяна Эрдэмовна

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ARTEMISIA ANNUA L. И ARTEMISIA SIEVERSIANA WILLD. ФЛОРЫ БУРЯТИИ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

- 1 ДЕК 2011

Улан-Удэ-2011

005004710

Диссертационная работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Бурятский государственный университет» Министерства образования и науки Российской Федерации и Учреждении Российской академии наук Байкальском институте природопользования Сибирского отделения РАН

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Раднаева Лариса Доржиевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Анцупова Татьяна Петровна

кандидат фармацевтических наук Монголов Ханхай Пурбуевич

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Пермская государственная

фармацевтическая академия»

Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «23» декабря 2011 года в 10°° часов на заседании Диссертационного совета ДМ 003.028.02 при Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН по адресу: 670047, г. Улан-Удэ, ул.Сахьяновой, 6.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Бурятского научного центра СО РАН.

Автореферат разослан « 22 » ноября 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Хобракова В.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Растения рода Artemisia (Полынь) -перспективные источники биологически активных веществ, такие виды как полынь эстрагон Artemisia dracunculus L., полынь горькая Artemisia absinthium L., полынь обыкновенная Artemisia vulgaris L. широко используются в народной, традиционной медицине и пищевой промышленности. Полынь однолетняя Artemisia annua L. успешно введена в культуру во многих странах и в 2001 году была рекомендована ВОЗ как основной источник артемизинина - средства первой линии терапии для борьбы с малярией. На сегодняшний день страны, производящие артемизинин, обеспечивают около четверти потребности мирового здравоохранения (Толстикова, 2010; Xiao Wang, 2011). Из п. однолетней выделено 137 биологически активных соединений, в том числе 40 сесквитерпенов, 10 тритерпенов, 7 кумаринов, 46 флавоноидов, которые могут послужить основой для разработки лекарственных препаратов (Bhakuni, 2001). В 80-х годах XX века группой ученых (Шретер, 1989) были предприняты попытки культивирования дикорастущей п. однолетней флоры СССР в ВИЛР (г. Москва). В наши дни крупные работы по интродукции п. однолетней проводятся в Томском государственном университете. В Бурятии п. однолетняя является дикорастущим видом.

Наряду с п. однолетней в Бурятии широко распространена полынь Сиверса Artemisia sieversiana Willd., которая также является перспективным для здравоохранения видом. В траве п. Сиверса содержатся флавоноиды, эфирное масло, кумарины (Ткачев, 2002; Shatar,1998; Ханина, 1999; Suleimenov, 2009). Эфирное масло п. Сиверса представляет интерес как источник хамазулена - нетоксичного соединения, обладающего противовоспалительным, бактерицидным, регенераторным действием (Березовская, 1991; Ханина, 1992).

До настоящего времени детального химического исследования полыни Сиверса и полыни однолетней флоры Бурятии как перспективных источников биологически активных веществ не проводилось, поэтому изучение их является актуальной задачей.

Цель работы: Фармакогностическое изучение полыни Сиверса Artemisia sieversiana Willd. и полыни однолетней Artemisia annua L. в качестве ценных источников биологически активных веществ.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Выявить анатомо-диагностические признаки надземной части п. Сиверса и п. однолетней, установить товароведческие показатели

сырья, оценить запасы и возможность заготовки п. однолетней и п. Сиверса на территории республики Бурятия;

2. Изучить химический состав основных групп биологически активных веществ указанных растений и определить их количественное содержание, установить локализацию эфирных масел и артемизинина в отдельных частях растений, изучить динамику их накопления по фазам развития и определить оптимальные условия сбора;

3. Разработать методику количественного определения артемизинина в надземной части п. однолетней;

4. Определить показатели качества и нормы содержания основных биологически активных веществ, разработать нормативную документацию на лекарственное сырье - трава полыни Сиверса и трава полыни однолетней.

Научная новизна. Установлены основные диагностические признаки травы п. Сиверса и п. однолетней, разработаны числовые показатели, необходимые для стандартизации сырья.

Проведено изучение химического состава травы п. Сиверса и травы п. однолетней. Определено содержание эфирных масел, флавоноидов, жирных кислот, макро- И микроэлементов. Методом ВЭЖХ-МС в указанных растениях обнаружены флавоноиды - лютеолин-7-глюкозид, рутин, кверцетин и хризоэриол. Основными жирными кислотами в исследуемых видах полыней являются пальмитиновая, линолевая, линоленовая, в полыни однолетней также обнаружена в значительных количествах 10-октадекеновая кислота.

Определены условия извлечения артемизинина (тип экстрагента, метод экстракции, время экстракции) из травы п. однолетней и установлено, что максимальное извлечение артемизинина достигается при УЗ- и докритической С02-экстракции. Методом ВЭЖХ-МС установлено, что наибольшее количество артемизинина в п. однолетней содержится в фазу цветения в соцветиях.

Изучена динамика накопления эфирного масла в зависимости от фазы развития и части растения. Наибольшее количество хамазулена эфирное масло п. Сиверса накапливает в фазы бутонизации и цветения в соцветиях.

Установленные показатели качества БАВ внесены в нормативные документы.

Практическая значимость. Определены запасы и возможный ежегодный объем заготовки п. Сиверса и п. однолетней на территории республики Бурятия (п. Сиверса - от 0.1 до 73.7 тонн в год, п. однолетней - от 1.2 до 122.3 тонн в год).

Разработана методика количественного определения артемизинина в траве п. однолетней методом ВЭЖХ-МС. Научно обоснованы условия пробоподготовки сырья к анализу для количественного определения артемизинина.

Проведена стандартизация сырья, разработаны проекты ФС -«Трава полыни Сиверса» и «Трава полыни однолетней».

Степень внедрения. Методика выделения эфирного масла и данные по микроскопическому анализу апробированы и внедрены в учебный процесс кафедры фармации ФГБОУ ВПО «Бурятский государственный университет» (Акт внедрения №1 от 6 сентября 2011 года). Подготовлены к рассмотрению проекты ФС на траву полыни Сиверса и траву полыни однолетней.

На защиту выносятся:

• результаты изучения анатомического строения, запасов, критериев подлинности п. Сиверса и п. однолетней, произрастающих в Бурятии;

• результаты химического изучения биологически активных веществ и их сезонной динамики накопления;

• результаты исследований по стандартизации надземной части п. Сиверса и п. однолетней.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: научно-практической конференции с международным участием «Развитие традиционной медицины в России: опыт, научные исследования, перспективы» (Улан-Удэ, 2010); 7th Winter Simposium on Chemometrics «Modern Methods of Data Analysis» (Saint-Petersburg, 2010); международной научной конференции, посвященной 15-летию Бурятского государственного университета «Актуальные исследования Байкальской Азии» (Улан-Удэ, 2010); V международной научно-практической конференции «Приоритеты и особенности развития Байкальского региона» (Улан-Удэ, 2011); X международной научно-практической конференции «Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии» (Барнаул, 2011); IV всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2009); XVI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009» (Москва, 2009); XV международной экологической студенческой конференции «Экология России и сопредельных территорий» (Новосибирск, 2010); II всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Технологии и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности» (Бийск, 2009); Всероссийской научно-практической конференции «Растительность

Байкальского региона и сопредельных территорий» (Улан-Удэ, 2011); V школе семинаре молодых ученых России «Проблемы устойчивого развития региона» (Улан-Удэ, 2009); региональной молодежной научно-практической конференции с международным участием «Экологобезопасные и ресурсосберегающие технологии и материалы» (Улан-Удэ, 2010).

Работа выполнена в рамках исследований по проектам: РФФИ: 08-04-90202-Монг_а «Исследование биогенетических закономерностей биосинтеза биологически активных соединений эндемичных растений Центральной Азии» (2008-2009гг.), 08-04-98037-р_сибирь_а «Химический состав растений как индикатор состояния экосистем Байкальского региона» (2008-20 Югг,); междисциплинарный интеграционный проект № 93 «Развитие исследований в области медицинской химии и фармакологии как научной основы разработки отечественных лекарственных препаратов»; совместный проект с академией наук Монголии «Получение новых липо- и наносомальных форм лекарственных средств с использованием природного сырья»; РФФИ: 10-03-16001-моб_з_рос «Мобильность молодых ученых» (2010г.), 11-03-90705-моб_ст научная работа (стажировка) молодых российских ученых в ведущих научных организациях Российской Федерации 2011 (2011г.).

Публикации. По результатам работы опубликовано 17 научных работ, из них 3 - в периодических изданиях, рекомендованных ВАК МО и науки РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 172 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (4 главы), общих выводов, списка литературы и приложений. Работа иллюстрирована 37 таблицами и 61 рисунком. Библиографический указатель включает 139 источников, в том числе 42 иностранных.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, представлены научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе (обзор литературы) приведены данные о химическом составе, спектре фармакологической активности, применении в традиционной и современной медицинской практике полыней рода Artemisia L.

Во второй главе (материалы и методы) приведены данные об объектах исследования, используемых методах, приборах и реактивах, другие сведения методического характера.

В третьей и четвертой главах приведены данные по изучению анатомо-диагностических признаков п. Сиверса и п. однолетней. Методом

УФ-спектрофотометрии определено суммарное содержание флавоноидов и дубильных веществ в объектах исследования. С помощью ГХ-МС исследован качественный и количественный состав эфирного масла и жирных кислот полыней. Методом ВЭЖХ-МС установлено качественное и количественное содержание флавоноидов. Определен элементный состав растений методом ААС. Разработана и предложена методика количественной оценки содержания артемизинина. методом ВЭЖХ-МС. Кроме того нами исследованы химические составы эфирных масел пяти видов полыней, наиболее часто встречающихся на территории Бурятии и Монголии - полынь Гмелина Artemisia gmelinii Web. et Stechm., полынь серая Artemisia glauca Pall, ex Wild., полынь крупноголовчатая Artemisia macrocephala Jacq. ex Bess., полынь Сиверса Artemisia sieversiana Willd. и полынь однолетняя Artemisia annua L.

В пятой главе приводятся данные по стандартизации травы п. Сиверса и п. однолетней, предлагаемых в качестве перспективных источников хамазулена и артемизинина, соответственно.

Основное содержание работы

Объекты и методы исследования. Объектами исследования служили образцы травы п. Сиверса и п. однолетней, собранные в различных районах Республики Бурятии (Иволгинском, Прибайкальском, Селенгинском, Тункинском, Закаменском, Курумканском) Иркутской области (о. Ольхон) и Монголии (Селенгинский аймак), в период с 2008 по 2011 годы.

Микроскопический анализ проводили в соответствии со статьей «Техника микроскопического анализа» (ГФ XI, вып. 2) на микроскопах Микмед (Ломо, Россия) с окуляром 10х; объективами 4х, 10х, 40х и МС-300(TFXS), Fluorescent System Set (Micros, Австрия) с окуляром 10х; объективами 4х, 10х, 40х. Урожайность сырья определяли методом учетных площадок.

Выделение эфирного масла проводили гидродистилляцией, экстракты получали УЗ—экстракцией, С02-экстракцией и мацерацией.

Изучение качественного и количественного состава указанных объектов проводили следующими методами - ГХ-МС, ВЭЖХ-МС, ТСХ, БХ, УФ-спектрофотометрия и ААС. Хромато-масс-спектрометрический анализ проводили на газовом хроматографе Agilent 6890 с квадрупольным масс-спектрометром HP MSD 5973N (Agilent Technologies, США; колонки: HP-5ms, ё=0,25мм, толщина пленки 0,25мкм (сополимер - 5%, дифенил - 95% диметилсилоксан) и DBWax с внутренним диаметром 0,25 мкм, газ-носитель - гелий, г)потока 1-1,5 мл/мин); ВЭЖХ-МС анализ проводили на высокоэффективных жидкостных хроматографах «Finnigan Surveyor» (Thermo Scientific, США) и «Agilent 1200» (Agilent Technologies,

США) с масс - селективным детектором «LCQ Advantage МАХ» («ионная ловушка») марки «Finnigan» (Thermo Scientific, США) и с тандемным масс-спектрометрическим детектором («ионная ловушка») 6330 (Agilent Technologies, США), способ ионизации электроспрей; условия: колонки Hypersyl Gold Cl8, 5 мкм, 150x4 мм (Thermo electronic corporation, США) и Zorbax Eclipse C18, 5 мкм, 4.6*150 мм (Agilent Technologies, США), объемная скорость потока элюента - 0,5 мл/мин. ТСХ анализ проводили на пластинках «Sorbfil» ПТСХ-П-А-УФ (Imid Ltd, Россия); БХ анализ проводили на бумаге FN 6 (Filtrak, Германия); спектры поглощения регистрировали на спектрометре StellarNet Green Waiv (StellarNet Inc, США), AAC анализ проводили на спектрофотометрах SOLAAR Мб (Thermo scientific, США) и Varían модель АА240 (Varian, Россия).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили методом вариационно-статистического анализа. Часть данных была обработана МГК (программный пакет Sirius version 6.0, Pattern Recognition Systems, a/s, Норвегия).

Результаты исследования

Фармакогностическая характеристика травы п. Сиверса и п. одолетней. Установлены следующие показатели качества лекарственного сырья. Трава полыни Сиверса. Цельное сырье. Цельные или частично олиственные верхушки цветоносных стеблей длиной не более 45 см, не содержащих грубых частей стебля. Стебель опушенный, прямой, ребристый и ветвистый. Прикорневые и средние листья черешковые, широкотреугольные, трижды перисторассеченные на продолговатые плоские дольки, длиной 1,4 - 2,5 см, шириной 0,1 - 0,5 см. Корзинки полушаровидные, диаметром 0,4 - 0,6 см, в широком метельчатом соцветии. Краевые цветки пестичные (их около 18). Цветки обоеполые, многочисленные, с воронковидным венчиком.

Трава полыни однолетней. Цельное сырье. Цельные или частично олиственные верхушки цветоносных стеблей длиной не более 50 см, не содержащих грубых частей стебля. Стебель голый, прямой, бороздчатый, в начале вегетации - зеленый, под конец темно-фиолетовый. Пластинка нижних и средних стеблевых листьев яйцевидная или овальная, на черешке 1,5-7,0 см длиной эллиптической формы, без крыльев, трижды пересторассеченная на широкие сегменты, сегментики и доли, длиной от 0,5 до 0,8 см, ширина не более 0,2 см. Корзинки диаметром около 0,2 см в метельчатом соцветии.

При проведении анатомического исследования травы п. Сиверса и п. однолетней выявлен ряд анатомо-диагностических особенностей. Строение листьев полыней представлено в таблице 1. Стебель у полыни Сиверса крупноребристый, клетки эпидермы удлиненной формы.

Встречаются эфирномасличные железки, Т-образные волоски и округлые устьичные клетки. У стебля пучковый тип строения. В ребрах располагаются участки колленхимы. Коллантеральные пучки, расположенные по кругу, характеризуются сильно развитой склеренхимой. Хорошо выражена эндодерма, состоящая из крупных тонкостенных клеток круглой формы, плотно прилегающих друг к другу.

Таблица 1

Характеристика анатомического строения листьев п. Сиверса и п. однолетней __

эпидермис полынь Сиверса полынь однолетняя

верхний прямостенныи прямостенныи

нижний извилистостенный слабоизвилистосгенный

тип усгтьичного аппарата верхний аномоцитный

нижний аномоцитный, устьиц больше, чем на верхней стороне листа

форма устьиц овальная с чечевицевидными устьичными клетками

характеристика волосков густо опушены Т-образными волосками, состоящими из двух-, четырехклеточной ножки, и многоклеточными бичевидными волосками встречаются два типа волосков - звездчатые и Т-образные с многоклеточной ножкой

терпеноидсодержащие структуры имеются многоклеточные, крупные эфирномасличные железки. схизогенные вместилища и неспециализированные паренхимные клетки

у п. однолетней бороздчатый, почти голый стебель, клетки эпидермы удлиненной формы. У стебля п. однолетней, также как и у стебля п. Сиверса, пучковый тип строения, встречаются эфирномасличные железки, редко волоски и овальные устьичные клетки, коллантеральные пучки характеризуются развитой склеренхимой, выражена эндодерма с крупными тонкостенными клетками круглой формы, прилегающими друг к другу. У обоих видов полыней клетки эпидермиса на венчике трубчатых цветов тонкостенные, вытянутые с заостренными концами, характеризуются наличием большого количества эфирномасличных железок и отсутствием волосков.

На нескольких партиях сырья установлены товароведческие показатели:

Трава полыни Сиверса. Влажность (не более 7 %), золы общей (не более 11 %), золы, нерастворимой в 10 % хлористоводородной кислоте (не более 2 %), экстрактивных веществ (не менее 33 %), листьев побуревших и почерневших (не более 5 %), органической примеси (не более 2 %), минеральной примеси (не более 0.5 %).

Трава полыни однолетней. Влажность не более 7 %, золы общей (не более 9 %), золы, нерастворимой в 10 % хлористоводородной кислоте (не более 1 %), экстрактивных веществ (не менее 42 %), листьев побуревших и почерневших (не более 5 %), органической примеси (не более 2 %), минеральной примеси (не более 0.5 %).

По результатам предварительного фитохимического анализа в траве п. Сиверса и п. однолетней обнаружены эфирное масло, флавоноиды, дубильные вещества, оксикоричные кислоты, кумарины, жирные кислоты и сесквитерпеновые лактоны.

Запасы п. Сиверса и п. однолетней. В таблице 2 приводятся данные по урожайности, биологическому (БЗ) и эксплуатационному запасам (ЭЗ) п. Сиверса и п. однолетней, произрастающей в разных районах Бурятии.

Таблица 2

Запасы сырья п. Сиверса и п. однолетней в районах Бурятии

полынь Сиверса

район сбора урожайность (г/м2) общая Э зарослей,(га) БЗ (кг) ЭЗ (кг)

Селенгинский р-н.

окр. г. Гусиноозерска 58.0±4.1 0.8 530.0 398.4

окр. с. Ганзурино 33.8±2.4 0.4 154.4 116.0

окр. с. Бораты 220.6±15.1 20.0 50160.0 41100.0

Иволгинский р-н

окр. с Тапхар 500.0±26.3 0.5 2763.0 2237.0

окр. с. Сотниково 240.2±19.4 25.0 69750.0 52850.0

окр. г. Улан-Удэ 500.0±32.5 0.5 2815.0 2175.0

Кабанский р-н 285.Ш=19.7 30.0 97320.0 73680.0

Тункинский р-н 70.0±8.0 0.2 172.0 108.0

Прибайкальский р-н 280.9±25.3 1.0 3315.0 2297.0

Курумканский р-н 370.6±34.0 0.1 438.6 302.6

полынь однолетняя

Иволгинский р-н,

окр. с. Хурумша 228.0±10.8 0.6 1497.6 1238.4

окр. п. Нурселение 500.0±46.2 30.0 177720.0 122280.0

окр. с. Сотниково 39.0±2.1 25.00 10800.0 8700.0

Кабанский р-н 400.0±27.1 30.0 136260.0 103740.0

Урожайность надземной части полыни Сиверса и п. однолетней в исследуемых зарослях варьирует от 33.8±2.4 до 500.0±32.5 г/м2 и от 39±2.1 до 500±46.2 г/м2, соответственно. Биологический и эксплуатационный запасы надземной части исследуемых растений составляет 154.4-97320.0 кг и 116.0-73680.0 кг (полынь Сиверса), 1497.6177720.0 кг и 1238.4-122280.0 кг (полынь однолетняя).

Химическое изучение травы п. Сиверса и п. однолетней Флавоноиды. Определено суммарное количественное содержание флавоноидов по общепринятой методике спектрофотометрического определения в траве п. Сиверса и п. однолетней, в пересчете на лютеолин-7-глюкозид на разных фазах развития растений (вегетации, бутонизации, цветения, плодоношения). Наибольшее содержание флавоноидов установлено в образцах п. Сиверса и п. однолетней, собранных в фазу бутонизации - 0.68 и 0.66 %, наименьшее - в сырье, собранном в фазу плодоношения - 0.31 % и 0.38 % (табл.3).

Таблица 3

Количественное содержание суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин-7-глюкозид в траве п. Сиверса и в траве п. однолетней в зависимости от фазы вегетации

фаза развития растения сумма флавонидов, в пересчете на лютеолин-7-глюкозид (%)

полынь Сиверса полынь однолетняя

вегетация 0.67±0.02 0.64±0.04

бутонизация 0.68±0.05 0.66±0.03

цветение 0.48±0.03 0.52±0.02

плодоношение 0.31±0.01 0.35±0.01

Методом ВЭЖХ-МС обнаружены следующие флавоноиды - рутин, лютеолин-7-глюкозид, хризоэриол, кверцетин в траве п. Сиверса и в траве п. однолетней (рис.1).

Рис.1. Хроматограммы СО флавоноидов и п. Сиверса, п. однолетней.

Методом внешнего стандарта определено количественное содержание рутина, хризоэриола, кверцетина в траве п. Сиверса и в траве п. однолетней (табл. 4).

В обоих видах полыней в наибольшем количестве содержится лютеолин-7-глюкозид 0.04-0.08% (п. Сиверса) и 0.88-1.77 % (п. однолетняя), наименьшем - кверцетин 0.001 % (п. Сиверса) и 0.0070.009 % (п. однолетняя).

Таблица 4

Количественное содержание флавоноидов (ВЭЖХ-МС)

полынь Сиверса Район сбора содержание флавоноидов (%)

рутин кверцетин лютеолин-7-глюкозид

Иволгинский р-н, окр. с. Тапхар, 0.002±0.0001 0.001±0.0002 0.040±0.003

Иволгинский р-н, окр. п. Сотниково 0.002±0.0002 0.001 ±0.0001 0.080±0.005

ПОЛЫНЬ однолет ияя Иволгинский р-н, окр. п. Сотниково 0.018±0.001 0.007±0.0003 0.880±0.004

Кабанский р-н, окр. с. Таракановка 0.012±0.002 0.009±0.0003 1.700±0.005

Жирные кислоты. В образцах полыней содержится от 8 до 13 жирных кислот. Общими для обоих видов являются пальмитиновая (16:0), линолевая (18:2п6), линоленовая (18:ЗпЗ) кислоты, в сумме 56.87-82.67 % (от общего содержания жирных кислот) в п. Сиверса, 58.36-67.19 % в п. однолетней (от общего содержания жирных кислот). Кроме указанных кислот, в п. однолетней в значительном количестве содержится 10-октадекеновая кислота (18:1п8) от 3.64% до 11.65%. Также во всех образцах обнаружены 10-метил-ундекановая (¡зо 12:0) и 12-метил-тетрадекановая (а ¡во 15:0) кислоты, их содержание не превышает 1 %. Хроматограммы приведены на рисунке 2.

и!

а) б)

Рис. 2. Хроматограммы жирных кислот (а) п. Сиверса и (б) п. однолетней (I - (16:0), 2 - (18:2п6), 3 - (18:ЗпЗ), 4 - (18:1п8)).

Элементный состав. В траве п. Сиверса, произрастающей в различных районах Бурятии содержание кальция составляет 0.56±0.02-0.89±0.03%, магния - 0.12±0.01-0.28±0.01 %. Наибольшее содержание кальция и магния отмечено в образцах, собранных в Курумканском районе, наименьшее содержание магния - в сырье из Тункинского района, а кальция - в растениях, собранных в Селенгинском районе. Железа больше всего содержится в растениях из Курумканского района

(141.25±12.13 мг/кг), меньше - из Селенгинского района (141.25±12.13 мг/кг).

Содержание цинка варьируется от 23.73±1.56 до 59.8±1.56 мг/кг -п. Сиверса и от 55.32±0.83 до 66.50+0.89 мг/кг - п. однолетняя, что является допустимым для нормального функционирования биохимических процессов. Содержание меди составляет 8.42±0.45-24.30±1.56 мг/кг -п. Сиверса, 9.37+0.18-13.48+0.44 мг/кг - п. однолетняя (необходимое количество от 5 до 30 мг/кг). Никеля в траве п. Сиверса содержится 0.40±0.01 -2.06±0.03мг/кг, что соответствует норме потребности растения от 0.1 до 5 мг/кг. Содержание кобальта в растении не должно превышать 1 мг/кг, свинца - 10 мг/кг, кадмия - 0.2 мг/кг, хрома - 1.0 мг/кг (Кабата-Пендиас, 1989; Кашин, 2009). В п. Сиверса содержание кобальта менее 0.3 мг/кг, свинца - 3.19±0.11 мг/кг, в п. однолетней - 0.59±0.02 мг/кг, кадмия -0.18±0.02 мг/кг, хрома - 0.76±0.02 мг/кг во всех образцах. Таким образом, содержание макро- и микроэлементов находится в концентрациях, нормальных и достаточных для протекания жизненно важных для растений функций.

Эфирное масло травы полыни Сиверса. Эфирное масло из растений выделяли фармакопейным методом №2. В различных образцах п. Сиверса содержание эфирного масла составляет от 0.1 до 1.9%. В эфирных маслах п. Сиверса, произрастающих в разных районах Бурятии, идентифицировано свыше 80 соединений.

Нами исследован состав эфирных масел, выделенных из травы полыни Сиверса, произрастающей в разных районах Бурятии

(Иволгинский (1), Селенгинский (2), Курумканский (3), Прибайкальский (4,9),

Тункинский (5), Закаменский районы (8)), Иркутской области (о. Ольхон) (6) и Монголии (7). Наибольший выход эфирного масла в полыни Сиверса, произрастающей в Тункинском и Курумканском районах (0.4%). Минимальное количество масла было выделено из растений, собранных на территории Закаменского, Прибайкальского районов и Монголии (0.1 %) (рис. 3).

Изучена динамика накопления эфирного масла в зависимости от фазы развития растения (рис. 4). Полученные результаты показали, что в наибольшем количестве масло накапливается в фазу цветения (0.6 %), в

123456780

Рис. 3. Выход эфирного масла п. Сиверса от места произрастания.

фазы бутонизации и плодоношения накапливается одинаковое количество эфирного масла (около 0.3 %).

0,8 -,

1- 1,8-данеол I - терпинеал-4 3 - р-фарнекн '1 ■ сишна-4,11-днен

5 .гершкренС

6 - нерт-2-метдабугошг

7 ■ хамазулен

Рис. 5. Хроматограмма эфирного масла п. Сиверса.

Рис. 4. Выход эфирного масла п.

Сиверса на разных фазах развития растения (в-вегетация, б - бутонизация, ц - цветение,

п - плодоношение).

Все компоненты эфирного масла можно разделить на две группы — константные, то есть обнаруженные в масле на всех фазах развития растений и спорадически появляющиеся (минорные). Во всех образцах эфирного масла п. Сиверса, независимо от района произрастания растения, обнаруживаются 1,8-цинеол (2.34-22.57%), терпинеол-4 (0.964.70%), гермакрен Э (8.66-12.36 %), Р-фарнезен (0.64-5.17%), селина-4,11-диен (0.97-4.66 %), нерил-2-метилбутаноат (4.80-8.79 %) и хамазулен (0.60-25.36 %) (рис. 5).

Наибольшее количество хамазулена содержат эфирные масла, выделенные из растений, произрастающих в степных районах, в Прибайкальском районе (25.36%), наименьшее - в Закаменском районе (0.60%).

В составе эфирного масла, выделенного из растений на разных фазах развития - вегетации, бутонизации, цветения и плодоношения идентифицировано 54 соединения. Константными компонентами являются 1,8-цинеол, линалоол, терпинеол-4, а-терпинеол, р-фарнезен, селина-4,11-диен, хамазулен.

Содержание хамазулена, в фазу вегетации колеблется от 0.20 до 24.69 %, в фазу бутонизации - от 21.34 до 61.91 %, в фазу цветения - от 1.53 до 34.42%, в фазу плодоношения - от 10.87 до 20.64%. Набор спорадически появляющихся компонентов значителен (до 40 соединений) при одновременно низком их количественном содержании, поэтому трудно выявить зависимость их состава от фазы развития растения.

Для оценки влияния фазы развития на составляющих масла был использован МГК (рис. 6).

МГК -

методов

состав минорных

/ Т (

• /

и /

Рис. 6. ГК-модель зависимости состава

эфирного масла от фазы развития п. Сиверса (I-вегетация, 2-бутонизация, 3-цветение, 4-плодоношение)

это один из анализа

многомерных данных, позволяющий выделять в больших массивах данных скрытые переменные и анализировать связи,

существующие в изучаемой системе. Цель метода главных компонент -замена исходного описания образцов с помощью р переменных на новую форму, представленную в пространстве главных компонент (Эсбенсон, 2010).

На ГК-модели можно выделить отдельные области, отграниченные одна от другой и соответствующие разным фазам развития полыни Сиверса, что свидетельствует о том, что состав масла на разных фазах развития отличается по содержанию минорных соединений.

Таким образом, на разных фазах развития п. Сиверса качественный состав эфирного масла совпадает по константным и отличается по минорным соединениям.

Изучение по фазам развития растения показало, что наибольшее количество хамазулена в эфирном масле п. Сиверса концентрирует в фазы бутонизации и цветения, при этом накопление масла в фазу цветения больше чем в фазу бутонизации. Поэтому в указанные фазы мы изучили особенности аккумуляции эфирных масел в различных частях растения (рис. 7).

Исследование количества

О фаза бутонизации В фаза цветения

Рис. 7. Выход эфирного масла в различных частях п. Сиверса.

извлекаемого эфирного масла из разных частей растений в фазу цветения показало, что наибольшим выходом характеризуются соцветия (корзинки), несколько меньшим - листья, минимальным - стебли. В фазу

бутонизации в траве п. Сиверса больше всего содержится масла в бутонах, чуть меньше в листьях и минимальное количество масла в стеблях.

Анализ эфирного масла из разных частей растения выявил, что наиболее разнообразен компонентный состав масла, выделенного из соцветий и бутонов травы п. Сиверса - свыше 70 компонентов, затем из листьев - свыше 40 компонентов и меньше всего соединений в масле, выделенном из стеблей - около 20 компонентов. Константными компонентами образцов эфирного масла независимо от локализации являются 1,8-цинеол, линалоол, терпинеол-4, гермакрен 13, а-терпинеол, а-бисаболол и хамазулен (табл. 5).

Таблица 5

Константные компоненты эфирного масла полыни Сиверса

компоненты содержание компонентов в % от цельного масла

фаза цветения фаза бутонизации

соцветия листья стебли бутоны листья стебли

1,8-цинеол 8.00 6.39 6.04 1.94 + 23.41

линалоол 5.93 1.38 0.65 + + 3.83

терпинеол-4 2.56 2.10 0.57 0.88 + 5.37

а-терпинеол 2.39 2.10 0.82 1.44 + 4.66

гермакрен Э 7.20 7.81 1.96 11.18 7.81 10.57

а-бисаболол 2.28 1.25 1.66 5.24 10.93 5.86

хамазулен 6.23 23.02 37.11 7.81 21.17 3.51

Проведенный анализ показал, что в разных районах произрастания, на разных фазах развития и в различных частях п. Сиверса качественный состав эфирного масло совпадает по константным и отличается по спорадически появляющимся соединениям.

Эфирное масло травы полыни однолетней. Также как и в первом случае выделение эфирного масла проведено фармакопейным методом №2. Химический состав эфирных масел п. однолетней представлен 40 компонентами. Константными компонентами являются артемизиа кетон (10.24-14.62%), кариофиллен (9.93-10.71 %), гермакрен В (3.53- 7.82%), р-селинен (21.75-29.46 %), окись кариофиллена (4.44-14.31 %) (рис. 8).

На разных фазах развития растения из травы полыни однолетней извлекается от 0.5 до 0.7 % эфирного масла. Наибольший выход эфирного масла в фазу цветения (0.7 %) (рис.9).

На всех стадиях развития растения в эфирном масле содержится артемизиа кетон, кариофиллен, (3-селинен, окись кариофиллена. Количественное содержание основных компонентов на разных фазах развития растения изменяется. Содержание артемизиа кетона наибольшее в фазу плодоношения, Р-селинена - в фазу вегетации, кариофиллена и оксида кариофиллена - в фазу цветения.

основное компоненты ЭМ: {- «ртюшкя кетож I - карвофнллен

3 -гермакреиД

4 -р-с&тамм

$ - окнсь карнофнллеви

Рис.

3. Хроматограмма эфирного масла п. однолетней.

—

1 11 1

1 1

Рис. 9. Выход эфирного масла п. однолетней на разных фазах развития растения (в-вегетация, б-бутонизация, ц-цветение, п-плодоношение).

Эфирномасличные железы распределены в растении неравномерно, поэтому из разных частей растения могут быть выделены эфирные масла, различающиеся и количественно, и качественно.

Определены особенности аккумуляции эфирных масел в фазу цветения в различных частях полыни однолетней (рис. 10).

В эфирных маслах из разных частей растения обнаружено свыше 60 соединений. Константными

компонентами для масел из соцветий, листьев, стеблей являются - артемизиа спирт, р-кариофиллен, окись

кариофиллена, р-селинен.

Основной компонент эфирного масла п. однолетней - артемизиа кетон - не обнаруживается в масле из стеблей, хотя в масле из соцветий составляет половину (49.14 %) и почти треть из листьев (29.76 %).

Проведенный анализ эфирных масел показал, что в разных районах произрастания, на разных фазах развития и в различных частях травы п. однолетней, так же, как и траве п. Сиверса, качественный состав эфирного масла одинаков по константным и отличается по спорадически появляющимся компонентам.

Разработка методики количественного определения артемизинина в полыни однолетней методом ВЭЖХ-МС

Подбор условий количественного извлечения артемизинина из полыни однолетней. Для разработки методики количественного

1 2 з Рис. 10. Выход эфирного масла в различных частях п. однолетней (1-соцветия, 2-листья, 3-стебли).

определения артемизинина в траве п. однолетней были подобраны условия экстракции, при которых извлечение артемизинина достигает максимального значения. Были проанализированы извлечения, полученные методами - мацерацией, УЗ-зкстракцией и докритической С02-экстракцией. В качестве экстрагентов использовали различные растворители (табл. 6). Содержание артемизинина в экстрактах, выделенных УЗ-экстракцией и мацерацией, с использованием различных растворителей существенно не отличается (0.038-0.040 %). Наибольшее количество артемизинина (0.054%) содержится в извлечении, полученном при докритической С02-экстракции.

Таблица 6

Методы и параметры извлечения экстрактов из травы полыни однолетней различными экстракционными методами ______

метод экстракции экстрагент время экстракциии /параметры экстракции содержание артемизинина в %, в пересчете на а.с.с.

этанол 24 ч./соотношение сырье: растворитель (1:5), Т=25°С 0.040±0.002

Мацерация этанол 48 ч./ соотношение сырье: растворитель (1:5), Т=25°С 0.038±0.002

гексан 24 ч./соотношение образец: растворитель (1:5), Т=25°С 0.039±0.002

этилацетат 15 мин./ соотношение сырье: растворитель (1:5), частота озвучивания 50 КГц, Т=25°С 0.022±0.001

этанол 5 мин./ соотношение сырье: растворитель (1:5), частота озвучивания 50 КГц, Т=25°С 0.022±0.001

УЗ- эксгракция этанол 10 мин./ соотношение сырье: растворитель (1:5), частота озвучивания 50 КГц, Т=25°С 0,024±0,001

этанол 15 мин./ соотношение сырье: растворитель (1:5), частота озвучивания 50 КГц, Т=25С,С 0.039±0.002

этанол 20 мин./ соотношение сырье: растворитель (1:5), частота озвучивания 50 КГц, Т=25°С 0.039±0.002

со2- экстракция С02 24 ч.1 скорость потока 30 л/ч, Т=20-22°С, Р=6.0-6.2МПа 0.054±0.003

Из всех предложенных способов извлечения оптимальной является УЗ-экстракция (экстрагент этанол), так как данный метод экспрессный (время экстракции 15 мин.) и доступный по аппаратурному оформлению.

Методика количественного определения артемизинина.

Разработка методики количественного определения артемизинина в траве п. однолетней проведена методом ВЭЖХ-МС. В работе использовали ВЭЖХ «Agilent 1200» с MC - детектором («ионная ловушка») 6330, способ ионизации - электроспрей. Элюирование проводили в изократическом режиме (50%(А):50%(Б)), состав стартового буфера (А) -водный раствор муравьиной кислоты (рН=3)+2мл насыщенного раствора ацетата аммония, элюирующего буфера (Б) - 100% ацетонитрил. Объемная скорость потока элюента-0,5 мл/мин, объем вводимой пробы -25 мкл. Регистрация ионов проводилась в режиме мониторинга положительно-заряженных ионов (SRM) с массой 300 (за счет присоединения к молекуле артемизинина иона NrH4+), ширина окна (299301) m/z. Подтверждение полученных результатов проводили методом тандемной-масс-спектрометрии, из родительского иона (MS) с массой 300 m/z получали дочерний ион (MS2) с массой 223 m/z.

Совпадение времен удерживания и масс-спектров артемизинина, определяемого в траве п. однолетней с применением раствора СО указанного соединения позволяет сделать вывод об идентичности содержащегося соединения чистому артемизинину (рис.11,12).

Рис. 11. Хроматограмма СО артемизинина и экстракта п. однолетней.

»«I--^.„^а: •»«-.»

iv ix язтжяауат а к зс »

а) б)

Рис.12. Масс-спектры а) артемизинина, содержащегося в траве п. однолетней,б) СО артемизинина.

При хромато-масс-спектрометрическом определении для количественного анализа применяли способ расчета по абсолютной градуировке. Для определения коэффициента градуировочного графика готовили несколько (не менее 20) калибровочных растворов артемизизинина. Приготовление растворов проводили следующим образом: взвешивали 5*10"3 г артемизинина, помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляли 25 мл ацетонитрила. Содержимое колбы

тщательно перемешивали до полного растворения, после чего объем в колбе доводили до метки дистилированой водой. Проводили анализ при различном объеме вводимой пробы от 1 до 40 мкл. Измеряли площадь пиков на хроматограммах. По полученным данным строили градуировочный график (рис. 13). На оси ординат откладывали значения площади пика, а на оси абсцисс - соответствующие значения содержания артемизинина (г).

Из полученных данных рассчитали коэффициент градуировочного графика: к=Б/х, где к - коэффициент градуировочного графика, 5 -площадь пика анализируемого раствора, х - содержание артемизинина (г)

Коэффициент градуировочного графика (к) определяют как среднее арифметическое значение коэффициентов к,.

Рис. 13. Градуировочный график для определения содержания артемизинина.

Содержание артемизинина в экстракте полыни однолетней определяли по формуле: С =5 / к, где 5 - площадь пика артемизинина в анализируемом растворе, к - коэффициент градуировочного графика. Метрологические данные по определению коэффициента градуировочного графика (к) приведены в таблице 7.

Таблица 7

Метрологические характеристики расчета коэффициента градуировочного графика артемизинина

1 X Э2 Э Р ЮУ) Дх Е,%

19 1.32* 10м 1.84* О15 4.25*10" 95 2.09 1.28*10" 1.97 1.90*10"

Результаты количественного определения артемизинина в экстракте полыни однолетней представлены в таблице 8.

Таблица 8

Результаты количественного определения артемизинина в экстракте полыни однолетней методом ВЭЖХ-МС

Метрологические характеристики (п = 5, Р = 95%)

Х% Б2 5 Дх Е,%

0.039 0.75*10"' 0.27*10"2 2.57 0.83*10° 1.21 0.12*10"'

Разработанным методом определили количественное содержание артемизинина в траве п. однолетней в фазу цветения (табл. 9). Методика валидирована - подтверждена специфичность, прецизионность.

Таблица 9

Содержание артемизинина в траве полыни однолетней

район и дата сбора содержание артемизинина (%)

Иволгинский р-н, 10 км от п. Сотниково, 12.08.2010 0.054±0.003

Иволгинсхий р-н, 10 км от п. Сотниково, 22.08.2011 0.027^.001

Иволгинский р-н, окр. с. Иволга, 19.08.2011 0.069±0.004

Кабанский р-н, окр. с. Таракановка, 22.08.2011 0.023±0.001

В образцах, собранных в Иволгинском районе, в окрестностях с. Иволга содержится наибольшее количество артемизинина (0.069%), наименьшее - в образцах из Кабанского района, окр. с. Таракановка (0.023%). Установлено, что наибольшее количество артемизинина растение концентрирует в фазу цветения - 0.039%, наименьшее - в фазу вегетации и бутонизации - от 0.006 до 0.007%. В соцветиях артемизинина содержится - 0.029%, в листьях чуть меньше - 0.021%, а в стеблях минимальное количество - 0.007% (табл. 10).

Таблица 10

Содержание артемизинина в' траве полыни однолетней в зависимости от фазы вегетации, в различных частях растения

содержание артемизинина (%)

фаза развития часть растения

вегетации бутонизации цветения листья соцветия стебли

0.006±0.0002 0.007±0.0002 0.039±0.003 0.021±0.001 0.029±0.002 0.007±0.0002

Таким образом, оптимальным временем сбора травы полыни однолетней является фаза цветения, причем, целесообразно собирать полностью надземную часть.

Все полученные результаты внесены в проекты ФС на траву полыни Сиверса и траву полыни однолетней.

Выводы

1. Выявлены основные диагностические признаки травы п. Сиверса и п. однолетней, разработаны числовые показатели, необходимые для стандартизации сырья. Определены запасы п. Сиверса и п. однолетней, произрастающей в разных районах Республики Бурятии.

2. Установлено содержание флавоноидов, жирных кислот, макро- и микроэлементов в траве п. Сиверса и в траве п. однолетней. Методом ВЭЖХ-МС в указанных растениях обнаружены флавоноиды - лютеолин-7-глюкозид, рутин, кверцетин и хризоэриол. Основными жирными кислотами в исследуемых видах полыней являются пальмитиновая, линолевая, линоленовая, в полыни однолетней также обнаружена в значительных количествах 10-октадекеновая кислота.

3. Установлено, что качественный состав эфирных масел растений остается постоянным независимо от места произрастания и фазы развития. Константными компонентами п. Сиверса являются 1,8-цинеол, терпинеол-4, гермакрен D, p-фарнезен, селина-4,11-диен, нерил-2-метилбутаноат и хамазулен, а п. однолетней - артемизиа кетон, кариофиллен, гермакрен D, р-селинен, окись кариофиллена. Накопление эфирного масла в фазу цветения больше (0.7 %), чем в фазу бутонизации (0.3 %). Наибольшее количество хамазулена п. Сиверса накапливает в фазы бутонизации (до 62 %) и цветения (до 34 %).

4. Определены условия извлечения артемизинина (тип экстрагента, метод экстракции, время экстракции) из травы п. однолетней и установлено, что максимальное извлечение артемизинина достигается при УЗ- и докригической С02-экстракции. Разработана и валидирована методика количественного определения артемизинина в п. однолетней методом ВЭЖХ-МС (относительная ошибка определения ±1.21 %). Установлено, что наибольшее количество артемизинина в траве п. однолетней накапливается в фазу цветения в соцветиях (0.039 %).

5. Разработаны нормативные документы на сырье - проект ФС «Трава полыни Сиверса» и проект ФС «Трава полыни однолетней».

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Жигжитжапова, C.B. Химический состав эфирного масла Artemisia gmelinii Web. et Stechm, произрастающей в Центральной Азии / C.B. Жигжитжапова, Т.Э. Соктоева, Л.Д. Раднаева И Химия растительного сырья.-2010.-№2.-С. 131-133.

2. Жигжитжапова, C.B. Химический состав эфирного масла полыни Сиверса Artemisia sieversiana Willd., произрастающей в Бурятии / С.В Жигжитжапова, Т.Э. Соктоева, Л.Д. Раднаева, В.В. Тараскин // Вестник Бурятского государственного университета. Сер. Химия-Физика. - 2009. -Вып. 3. - С. 69-71.

3. Жигжитжапова, C.B. Состав эфирного масла полыни Сиверса Artemisia sieversiana Willd., произрастающей в Бурятии и Иркутской области / С.В Жигжитжапова, Т.Э. Соктоева, Л.Д. Раднаева, В.В. Тараскин // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. - 2009. - №2 (66). -С. 103-105.

4. Жигжитжапова, С.В. Компонентный состав эфирного масла Artemisia sieversiana Willd. на разных фазах развития растения / С.В. Жигжитжапова, Т.Э. Соктоева, Л.Д. Раднаева // Бюллетень ВосточноСибирского научного центра СО РАМН. - 2011. - №1 (77). Часть 2. - С. 138-141.

5. Соктоева, Т.Э. Компонентный состав эфирного масла Artemisia glauca Pall, ex Willd. флоры Монголии / Т.Э. Соктоева, С.В Жигжитжапова, Л.Д.

Раднаева, B.B. Тараскин // Вестник молодых ученых. - Томск, 2011. -Вып. 2. - С. 27-30.

6. Соктоева, Т.Э. Химический состав эфирного масла Artemisia gmelinii Web. Et Stechm. / Т.Э. Соктоева // «Ломоносов-2009»: мат-лы XVI междунар. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых. - Москва, 2009. - С. 37.

7. Жигжитжапова, C.B. Эфирное масло полыни Гмелина флоры Бурятии и Монголии / C.B. Жигжитжапова, Т.Э. Соктоева, Л.Д. Раднаева // «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья»: мат-лы IV Всеросс. науч. конф. - Барнаул, 2009. - С. 49-50.

8. Соктоева, Т.Э. Компонентный состав эфирного масла полыни Сиверса Artemisia sieversiana Willd., произрастающей в Республике Бурятия / Т.Э. Соктоева, C.B. Жигжитжапова, Л.Д. Раднаева // «Технологии и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности»: мат-лы II Всеросс. научн. конфер. студентов, аспирантов и молодых ученых. - Бийск, 2009. - С. 91-93.

9. Павлова Э.Т. Хроматографическое разделение и количественное определение компонентов лекарственных препаратов методом ВЭЖХ / Т.Э. Соктоева, Т.А. Колодин // «Проблемы устойчивого развития региона»: мат-лы V школы-семинара молодых ученых России. - Улан-Удэ, 2009. - С. 222-223.

10. Zhigzhitzhapova, S.V. Comparative analysis of chemical compositions of Artemisia L., growing in Central Asia / S.V. Zhigzhitzhapova, Т.Е. Soktoeva, L.D. Radnaeva, O. Grahl-Nilsen // « Modem Methods of Data Analysis» Seventh Winter Simposium on Chemometrics. - Saint-Petersburg, 2010. - P. 82-83.

11. Соктоева, Т.Э. Сравнительный анализ состава эфирных масел полыней рода Artemisia L., произрастающих в Центральной Азии / Т.Э. Соктоева // «Экологобезопасные и ресурсосберегающие технологии и материалы»: мат-лы регион, молодежной научн. конф. с междунар. участием. - Улан-Удэ, 2010.-С. 109-110.

12. Жигжитжапова, C.B. Эфирные масла полыней рода Artemisia L. / C.B. Жигжитжапова, Т.Э. Соктоева, Л.Д. Раднаева // «Развитие традиционной медицины в России: опыт, научные исследования, перспективы»: мат-лы научн. конф. с междунар. участием. - Улан-Удэ, 2010. - С. 405-407.

13. Соктоева, Т.Э. Состав эфирного масла полыни Сиверса Artemisia sieversiana Willd. / Т.Э. Соктоева, C.B. Жигжитжапова, Л.Д. Раднаева // «Актуальные исследования Байкальской Азии»: мат-лы междунар. научн. конф,- Улан-Удэ, 2010. - С. 309-312.

14. Бадмаева, Е.Е. Компонентный состав эфирного масла Artemisia macrocephala Jacq. ex Bess., произрастающей в Монголии / Е.Е. Бадмаева,

Т.Э. Соктоева // «Экология России и сопредельных территорий»: мат-лы XV междунар. экологической конф. - Новосибирск, 2010. - С. 325.

15. Бадмаева, Е.Е. Компонентный состав эфирного масла Artemisia annua / Е.Е. Бадмаева, Т.Э. Соктоева, C.B. Жигжитжапова, Л.Д. Раднаева // «Экологобезопасные и ресурсосберегающие технологии»: мат-лы Всеросс. молодежной конфер. с междунар. участием. - Улан-Удэ, 2011. -С. 156-157.

16. Соктоева, Т.Э. Экстракция артемизинина из полыни однолетней Artemisia annua L. / Т.Э. Соктоева, Г.Л. Рыжова, К.А. Дычко, В.В. Хасанов, C.B. Жигжитжапова, Л.Д. Раднаева // «Приоритеты и особенности развития Байкальского региона»: мат-лы V междунар. научн. конф. - Улан-Удэ, 2011. - С. 127-128.

17. Жигжитжапова, C.B. Химический состав Artemisia annua L. / C.B. Жигжитжапова, Т.Э. Соктоева, Л.Д. Раднаева // «Растительность Байкальского региона и сопредельных территорий»: мат-лы Всеросс. научн. конф. - Улан-Удэ, 2011. - С. 152-153.

Список сокращений:

ААС атомно-абсорбционная спектрофотометрия

а.с.с. абсолютно-сухое сырье

БАВ биологически активные вещества

БЗ биологические запасы

БХ бумажная хроматография

ВОЗ Всемирная организация здравоохранения

ВЭЖХ-МС высокоэффективная жидкостная хроматография масс-

спектрометр ия

ГФ Государственная Фармакопея

ПХ-МС газо-хромато-масс-спектрометрия

мгк метод главных компонент

окр. окрестности

СО стандартный образец

тех тонкослойная хроматография

УФ ультрафиолетовый

ЭЗ эксплуатационные запасы

SRM Select Reaction Monitoring

Благодарности

Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю -д.х.н., проф. Раднаевой Л.Д., а также к.б.н., доценту, с.н.с. Байкальского института природопользования СО РАН Жигжитжаповой C.B., д.х.н., почетному проф. Томского государственного университета Рыжовой Г.Л. за помощь и поддержку в подготовке диссертационной работы.

Подписано в печать 21.11.2011 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Объем 1,5печ. л. Тираж 100. Заказ № 67.

Отпечатано в типографии Изд-ва БНЦ СО РАН. 670047 г. Улан-Удэ ул. Сахьяновой, 6.

Оглавление диссертации Соктоева, Туяна Эрдэмовна :: 2011 :: Улан-Удэ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Современное состояние исследований по изучению рода Artemisia L.

1.1. Ботаническая характеристика полыни Сиверса и полыни 12 однолетней

1.2. Эфирные масла и природные азулены растений рода Полынь

1.2.1. Химический состав эфирных масел и природных азуленов 14 растений рода Полынь

1.2.2. Применение эфирных масел растений рода Полынь в медицине

1.2. Артемизинин: открытие, строение и синтез, физико-химические 31 свойства, механизм противоплазмодиевого действия

1.3. Жирнокислотный состав растений рода Полынь

1.4. Фенольные соединения растений рода Полынь

1.5. Элементный состав растений рода Полынь 38 ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ

ГЛАВА 2. ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ И МЕТОДОВ 41 ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования, образцы сырья - травы полыни Сиверса и 41 травы полыни однолетней

2.2. Методы исследования

2.2.1. Биологические методы исследования

2.2.1.1. Анатомо-диагностическое изучение

2.2.1.2. Ресурсные исследования

2.2.2. Методы качественного и количественного определения 43 биологически активных веществ

2.2.3. Товароведческий анализ: методы установления 50 доброкачественности сырья

2.2.4. Методы статистической обработки. Метод главных компонент.

ГЛАВА 3. ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ТРАВЫ ПОЛЫНИ 53 СИВЕРСА

3.1. Микроскопический анализ травы полыни Сиверса

3.2. Запасы полыни Сиверса

3.3. Исследование основных БАВ травы полыни Сиверса

3.3.1. Качественное и количественное содержание компонентов 64 эфирного масла полыни Сиверса

3.3.1.1. Химический состав и динамика накопления эфирного масла и 64 хамазулена в траве полыни Сиверса в различных районах Бурятии

3.3.1.2. Особенности аккумуляции эфирного масла и хамазулена в траве 65 полыни Сиверса на разных фазах развития растения

3.3.1.3. Накопление минорных компонентов эфирного масла травы 71 полыни Сиверса

3.3.1.4. Особенности аккумуляции эфирного масла и хамазулена в траве 72 полыни Сиверса из разных частей растения

3.3.2. Качественное и количественное содержание флавоноидов и дубильных веществ в траве полыни Сиверса

3.3.3. Жирнокислотный состав травы полыни Сиверса

3.3.4. Элементный состав травы полыни однолетней ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ

ГЛАВА 4. ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ТРАВЫ ПОЛЫНИ 83 ОДНОЛЕТНЕЙ

4.1. Микроскопический анализ травы полыни однолетней

4.2. Запасы полыни однолетней

4.3. Исследование основных БАВ травы полыни однолетней

4.3.1. Качественное и количественное содержание компонентов эфирного масла в траве полыни однолетней

4.3.1.1. Химический состав и динамика накопления эфирного масла в 92 траве полыни однолетней из разных мест произрастания

4.3.1.2. Особенности аккумуляции эфирного масла в траве полыни ^ однолетней на разных фазах развития и в различных частях растения

4.3.2. Качественное и количественное определение флавоноидов травы 100 полыни однолетней

4.3.3. Жирнокислотный состав травы полыни однолетней ^ ® *

4.3.4. Элементный состав травы полыни однолетней

4.4. Разработка методики количественного определения артемизинина в 103 траве полыни однолетней методом ВЭЖХ-МС

4.4.1. Подбор условий количественного извлечения артемизинина из 103 полыни однолетней

4.4.2. Разработка методики количественного определения артемизинина 104 методом ВЭЖХ-МС

4.4.3. Количественное содержание артемизинина в полыни однолетней из разных мест произрастания

4.4.4. Анализ количественного содержание артемизинина в траве 107 полыни однолетней на разных фазах развития и в различных' частях растения

ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ

ГЛАВА 5. УСТАНОВЛЕНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ 111 ДОБРОКАЧЕСТВЕННОСТИ СЫРЬЯ

5.1. Морфометрические показатели сырья

5.2. Стандартизация травы полыни Сиверса

5.2.1. Товароведческие показатели травы полыни Сиверса !

5.2.2. Стандартизация травы полыни Сиверса по содержанию 115 хамазулена в составе эфирного масла

5.2.3. Установление срока годности травы полыни Сиверса

5.3. Стандартизация травы полыни однолетней ^ ^ ^

5.3.1. Товароведческие показатели травы полыни однолетней *' ^

5.3.2. Стандартизация травы полыни однолетней по содержанию артемизинина

5.3.3. Установление срока годности травы полыни однолетней

ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ

Введение диссертации по теме "Фармацевтическая химия, фармакогнозия", Соктоева, Туяна Эрдэмовна, автореферат

Актуальность темы. Растения рода Artemisia (Полынь) -перспективные источники биологически активных веществ, такие виды как полынь эстрагон Artemisia dracunculus L., полынь горькая Artemisia absinthium L., полынь обыкновенная Artemisia vulgaris L. широко используются в народной, традиционной медицине и пищевой промышленности. Полынь однолетняя Artemisia annua L. успешно введена в культуру во многих странах и в 2001 году была рекомендована ВОЗ как основной источник артемизинина - средства первой линии терапии для борьбы с малярией. На сегодняшний день страны, производящие артемизинин, обеспечивают около четверти потребности мирового здравоохранения [1, 2]. Из п. однолетней выделено 137 биологически активных соединений, в том числе 40 сесквитерпенов, 10 тритерпенов, 7 кумаринов, 46 флавоноидов, которые могут послужить основой для разработки лекарственных препаратов [3]. В 80-х годах XX века группой ученых [4] были предприняты попытки культивирования дикорастущей п. однолетней флоры СССР в ВИЛР (г. Москва). В наши дни крупные работы по интродукции п. однолетней проводятся в Томском государственном университете. В Бурятии п. однолетняя является дикорастущим видом.

Наряду с п. однолетней в Бурятии широко распространена полынь Сиверса Artemisia sieversiana Willd., которая также • является перспективным для здравоохранения видом. В траве п. Сиверса содержатся флавоноиды, эфирное масло, кумарины [5-8]. Эфирное масло п. Сиверса представляет интерес как источник хамазулена - нетоксичного соединения, обладающего противовоспалительным, бактерицидным, регенераторным действием [9, 10].

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Выявить анатомо-диагностические признаки надземной части п. Сиверса и п. однолетней, установить товароведческие показатели сырья, оценить запасы и возможность заготовки п. однолетней и п. Сиверса на территории республики Бурятия;

3. Разработать методику количественного определения артемизинина в надземной части п. однолетней;

Проведено изучение химического состава травы п. Сиверса и травы п. однолетней. Определено содержание эфирных масел, флавоноидов, жирных кислот, макро- и микроэлементов. Методом ВЭЖХ-МС в указанных растениях обнаружены флавоноиды - лютеолин-7-глюкозид, рутин, кверцетин и хризоэриол. Основными жирными кислотами в исследуемых видах полыней являются пальмитиновая, линолевая, линоленовая, в полыни однолетней также обнаружена в значительных количествах 10-октадекеновая кислота.

Установленные показатели качества БАВ внесены в нормативные документы.

Проведена стандартизация сырья, разработаны проекты ФС - «Трава полыни Сиверса» и «Трава полыни однолетней».

Работа выполнена в рамках исследований по проектам: РФФИ: №08-04-90202-Монга «Исследование биогенетических закономерностей биосинтеза биологически активных соединений эндемичных растений Центральной Азии» (2008-2009гг.), №08-04-9803 7-рсибирьа и

Химический состав растений как индикатор состояния экосистем Байкальского региона» (2008-2010гг.); междисциплинарный интеграционный проект №93 «Развитие исследований в области медицинской химии и фармакологии как научной основы разработки отечественных лекарственных препаратов»; совместный проект с академией наук Монголии «Получение новых липо- и наносомальных форм лекарственных средств с использованием природного сырья»; РФФИ: № 10-03-16001-мобзрос «Мобильность молодых ученых» (2010г.), №11-03-90705-мобст научная работа (стажировка) молодых российских ученых в ведущих научных организациях Российской Федерации 2011 (2011г.).

На защиту выносятся:

• результаты химического изучения биологически активных веществ и их сезонной динамики накопления;

• результаты исследований по стандартизации надземной части п. Сиверса и п. однолетней.

Заключение диссертационного исследования на тему "Фармакогностическое исследование Artemisia annua L. и Artemisia sieversiana Willd. флоры Бурятии"

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. . Выявлены основные диагностические признаки травы п. Сиверса и п. однолетней, разработаны числовые показатели, необходимые для стандартизации сырья. Определены запасы п. Сиверса и п. однолетней, произрастающей в разных районах Республики Бурятии.

3. Установлено, что качественный состав эфирных масел растений остается постоянным независимо от места произрастания и фазы развития. Константными компонентами п. Сиверса являются 1,8-цинеол, терпинеол-4, гермакрен Б, [3-фарнезен, селина-4,11-диен, нерил-2-метилбутаноат и хамазулен, а п. однолетней - артемизиа кетон, кариофиллен, гермакрен Б, {3-селинен, окись кариофиллена. Накопление эфирного масла в фазу цветения больше (0.7 %), чем в фазу бутонизации (0.3 %). Наибольшее количество хамазулена п. Сиверса накапливает в фазы бутонизации (до 62 %) и цветения (до 34 %).

4. Определены условия извлечения артемизинина (тип экстрагента, метод экстракции, время экстракции) из травы п. однолетней и установлено, что максимальное извлечение артемизинина достигается при УЗ- и докритической С02-экстракции. Разработана и валидирована методика количественного определения артемизинина в п. однолетней методом ВЭЖХ-МС (относительная ошибка определения ±1.21 %). Установлено, что наибольшее количество артемизинина в траве п. однолетней накапливается в фазу цветения в соцветиях (0.039 %).

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2011 года, Соктоева, Туяна Эрдэмовна

1. Толстикова, Т.Г. Лекарства из растительных веществ / Т.Г. Толстикова, А.Г. Толстиков, Г.А. Толстиков. Новосибирск, 2010. - 215 с.

2. Xiao, Wang A combination of ultrasonic-assisted extraction with RRLC-QQQ method for the determination of artemisinin in the Chinese herb Artemisia annua L. / Wang Xiao, Zhao Xian-en, Yang Bin et al. // Phytochem. Anal. 2011. - 22. -P. 280-284

3. Bhakuni, R.S. Secondary metabolites of Artemisia annua and their biological activity / R.S. Bhakuni, D.C. Jain, R.P. Sharma // Current science. 2001. -Vol. 80. № 1.-P. 35-48

4. Шретер, А.И. Содержание артемизинина в Artemisia annua L. / A.M. Шретер, K.C. Рыбалко, O.A. Коновалова и др. // Растительные ресурсы. -1989.-Вып. 1.-С. 66-72.

5. Ткачев, А.В. Изменение состава эфирного масла при разных сроках хранения сырья / А.В. Ткачев // Химия растительного сырья. 2002. №2. -С. 19-30.

6. Shatar, S. Chemical investigation of essential oil from Mongolian flora / S. Shatar. Ulaan-Baatar, 1998. - 166 p.

7. Ханина, M.A. // Полыни Сибири и Дальнего Востока (фармакогностическое исследование и перспективы использования в медицине): автореф. дис. . док. фарм. наук-Пермь, 1999. 46с.

8. Березовская, Т.П. Полыни Сибири: систематика, экология, химия, хемосистематика, перспективы использования / Т.П. Березовская, В.П. Амельченко, И.М. Красноборов и др. Новосибирск, 1991. - 125с.

9. Ханина, M.А. Эфирные масла полыней секции Absinthium DS / М.А. Ханина, Е.А. Серых, Т.П. Березовская и др. // Химия природных соединений. 1992. - №2-С. 283-284.

10. Гроссгейм, A.A. К вопросу о географическом изобретении системы цветковых растений / A.A. Гроссгейм // Сов. бот. 1945. - Т. 13. №3.

11. Гроссгейм, A.A. К вопросу о географическом изображении характера эволюции на филогенетичских схемах / A.A. Гроссгейм // Бот. журн. -1948. -Т.З. №4.

12. Тахтаджян, АЛ. Происхождение и расселение цветковых растений / A.JI. Тахтаджян. JI.: Наука, Ленинград, отделение, 1970.

13. Горяев, М.И. Химический состав полыней / М.И. Горяев, B.C. Базалицкая, П.П. Поляков. Алма-Ата, 1962.- 152 с.

14. Поляков, П.П. Род Полынь Artemisia L. / П.П. Поляков //Флора СССР. -М.-Л., 1961. - Т.26. - С.125-630.

15. Шишкин, Б.К. Флора Западной Сибири (руководство к определению западно-сибирских растений) / Б.К. Шишкин, Л.П. Сергиевская. Томск, 1949.-С. 2803-2804.

16. Намзалов, Б.Б. Род полынь. Определитель растений Бурятии / Б.Б. Намзалов, под ред. Аненхонова O.A. Улан-Удэ, 2001. - 533 с.

17. Атажанова, Г.А. Развитие фитохимии и перспективы создания новых лекарственных препаратов / Г.А. Атажанова. Караганда, 2006. - С. 18.

18. Божко, В.Г. Малярия: диагностика, лечение, профилактика / В.Г. Божко, Е.А. Иоанниди, В.Ф. Обехов, Ф.С. Искулов // Научно-информационный журнал 2010. 6(38). - С. 23-28.

19. Шатар, С. Эфироносные растения бассейна реки Селенга / С. Шатар, Н.В. Бодоев, C.B. Жигжитжапова, Ш. Алтанцэцэг, Б.Б. Намзалов. Улан-Удэ: Бурятский госуниверситет, 2006. - 134 с.

20. Красноборов, И.М. Род Artemisia L. Флора Сибири / И.М. Красноборов. -Новосибирск, 1997. Т. 13. - С. 90-14.

21. Горяев, М.И. Эфирные масла флоры СССР / М.И. Горяев. Алма-Ата, 1951.-541 с.

22. Кагарлицкий, А.Д. Сесквитерпеновые лактоны растений Центрального Казахстана / А.Д. Кагарлицкий, С.М. Адекенов, А.Н. Куприянов. Алма-Ата, 1987.- 188 с.

23. Прибыткова, JI.H. Флавоноиды растений рода Artemisia / JI.H. Прибыткова, С.М. Адекенов. Алматы, Гылым, 1999. - 180 с.

24. Гринкевич, Н.И. Химический анализ лекарственных растений /' Н.И. Гринкевич, Л.Н. Сафронович. М.: Высшая школа, 1983. - 176 с.

25. Семенов, A.A. Очерки химии природных соединений / A.A. Семенов. -Новосибирск: Наука, 2000. 664 с.

26. Племенков, В.В. Введение в химию природных соединений / В.В. Племенков. Казань, 2001. - 376 с.

27. Саратиков, A.C. Противовоспалительные свойства эфирных масел тысячелистника азиатского и некоторых видов полыней / A.C. Саратиков, Т.П. Прищеп, А.Н. Венгеровский и др. // Химико-фармацевтический журнал. 1986. - Т.20. № 5. - С.585-588.

28. Атажанова, Г.А. Эфирные масла растений рода Artemisia L. свойства и применение / Г.А. Атажанова // Развитие фитохимии и перспективы создания новых лекарственных препаратов. Караганда, 2006. - С. 18-37.

29. Gordon, M. The azulens / M. Gordon // Chem. Revs. 1952. 50. - P. 127-200.

30. Рыбалко, К.С. Природные секвитерпеновые лактоны / К.С. Рыбалко. М.: Медицина, 1979. - 320 с.

31. Ruzhichka, L. Helv. chim. Acta / L. Ruzhichka, E.A. Rudolph. 1926. - 9. -131 p.

32. Yamaguchi, H.Excited-state dipole moments of azulene and 3,5 dimetyl-cyclopentae, f. heptalene / H.Yamaguchi, T. Ikeda, H. Mametsukaet // Bull. Chem. Soc. Jap. 1976. - Vol. 49. N 7. - P. 1762-1765.

33. Мочалин, В.Б. Успехи химии азулена / В.Б. Мочалин, Ю.Н. Поршнев // Успехи химии. T. XLVI. Вып. 6. - С. - 1002-1040.

34. Березовская, Т.П. Фармакогностическое изучение Artemisia jacutica Drob. / Т.П. Березовская, А.П. Цареградская, Е.А. Серых, Г.И. Калинкина // Растительные ресурсы. 1980. - Т. 16. - С. 54-60.

35. Березовская, Т.П. Сибирские виды полыней в народной медицине растительные ресурсы Южной Сибири, их рациональное использование и охрана / Т.П. Березовская, Е.А. Серых. Томск: изд-во Томского университета, 1982. - С. 60-65.

36. Березовская, Т.П. Полынь Сиверса полноценный заменитель полыни горькой / Т.П. Березовская, В.И. Великанова, Р.П. Уралова //Некоторые вопросы фармакогнозии дикорастущих и культивируемых растений Сибири.-Томск, 1969.-С. 86-89.

37. Маркова, J1.H. Химическая изменчивость полыни Сиверса / JI.H. Маркова, М.В. Назаренко // Актуальные проблемы изучения эфирномасличных растений и эфирных масел. Кишинев, 1980. - С. 138.

38. Lemberkovics Е. Artemisia absinthium L. illolajanak nehany fitokemial sajatsaga / E. Lemberkovics, G. Verzar-Petry, G. Szabo, M. Bihari // Herba Hungarica. 1982. - T. 2. N 2-3. - C. 197-215.

39. Berteiii, D.J. Naturally occuring fulvene hydrocarbons / DJ. Bertelli, J.N. Grabtree // Tetrahedron. 1968. - Vol. 24. N 5. - P. 2079-2089.

40. Коновалов, Д.А. Природные азулены / Д.А. Коновалов // Растительные ресурсы. 1993. - Т. 31. В.1. - С. 101-131.

41. Philip, R. The azulenes in essential oils / R. Philip // Pharmac. J. 1957. Vol. 179. N4895. - P. 135.

42. Thieme, H. Die azulenbildnesdes Kamille, der Schafgarbe und des Wermuts / H. Thieme // Planta med. 1958. Vol. 6. N 1. - P. 70-77.

43. Хельброннер, Е. Азулены / Е. Хельброннер пер. с англ. // Небензоидные ароматические соединения. М., 1963. - С. 176-278.

44. Поршнев, Ю.Н. Полициклические азуленоидные системы / Ю.Н. Поршнев, В.Б. Мочалин, М.И. Черкашин // Успехи химии. 1982. - Т. 51. № 11.-С. 1897-1934.

45. Поршнев, Ю.Н. Псевдоазулены как 7г-изоэлектронные аналоги азулена / Ю.Н. Поршнев, В.А. Чуркина, М.И. Черкашин // Успехи химии. 1987. -Т. 56. №1,-С. 95-127.

46. Фойстель, Л. Методы определения гвайазулена и его устойчивость в косметических изделиях / Л. Фойстель // IV Междунар. конгресс по эфирным маслам. Тбилиси, 1968. - Т.1. - С. 377-381.

47. Sorm, F. A further chamazulene precursor: The bitter principle of Artemisia absinthium L. / F. Sorm, L. Novotny, V. Herout // Chem and Ind. 1955. - N 20. -P. 596.

48. Novotny, L. Plant substances: The composition of Artemisia sieversiana Willd. / L. Novotny, Y. Herout // Collect. Szech. Chem. Communs. 1962. - Vol. 27. N. 6. - P. 1508-1510.

49. Marco, J.A. Natural products from the genus of Artemisia L. / J.A. Marco, O. Barbera // Stud. Nat. Prod. Chem. Amsterdam etc., 1990. - Vol. 7. pt A. -P. 201-204.

50. Beauhaire, J. Structure of absintolide, a new qualanolide dimmer of Artemisia absinthium L. / J. Beauhaire, J.L. Forrey, E. Guittef // Tetrahedrom Lett. 1984. -N26.-P. 2751-2754.

51. Адекенов, C.M. Артаусин новый сесквитереновый лактон из Artemisia austriaca / C.M. Адекенов, K.A. Айтуганов, Н.И. Головцов // Химия природных соединений. - 1987. - № 1. - С. 148-149.

52. Танасиенко, Ф.С. Эфирные масла. Содержание и состав в растениях / Ф.С. Танасиенко. Киев: Наукова Думка, 1985. - 264 с.

53. Балковая, М.Н. Физиолого-биохимическая характеристика эфирномасличных растений / М.Н. Балковая. Днепропетровск: «Днепропетровский государственный университет», 1958. - 184 с.

54. Денисова, Г. А. Распределение в растительном мире терпеноидсодержащих вместилищ / Г.А. Денисова // Бот. журнал. 1976. -№ 11.-С. 1489-1505.

55. Ханина, М.А. Атлас анатомических признаков полыней / М.А. Ханина, Е.А. Серых, В.П. Амельченко. Томск, 1999.

56. Атажанова, Г.А. Терпеноиды эфирных масел и экстрактов полыни. Автореф. дисс.канд. хим. наук. Караганда, 1999. - 22 с.

57. Валджи, X. Ароматерапия / X. Валджи. Ростов-на Дону, 1997. - 353 с.

58. Войткевич, С.А. Эфирные масла для парфюмерии и ароматерапии / С.А. Войткевич. Москва: Пищевая промышленность, 1999. - 267 с.

59. Arino, A. Essential oil of Artemisia absinthium L. from the Spanish Pyrenees / A. Arino, J. Arberas, C. Renobales et al. // J. of Essent. Oils Res. 1999. - 11. №2. -P. 182.

60. Nin, St. Quantitative Determination of Some Essential Oil Componends of Selected Artemisia absinthium Plants / St. Nin, P. Arfaioli, M. Bosseto // J. of Essent. Oils Res. 1995. - №7. - P. 271.

61. Burits, M. The antioxidant activity of the Essentials Oils of Artemisia afra, Artemisia abyssinica and Jupenirus procera / M. Burits, K. Asters, F. Bucar // Phytoterapy Res. 2001. № 15. - P. 103.

62. Graven, E.H. Antimicrobal and antioxidative properties of the volatile oil Artemisia afra Jacq. / E.H. Graven, S.G. Deans, K.P. Svoboda et al. // Flavour and Fragrance. 1992. - №3. - P. 12.

63. Gundidza, M. Antifungal activity of essential oil from Artemisia afra Jacq. / M. Gundidza // Central African Journal of Medicine. 1993. - 39. №7. - P. 140.

64. Горяев, М.И. Растения, обладающие противоопухолевой активностью / М.И. Горяев, Ф.С. Шарипова. Наука: Алма-Ата, 1983. - С. 171-172.

65. Tan, R.X. Biologically active substances from the genus Artemisia / R.X. Tan, W.F. Zheng, H.Q. Tang // Planta Med. 1998. - 64. - P. 295.

66. Макарчук, Я.М. Применения фитонцидов для санации воздуха закрытых помещений / Я.М. Макарчук, Я.С. Лещинская, В.В. Кривенко и др. // Тезисы докладов «Фитонциды. Бактериальные болезни растений». — Киев: Наукова думка, 1985.- С.143-144.

67. Бодруг, М.В. Антимикробные свойства эфирных масел Artemisia L. / М.В. Бодруг, Н.П. Марку, С.А. Бурцева, К.А. Панюшкин // Тез. докл. 3 Укр. конф. по мед. Бот. Киев, 1992. - С. 3-8.

68. Shanta, М. Antimicrobial activity of the essential oils of some Indian Artemisia species / M. Shanta, A.K.S. Ravant, S. Usha // Fitoterapia. 1993. - 64. №1. -P. 65-67.

69. Шретер, А.И. Изучение и использование лекарственных растительных ресурсов СССР / А.И. Шретер. Москва, 1964. - 154 с.

70. Бейсембаев, А.А. Токсическое и местно-раздражающие свойства эфирного масла полыни цитварной / А.А. Бейсембаев, В.А. Узбеков, К.Д. Рахимов и др. // Фарм. Бюллетень. 2001. - №5. - С. 18-19.

71. Полунов Я.М. О применении растительных препаратов в отиатрии. Фитонциды (биологическое значение, свойства и применение) / Я.М. Полунов, Г.А. Мустафаева. Киев: Наукова думка. 1973. — 215 с.

72. Сейдахметова, Р.Б. Противовоспалительные свойства эфирного масла Artemisia glabella Kar. et Kir. / Р.Б. Сейдахметова, P.H. Пак, А. А. Бейсенбаев и др. // Растительные ресурсы. 2002. - Вып. 1. - С. 102-107.

73. Зарубина, Л.А. Химический состав и антимикробная активность эфирного масла Artemisia glauca Pall. / Л.А. Зарубина, Г.И. Калинкина, А.Д. Дембицкий // Растительные ресурсы. 1993. - №3. - С. 70-74.

74. Yashphe, J. The antibacterial and antispasmodic activity of Artemisia herba alba Asso / J. Yashphe, I. Feuerstein, S. Barel, R. Segal // Int. J. Crude Drug Res. -1987. -№2.-P.89.

75. Charchari, S. In vitro antimicrobial activity of essential oils of Artemisia herba-alba and Artemisia judaica from Aljeria / S. Charchari, A. Dahoun, F. Bachi, A. Benslimani // Riviata Italiana Eppos. 1996. - №18. - P. 3.

76. Kishore, N. Antimicotyc activity of the essential oil of Artemisia nilagirica / N. Kishore, N.K. Dubey, J.P.N. Chansouria // Flavour Fragr. J. 2001. - 16. - P. 6163.

77. Ханина, M.A. Эфирное масло Artemisia rubripes / M.A. Ханина, E.A. Серых, Т.П. Березовская, В.А. Хан // Химия природных соединений. 1991. -№6.- С.859-860.

78. Swiader, К. Chemical composition of essential oil Artemisia selengensis Turcz. Er Bess, and Artemisia stolonifera Komar. and antifungal properties / K. Swiader, J. Krzyzanowska // Herba polonica. 1997. - 43. №4. - P. 434.

79. Николаевский, В.В. Биологическая активность эфирных масел / В.В. Николаевский, А.Е. Еременко, И.К. Иванов. М.: Медицина, 1987. - С. 144.

80. Макарчук, Н.М. Фитонциды в медицине / Н.М. Макарчук, Я.С. Лещинская, Ю.А. Киев: Наукова думка, 1990. - 216 с.

81. Погорелко, И.П. Эфирные масла (артемизол) при лечении уролитиаза / И.П. Погорелко, Н.С. Махмудов // Мед. журн. Узбекистана. 1963. - №6.

82. Коновалов, Д.А. Препарат Оласкар новое противогрибковое лечебное средство / Д.А. Коновалов, В.А. Челомбитько // Тез. II Рос. Нац. Конгресса «Человек и лекарство». — Москва, 1992. - С. 307.

83. Нежувака, А.К.Антигрибковые свойтсва эфирных масел / А.К. Нежувака,

84. C.Е. Дмитрук, С.И. Дмитрук, Е.Н. Сальникова // Военно-мед. журн. 1987. -№8. - С.64.

85. Божко, В.Г. Малярия: диагностика, лечение, профилактика / В.Г. Божко, Е.А. Иоанниди, В.Ф. Обехов, Ф.С. Искулов // Научно-информационный журнал. -2010. 6(38). - С. 23-28.

86. Бородулина, Б.В. Медицинский энциклопедический словарь / Б.В. Бородулина. М., 2002. - 704 с.

87. Денисов, Е.Т. Радикальная химия артемизинина / Е.Т. Денисов, C.JI. Солодова, Т.Г. Денисова // Успехи химии. 2010. - 79 (11). - С. 1065-1088.

88. Племенков, В.В. Химия изопреноидов / В.В. Племенков. Барнаул, 2007.-321 с.

89. Lapkin, A.A. Comparative assessment of technologies for extraction of artemisinin / A.A. Lapkin, P.K. Plucinski, M. Cutler // J. Nat. Prod. 2006. - 69. -P. 1653-1666.

90. Ferreira, J. F. Drying affects artemisinin, dihydroartemisinic acid, artemisinic acid, and the antioxidant capacity of Artemisia annua L. leaves / J. F. Ferreira,

91. D.L. Luthria. // J. Agric. Food Chem. 2010. - 58. - P. 1691-1698.

92. Красильникова, Jl.A. Биохимия растений / Л.А. Красильникова, О.А. Авксентьева, В.В. Жмурко, Ю.А.Садовниченко. Харьков: «Торсинг», 2004. -224 с.

93. Carvalho, I.S. Fatty acids profile of selected Artemisia spp. plants / I.S. Carvalho, M.C. Teixeira, M. Brodelius // Health promotion, LWT. Food Science and Technology. 2011. - 44. - P. 293-298.

94. Boden, G. Free fatty acids produce insulin resistance and activate the proinflammatory nuclear factor-kappa В pathway in rat liver. / G. Boden, P. X. She, M. Mozzoli, P. Cheung et al. // Diabetes. 2005. - 54(12). - P. 3458-3465.

95. Bourre, J. M. Dietary oleic acid not used during brain development and in adult in rat, in contrast with sciatic nerve / J. M. Bourre, O. Dumont // Neuroscience Letters. 2003. - 336(3). - P. 180-184.

96. Максютина, Н.П. Методы выделения и исследования флавоноидных соединений / Н.П. Максютина, В.И. Литвиненко // Фенольные соединения и их биологические функции. М., 1968. - С. 7-26.

97. Балицкий, К.П. Лекарственные растения в терапии злокачественных опухолей / К.П. Балицкий, А.Л. Воронцова. Ростов-на-Дону, 1980. - 296 с.

98. Фадеева, О.В. Полыни Казахстана источники биологически—активных веществ / О.В. Фадеева // Тез.докл. 2-го съезда фармацевтов КазССР. -Чимкент, 1981. - С. 426-464.

99. Растительные ресурсы СССР. Цветковые растения, их химический состав, использование; семейство Asteraceae (Compositaea). СПб: Наука, -1993.

100. Anurag, Singh. An ethnobotanical study of medicinal plants in Chandauli District of Uttar Pradesh, India / Singh Anurag, P.K. Singh // Journal of Ethnopharmacology. 2009. - 121. - P. 324-329.

101. Сальникова, E.H. Химическое исследование флавоноидов полыни горькой Artemisia absinthium L. полыни Сиверса Artemisia sieversiana Willd. / E.H. Сальникова, Г.И. Калинкина, C.E. Дмитрук // Химия растительного сырья. 2001. - №3. - С. 71-78.

102. Кабата-Пендиас, А. Микроэлементы в почвах и растениях / А. Кабата-Пендиас, X. Пендиас. М.: Мир, 1989. - 680 с.

103. Bowen, H.J.M. Environmental Chemistry of the Elements / H.J.M. Bowen. -New York: Academic Press, 1979. 333 p.

104. Marutian, S.A. Activity of micro- and macroelements in vine shoots during nongrowing season / S.A. Marutian // 3rd Coll. Le Controle de l'Alimentation des plantes Cultivees. Budapest, 1972. - P. 763.

105. Школьник, М.Я. Микроэлементы в жизни растений / М.Я. Школьник. -Л.: Наука, 1974.-323 с.

106. Лысенко, А.И. Влияние марганца на образование дубильных веществ и некоторых других восстановителей в щавеле тянынанском: автореф. канд. дис. Пермь, 2003.- 180 с.

107. Гринкевич, H.H. Химический анализ лекарственных растений / Н.И. Гринкевич, Л.Н. Сафронович. М., 1983. - 176 с.

108. Казарян, Е.С. Содержание меди в кормовых растениях горных районов Армении / Е.С. Казарян // Биологическая роль меди: Сб. науч. тр. М., 348 с.

109. Бойченко, Э.С. Влияние некорневой подкормки бором и цинком на урожай и качество мяты перечной / Э.С. Бойченко // Агрохимия. 1970. -№ 12.-С.107.

110. Васильева, В.Т. Эколого-биохимическая характеристика и пищевая ценность полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.) Центральной Якутии / В.Т. Васильева. Наука и образование, 2009. - №2.

111. Хайдав, Ц. Лекарственные растения в монгольской медицине / Ц. Хайдав, Б. Алтанчимэг, Т.С. Варламова. Улан-Батор, 1985. - 200 с.

112. Ханина, М.А. Результаты химического исследования Artemisia gmelinii Web. et Stechm. Флоры Сибири / М.А. Ханина, Е.А. Серых, Л.М. Покровский, A.B. Ткачев // Химия растительного сырья. 2000. - №3. - С. 77-84.

113. Асеева, Т.А. Лекарственные растения тибетской медицины / Т.А. Асеева, Д.Б. Дашиева, А.Н. Кудрин. Новосибирск: Наука, 1985. - 151 с.

114. Намзалов, Б.Б. Этноботанические исследования: справочник растений бурятской народной медицины / Б.Б. Намзалов, Т.Г. Басхаева. Улан-Удэ: Изд-во Бур. универ., 2008. - 183 с.

115. Полянская, Е.В. Состав эфирного масла Artemisia glauca из западной Сибири / Е.В. Полянская, Е.А. Королюк. A.B. Ткачев // Химия природных соединений. 2007. - №5. - С. 446-449.

116. Пигулевский, Г.В. Исследование эфирного масла полыни Сиверса / Г.В. Пигулевский, Т.П. Березовская // Новые лекарственные растения Сибири, их лечебные препараты и применение. Новосибирск, 1949. - С. 69-78.

117. WHO monograph on good agricultural and collection practices (GACP) for Artemisia annua L. Geneva: World Health Organization, 2006.

118. Долгова, A.A. Руководство к практическим занятиям по фармакогнозии / A.A. Долгова, Е.Я. Ладыгина. М.: Медицина, 1977. - 91 с.

119. Амельченко, В.П. Биосистематика полыней / В.П. Амельченко // Кемерово, 2006. 237 с.

120. Бело дубровская, Г. А. Энциклопедический словарь лекарственных растений и продуктов животного происхождения / Г.А. Белодубровская, под ред. Г.П. Яковлева, К.Ф. Блиновой. СПб: Спец. лит-ра, 1999. - 407 с.

121. Шретер А.К. Методика определения запасов лекарственных растений / А.К. Шретер, И.Л. Крылова, H.A. Борисова. М., 1986. - 50с.

122. Государственная Фармакопея СССР. Вып.1. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье МЗ СССР. 11-е изд. М., 1987. 385 с.

123. Ткачев, A.B. Исследование летучих веществ растений / A.B. Ткачев. -Новосибирск: Издательско-полиграфическое предприятие «Офсет», 2008. -969 с.

124. Федосеева, Г.М. Микроскопический анализ лекарственного растительного сырья / Г.М. Федосеева. Иркутск, 2007. - 100 с.

125. Stoffel, W. Analysis of long chain fatty acids by gas-liquid chromatography. Micromethod for preparation of methyl esters / W. Stoffel, F. Chu, E.H. Ahrens // Anal. Chem. 1959. - Vol. 31. №2. - P. 307-308.

126. Бандюкова, В.А. Качественный анализ флавоноидов в растительном материале при помощи хроматографии на бумаге. Методические рекомендации / В. А. Бандюкова, А. А. Шинкаренко. Пятигорск, 1972.

127. Lee, S.C. Flavonoids and phenolic acids from Labisia pumila (Kacip Fatimah) / L.S. Chua, N.A. Latiff, S.Y. Lee et al. // Food chemistry. 2011. ~ 127. -P. 1986-1192.

128. Кузнецова, Г.А. Природные кумарины и фурокумарины / Г.А. Кузнецова. Ленинград: Издательство «Наука» Ленинградское отделение, 1967.

129. Лазуревский, Г.В. Практические работы по химии природных соединений / Г.В. Лазуревский, И.В. Терентьева, А.А. Шамшурин. М., 1966. - 335 с.

130. Бандюкова В.А. Фенолокислоты, их эфиры и гликозиды / В.А. Бандюкова // Химия природных соединений. 1983. - №3. - С. 263 - 273.

131. Обухов, А.И. Атомно-абсорбционный анализ в почвенно-биологических исследованиях / А.И. Обухов, И.О. Плеханова М.: Изд-во МГУ, 1991. -184 с.

132. Государственная Фармакопея СССР. Вып.2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье МЗ СССР. 11-е изд. М., 1990. - 400 с.

133. Эсбенсон, К. Анализ многомерных данных / К. Эсбенсон, перевод с англ. Родионовой О. М.: ИПХФ РАН, 2005. - 170 с.

134. СанПин 2.3.2.1078-01 Гигиенические требования безопасности и пищевые ценности пищевых продуктов.