Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:РАЗРАБОТКА КОМПЛЕКСНОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СРЕДСТВА, ПРЕДНАЗНАЧЕННОГО ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ МОЧЕВЫДЕЛИТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ

003483455

На правах рукописи

РАЗРАБОТКА КОМПЛЕКСНОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СРЕДСТВА, ПРЕДНАЗНАЧЕННОГО ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ МОЧЕВЫДЕЛИТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

1 9 Ц0л ?лп

Улан-Удэ-2009 г.

003483455

Диссертационная работа выполнена в ГОУ ВПО «Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова»

Научный руководитель:

Доктор фармацевтических наук, Маркарян Артем Александрович

профессор

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук, профессор

Кандидат фармацевтических наук

Федосеева Галина Михайловна Югдурова Елизавета Долгоровна

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН

•Защита состоится « 03 » декабря 2009 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета ДМ 003.028.02 в Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН по адресу: 670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Бурятского научного центра СО РАН.

Автореферат разослан « » ноября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

В.Б. Хобракова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы.

Результаты исследований последних десятилетий свидетельствуют об уменьшении продолжительности жизни населения индустриально развитых стран и в значительном увеличении заболеваний сердечно-сосудистой системы, желудочно-кишечного тракта, эндокринной, мочевыделительной и других систем организма.

Заболевания мочевыделительной системы занимают одно из ведущих мест в общей структуре болезней. В настоящее время до 90 % мужчин старше 60 лет страдают заболеваниями почек, мочевого пузыря и предстательной железы, а также около 70 % женщин в возрасте старше 50 лет страдают почечно-каменной болезнью, пиелонефритом, циститом. Имеются данные, что около 15 % женщин детородного возраста страдают воспалительными заболеваниями мочеполовой системы (Здоровье населения..,2005). Медико-социальная значимость указанных нозологических форм, помимо их широкой распространенности, обусловлена и тем, что они являются одной из ведущих причин инвалидизации и смертности. Основным и наиболее распространенным методом лечения заболеваний мочевыделительной системы является антибактериальная терапия. Однако, при курсовом применении антибактериальные средства вызывают побочные действия на организм, проявляющиеся в виде аллергических реакций и иммунодепрессивных состояний организма и приводящие к развитию устойчивости к патогенной микрофлоры (Ушкалова и соавт.,2002). В этой связи актуальной проблемой остается разработка высокоэффективных уросептических средств, не оказывающих побочного действия.

Ассортимент растительных средств и биологически активных добавок (БАД) к пище при данной патологии, в настоящее время весьма ограничен. Весьма эффективными при профилактическом и терапевтическом применении являются многокомпонентные лекарственные растительные средства и БАД к пище в виде сборов (чаев), оказывающих комплексное фармакотерапевтическое воздействие на основные звенья патологического процесса, обладающих низкой токсичностью и отсутствием побочного эффекта при их длительном применении. Кроме того, актуальным является разработка рациональной лекарственной формы на их основе - экстрактов сухих, сохраняющих все преимущества многокомпонентных лекарственных средств, при этом увеличиваются сроки годности и улучшается точность дозирования.

В связи с вышесказанным, целесообразным представляется проведение информационно-аналитических, фармакогностических, фармакологических и технологических исследований по созданию

растительной композиции, улучшающих функциональное состояние мочевыделительной системы.

Цель и задачи исследования. Целью настоящих исследований является разработка и стандартизация биологически активной добавки к пище в виде чая «Тан-№22» и экстракта сухого, рекомендованного для профилактики заболеваний мочевыделительной системы.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

> обосновать и экспериментально подтвердить состав и соотношение растительных компонентов в чае «Тан-22»;

> провести комплексные фармакогностические исследования многокомпонентного чая «Тан-22», определить критерии подлинности и показатели его качества;

> изучить влияние основных факторов экстракции на выход биологически активных веществ из чая для разработки рациональной схемы получения экстракта сухого;

> провести исследования химического состава чая и экстракта сухого на его основе, разработать методики количественного определения основных групп биологически активных веществ и установить нормы их содержания;

> разработать нормативную документацию: технические условия (ТУ) и технологическую инструкцию (ТИ) на БАД к пище чай «Тан-22» и внедрить их в производство.

Научная новизна работы.

Разработан и обоснован оптимальный состав растительных компонентов в чае «Тан-22», рекомендованном для профилактики заболеваний мочевыделительной системы.

В ходе фармакогностических исследований выявлены диагностически значимые признаки лекарственного растительного сырья в чае, определены критерии его подлинности, установлены показатели качества, внесенные в нормативные документы.

С использованием современных методов анализа: бумажной и тонкослойной хроматографии (ТСХ), высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), УФ-спектрофотометрии установлено содержание основных групп биологически активных веществ (флавоноидов, органических и фенолкарбоновых кислот, полисахаридов, сапонинов) в чае «Тан-22» и экстракте сухом.

На основании изучения химического состава, обоснована разработка методик стандартизации чая и экстракта сухого. Разработаны

методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчёте на рутин; суммы полисахаридов после гидролиза в пересчёте на глюкозу; арбутина и глицирризиновой кислоты методом ВЭЖХ; определения содержания кремния методом атомно-абсорбционной спектроскопии.

Разработана рациональная схема получения экстракта сухого, установлена зависимость выхода действующих веществ от различных режимов экстракции.

Оформлены нормативные документы: технические условия (ТУ) и технологическая инструкция (ТИ) на БАД к пище чай «Тан-22» и экстракт сухой.

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:

> методика установления подлинности лекарственного растительного сырья (J1PC) микроскопическим методом;

> методики качественного и количественного определения флавоноидов и полисахаридов в чае «Тан-22» и экстракте сухом;

> Технические условия (ТУ 9361—025-03533369-01) «БАД к пище чай «Тан-22»; технологическая инструкция. По результатам проведенных исследований чай «Тан-22» внесен в Государственный реестр БАД к пище: РУ 02396.Р.643.01.2001.

> Технические условия на экстракт сухой.

Связь задач исследований с проблемным планом НИР

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО «Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова» по теме: «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на базе достижений медико-биологических исследований» (регистрационный номер 01.2.006 06 352)

Основные положения, выносимые на защиту:

> обоснование разработки состава чая «Тан-22», результаты фармакогностического исследования, определения характеристик подлинности и показателей его качества;

> результаты исследований химического состава растительной композиции чая «Тан-22» и экстракта сухого;

> разработка методик количественного анализа действующих веществ в чае «Тан-22» и экстракте сухом;

> результаты изучения влияния основных факторов экстракции на выход БАВ из чая;

> результаты разработок технических условий и технологической инструкции на чай «Тан-22» и экстракта сухого в соответствии с учетом современных требований качества на биологически активную добавку к пище.

Апробация работы.

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2008); - конференции РАЕН «Инновации в получении JIC и БАД к пище на основе сырья природного происхождения» (Москва, 2007); - международной научно-практической конференции «Практическая фитотерапия» (Москва, 2008); - IX международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2008).

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 6 научных работах, из них 2 статьи в периодических изданиях, рекомендованных ВАК МО и науки РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 165 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы (глава 1), 4 глав экспериментальной части, выводов, списка литературы, включающего 198 источников, в том числе 83 иностранных, приложений. Работа содержит 40 рисунков и 60 таблиц.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, представлены научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе на основании данных обзора литературы рассматриваются вопросы применения растительных препаратов для профилактики заболеваний мочевыводящей системы. Представлено ботаническое описание, данные по химическому составу, распространению, применению в народной и научной медицине сырья, входящего в БАД к пище чай «Тан-22». Приведена характеристика основных групп биологически активных веществ, содержащихся в сырье для чая «Тан-22» (выделение, установление структуры и их стандартизация).

В разделе Пояснение к эксперименту приведены сведения об объектах изучения, о методах и приборах, используемых в эксперименте.

Вторая глава посвящена установлению оптимального соотношения ингредиентов чая, фармакогностическому исследованию

сырья лекарственных растений, входящих в состав чая «Тан-22»; установлению показателей, позволяющих идентифицировать данное сырье и контролировать его качество.

В третьей главе представлены данные фотохимического изучения сырья растений, входящих в состав чая «Тан-22»; проведено детальное изучение состава биологически активных веществ БАД к пище «Тан № 22» с использованием современных физико-химических методов, разработаны методики количественного определения основных БАВ.

В четвертой главе изложены результаты исследований по подбору оптимальных условий и разработке рациональной технологии получения экстракта сухого из чая «Тан-22». Приведены результаты изучения химического состава, разработаны методики их количественного определения и установлены показатели качества экстракта сухого, получаемого из чая «Тан-22».

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Объектами исследования служило лекарственное растительное сырье, полученное в период с 2006 по 2008 гг. в ОАО «Красногорсклексредства», сырье соответствовало требованиям НД и прошло микробиологический и радиационный контроль.

Цветки календулы лекарственной ГФ XI изд., Ст. 5

(Flores Calendulaé)

Цветки ромашки аптечной ГФ XI изд., Ст. 7

(Flores Chamomillae)

Листья ортосифона тычиночного ГФ XI изд., Ст. 21

(Folia Orthosiphonis)

Листья толокнянки обыкновенной ГФ XI изд., Ст. 26

(Folia Uvae-ursi)

Трава хвоща полевого (Herba Equiseti) ГФ XI изд., Ст. 50

Корни солодки голой, уральской

(Radices Glycyrrhizae glabrae, uralensis) ГФ X изд., Ст. 573

Оценку содержания действующих веществ в различных вариантах чая проводили по выходу экстрактивных веществ и по сумме флавоноидов в пересчете на рутин методом УФ-спектрофотометрии.

Изучение внешних признаков растительных смесей проводили в соответствии с требованиями ГФ XI изд., вып.1, С. 266-267. Микроскопические исследования сбора проводили по методике ГФ XI изд., вып.1 .,С.277.Сгущение полученных извлечений на стадии экспериментальных исследований получали на вакуум-выпарном

ротационном испарителе марки ИРМ-1. Для исследования качественного состава изучаемых объектов использовали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) с применением пластин марки «Kieselgel 60 F 254» размером 20*20 см. Нанесение исследуемых растворов на хроматографические пластины осуществляли при помощи микрошприцов марки Hamilton объемом от 10 до 50 мкл. Обнаружение зон адсорбции фенольных соединений на хроматограммах производили путем просматривания их в УФ-свете при длине волны = 360±5 и 254 нм до и после обработки 2% спиртовым раствором алюминия хлорида. Используемые растворители: 1-зтилацетат-уксусная кислота-вода(25:5:5), 2-толуол-уксусная кислота-метанол (55:40:5), 3 -изопропанол-муравьиная кислота-вода (70:6:4). Для бумажной хроматографии использовали следующие растворители: 4- уксусная кислота-15%, 5 - бутанол-уксусная кислота-вода (6:4:2). Идентификация моносахаридов проведена в системе 6-пиридин-уксусный ангидрид-вода (6:4:3), проявитель: анилин-фталат. Идентификацию веществ методом ВЭЖХ проводили при помощи прибора фирмы «GILSON» с компьютерной обработкой результатов программой «Мультихром» для Windows. В работе применен обращено-фазный вариант метода, в качестве неподвижной фазы использовали металлические колонки Kromasil Cl8 размером 4,6x150 мм; ALLTECH ОА-ЮОО Organic Acids, размером 6,5x300 мм; детектирование осуществляли с помощью УФ-детектора при длинах волн - 190 - 400 нм. Спектры поглощения соединений в УФ-свете и видимом свете регистрировали на приборе GELIOS (США) в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм.

Количественное определение содержания кремния проведено методом атомно-абсорбционной спектроскопии на приборе AAS QUANT-Z с программным обеспечением «Quant Zeeman foT Windows», оборудованном кремниевой лампой с полым катодом в качестве источника излучения; рабочая длина волны 251,6 нм. Построение калибровочного графика осуществлено путем измерения нескольких калибровочных точек - растворов с известной концентрацией определяемого вещества.

Статистическая обработка результатов - в соответствии с ГФ XI изд., вып. 1, С. 199-207.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Разработка способа получения биологически активной добавки к пище - чай «Тан-22» и установление показателей качества Фитокомпозидия «Тан-22» составлена с учетом анализа данных литературы, фармакологических свойств, химического состава, применения в научной медицине и состояния сырьевой базы используемых растений.

Для изготовления БАД к пгаце применяли следующие виды лекарственного растительного сырья: цветки календулы лекарственной и ромашки аптечной; листья ортосифона тычиночного и толокнянки обыкновенной; трава хвоща полевого и корни разрешенных к применению видов солодки. Использовалось высушенное стандартизованное сырье урожая 2006 - 2008 гг. По числовым показателям образцы сырья соответствовали требованиям НД.

С целью выбора оптимального соотношения входящих компонентов нами изучено несколько вариантов, данные приведены в табл. 1.

Таблица 1

№ Наименование Варианты чая по количеству входящих

п/п ингредиентов чая ингредиентов (100 г)

1 2 3 4

1 Листья ортосифона 30 40 20 25

2 Цветки календулы 20 15 10 25

3 Цветки ромашки 10 15 30 5

4 Трава хвоща 5 10 10 5

полевого

5 Корень солодки 15 15 10 20

6 Листья толокнянки 10 15 20 20

На основании проведенных фармакологических исследований отваров и экстрактов сухих, полученных из предложенных вариантов, была выбрана растительная композиция №1, обладающая наиболее выраженным фармакологическим действием и безопасностью его состава.

Разработанная схема получения БАД к пище включает следующие основные стадии технологического процесса: ТП. I. Измельчение и просеивание растительного сырья; ТП. 2.Получение готового продукта; УМО. I. Фасовка и упаковка.

Согласно технологической схеме производства наработано 5 серий чая «Тан-22».

Изучены анатомо-диагностические признаки сырья методами макро- и микроскопии. Установлено, что измельченный чай представляет собой растительную смесь неоднородных частиц сырья серовато-зеленого цвета со светло-желтыми и белыми вкраплениями, проходящие сквозь сито с отверстиями диаметром 5 мм. Вкус водного извлечения -своеобразный, со сладким привкусом. .

При проведении микроскопического анализа чая были выявлены диагностически значимые признаки отдельных растительных компонентов. Исследуемый сбор включает сырье различных морфологических групп, для этого было сгруппировано сырье по их морфологической принадлежности:

> листья (ортосифона, толокнянки, трава хвоща);

> цветки (ромашки, календулы);

> корни (солодки).

В морфологической группе «листья» наблюдались: частицы от серовато-зеленого до темно-зеленого цвета листа толокнянки, видно наличие многоугольных клеток эпидермиса с прямыми и довольно толстыми стенками и крупных устьиц, окруженных 8 (5-9) клетками, видны одиночные призматические кристаллы оксалата кальция; диагностические признаки хвоща: клетки эпидермиса стеблей и ветвей на ребрах сильно удлиненные с прямыми пористыми стенками, в бороздках, слегка удлиненные с более извилистыми стенками, с устьицами. Устьица слегка погруженные, с характерной лучистой складчатостью кутикулы, расположены обычно в 3 ряда, реже в 4, 2 или 1 ряд; - у листьев ортосифона видны многоугольные клетки верхнего эпидермиса с прямыми или слабоизвилистыми стенками; клетки нижнего эпидермиса мельче и стенки их более извилистые. Устьица расположены с обеих сторон и окружены 2-3, реже 4 околоустьичными клетками. По жилкам и краю листа расположены простые бородавчатые 1-7~клеточные волоски; с обеих сторон встречаются железистые волоски на короткой ножке с одно-или двуклеточной головкой.

В морфологической группе «цветки», при рассмотрении препарата язычковых цветков календулы с поверхности видны удлиненные клетки эпидермиса с оранжевыми округлыми хромопластами. На зубчиках эпидермис с сосочками, иногда с устьицами. Трубка венчика густо опушена простыми и железистыми одно- или двухрядными волосками; у цветков ромашки отдельные желтые трубчатые и белые язычковые цветки и их фрагменты; кусочки цветоложа, серовато-зеленые, конические, голые, мелкоямчатые снаружи

и полые внутри, иногда с частично сохранившимися трубчатыми, реже краевыми язычковыми цветками и желтовато-зелеными или серовато-зелеными листочками обвертки; отдельные листочки обвертки продолговато-яйцевидной формы с тупой верхушкой и широкой пленчатой окраиной; кусочки ребристых цветоносы от светло-зеленого до зеленовато-коричневого цвета.

В морфологической группе - «корни», для корня солодки диагностическое значение имеют широкие сердцевинные лучи, расширяющиеся во вторичной коре, и присутствие во вторичной коре деформированного луба, группы лубяных волокон с сильно утолщенными стенками, окруженных кристаллоносной обкладкой. В порошке солодки присутствуют обрывки тонкостенной паренхимы, клетки которой содержат большое количество крахмальных зерен, группы склеренхимных волокон коры и древесины обычно с остатками кристаллоносной обкладки, а также обрывки сосудов.

При анализе данной многокомпонентной смеси проведено разделение по частоте встречаемости их диагностических признаков на 3 группы. Наиболее встречаемыми видами сырья являлись: листья ортосифона - в 93% случаях, цветки календулы - 78%, корни солодки -67%, листья толокнянки и трава хвоща - редко встречающие.

. Для разработки дополнительных характеристик подлинности проведено определение числовых показателей качества: суммы экстрактивных веществ (водой) - не менее 15%; влажности - не более 14%; золы общей - не более 15%, золы, нерастворимой в 10% хлористоводородной кислоте - не более 7%; содержание органической примеси - не более 2%, минеральной примеси — не более 2%; побуревших и почерневших листьев, - от 0,6 до 1,5%. На долю стеблей приходится от 3,12% до 9,23%. В ЛРС не допускается наличие поверхностной влаги, плесени, гнили и амбарных вредителей.

Определен коэффициент водопоглощения сырья, который составляет - Кв чая - 1,9±0,062. При хранении в обычных условиях установлен срок годности - 2 года.

2. Фитохимическое изучение чая «Тан-22»

Биологически активные вещества в чае представлены веществами разнообразной химической природы, которые обеспечивают совокупное профилактическое и лечебное действие. Для ЛРС входящего в состав чая «Тан-22» разработаны критерии подлинности, включающие качественные реакции на фенольные соединения и хроматографирование в тонком слое, сорбента (ТСХ).

С помощью общеизвестных и принятых качественных реакций на основные группы БАВ установлено наличие таких природных соединений, как: флавоноидов, дубильных веществ, органических кислот, полисахаридов, сапонинов и др.

Обнаружение фенольных соединений в водно-спиртовых извлечениях осуществляли методом ТСХ, в качестве свидетелей использовали спиртовые растворы аутентичных стандартных образцов: флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, органических кислот, сапонинов. Установлено наличие таких соединений как, флавоноидов: рутина К1-(0,3-0,31, система 1), кемпферола КГ (0,94-0,96), лютеолин-7-гликозида ЯГ (0,48-0,5) обнаружено наличие синенсетина М (0,35 система 2); кофейной и хлорогеновой кислот; а также установлено присутствие глицирризиновой кислоты (М -0,60, система 3). Идентификация данных соединений подтверждена с помощью метода ВЭЖХ и позволила идентифицировать следующие соединения: флавоноиды (апигенин, кверцетин, кемпферол, гесперидин, рутин, ликуразид, лютеолин-7-гликозид, гиперозид); оксикоричные кислоты: (галловая, хлорогеновая и кофейная кислоты), а также идентифицирован арбутин (рис. 1, табл. 2).

»V

ловя-

«о-

205-

100-

123 4

10 12 14 16 18 20 22 24 X 28 30 32

Рис. 1. - Хроматограмма фенольных соединений чая «Тан-22»: 1 - арбутин; 2 - галловая кислота; 3 - хлорогеновая кислота; 4 - кофейная кислота; 5 - гесперидин; 6 - ликуразид; 7 - кемпферол; 8 - лютеолин-7-гликозид; 9 - рутин; 10 — гиперозид; 11 - глицирризиновая кислота; 12 -

кверцетин

Таблица 2

Хроматографические характеристики фенольных соединений, ___ обнаруженных в чае «Тан-22»_

№ Время, Площадь, Содержание Название соединения

пика сек шУхсек вещества, %

1. 112.8 1583.08 3.51 Арбутин

2. 138.2 1952.17 4.33 Галловая кислота

3. 174.5 1225.16 2.72 Хлорогеновая кислота

4. 214.1 3311.65 7.35 Кофейная кислота

5. 381.8 3815.86 8.47 Гесперидин

6. 424.0 2369.57 5.26 Ликуразид

7. 500.1 828.71 1.84 Кемпферол

8. 521.1 675.18 1.50 Лютеолин-7-гликозид

9. 573.8 1469.72 3.26 Рутин

10. 655.4 2443.68 5.42 Гиперозид

11. 838.3 1524.16 3.38 Глицирризиновая к-та

12. 1494.0 2218.04 4.92 Кверцетин

13. 1807.0 2682.05 4.83 Апигенин

В водных извлечениях, методом ВЭЖХ обнаружены органические кислоты, идентифицированные по времени удерживания стандартных растворов веществ: щавелевая, лимонная, винная, яблочная и янтарная кислоты. Полученные результаты представлены на рис. 2 и табл.3.

тУ

100 -

50

10

12

Рис. 2. - Хроматограмма органических кислот: 1 - щавелевая кислота; 2 -лимонная кислота; 3 - винная кислота; 4 - яблочная кислота; 5 - янтарная

кислота

Таблица 3

Хроматографические характеристики органических кислот, обнаруженных в чае

«Тан-22»

№ пика Время, Площадь, Содержание Название соединения

сек mV х сек вещества, %

1. 280.44 691.96 2.04 Щавелевая кислота

2. 345.24 1110.82 2.71 Лимонная кислота

3. 371.52 596.74 1.93 Винная кислота

4. 441.12 17.75 0.355 Яблочная кислота

5. 625.20 70.68 0.841 Янтарная кислота

Также методом ВЭЖХ в водных растворах установлено наличие моно- и дисахаридов, которые в основном представлены сахарозой (54,63%), фруктозой (18,14%) и глюкозой (15,25%), результаты приведены на рис. 3 и в табл. 4. ш¥

2 — мальтоза; 3 - глюкоза; 4 - фруктоза; 5 - арабиноза

Таблица 4

Хроматографические характеристики моно- и дисахаридов, _ обнаруженных в чае «Тан-22»__

№ Время, Площадь, Содержание в Название

пика сек mV х сек выделенной смеси, % соединения

1. 561.42 11267.45 54.63 Сахароза

2. 774.72 3561.24 4.51 Мальтоза

3. 870.96 4784.91 15.25 Глюкоза

4. 942.84 4961.12 18.14 Фруктоза

5. 1424.88 1462.97 1.58 Арабиноза

3. Разработка методик количественного определения содержания Б AB

Для количественной оценки содержания БАВ в чае «Тан-22» разработаны методики их количественного определения. Чай предложено характеризовать по двум показателям: по содержанию суммы флавоноидов и по сумме полисахаридов после их гидролиза с использованием спектрофотометрического метода определения.

3.1. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов

Установлено, что одним из важнейших аспектов механизма мочевыделительного действия является наличие у данного растительного средства базисной мембраностабилизирующей активности, реализация которой связана с антиоксидантным действием комплекса фенольных соединений, а именно флавоноидов, то в качестве критерия подлинности предлагается разработка методики количественного определения по содержанию их суммы в растительном комплексе.

При разработке методики учитывались оптимальные условия экстракции. Так установлено, что максимальное извлечение достигается путем трехкратной экстракции чая спиртом этиловым 80 %, для размеров частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм, при соотношении сырья и экстрагента (1:10-12), при нагревании до 90 °С в течение 1 ч. Методика количественного определения суммы флавоноидов проведена методом дифференциальной спектрофотометрии. Данный метод, преимуществами которого являются высокая точность и экспресность основана на реакции комплексообразования флавоноидов с алюминия хлоридом, с которым флавоноиды образуют комплексы, устойчивые в кислой среде. При выборе рабочего стандартного образца апробировались рутин, кверцетин, нарингенин после проведения реакции комплексообразования с алюминия хлоридом (рис. 5).

В качестве стандарта выбран раствор PCO рутина, в качестве аналитической выбрана длины волны 413±3 нм, которая совпадает с максимумом поглощения рутина - стандарта и позволяет проводить количественное определение суммы флавоноидов в пересчете на PCO рутина. Изучение зависимости оптической плотности от концентрации раствора, показало, что поглощение света раствором рутина и спиртового извлечения из фиточая подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бэра.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье должно быть не менее 0,50 %.

Wavelenjjth (nm)

Рис. 5. - Спектры комплексов флавоноидов с алюминия хлоридом: 1 - извлечение из чая; 2 - нарингенин; 3 - рутин; 4 - кверцетин

Воспроизводимость методики количественного определения суммы флавоноидов была установлена на примере одного образца сырья в 5 независимых повторностях. Относительная ошибка методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин с 95% вероятностью составляет ± 4,56% (табл. 5).

Разработанная методика валидирована, с помощью современных статистических методов доказана ее правильность, достоверность и воспроизводимость.

Таблица 5

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин

п f Хор Sx Р,% t(P,f) АХср Еср> %

5 4 0,656 0,00058 0,0108 95 2,78 0,0298 ±4,56

3.2. Разработка методики количественного определения суммы

моносахаридов

Количественное определение содержания суммы моносахаридов в чае проводили спектрофотометрическим методом после кислотного гидролиза полисахаридной фракции. Метод основан на способности моносахаридов восстанавливать в щелочной среде пикриновую кислоту до пикрамовой со сдвигом максимума поглощения до 455±5 нм (рис.6), что позволяет исключить влияние сопутствующих веществ.

У№)1епд№ (пш)

Рис. 6. - Спектры поглощения комплекса углеводов с пикриновой кислотой: нижняя кривая - испытуемый раствор; верхняя кривая -стандартный раствор глюкозы

Оптимальным режимом для проведения количественного определения моносахаридов явилось: измельчение 2 мм, соотношения сырья и экстрагента 1:25, соотношения извлечения и 95% спирта этилового, необходимого для осаждения полисахаридов 1:3 и количества кислоты хлористоводородной, необходимого для гидролиза - 20 мл, аналитическая длина волны 460 нм.

Содержание моносахаридов после гидролиза в пересчете на глюкозу и абсолютно сухое сырье в извлечениях чая «Тан-22» должно быть не менее 3,0 %.

Воспроизводимость методики количественного определения моносахаридов была установлена на примере одного образца сырья в 5 независимых повторностях. Метрологические характеристики методики количественного определения моносахаридов в чае «Тан-22» представлены в табл. 6.

Таблица 6

Метрологические характеристики методики количественного определения моносахаридов в пересчете на глюкозу в чае «Тан-22»

п Г Хср Б2 Эх Р,% ЛХср Сер, %

5 4 3,414 0,00633 0,0356 95 2,78 0,0989 ±2,90

Относительная ошибка методики количественного определения моносахаридов после гидролиза в пересчете на глюкозу с 95% вероятностью составляет ± 2,90 %.

3.3. Определение содержания кремния

Так как в составе чая присутствует трава хвоща, а по данным литературы известно, что хвощ накапливает кремний, нами проведено определение содержания кремния методом атомно-абсорбционной спектроскопии. Расчет проводили по калибровочному графику, построенному на основании данных для стандартного раствора кремния. Содержание кремния в абсолютно сухом сырье чая «Тан-22» должно быть не менее 0,20%.

На основании полученных экспериментальных данных разработаны технические условия на БАД к пище чай «Тан-22».

4. Разработка способа получения экстракта сухого

Сухие экстракты являются одним из наиболее рациональных способов переработки ЛРС, обеспечивающих максимальное извлечение действующих веществ и возможность создания стандартизованного фитопрепарата. Поэтому следующим этапом нашей работы является разработка способа получения сухого экстракта, как субстанции для создания готовых лекарственных форм. Для определения оптимальных условий стадии экстракции изучено влияние экстрагента, температурного режима, соотношения сырье-экстрагент, времени и кратности экстракции на выход биологически активных веществ.

Экспериментально установлено, что оптимальным является проведение трехкратной экстракции сырья с размером частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 3 мм, в соотношении 1:10-12 при использовании в качестве экстрагента воды очищенной и нагревании до 80 °С в течение 1 часа. Подобранные в ходе эксперимента оптимальные параметры процесса экстракции были положены в основу проведения серии 5 балансовых загрузок в лабораторных условиях. Технологическая схема получения экстракта представлена на рис. 7.

Анализ готового продукта и отходов производства (шрота, осадка балластных веществ) осуществляли по сумме флавоноидов в пересчете на рутин и суммы моносахаридов после гидролиза в пересчете на глюкозу.

Экстракт сухой, полученный из чая «Тан-22» представляет собой аморфный, гигроскопичный, комкующийся порошок от светло-коричневого до коричневого цвета со специфическим запахом.

Насыпная масса экстракта при свободном падении - 0,48 г/см3, при уплотнении — 0,76 г/см3. Сыпучесть — 1,90 г/сек, угол естественного откоса 35-37°. Потеря в массе при высушивании при 100-105 °С до постоянной массы установлена в соответствии с ГФ XI год. и не превышает 5 %.

СЫРЬЕ

Рис. 7 Технологическая схема получения экстракта сухого

Разработка показателей качества экстракта сухого

Для проведения качественных реакций экстракта сухого, готовили спиртовое и водное извлечение и проводили скрининг на наличие БАВ. Установлены положительные качественные реакции на фенолыше соединения, сапонины, восстанавливающие сахара, что свидетельствует об их наличии. Обнаружение фенольных соединений в извлечении осуществляли методом ТСХ и ВЭЖХ. В спиртовых извлечениях из экстракта сухого обнаружены флавоноиды (рутин, кемпферол, лютеолин-7-гликозид, синенсетин); сапонины, представленные глицирризиновой кислотой.

Содержание других БАВ, содержащихся в извлечениях в экстракте сухом, было подтверждено с помощью метода ВЭЖХ: обнаружены флавоноиды, органические кислоты, моно- и дисахариды, арбутин, глицирризиновая кислота. Все методики качественного обнаружения веществ идентичны использованным методикам для анализа извлечения из чая.

5.1. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в экстракте сухом

Для количественной оценки содержания БАВ в экстракте сухом, предложена методика количественного определения по содержанию суммы флавоноидов и суммы моносахаридов после гидролиза методом спектрофотометрии, при этом учтена разработка данной методики для чая.

В качестве стандартного образца выбран рутин, аналитическая длина волны 413±3 нм, которая совпадает с максимумом поглощения рутина - стандарта (Рис. 8).

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье должно быть не менее 1,20 %. Воспроизводимость методики количественного определения суммы флавоноидов была установлена на примере одного образца экстракта сухого в 5 независимых повторностях.

Относительная ошибка методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин с 95 % вероятностью не превышает 5 % (табл. 7). Разработанная методика валидирована, с помощью современных статистических методов доказана ее правильность, достоверность и воспроизводимость.

пш

Рис. 8. - Спектры поглощения флавоноидов с алюминия хлоридом в УФ-свете: 1 - рутина СО; 2 - комплекс флавоноидов извлечения из экстракта

сухого

Таблица 7

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в экстракте сухом_

Р,%

1(Р,0

АХС,

£ср, %

1,274

0,00068

0,0167

95

2,78

0,0324

±2,54

5.2. Разработка методики количественного определения суммы

моносахаридов в экстракте сухом Определение содержания суммы моносахаридов в пересчете на глюкозу проводили после кислотного гидролиза полисахаридов. спектрофотометрическим методом - измеряли поглощение продукта реакции углеводов с пикриновой кислотой, максимум поглощения при 455±5 нм.

Содержание суммы моносахаридов после гидролиза в пересчете на глюкозу и абсолютно сухое сырье в извлечениях экстракта сухого чая должно быть не менее 8,0 %.

Воспроизводимость методики количественного определения суммы моносахаридов была установлена на примере одного образца экстракта сухого в 5 независимых повторностях.

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы моносахаридов после гидролиза в экстракте сухом представлены в табл. 8.

Таблица 8

Метрологические характеристики методики количественного определения

п Г Б2 Я* Р,% АХср еср, %

5 4 8,502 0,00837 0,0409 95 2,78 0,114 ± 1,34

Относительная ошибка методики количественного определения суммы моносахаридов после гидролиза в пересчете на глюкозу в экстракте сухом чая с 95 % вероятностью не превышает 5 %.

В экстракте сухом проводилось определение содержания кремния методом атомно-абсорбционной спектроскопии. Расчет проводят по калибровочному графику, построенному на основании данных для стандартного раствора кремния. Содержание кремния в экстракте сухом чая должно быть не менее 0,55%.

Разработанные показатели качества: описание внешнего вида, подлинность, потеря в массе при высушивании, сыпучесть, содержание суммы флавоноидов и моносахаридов включены в нормативные документы. При хранении в обычных условиях установлен предварительный срок годности экстракта сухого - 1 год.

Подготовлен проект технических условий на экстракт сухой, а также оформлена технологическая схема производства экстракта сухого, который может быть рекомендован для применения при профилактике заболеваний мочевыводящих путей.

ВЫВОДЫ

1. Обоснован и экспериментально подтвержден состав растительной композиции в чае Тан-22 в виде БАД к пище.

2. На основании фармакогностического изучения выявлены диагностические признаки компонентов чая «Тан-22» при их совместном присутствии. Установлены числовые показатели, введенные в нормативные документы. Исследован качественный состав чая различными видами хроматографии, при этом идентифицированы флавоноиды: апигенин, лютеолин, кверцетин, рутин, гиперозид, ликуразид, глицирризиновая кислота; фенолкарбоновые кислоты: хлорогеновая, галловая; кофейная. Методом атомно-абсорбционной спектроскопии изучено содержание микроэлемента кремния в чае «Тан-22» и экстракте сухом.

3. Разработана технология получения экстракта сухого. Исследовано влияние основных факторов на процесс экстрагирования биологически активных веществ. Установлены оптимальные условия экстракции: тип экстрагента - горячая вода при температуре 80 - 90 °С;

соотношение сырья и экстрагента 1:(10-12); кратность - 3; время экстракций - по 1 ч. Оформлена технологическая схема производства.

4. Разработаны методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин и моносахаридов в пересчете на глюкозу в чае «Тан-22» и экстракте сухом, полученном на его основе.

5. Разработанные показатели качества включены в нормативные документы. Установлен срок годности чая «Тан-22» - 2 года, экстракта сухого - 1 год. По результатам исследования подготовлены проекты ТУ на БАД к пище чай «Тан-22» и «Экстракт сухой». Чай «Тан-22» внесен в Государственный реестр БАД к пище: РУ 02396.Р.643.01.2001.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Рогозина О.И. Разработка методик качественного и количественного анализа многокомпонентного растительного сбора «Тан-22» / О.И. Рогозина, A.A. Маркарян //Вестник Российского университета дружбы народов. Серия "Медицина". -2008.-№7.-С. 469-472.

2. Рогозина О.И. Изучение качественного состава чая «Тан-22» / О.И. Рогозина, А.А.Маркарян, О.В. Нестерова //Практическая фитотерапия. - 2008. - № 4. - С. 7-8.

3. Рогозина О.И. Идентификация глицирризиновой кислоты методом тонкослойной хроматографии в чае, рекомендуемом при урологических заболеваниях / О.И. Рогозина // Практическая фитотерапия. - 2008. - № 4. - С. 11-12.

4. Рогозина О.И., Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в растительной композиции, рекомендуемой для использования при заболеваниях мочеполовой системы / О.И. Рогозина, A.A. Маркарян, О.В.Нестерова // Практическая фитотерапия. - 2008. - № 4. - С. 15-17.

5. Рогозина О.И. Разработка методики количественного определения полисахаридов в чае, используемом при заболеваниях мочевыделительной и половой системы / О.И. Рогозина // Практическая фитотерапия. - 2008. -№ 4. - С. 17-19.

6. Рогозина О.И. Изучение химического состава чая "Тан-22", используемого при заболеваниях мочевыделительной системы / О.И. Рогозина, A.A. Маркарян, О.В. Нестерова и др. // Сибирский медицинский журнал. - 2009. - № 1. - Т.84. - С. 81-84.

Подписано в печать 02.11.2009 г. формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Объем 1,4 печ. л. Тираж 100. Заказ №52.

Отпечатано в типографии Изд-ва БНЦ СО РАН. 670047 г. Улан-Удэ ул. Сахъяновой, 6.

Актуальность темы.

Результаты исследований последних десятилетий свидетельствуют о снижении продолжительности жизни населения индустриально развитых стран и в значительном увеличении заболеваний- сердечно-сосудистой системы, желудочно-кишечного тракта, эндокринной, мочевыделительной и других систем организма.

Заболевания мочевыделительной системы занимают одно из ведущих мест в общей структуре болезней. В настоящее время до 90 % мужчин старше 60 лет страдают заболеваниями почек, мочевого пузыря и предстательной железы, а также около 70 % женщин в возрасте старше 50 лет страдают почечно-каменной болезнью, пиелонефритом, циститом. Имеются данные, что около 15 % женщин детородного возраста страдают воспалительными заболеваниями мочеполовой системы (Здоровье населения.,2005). Медико-социальная значимость указанных нозологических форм, помимо их широкой распространенности, обусловлена и тем, что они являются одной из ведущих причин инвалидизации и смертности. Основным и наиболее распространенным методом лечения заболеваний мочевыделительной системы является антибактериальная терапия. Однако, при курсовом применении антибактериальные средства вызывают побочные действия на организм, проявляющиеся в виде аллергических реакций и иммунодепрессивных состояний организма и приводящие к развитию устойчивости патогенной микрофлоры (Ушкалова и соавт., 2002). В этой связи актуальной проблемой остается разработка высокоэффективных уросептических средств, не оказывающих побочного действия.

Ассортимент растительных средств и биологически активных добавок (БАД) к пище при данной патологии, в настоящее время весьма ограничен. Весьма эффективными при профилактическом и терапевтическом применении являются многокомпонентные лекарственные растительные средства и БАД к пище в виде сборов (чаев), оказывающих комплексное фармакотерапевтическое воздействие на основные звенья патологического процесса, обладающих низкой токсичностью и отсутствием побочного эффекта при их длительном применении. Кроме того, актуальным является разработка рациональной лекарственной формы на их основе - экстрактов сухих, сохраняющих все преимущества многокомпонентных лекарственных средств, при этом увеличиваются сроки годности и улучшается точность дозирования.

В связи с вышесказанным, целесообразным представляется проведение информационно-аналитических, фармакогностических, фармакологических и технологических исследований по созданию растительной композиции, улучшающих функциональное состояние мочевыделительной системы.

Цель и задачи исследования. Целью настоящих исследований является разработка и стандартизация биологически активной добавки к пище в виде чая «Тан-№22» и экстракта сухого, рекомендуемых для профилактики заболеваний мочевыделительной системы.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: обосновать рациональный состав растительных компонентов в чае «Тан-22»; провести комплексные фармакогностические исследования многокомпонентного чая «Тан-22», определить критерии подлинности и показатели его качества; изучить влияние основных факторов экстракции на выход биологически активных веществ из чая для разработки рациональной схемы получения экстракта сухого; провести исследования химического состава чая и экстракта сухого на его основе, разработать методики количественного определения основных групп биологически активных веществ; разработать нормативную документацию: технические условия (ТУ) и технологическую инструкцию (ТИ) на БАД к пище чай «Тан-22» и внедрить их в производство.

Научная новизна работы.

Разработан и обоснован оптимальный состав растительных компонентов в чае «Тан-22», рекомендованный для профилактики заболеваний мочевыделительной системы.

В ходе фармакогностических исследований выявлены диагностически значимые признаки лекарственного растительного сырья (JIPC) в чае, определены критерии его подлинности, установлены показатели качества, внесенные в нормативные документы.

С использованием современных методов анализа: бумажной и тонкослойной хроматографии (ТСХ), высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), УФ-спектрофотометрии установлено содержание основных групп биологически активных веществ (флавоноидов, органических и фенолкарбоновых кислот, полисахаридов, сапонинов) в чае «Тан-22» и экстракте сухом.

На основании изучения химического состава, обоснована разработка методик стандартизации чая и экстракта сухого. Разработаны методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчёте на рутин; суммы полисахаридов после гидролиза в пересчёте на глюкозу; арбутина и глицирризиновой кислоты методом ВЭЖХ; определение содержания кремния методом атомно-абсорбционной спектроскопии.

Разработана рациональная схема получения экстракта сухого, установлена зависимость выхода действующих веществ от режимов экстракции.

Оформлены нормативные документы: технические условия (ТУ) и технологическая инструкция (ТИ) на БАД к пище чай «Тан-22» и экстракт сухой.

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны и внедрены: методика установления подлинности лекарственного растительного сырья (ЛРС) микроскопическим методом; методики качественного и количественного определения флавоноидов и полисахаридов в чае «Тан-22» и экстракте сухом;

Технические условия (ТУ 9361-025-03533369-01) «БАД к пище чай «Тан-22»; технологическая инструкция. По результатам проведенных исследований чай «Тан-22» внесен в Государственный реестр БАД к пище: РУ 02396.Р.643.01.

Технические условия на экстракт сухой (ТУ 9373-005-0353336908).

Связь задач исследований с проблемным планом НИР

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова по теме: «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на базе достижений медико-биологических исследований» (регистрационный номер 01.2.006 06 352)

Основные положения, выносимые на защиту: обоснование рационального состава чая «Тан-22», результаты фармакогностического исследования, определения характеристик подлинности и показателей его качества; результаты исследований химического состава растительной композиции чая «Тан-22» и экстракта сухого; разработка методик количественного анализа действующих веществ в чае «Тан-22» и экстракте сухом; результаты изучения влияния основных факторов экстракции на выход БАВ из чая; результаты разработок технических условий и технологической инструкции на чай «Тан-22» и экстракта сухого в соответствии с учетом современных требований качества на биологически активные добавки к пище.

Апробация работы.

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: - конференции РАЕН «Инновации в получении JIC и БАД к пище на основе сырья природного происхождения» (Москва, 2007);

- XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2008); - международной научно-практической конференции «Практическая фитотерапия» (Москва, 2008); - IX международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2008).

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 6 научных работах, из них 2 статьи в периодических изданиях, рекомендованных ВАК МО и науки РФ.

ВЫВОДЫ

1. На основе экспериментального исследования обоснован рациональный состав растительной композиции чая «Тан-22» как БАД к пище.

2. Выявлены диагностические признаки компонентов чая «Тан-22». Установлены числовые показатели, качественный состав чая различными видами хроматографии, идентифицированы флавоноиды: апигенин, лютеолин, кверцетин, рутин, гиперозид, ликуразид, глицирризиновая кислота; фенолкарбоновые кислоты: хлорогеновая, галловая; кофейная. Методом атомно-абсорбционной спектроскопии определено содержание микроэлемента кремния в чае «Тан-22» и экстракте сухом.

3. Разработана технология получения экстракта сухого, установлены оптимальные условия экстракции: тип экстрагента - горячая вода при температуре 80 - 90 °С; соотношение сырья и экстрагента 1:(10-12); кратность - 3; время экстракций - по 1 ч. Предложена технологическая схема производства.

4. Разработаны методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутип и моносахаридов в пересчете на глюкозу в чае «Тап-22» и экстракте сухом, полученном на его основе.

5. Показатели качества включены в нормативные документы; установлены предварительные сроки годности чая «Тан-22» - 2 года, экстракта сухого - 1 год. По результатам исследования подготовлены проекты нормативных документов на БАД к пище чай «Тан-22» и «Экстракт сухой». Чай «Тан-22» внесен в Государственный реестр БАД к пище.