Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Фармакодинамические и фармакокинетические свойства соединения - N9-производного имидазо[1,2-a]бензимидазола, обладающего противоязвенной активностью

На правах рукописи

СПЕРАНСКАЯ АННА СЕРГЕЕВНА

ФАРМАКОДИНАМИЧЕСКИЕ И ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА СОЕДИНЕНИЯ - ^-ПРОИЗВОДНОГО ИМИДАЗО[1,2-а]БЕНЗИМИДАЗОЛА, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВОЯЗВЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

ПЯТИГОРСК - 2004

РАБОТА ВЫПОЛНЕНА В ВОЛГОГРАДСКОМ ГОСУДАРСТВЕННОМ МЕДИЦИНСКОМ УНИВЕРСИТЕТЕ И ВОЛГОГРАДСКОМ НАУЧНОМ ЦЕНТРЕ РАМН И АВО

Научный руководитель: Член-корреспондент РАМН, Заслуженный

деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Спасов Александр Алексеевич

Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, профессор

Батурин Владимир Александрович Кандидат фармацевтических наук, доцент Кулешова Светлана Анатольевна

Ведущая организация: Московская медицинская академия

им. И.М. Сеченова

Зашита диссертации состоится «Л/» 2004 г. в часов на

заседании диссертационного совета Д 208.069.01 по защитам диссертаций при Пятигорской государственной фармацевтической академии по адресу: 357533, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пятигорской государственной фармацевтической академии.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор фармацевтических наук, профессор

Е.В. Компанцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Современная терапия язвенной болезни направлена на подавление кислотно-пептической агрессии, повышение защитных возможностей гастродуоденальной слизистой и эрадикацию Helicobacter pylori (Рысс Е.С., Звартау Э.Э., 1998).

Контроль секреции соляной кислоты в желудке остаётся одним из основных элементов фармакотерапии язвенной болезни (Pohle Т., Domschke W., 2003). Базисной группой антисекреторных препаратов, наряду с ингибиторами протонной помпы, являются Н2-гистаминоблокаторы. Многолетний опыт применения этих средств показал высокий уровень заживления язв, четкий клинический эффект. Однако, и у этих препаратов в их фармакодинамическом спектре отмечаются нежелательные свойства - антиандрогенный и аритмогенный эффекты, гепато- и миелотоксичность, секреторная отдача при резкой отмене препаратов, угнетение функции микросомальной окислительной системы печени (Буркхалтер А., 1998; Рысс Е.С., Звартау Э.Э., 1998; Lin J.H.,

В настоящее время инвазия Helicobacter pylori рассматривается как один из важнейших факторов пептической язвы (Hoick S. et al., 2003). В комплексную терапию язвенной болезни прочно вошли антигеликобактерные средства. Современная антигеликобактерная терапия уменьшает число рецидивов, способствует возникновению реальных предпосылок для полного излечения, резко сокращает процент осложнений (Gisbert J.P., Pajares J.M., 2003). Так же большое значение придаётся повышению сопротивляемости гастродуоденальных слизистых оболочек.

Поэтому в последние годы ведется изыскание и изучение Hi-гистаминоблокаторов нового поколения, «действие которых не ограничивается подавлением кислотной продукции. Наиболее перспективным является сочетание антисекреторных, гастропротективных и антигеликобактерных свойств (Рысс Е Зве . t al.,

1991).

2003).

На кафедре фармакологии Волгоградского государственного медицинского университета совместно с НИИ ФОХ Ростовского государственного университета был проведён поиск веществ с антисекреторной активностью среди конденсированных производных бензимидазола (Анисимова В.А. и др., 1989; Ковалёв Г.В. и др., 1990; Спасов А.А. и др., 1990). Наибольшую антисекреторную активность продемонстрировало соединение РУ-64 - производное имидазо[1,2-а] бензимидазола (Бакумов П.А., 1991; Черников М.В., 2000). Был доказан Нг-гистаминоблокирующий механизм действия данного вещества, и кроме того, показана выраженная противоязвенная активность на различных экспериментальных моделях язвообразования (Черников М.В., 2000).

Учитывая вышесказанное, представляется целесообразным дальнейшее исследование фармакодинамических и фармакокинетических свойств соединения РУ-64 с целью создания на его основе нового оригинального противоязвенного препарата.

Цель исследования. Целью настоящего исследования является изучение антисекреторных и гастропротективных свойств, фармако кинетики л-производного имидазо[1,2-а] бензимидазола- соединения РУ-64.

Задачи исследования. Для достижения указанной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Изучить антисекреторное и гастропротективное действие соединения на модели 7-ми часового лигирования привратника по Shay при интрадуоденальном и пероральном введении.

2. Исследовать противоязвенную активность вещества на аммиакиндуцированной модели язвообразования.

3. Изучить гастропротективные свойства соединения на монохлораминовой модели язвообразования.

4. Определить продолжительность антисекреторного и

противоязвениога.лействия соединения при пероральном введении. H<H.V;o х, -. Г -

I » 1 г

« ** .'i-V =?!:,„( и .5 i

» »f ;

; »»'v r-y *>■. ;

u -I , , ^

5. Изучить фармакокинетические свойства вещества при внутривенном и пероральном введении и связывание с белками плазмы крови.

6. Определить возможные пути метаболизма соединения.

7. Исследовать влияние соединения на активность ферментов биотрансформации ксенобиотиков в печени.

Научная новизна. Впервые изучены гастропротективные свойства соединения РУ-64 на модели -монохлораминового язвообразования, отражающей механизмы повреждения слизистой оболочки желудка при геликобактерной инфекции. Проведено морфологическое исследование характера повреждения слизистой оболочки желудка крыс при данных патологических моделях. Впервые изучена продолжительность антисекреторного и противоязвенного действия соединения РУ-64 на моделях 7-ми» часового лигирования привратника по Shay и монохлораминового повреждения слизистой оболочки желудка крыс. Проведено фармакокинетическое исследование вещества при внутривенном и пероральном введении в эксперименте: изучены процессы всасывания, распределения, элиминации, связывания с плазменными альбуминами. Спрогнозированы возможные пути метаболизма соединения РУ-64 и экспериментально изучено влияние данного вещества на активность ферментов I (различные формы цитохрома Р450) и II (УДФ-глюкуронилтрансферазу) фаз биотрансформации ксенобиотиков в печени.

Научно-практическая значимость работы. Соединение РУ-64, наряду с выраженным антисекреторным эффектом, оказывает существенное гастропротективное действие при пероральном введении, что определяет целесообразность разработки нового противоязвенного средства на его основе в виде пероральной лекарственной формы. Данные, полученные при изучении фармакокинетических свойств соединения РУ-64, существенно расширили представления о процессах всасывания, распределения, метаболизма и выведения данного вещества, что может служить основой для разработки и

оптимизации схем проведения клинических фармакокинетических исследований и разработки рациональных схем дозирования.

Тема, является составной частью Федеральной научно-технической программы «Создание новых лекарственных средств методами химического и биологического синтеза» и включена в план НИР ВолГМУ. Утверждена на заседании Ученого Совета университета (протокол № 9 от 10 апреля 2002 года).

Реализация, результатов исследования. Методология изучения фармакокинетических свойств производных бензимидазола используется в НИИ фармакологии ВолГМУ при проведении фармакокинетических исследований. Модель геликобактерподобного ульцерогенеза применяется лабораторией патологии Волгоградского научного центра РАМН для экспериментального изучения язвенной болезни, ассоциированной с Helicobacter pylori. Результаты работы используются в лекционном и практическом курсах для студентов лечебного, педиатрического, фармацевтического факультетов, слушателей факультета усовершенствования врачей и провизоров на кафедрах фармакологии, фармакологии и биофармации ФУВ ВолГМУ.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Соединение РУ-64 — Ыд-производное имидазо[1,2-а]бензимидазола, проявляет выраженные противоязвенные свойства при пероральном введении у лабораторных животных на моделях, воспроизводящих специфические геликобактероподобные повреждения слизистой оболочки желудка.

2. Противоязвенный и антисекреторный эффекты изучаемого вещества у крыс наблюдаются через 1 час после профилактического перорального введения и продолжаются до 8-го часа.

3. Соединение РУ-64 при внутривенном введении определяется в крови, в органе потенциального действия - желудке, а также в легких .и в печени. Вещество связывается с белками плазмы крови и интенсивно подвергается процессам биотрансформации.

Апробация работы. Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались ь на 60-й и 61-й итоговых научных конференциях студентов и молодых учёных ВолГМУ, Волгоград, 2002-2003 гг.; VII-VIII Региональных конференциях молодых исследователей Волгоградской области, Волгоград, 2002-2003 гг.; III международной научно-практической конференции молодых учёных и студентов «Санкт-Петербургский научный форум - 2003», Санкт-Петербург, 2003.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 201 странице машинописного текста, иллюстрирована 30 рисунками, 12 фотографиями, содержит 24 таблицы. Состоит из введения, обзора литературы (глава I), описания материалов и методов исследования (глава II), экспериментальной части (главы Ш и IV), обсуждения результатов (глава V), выводов и списка литературы, включающего 88 отечественных и 125 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

Эксперименты выполнены на 546 белых нелинейных крысах обоего пола, массой 180-270 г и 26 белых неимбредных мышах-самцах, массой 22-24 г, содержащихся в условиях вивария ВолГМУ на стандартной диете с соблюдением всех правил и Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997). Субстанция соединения РУ-64 синтезирована в НИИ ФОХ Ростовского государственного университета. В качестве препаратов сравнения использовались фамотидин (Квамател, «Gedeon Richter», Венгрия), таурин (Тауфон, «Московский эндокринный завод», Россия) и мизопростол (Сайтотек, «Searle», США).

Выражаем признательность ведущему научному сотруднику, к.х.н. В А. Анисимовой за синтез и предоставление субстанции соединения РУ-64 для проведения настоящей работы.

Изучение антисекреторной и гастропротективной активности.

Антисекреторная и противоязвенная активность соединения РУ-64 исследовалась на модели 7-ми часового лигирования привратника, а также гастропротективное действие вещества изучалось на моделях аммиакиндуцированного и монохлораминового повреждения слизистой оболочки желудка.

По методу Shay (Оболенцева Г.В. и др., 1995) осуществлялось наложение лигатуры на привратник, через 7 часов желудок извлекался, измерялись объём желудочного сока, кислотность (методом кислотно-основного титрования) и определялся эрозивно-язвенный индекс (в мм2/животное). Соединение РУ-64 в виде водного раствора вводилось интрадуоденально в дозах 2,5, 5 и 10 мг/кг, а также для изучения эффективности при пероральном введении и длительности действия - интрагастрально за 1, 2, 4, 8 и 12 часов до лигирования привратника в дозе 10 мг/кг. Контрольной группе животных вводили воду очищенную в аналогичном объёме.

Модели геликобактерподобного повреждения (UmedaM. et al., 1999) слизистой оболочки желудка воспроизводились путем внутрижелудочного введения раствора гидроксида аммония (600 ммоль/л) — неспецифическое повреждение и при введении субэрозивных концентраций раствора аммиака (100 ммоль/л) на фоне ишемии, вызванной дозированным забором крови из сонной артерии (1мл на 100 г веса) — специфическое монохлораминовое повреждение. Соединение РУ-64 и препарат сравнения фамотидин вводились перорально в дозах 3, 10 и 30 мг/кг за 1 час до создания патологических моделей. На монохлораминовой модели дополнительно в качестве препаратов сравнения использовались - таурин в дозе 125 мг/кг и мизопростол в дозе 6 мкг/кг. Для изучения продолжительности гастропротективного действия соединения РУ-64 на модели монохлораминового язвообразования исследуемое вещество вводили интрагастрально в дозе 13,5 мг/кг (ЕД50) за 1,2, 4, 6 и 24 часа до воспроизведения монохлораминового повреждения. Контрольной группе

животных вводили воду очищенную в аналогичном объёме. Измерялась площадь (мм2) эрозивно-язвенных повреждений слизистой оболочки желудка.

Характер повреждений слизистой оболочки оценивался морфологически на макро- и микропрепаратах стенки желудка крыс.

Изучение фармакокинетических свойств соединения РУ- 64.

Экспериментальная фармакокинетика соединения РУ-64 изучалась согласно "Методическим рекомендациям по доклиническому изучению фармакокинетики лекарственных средств" (Фирсов А.А. и др., 2000).

Для проведения фармакокинетического исследования соединения РУ-64 при внутривенном введении опытным животным вещество в виде водного раствора вводилось в хвостовую вену в дозе 10 мг/кг. По истечению 5, 10, 15, 30, 45 минут и 1, 1,5, 3, 5, 7 часов после введения вещества животных декапитировали для получения биологического материала (кровь, желудок, селезёнка, мышца, сальник, головной мозг, лёгкие, сердце, печень и почки). При изучении фармакокинетики соединения РУ-64 при пероральном введении вещество вводилось интрагастрально в дозе 10 мг/кг. Контрольной группе животных вводилась вода очищенная в аналогичном объеме. Забор проб крови и образцов органов и тканей производился через 30 минут и через 1, 2, 3 и 5 часов после введения вещества.

Количественное определение соединения РУ-64 проводилось методом ВЭЖХ с использованием жидкостного хроматографа «HEWLETT PACKARD» (США) серии 1050 на колонке BIO-SIL ODS-5S (4100) с размером частиц 5 мкм фирмы «BIO-RAD» (США). Скорость потока элюента (70% ацетонитрила «УФ-210» фирмы «Лекбиофарм» (Россия) и 30% ацетатного буфера 0,1 М с рН=5,0) 1 мл/мин, УФ-детекция при-длине волны 265 нм. Чувствительность метода 100 нг/мл, время удерживания 15 минут. Содержание соединения РУ-64 в пробах определяли методом абсолютных стандартов. В качестве стандартного

* Выражаем благодарность зав. каф. судебной медицины ВолГМУ, д.м.н., проф. СИ. Зайченко за консультативную помощь при анализе морфологических данных.

образца использовали водный раствор соединения РУ-64 в концентрации 10 мкг/мл.

При исследовании процессов элиминации соединения РУ-64 вещество вводилось внутривенно и перорально в дозе 10 и 50 мг/кг. Взятие проб мочи и кишечного экскрета проводили в течение суток после введения соединения. Для выявления возможных метаболитов синтетической фазы биотрансформации проводили ферментативный (с (J-глюкуронидазой и арилсульфатазой, фирмы "Boehringer Mannheim", Германия), кислотный (с 5М раствором НС1) и щелочной (с 5М раствором NaOH) гидролиз (Thomas F.T. et al., 1999; Dix K.J. et al., 1999; Manini P. et al., 1999) мочи и кишечного содержимого.

Изучение степени связывания с белками сыворотки крови крыс осуществлялось методом диализного равновесия (Зайцева Т.М. и др., 1998, ЧёгёрС.И., 1975) с помощью диализной камеры; количественное определение соединения РУ-64 после установления диализного равновесия проводилось методом ВЭЖХ и методом УФ-спектроскопии. Характер связывания исследуемого соединения с сывороточным альбумином исследовался методом флуоресцентных зондов (Вольфбейс О.С., КесслерМ.Ф., 1998) с использованием набора «зонд-альбумин» фирмы «Зонд» (Россия) с флуоресцентным зондом К-35 (Грызунов Ю.А., 1994). Флуоресценцию измеряли на спектрофлуориметре MPF-4, фирмы «Hitachi» (Япония) при длине волны возбуждения 240 нм и спектре длин волн испускания от 480 до 570 нм.

Для изучения метаболизма соединения РУ-64 был произведен компьютерный прогноз с помощью программы «PALLAS» (CompuDrug Chemistry Ltd). Для подробного изучения влияния соединения РУ-64 на систему биотрансформации ксенобиотиков в печени использовались следующие' фармакологические тесты:

• гексеналового сна - влияние на активность изоформ цитохрома Р450 - CYP2C9, CYP2B1 и CYP2B2 (Omiecinski C.J. et al.,1999; Nebert D.W. et

al., 2002); гексенал (000 «МедПро Инк», Латвия) в виде водного раствора инъецировали крысам-самцам внутрибрюшинно в дозе 70 мг/кг,

• мидазоламового сна - влияние на изоформы CYP3A1 и CYP2C (Perloff M.D., et al., 2000; Warrington J.S., et al., 2000); мидазолам (Dormicum, «Roche», Швейцария, 0,5% раствор в ампулах по 3 мл) вводился мышам-самцам внутрибрюшинно в дозе 80 мг/кг;

• альпразоламового сна - влияние на CYP3AI (Никитин НА, 2002); альпразолам («Органика», Россия, таблетки по 0,001) в виде суспензии на твине-85 вводился мышам-самцам внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг;

• хлоралгидратного сна - влияние на II фазу биотрансформации (на УДФ-глюкуронилтрансферазу) (Лакин К.М. и др., 1981); хлоралгидрат (ООО «МедПро Инк», Латвия) вводили крысам внутрибрюшинно в виде водного раствора в дозе 70 мг/кг;

• барбиталового сна - для исключения возможного центрального действия соединения РУ-64; барбитал-натрий (ООО «МедПро Инк», Латвия) в виде водного раствора вводили крысам внутрибрюшинно в дозе 250 мг/кг.

Соединение РУ-64 вводили перорально в дозе 10 мг/кг за 1 час до введения тест-субстратов. Длительность сна животных определяли по времени нахождения в «боковом положении». Эксперименты проводили в условиях звукоизоляции при комнатной температуре.

Результаты обрабатывались статистически с помощью программы Microsoft Excel 10.0. Рассчитывали среднюю арифметическую (М), стандартную ошибку средней арифметической (m). Оценку значимости различий между сравниваемыми выборками проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при р<0,05.

Результаты и их обсуждение.

В ходе исследования были выявлены выраженные антисекреторные и гастропротективные свойства соединения РУ-64.

Так, на модели 7-ми часового лигирования привратника желудка по ShayH., вещество РУ-64 при интрадуоденальном введении демонстрировало

существенный дозозависимый антисекреторный эффект. Величина ЕД50 антисекреторного действия составила 8,9 мг/кг. При внутридуоденальном введении выраженность антисекреторного эффекта превышала таковую при пероральном введении данного вещества в той же дозе (10 мг/кг) в 2 раза. Однако, соединение РУ-64 в исследуемых дозах при интрадуоденальном введении не оказывало достоверного противоязвенного эффекта, а при пероральном введении проявило выраженный гастропротективный эффект.

При изучении длительности антисекреторного и гастропротективного эффектов соединения РУ-64 при пероральном введении на данной экспериментальной модели обнаружено, что исследуемое вещество подавляет секрецию соляной кислоты и предупреждает развитие эрозивно-язвенных повреждений слизистой оболочки желудка крыс достоверно в течение 4-х часов, к 8-му часу антисекреторная и гастропротективная активность вещества значительно снижаются (рис. 1). При этом максимальная антисекреторная активность наблюдается через 4 часа после введения соединения, а выраженная противоязвенная активность развивается уже через 1 час после введения и сохраняется до 4-го часа.

На основании полученных данных можно предположить, что гастропротективный эффект изучаемого соединения связан не только со снижением секреции соляной кислоты и уменьшением её агрессивного воздействия на слизистую оболочку желудка, но и, возможно, с активацией «местных» защитных механизмов (стимуляция секреции слизи и синтеза простагландинов, улучшение микроциркуляции). Данные предположения согласуется с результатами, полученными ранее Бакумовым П.А. (1991), который показал, что исследуемое вещество повышает содержание гастромукопротеидов и гликозаминогликанов в желудочном соке; а по данным морфологического исследования под действием соединения РУ-64 повышается содержание мукоидного секрета в бокаловидных клетках слизистой желудка.

Рисунок 1 - Влияние соединения РУ-64 при пероральном введении (10 мг/кг) на кислотность (А) и степень повреждения слизистой оболочки желудка крыс (В) на модели 7-ми часового лигирования привратника желудка по Shay H. Обозначения: по оси абсцисс - время (час), по оси ординат - изменение кислотности (А) и степени повреждения слизистой оболочки желудка (В) в процентах по отношению к контролю (Д%)

Гастропротективные свойства соединения РУ-64 были изучены на аммиакиндуцированной и монохлораминовой моделях язвообразования (Umeda М,, 1999). Модель мононохлораминового повреждения слизистой оболочки желудка крыс наиболее адекватно отражает ульцерогенез при инфицировании Helicobacter pylori. Морфологическое исследование позволило выявить механизмы повреждающего действия аммиака и монохлорамина на слизистую оболочку желудка.

Раствор гидроксида аммония при введении в высоких концентрациях (600-1200 ммоль/л) вызывал коагуляционный некроз слизистой оболочки желудка, тромбоз сосудов, выраженный отёк и слабую инфильтрацию полиморфно-ядерными лейкоцитами подслизистого слоя, что свидетельствует о неспецифическом повреждении. При введении раствора гидроксида аммония в низких субэрозивных концентрациях (100 ммоль/л) на фоне острой ишемии морфологическая картина характеризовалась выраженным нарушением кровообращения: отёк подслизистого слоя, полнокровие и тромбоз сосудов, а главное, наблюдалась максимально выраженная воспалительная клеточная инфильтрация слизистой оболочки- желудка и подслизистого слоя, представленная в основном полиморфно-ядерными нейтрофильными лейкоцитами, что свидетельствует о специфическом характере повреждения слизистой оболочки желудка вследствие образования эндогенного монохлорамина.

Исходя из механизма действия соединения РУ-64, в настоящей работе в качестве препаратов сравнения были выбраны вещества, препятствующие образованию и цитотоксическому воздействию монохлорамина на слизистую оболочку желудка: Н^-гистаминоблокатор — фамотидин, скавенджер хлорноватистой кислоты и монохлорамина — таурин, препарат простагландина - мизопростол.

При неспецифическом повреждении слизистой оболочки желудка (аммиакиндуцированная. модель) соединение РУ-64 и фамотидин

продемонстрировали гастропротективный эффект, однако четкой зависимости от дозы не наблюдалось.

При специфическом повреждении слизистой оболочки желудка крыс эндогенным монохлорамином соединение РУ-64 и фамотидин продемонстрировали четкий дозозависимый противоязвенный эффект (рис. 2). Величины ЕД50 при этом у соединения РУ-64 составила 13,5 мг/кг и у фамотидина 21,8 мг/кг. .Соответственно, гастропротективный эффект изучаемого вещества превышал таковой у фамотидина в 1,6 раза.

Рисунок 2 - Влияние соединения РУ-64, фамотидина, таурина и мизопростола (при пероральном введении) на развитие эрозивно-язвенных повреждений слизистой оболочки желудка крыс, вызванных монохлорамином (при интрагастральном введении раствора гидроксида аммония в дозе 100 ммоль/л в сочетании с ишемией).

Соединение РУ-64 изменяло патоморфологическую картину повреждения слизистой оболочки желудка: наблюдалось уменьшение глубины и распространенности некрозов эпителия, выраженность нарушения кровообращения была слабой, количество тучных клеток не изменялось, в клетках преобладала ортохроматическая зернистость, в отдельных клетках выявлялась метахроматическая зернистость и дегрануляция.

При изучении длительности гастропротективного эффекта соединения РУ-64 на монохлораминовой модели язвообразования максимальное противоязвенное действие исследуемое вещество демонстрировало через 1 час после перорального введения (рис. 3).

Рисунок 3 - Влияние соединения РУ-64 при пероральном введении в дозе, равной ЕД50 (13,5 мг/кг) на развитие монохлораминовых повреждений слизистой оболочки желудка крыс.

Обозначения: по оси абспцсс - время (час), по оси ординат — изменение степени повреждения слизистой оболочки желущса в процентах по отношению к контролю (Д%).

Полученные результаты подтверждают литературные данные (vanZylJ.M. et э1., 1993; LapennaD. et э1., 1994; UmedaM. et э1., 1999) о возможности влияния веществ с Нг-гистаминоблокирующим механизмом действия на специфические механизмы геликобактерного ульцерогенеза и способности препятствовать образованию и повреждающему воздействию на слизистую оболочку желудка эндогенного монохлорамина.

Анализ полученных данных позволяет предположить, что гастропротективный эффект соединения РУ-64 реализуется посредством нескольких механизмов, характерных для гистаминоблокаторов -связывания хлорноватистой кислоты, необходимой для образования монохлорамина, и самого эндогенного монохлорамина; снижения секреции соляной кислоты и уменьшения её агрессивного воздействия на слизистую

оболочку желудка, а также, стимуляции «местных» защитных механизмов слизистой оболочки желудка.

При создании новых лекарственных препаратов важное место занимают фармакокинетические исследования, позволяющие получить точные данные о процессах всасывания, распределения, биотрансформации и выведения изучаемых веществ из организма (ЖердевВ.П. и др., 1995), что даёт возможность выявить некоторые побочные эффекты, взаимодействие с другими лекарственными средствами, определить наиболее перспективные лекарственные формы и создать рекомендации для проведения клинических испытаний (Родионов А.П. и др., 1995).

Соединение РУ-64 при. внутривенном введении в плазме крови определяется до 5-го часа, при этом снижение содержания вещества носит быстрый характер (рис. 4). Максимальная концентрация - составляет 12,75 мкг/мл. Соединение РУ-64 при внутривенном введении обнаруживалось в органе потенциального действия - желудке, а так же в лёгких и в печени. Вещество отсутствует в кишечном экскрете в течение 24 часов, в низких концентрациях определяется в моче.

Рисунок 4 - Содержание соединения РУ-64 в крови крыс при внутривенном введении в дозе 10 мг/кг.

Обозначения: по оси абсцисс - время (час), по оси ординат - концентрация соединения РУ-64 в крови крыс (мкг/мл). Вертикальные штрихи соответствуют стандартной ошибке средней арифметической.

При пероральном введении неизменённое соединение РУ-64 определялось в низких концентрациях только в печени и отсутствовало в плазме венозной крови, полученной из системного кровотока. В кишечном экскрете и моче исходное соединение также не обнаруживалось.

При изучении степени связывания вещества РУ-64 с белками плазмы крови методом диализного равновесия при количественном определении методами ВЭЖХ и УФ-спектроскопии установлено, что связанная фракция составила в среднем 64,75%. Исследование характера и возможных мест связывания соединения с сывороточным альбумином методом флуоресцентных зондов показало увеличение флуоресценции после добавления < вещества к комплексу «альбумин-зонд» на 32% и снижение флуоресценции в пробах «альбумин+препарат+зонд» на 29%, что может свидетельствовать о наличии как неконкурентного, так и конкурентного взаимодействия между исследуемым веществом и зондом. Полученные данные дают возможность предположить существование нескольких центров связывания на молекуле сывороточного альбумина для соединения РУ-64.

Так как возможные метаболиты соединения РУ-64 при условиях хроматографии, подобранных для исходного вещества, в крови не обнаруживались и проведение ферментативного, щелочного и кислотного гидролиза почечного и кишечного экскретов также не позволило выявить наличие метаболитов синтетической фазы биотрансформации, был произведён компьютерный прогноз возможных путей метаболизма соединения РУ-64 и изменения физико-химических свойств возможных метаболитов с помощью программы «PALLAS» (CompuDrug Chemistry Ltd). Было показано, что метаболизм соединения РУ-64 возможен по двум путям: окислительному и деградационному. При этом возможные метаболиты, образованные в ходе реакций окисления, имеют сильно изменённые физико-химические свойства по сравнению с физико-химическими свойствами исходного вещества, что затрудняет их определение в хроматографических условиях, подобранных для неизменённого соединения. Метаболит, образованный при деградации

диэтиламиноэтильного радикала, имеет сходные физико-химические свойства с неизмененным соединением РУ-64, однако также не определяется. Это свидетельствует об отсутствии деградационного пути метаболизма для соединения РУ-64.

При изучении влияния соединения РУ-64 на ферментативную систему печени были получены результаты, свидетельствующие о возможном влиянии данного вещества на ферменты как I фазы (различные изоформы цитохрома Р450), так и II фазы (УДФ-глюкуронилтрансферазу) биотрансформации, вероятно, посредством конкурентного метаболизма исследуемого соединения с тест-субстратами. Так, в тестах гексеналового, альпразоламового, мидазоламового и хлоралгидратного сна соединение РУ-64 вызывало увеличение его продолжительности (рис. 5). При введении барбитала натрия, который, как известно, не подвергается печеночному метаболизму, изучаемое вещество длительность сна не изменяло, что позволяет исключить потенциирующее влияние исследуемого вещества на гипногенный эффект тест-субстратов.

Рисунок 5 - Влияние соединения РУ-64 при пероральном введении (10 мг/кг) на систему цитохрома Р450 (по результатам тестов гексеналового, мидазоламового и альпразоламового сна) и глюкуронилтрансферазу (по результатам теста хлоралгидратного сна).

Анализируя. полученные данные, можно предположить, что в I фазе биотрансформации соединение РУ-64, возможно, подвергается активному метаболизму с помощью системы цитохрома Р450 путём реакций окисления, в результате чего образуются первичные метаболиты, содержащие, в отличие от исходного вещества, гидроксильные группы. Во II фазе биотрансформации, вероятно,-образуются вторичные метаболиты, путём глюкуронизации по образовавшимся гидроксильным группам.

При пероральном введению изучаемое вещество в неизменённом виде определяется только в печени крыс (рис. 6) и максимальная концентрация при этом наблюдается к 1-му часу, а максимальный антисекреторный эффект развивается к 4-му часу.

Рисунок 6 - Зависимость изменения кислотности желудочного сока крыс (в процентах от исхода) и изменения содержания соединения РУ-64 в печени крыс при пероральном введении (10 мг/кг).

Обозначения: по оси абсцисс - время (час), по левой оси ординат - изменения кислотности желудочного сока (Д%), по правой оси ординат - концентрация соединения РУ-64 в печени крыс (мкг/г).

Таким образом, сопоставляя данные фармакодинамического и фармакокинетического исследования соединения РУ-64, можно предположить, что выраженное антисекреторное действие соединения РУ-64 при пероральном введении реализуется посредством активных метаболитов, образующихся при

первом прохождении через печень, которые вследствие сильно, изменённых физико-химических свойств не определяются в хроматографических условиях, подобранных для неизменённого вещества.

Учитывая наличие выраженных антисекреторных и гастропротективных свойств у соединения РУ-64 при пероральном введении, можно считать перспективным создание на его основе нового противоязвенного препарата, а также разработку и изучение пероральной лекарственной формы, как наиболее удобной и эффективной для использования в терапии язвенной болезни.

ВЫВОДЫ

1. Вещество под лабораторным шифром РУ-64 на модели 7-ми часового лигирования привратника по Shay при интрадуоденальном введении оказывает выраженное антисекреторное действие, превосходящее таковое при пероральном введении данного вещества в 2 раза. Величина ЕД50 антисекреторного действия соединения РУ-64 при интрадуоденальном введении составляет 8,9 мг/кг.

2. Соединение РУ-64 и препарат сравнения фамотидин на модели неспецифического химического аммиакиндуцироанного повреждения слизистой оболочки желудка крыс демонстрируют умеренное противоязвенное действие без признаков дозозависимости.

3. Вещество РУ-64 и фамотидин на монохлораминовой модели язвообразования проявляют выраженный дозозависимый гастропротективный эффект, при этом противоязвенное действие соединения РУ-64 превышает таковое фамотидина в 1,6 раза. Величины гастропротёктивого действия вещества РУ-64 и фамотидина составляют 13,5 мг/кг и 21,8 мг/кг, соответственно.

4. На модели 7-ми часового лигирования привратника по Shay антисекреторный и гастропротективный эффекты наблюдаются при пероральном введении соединения РУ-64 в течение 8-ми часов. При этом максимальная антисекреторная активность развивается через 4 часа, а

максимальный противоязвенный эффект проявляется через 1 час после введения вещества и сохраняется в течение 4-х часов. На модели монохлораминового язвообразования продолжительность гастропротективного действия соединения РУ-64 составляет 4 часа, при этом вещество максимально ингибирует развитие эрозивно-язвенных повреждений слизистой оболочки желудка крыс через 1 час после введения.

5. При изучении фармакокинетических свойств соединения РУ-64 при внутривенном введении было установлено, что вещество в крови определяется до 5-го часа; вещество обнаруживается в лёгких, в желудке и в печени. При пероральном введении установлено наличие соединения только в печени, в венозной крови концентрация вещества ниже порога определения. Соединение РУ-64 связывается с белками плазмы крови на 64,75%, при этом возможно наличие нескольких центров связывания на молекуле сывороточного альбумина для изучаемого вещества.

6. В плазме крови метаболиты не определяются в хроматографических условиях, подобранных для неизменённого соединения РУ-64, как при внутривенном, так и при пероральном введении вещества. При проведении ферментативного (¡3-глюкуронидаза и арилсульфатаза), щелочного (NaOH) и кислотного (НС1) гидролиза почечного и кишечного экскретов крыс метаболиты синтетической фазы биотрансформации не обнаружены. При компьютерном прогнозировании путей метаболизма соединения РУ-64 получены данные, свидетельствующие о возможности вещества интенсивно подвергаться процессам биотрансформации с образованием метаболитов посредством реакций окисления.

7. В тестах гексеналового, альпразоламового, мидазоламового и хлоралгидратного сна, соединение РУ-64 вызывает увеличение его продолжительности, а при введении барбитала натрия - на длительность сна не влияет, что свидетельствует о взаимодействии вещества с ферментами I и II фаз биотрансформации (изоформами цитохрома Р450 и уридиндифосфат-глюкуронилтрансферазой).

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Разработка методов количественного определения производного имидазобензимидазола РУ-64 // Тез. докл. VI Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области. -Волгоград, 2001. -С. 46-47 (соавт. Ельцова Л.В., Кравченко М.С.).

2. Качественное и количественное определение нового противоязвенного соединения РУ-64 методами УФ-спектроскопии и ВЭЖХ // Материалы всероссийской научно-практической конференции «Химия в технологии и медицине». -Махачкала, 2002. -С. 146-148 (соавт. Смирнова Л.А.).

3. Фармакокинетические свойства соединения РУ-64 при внутривенном введении // Материалы 60-ой юбилейной открытой итоговой научной конференции студентов и молодых ученых ВМА «Медицина в начале нового века: достижения и перспективы». -Волгоград, 2002. -С. 328 (соавт. Ельцова Л.В., Кравченко М.С.).

4. Количественное определение производного имидазобензимидазола соединения РУ-64'методом УФ-спектроскопии и ВЭЖХ с УФ-детектором // Материалы 60-ой юбилейной открытой итоговой научной конференции студентов и молодых ученых ВМА «Медицина в начале нового века: достижения и перспективы». -Волгоград, 2002. -С. 155-156 (соавт. Ельцова Л.В., Кравченко М.С., Полторацкий А.С.).

5. Модель аммиак-индуцированного повреждения слизистой оболочки желудка // Тез. докл. VII Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области. -Волгоград, 2002. -С. 52-53 (соавт. Черников М.В.).

6. Фармакокинетические свойства нового соединения, обладающего противоязвенной активностью // Тез. докл. VII Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области. -Волгоград, 2002. -С. 15-16 (соавт. Смирнова Л.А., Ельцова Л.В., Кравченко М.С.).

7. Моделирование одного из возможных патогенетических путей геликобактерного ульцерогенеза // Материалы III международной научно-практической конференции молодых учёных и студентов

«Санкт-Петербургский научный форум - 2003» -СПб, 2003. -Т. 2, -С. 48-49 (соавт. Черников М.В.).

8. Фармакокинетика нового противоязвенного соединения, производного имидазобензимидазола // Материалы 58-й межрегиональной конференции по фармации и фармакологии: «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции». -Пятигорск, 2003. -С. 387-388 (соавт. Смирнова Л.А.).

9. Модель геликобактерподобного ульцерогенеза // Сб. тез. 2-го Съезда Российского Научного Общества Фармакологов «Фундаментальные проблемы фармакологии». -Москва, 2003. —Ч. 2. -С. 192 (соавт. Черников М.В., Зайченко СИ.).

10. Поиск и изучение фармакологических свойств блокаторов гистаминовых рецепторов // Сб. тез. 2-го Съезда Российского Научного Общества Фармакологов «Фундаментальные проблемы фармакологии». -Москва, 2003. -Ч. 2, -С. 273 (соавт. Черников М.В., Спасов А.А., Анисимова В.А.).

11. Изучение гастропротективного действия соединения РУ-64 на модели аммиакиндуцированного язвообразования // Материалы 61-й итоговой научной конференции студентов и молодых учёных ВолГМУ. -Волгоград, 2003. -С. 138 (соавт. Черников М.В.).

12. Изучение гастропротективных свойств нового производного бензимидазола // Тез. докл. научной конференции, посвященной 50-летию Алтайского государственного медицинского университета «Актуальные проблемы фармакологии». -Барнаул, 2003. -С. 55 (соавт. Черников М.В.).

СПЕРАНСКАЯ АННА СЕРГЕЕВНА

ФАРМАКОДИНАМИЧЕСКИЕ И ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА СОЕДИНЕНИЯ - ^-ПРОИЗВОДНОГО ИМИДАЗО[1,2-а]БЕНЗИМИДАЗОЛА, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВОЯЗВЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ

АВТОРЕФЕРАТ

Подписано в печать 12102.0.4. Формат 60 х 84/16. Бум. Тип. N1. Печать офсетная. Усл. печ. д. 1,0. Тираж 120. Заказ 8 9. Волгоградский государственный мед ицинский университет 400131, Волгоград, Пл. Павших борцов, 1

» -4 93 2