Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Эритроцитарный химеризм при аллогенной близкородственной трансплантации костного мозга

Государственное учреждение Гематологический научный центр Российской академии медицинских наук

На правах рукописи

ПОРЕШИНА ЛИДИЯ ПЕТРОВНА

ЭРИТРОЦИТАРНЫЙ ХИМЕРИЗМ ПРИ АЛЛОГЕННОЙ БЛИЗКОРОДСТВЕННОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ КОСТНОГО МОЗГА (ОСОБЕННОСТИ ПРОЯВЛЕНИЯ, КЛАССИФИКАЦИЯ)

14.00.29-гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва-2004

Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический научный центр Российской академии медицинских наук

Научные консультанты:

Е. А. Зотиков, академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор С. И. Донское, доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

А. А. Рагимов доктор медицинских наук, профессор

Н. Д. Хорошко, доктор медицинских наук, профессор

С. С. Хромова, доктор биологических наук, профессор

Ведущее учреждение: Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Минздрава Российской Федерации

на заседании диссертационного совета Д 001.042.02 в ГУ Гематологический научный центр РАМН (125167, г. Москва, Новый Зыковский проезд, 4а)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Гематологический научный центр РАМН

Автореферат разослан «_»_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Защита состоится «_»

2004 г. в «

» часов

В. Д. Реук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Огромный опыт, накопленный в области трансплантации костного мозга (ТКМ), как в нашей стране (Файнштейн Ф.Э. с соавт., 1969; 1987; Баранов А.Е. с соавт., 1989; Любимова Л.С., 1992; Савченко В.Г., 1993; Воробьев А.И., 1997; Менделеева Л.П., 2002; Афанасьев Б.В. с соавт., 2002; Зотиков с соавт. Е.А., 2003), так и за рубежом (Mathe G. et al., 1963; Barrett A.J. et al., 2000; Thomas E.D. et al., 1986; McCann S.R. et.al., 1993) свидетельствует о том, что в процессе взаимодействия системы хозяин-трансплантат возникают выраженные генетические трансформации, приводящие к появлению химеричных тканей, обладающих новыми свойствами.

В отличие от трансплантации почки и других органов, а также трансфузий крови, при которых совместимость донора и реципиента по антигенам АВО и резус является непреложным правилом (Аграненко В.А.с соавт., 1979, 2002; Умнова М.А., 1989; Донсков СИ. с соавт., 1998; Воробьев А.И. с соавт., 2001; Рагимов А.А. с соавт., 2004) при ТКМ указанная совместимость оказалась не столь обязательной (Техн. рук. ААВВ, 2000). Это обстоятельство указывает на особое место костного мозга среди трансплантируемых тканей и побуждает к поиску адекватных методов исследования постгрансплантационного статуса реципиента.

Взаимодействие генетического аппарата донора и реципиента после ТКМ представляет собой многогранный, часто непредсказуемый процесс, изучение которого сопряжено с большими трудностями и, в первую, очередь с недостатком знаний о механизмах формирования химеричных тканей.

Вместе с тем химеризм является основным индикатором лечебного эффекта алломиелотранспланитации.

Несмотря на наличие большого арсенала методов исследования химер, основанных на цитогенетическом анализе по половому хроматину (Thompson J.D. et al., 1992; Ariyama T.et al., 1993; Виноградова O.A., 2001), полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Singer J.W. et al., 1983; Демидова И.А., 1997; Чухловин А.Б. с соавт., 2003), антигенам групповых систем (Mielcarek M. et al., 2000), многие научные и методические аспекты этого чрезвычайно важного для транспланталогии направления, остаются малоизученными.

Не определены типы эритроцитарного химеризма и особенности его формирования, немногочисленны сведения о корреляции химеризма с клиническими проявлениями при ТКМ, далеко не ясна связь эритроцитарного химеризма и реакции трансплантат против хозяина (РТПХ), а также роль собственно групповых антигенов эритроцитов в механизме отторжения трансплантата.

рос. национальная

библиотека

iiïïS&Q

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Установить типы эритроцитарного химеризма при трансплантации аллогенного костного мозга и их корреляцию с приживлением трансплантата.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Изучить формирование эритроцитарного химеризма с помощью модифицированного микрометода дифференциальной агглютинации (по серологическим различиям системы ABO, Rh-Hr, MN, P, Le, и др.).

2. Разработать классификацию эритроцитарного химеризма с учетом форм его проявления.

3. Оценить диагностическое значение эритроцитарного химеризма как показателя эффективности алломиелотрансплантации.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Установлено, что формы проявления эритроцитарного химеризма вариабельны. Выделены и охарактеризованы 2 типа, 3 подтипа, 2 варианта и 5 подвариантов эритроцитарных химер.

2. Показано, что типы, подтипы, варианты и подварианты эритроцитарного химеризма отражают характер приживления костного мозга.

3. Выявлена зависимость между типом эритроцитарного химеризма и развитием вторичной болезни.

4. Установлено, что смешанный химеризм ассоциирован с высоким риском возникновения посттрансплантационных рецидивов основного заболевания

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Предложена классификация эритроцитарного химеризма, которая позволяет прогнозировать РТПХ, развитие посттрансплантационного рецидива основного заболевания, служит критерием при выборе компонентов крови для трансфузионно-эксфузионной терапии реципиентам в различные сроки до и после алломиелотрансплантации.

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ

Основные положения диссертации внедрены в практику работы ГНЦ РАМН, отражены в методических рекомендациях МЗ СССР «Трансплантация костного мозга при острых лейкозах и апластической анемии» М., 1986, включены в цикл лекций по курсу «Основы клинической трансфузиологии» и «Иммуносерология». Показатели эритроцитарного химеризма, титра, специфичности антител учитываются при оценке приживления костного мозга и выборе трансфузионно-эксфузионной терапии реципиентам

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Типы эритроцитарного химеризма коррелируют с эффективностью трансплантации костного мозга.

2. Химеризм проявляется в виде клеточного и клеточно-гуморального варианта, подвариантов и групп.

3. Предложенная классификация эритроцитарных химер при трансплантации костного мозга может быть использована для оценки показаний и противопоказаний при трансфузионно-эксфузионной терапии в до и посттрансплантационном периоде.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты работы доложены на съездах, симпозиумах, конференциях, научных обществах:

1. Всесоюзный съезд гематологов и трансфузиологов (Львов, 1985). 2. Съезд гематологов (Киров, 1996). 3. Всесоюзный симпозиум «Трансплантация костного мозга в клинике и эксперименте» (Москва, 1984). 4. Сессия ЦНИИГПК (Москва, 1986). 5. Всесоюзная конференция гематологов и трансфузиологов (Киров, 1991). 6. Конференция Московского общества гемафереза (Москва, 1995, 1996, 2001). 7. Всероссийская конференция «Иммунологический мониторинг патологических состояний и иммунореабилитация» (Москва, 1995). 8. Национальная конференция Российской ассоциации аллергологов, клинических иммунологов, иммунофармакологов (Москва, 1997). 9. Конференция «Трансфузиология и служба крови» (Москва, 1998). 10. Научно-практическая конференция «Проблемы трансплантации костного мозга и стволовых клеток периферической крови» (Москва, 1999). 11. Научно-практическая конференция «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 2000). 12. Международная Европейская гематологическая ассоциация (Мюнхен, 2001). 13. Всероссийская научно-практическая конференция «Биотерапия рака» (Москва, 2002). 14. Всероссийская научно-практическая конференции с международным участием (Москва, 2002). 15. Всероссийский съезд по трансплантологии и разработке искусственных органов (Москва, 2002). 16. Конференция «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (Москва, 2003). 17. Российско-Норвежская конференция по гематологии (Санкт-Петербург, 2003). 18. Конференция «Стволовые клетки и перспективы их использования в здравоохранении». (Москва, 2003). 19. Научно-практическая конференция «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 2004). 20. П-ой Всемирный конгресс по иммунопатологии и аллергологии (Москва, 2004).

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации опубликовано 26 научных работ, в том числе монография «Клеточный химеризм и химеризм клетки при трансплантации костного мозга» (2003 г).

Диссертация апробирована на совместном заседании проблемных комиссий «Гемобластозы и депрессии кроветворения» и «Иммуногематология» ГНЦ РАМН 23 июня 2004 г.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 207 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования (6 глав), заключения, практических рекомендаций, выводов, 4-х приложений, библиографического указателя, включающего 231 источников отечественных и зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 21 таблицей и 20 рисунками.

Работа выполнена в Гематологическом научном центре РАМН (директор академик Воробьев А.И.) в лаборатории иммуногематологии (рук. академик РАМН Зотиков Е.А.) в научном и практическом содружестве с другими лабораториями и отделениями ГНЦ РАМН: высокодозной химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга (рук. чл.- корр. РАМН Савченко В.Г.), экстрокорпарального кровообращения (рук. проф. Калинин Н.Н.), стандартизации групп крови (рук. проф. Донсков СИ.), отделение заготовки крови и ее препаратов (рук. к.м.н. Орлова Г.К.).

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом исследования служили эритроциты и сыворотки 126 больных гемобластозами до и в разные сроки после аллогенной ТКМ и 173 доноров.

Трансплантации выполнены в отделении химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга (зав. — чл.- корр. РАМН Савченко В.Г.) ГНЦ РАМН. Трансплантация КМ проводилась после соответствующей химио - и радиоподготовки реципиентов, обеспечивающей иммунодепрессию и цитотоксическое воздействие на лейкозные клетки реципиента -(миелоаблативный режим), и в ряде случаев был применен немиелоаблативный режим подготовки, вызывающий иммуносупрессию. Пересадку костного мозга осуществляли в среднем из расчета 3,7 х 108 миелокариоцитов на 1 кг веса больного. Среди пациентов было 76 мужчин и 50 женщин. Медиана возраста составила 30 лет (15-46). Реципиентами КМ были больные различными вариантами острых лейкозов - 70 (ОЛ), 44 - хроническим миелолейкозом (ХМЛ), 9 - рефрактерной анемией (МДС), 2 - лимфосаркомой (ЛСА) и 1 -параксизмальной ночной гемоглобинурией (ПНГ).

Донорами являлись сибсы - родные братья (64), сестры (62). Медиана возраста доноров составила 34 года (17-51). До ТКМ исследовали эритроциты, сыворотки реципиентов и доноров; после ТКМ - только реципиентов.

Исследования крови реципиентов после ТКМ проводили 1 раз в неделю на протяжении периода пребывания реципиента в стационаре (от 3 до 7 мес), а после выписки - в контрольные сроки явки. Учитывали динамику эритроцитарного химеризма, титр изогемагглютининов, появление алло - и аутоиммунных противоэритроцитарных антител, оценивали экспрессию антигенов.

В работе использовали общепринятые методы исследования эритроцитарных антигенов и антител: реакцию солевой агглютинации в 96-луночных планшетах при температуре 37°С, 22°С и 8°С; прямой и непрямой антиглобулиновый тест; реакцию агглютинации на плоскости с эритроцитами,

обработанными 1.5% раствором фицина по методике, описанной Р.С. Сахаровым и соавт. (2001) (Иммуносерология, нормативные документы. 1998) (табл. 1).

Определение эритроцитарного химеризма проводили с помощью дифференциальной агглютинации по Эшби (Ез№у) в собственной микромодификации.

Таблица 1

Характеристика материала и методов исследования

№ п/п Исследуемый Материал Методы исследования Исследуемый показатель Кол-во образцов

1 Эритроциты нативные Агглютинация на плоскости Антигены ABO, D, С, с, Е, е, MN 2 912

2 Эритроциты энзимированные Агглютинация на плоскости Группа крови Р, Le, Fy 274

3 Эритроциты нативные и энзимированные Дифференциальная агглютинация в пробирках % химеричных эритроцитов (донорского фенотипа) 12 744

4 Эритроциты реципиентов Прямой антиглобу-линовый тест Фиксированные на эритроцитах антитела 3 186

5 Сыворотки реципиентов и доноров Солевая агглютинация в пробирках Титр полных гемагглютинирующих аир антител 9 558

6 Сыворотки реципиентов и доноров Непрямой антиглобулиновый тест Неполные антитела 285

Итого 28 959

В зависимости от сочетания антигенов донора и реципиента при постановке реакции дифференциальной агглютинации неагглютинированными эритроцитами в одних случаях оставались эритроциты донора, в других -эритроциты реципиента. Расчет % химеричных эритроцитов проводили после подсчета в камере Горяева. Для этого в одну камеру вносили эритроциты из пробирки после контакта с реагентом (опыт), а в другую - из пробирки, в которой эритроциты находились с сывороткой AB(ГV) группы (контроль). Количество химеричных эритроцитов вычисляли по формуле:

X = (п: ]Ч) х 100% (1),

где X - % свободных эритроцитов, п - количество эритроцитов в опыте, N -количество эритроцитов в контроле. Эритроциты пар донор-реципиент, отличающихся по группе крови АВО, например, донор А(П) —► реципиент В(Ш), исследовали с реагентом анти-А и с реагентом анти-В. После контакта с реагентом анти-А неагглютинированными оставались эритроциты В(Ш) (опыт 1), а после контакта с реагентом анти-В - эритроциты А(П) (опыт 2). Сумма неагтлютинированных эритроцитов А(П) и В(Ш) должна равняться 100%. При сумме меньше или больше 100%, полученная разница, указывала на

присутствие у реципиента эритроцитов с антигенами А и В, то есть AB(IV) группы. Количество эритроцитов, содержащих одновременно оба антигена А и В, определяли после контакта с реагентом анти-А и анти-В по формуле:

X дв= 100% - (X а+ X в) (2)

где Хд - % свободных эритроцитов А(П) группы, а Хв - % свободных эритроцитов В(Ш) группы. В этих случаях одновременно присутствовали 3 варианта эритроцитов: А, В, АВ. Этот принцип расчета применяли для различных сочетаний антигенов донора и реципиента.

Если реципиент имел группу крови 0(1), а донор другую, то свободными оставались эритроциты реципиента, а эритроциты донора агглютинировались реагентом. Расчет проводили по той же формуле, а затем из 100% вычитали % эритроцитов реципиента 0(1). Полученная разница соответствовала количеству эритроцитов с донорским фенотипом.

При различиях между парами по антигенам системы резус и АВО определение химеризма проводили по реагентам с антителами к групповым и резус антигенам. Принцип расчета оставался тем же.

Титр естественных изогемагглютининов изучали в те же сроки, что и эритроцитарный химеризм. Сыворотки реципиентов титровали в 96 луночных планшетах и вносили эритроциты с антигенным фенотипом донора КМ. Для контроля специфичности реакцию проводили с аутологичными эритроцитами и эритроцитами 0(1) группы крови. Методы статистической обработки

Цифровые данные подвергали обработке методами вариационной статистики (О.Ю. Реброва «Статистический анализ медицинских данных», 2002). Результаты представлены в виде средних значений со стандартным отклонением. Для сравнения величин использовали критерий Манна-Уитни, z-критерий. Различия считались статистически достоверными при р<0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Исследование доноров и реципиентов до ТКМ

На основании антигенных различий между донором и реципиентом все пары были объединены в 4 группы (табл.2).

Таблица 2

Варианты антигенных различий донора и реципиента

Группы больных (количество) Число пар Группы крови

донора реципиента

I группа ABO разногруппные 8 •А(Ы) 0(1)

несовместимые 5 В(Ш) 0(0

(п = 25) 7 А(П) В(Ш)

3 В(Ш) А(П)

1 AB(IV) А(П)

1 AB(TV) В(Ш)

Группы больных Группы крови

(количество) Число пар

П группа АВО разногруппные 6 0(1) А(П)

совместимые 3 о® В(Ш)

(и =14) 1 0® AB(IV)

3 А(П) AB(IV)

1 В(Ш) AB(IV)

Ш группа АВО 9 D+ D-

идентичные с 10 D- D+

различиями по 4 СС Сс

антигенам: 5 сс Сс

D, С, с, Е, е (п = 37) 2 Сс сс

М, N, Р (п = 22) 2 Сс СС

Fy,Le(n = 3) 2 Ее ее

3 Ее Ее

1 М N

1 N М

3 М MN

1 N MN

4 MN М

3 MN N

4 Рр РР

5 Рр Рр

2 FyA- FyA+

1 LeB+ LeB-

IV группа - 7 0(1) 0(1)

АВО одногрушшые и 10 А(П) А(П)

идентичные по 6 В(Ш) В(Ш)

другим антигенам (п = 25) 2 AB(IV) AB(IV)

ВСЕГО 126

Первую группу составили пары донор-реципиент, несовместимые по антигенам АВО, вторую группу - разногрупнные совместимые, третью группу - идентичные по АВО антигенам с расхождениями по антигенам других систем. Большинство отобранных пар различались по антигенам резус (Б, С, с, Е, е), 22 - по антигенам М, К, Р, Бу и Ье. В IV группу были включены 25 пар идентичных по исследованным антигенам эритроцитов.

У реципиентов и доноров первой группы исследовали титр а и Р изогемагглютининов. Сыворотку реципиента изучали с эритроцитами донора, сыворотку донора - с эритроцитами реципиента.

Таблица 3

Изменение титра а и Р гемагглютининов у реципиентов после плазмообмена (ПО)

Реципиенты титра а — антител титра р - антител Число ПО

до ПО после ПО до ПО после ПО

донор А(П) —» реципиент 0(1)

Б-ш 1:32 1:8 1:8 1:4 2

Д-на 1:16 1:2 1:16 1:8 3

П-ва 1:256 1:16 1:512 1:16 3

Р-с 1:64 1:16 1:64 1:16 2

донор А(П) —»реципиент В(Ш)

Х-ва 1:64 1:2 - - 2

К-на 1:256 1:16 - - 3

донор В(Ш) —> реципиент 0(1)

К-к 1:16 1:8 1:32 1:4 1

донор АВ (IV) —► реципиент В(Ш)

С-ва 1:128 1:4 - - 3

При наличии в сыворотке реципиента до ТКМ антител с титром, превышающим 1:32, проводили замещающий плазмообмен (ПО) с целью уменьшения концентрации антител.

Количество ПО зависело от величины титра и интенсивности его снижения. Из 25 реципиентов первой группы 20 получили ПО, 5 реципиентам ПО не понадобился. В таблице 3 приведены выборочные, наиболее типичные, данные о снижении титра антител и количестве ПО. Эксфузия костного мозга у донора проводилась одновременно с последним ПО у реципиента. Из костномозговой взвеси донора удаляли эритроциты методом седиментации, после чего трансплантировали реципиенту. Эти манипуляции проводились с целью предупреждения посттрансфузионных осложнений гемолитического типа.

В группе совместимых разногруппных пар перед ТКМ из костномозговой взвеси удаляли плазму.

Резус отрицательных женщин (реципиентов и доноров), которые объединены в третью и четвертую группы, исследовали на наличие противорезусной сенсибилизации. У одной пациентки до ТКМ были обнаружены анти-Е антитела в титре 1:8. Так как донор КМ имел антиген Е, то реципиенту для профилактики посттрансфузионного осложнения были проведены 2 ПО. Ни в одном случае в результате ТКМ, несовместимой по антигенам АВО, не наблюдали развития посттрансфузионных осложнений.

КЛАССИФИКАЦИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО ХИМЕРИЗМА

До настоящего времени отсутствовала какая-либо классификация эритроцитарных химер. Имеется лишь определение этого явления: эритроцитарный химеризм — это одновременное присутствие в кровяном русле эритроцитов, имеющих разную группу крови. В литературе используется термин «полный химеризм» и «смешанный химеризм». «Полный химеризм» означает замену фенотипа реципиента на донорский фенотип. Термин «смешанный химеризм» означает одновременную циркуляцию эритроцитов донора и реципиента. На этом существовавшая характеристика химеризма исчерпывается.

Естественно, что такая характеристика химер не отражает всего многообразия процессов, связанных с приживлением костного мозга, а значит, и не дают возможности прогнозировать эффективность ТКМ.

В этой связи, мы сочли целесообразным систематизировать кинетику замещения эритроцитов реципиента на эритроциты донора в виде классификации в зависимости от антигенных различий между донором и реципиентом.

На основании исследования сроков формирования 100% эритропитарного химеризма, особенностей сочетания антител и антигенов у реципиентов выделены четыре условных уровня химеризма, которые были положены в основу классификации: тип, подтип, вариант, подвариант.

Для удобства изложения полученных результатов, приводим разработанную нами классификацию эритропитарного химеризма (рис.1).

Два типа эритроцитарного химеризма полный и смешанный характеризуют сроки формирования 100% химеры. Полный тип включает 2 подтипа: завершенный срочный, который характеризуется 100% заменой эритроцитов реципиента на эритроциты донора в течение 98,7+12,5 дней; завершенный отсроченный, при котором замена на эритроциты донора происходила в среднем через 234+37,8 дня, что соответствует 7,7 мес. после ТКМ.

Смешанный тип характеризуется наличием у реципиента, как аутологичных, так и аллогенных донорских эритроцитов. Этот тип химеризма включает незавершенный подтип, при котором наблюдается либо незавершенная по разным причинам репопуляция эритроцитов донора, либо пассивная транзиторная циркуляция эритроцитов, введенных реципиенту с костным мозгом донора.

Подтипы в зависимости от антигенного состава эритроцитов и характера антител образуют два варианта: клеточный и клеточно-гуморальный.

Клеточный вариант отражает антигенный состав эритроцитов, а именно их принадлежность донору или реципиенту, и включает два подварианта: комбинированный и мозаичный.

Комбинированный подвариант - это одновременное присутствие у реципиента эритроцитов собственного фенотипа, донорского фенотипа, а также и мозаичных эритроцитов.

Мозаичный подвариант химеризма - это одновременное присутствие на эритроцитах антигенов донора и реципиента. Циркуляция химеричных и эритроцитов при каждом из подвариантов может быть пролонгированной или краткосрочной (группы).

Рисунок 1 Классификации эритроцитарного химеризма.

Клеточно-гуморальный вариант эритроцитарного химеризма характеризуется многообразием сочетаний естественных изогемагглютининов и иммунных противоэритроцитарных антител с антигенами эритроцитов.

Выделены 3 подварианта: 1-с естественными изогемагглютининами, которые могут встречаться в различных комбинациях (группы) и соответствовать или не соответствовать группе крови донора и реципиента; 2 -без антител; 3-с антителами иммунной природы к антигенам реципиента или донора.

Таким образом, предлагаемая классификация эритроцитарных химер отражает их характер, форму и вариабельность.

ХАРАКТЕРИСТИКА И ОСОБЕННОСТИ ТИПОВ И ПОДТИПОВ ЭРИТРОЦИТАРНОГО ХИМЕРИЗМА

Полный тип был установлен у 67 их 97 реципиентов и характеризовался 100% замещением эритроцитов реципиента на эритроциты донора. У 30 реципиентов наблюдали смешанный тип химеризма.

Полный тип включает 2 подтипа, один из которых обозначен нами как завершенный срочный, а другой - завершенный отсроченный. Отличие этих подтипов заключалось в сроках формирования 100% химеризма. У 33 реципиентов имелся завершенный срочный подтип, при котором 100%

эритроцитарный химеризм формировался к 98,7+12,5 суткам. К указанному сроку у реципиентов заменялись антигены эритроцитов на антигены донора.

Завершенный отсроченный подтип имели 34 реципиента. Для этого подтипа характерны длительные сроки формирования антигенных замен в фенотипе реципиента, которые происходили в среднем через 234+37,8 суток. Сроки такой замены у отдельных больных колебались от 5 месяцев до двух лет. Отсроченный химеризм является промежуточным между завершенным и незавершенным подтипом.

Трудно прогнозировать развиватие событий в плане конкретных сроков приживления КМ. Индукция и поддержание толерантности у реципиентов позволяет в течение продолжительного времени сосуществовать двум популяциям эритроцитов. Наши наблюдения показали, что антигенные различия донора и реципиента практически не влияли на формирование этого типа ЭХ (табл. 4).

Несмотря на выявленные незначительные колебания в сроках завершенного химеризма, у всех реципиентов с полным типом, завершенным подтипом ЭХ произошло изменение группы крови и других антигенов на антигены донора (табл. 5). Примеры, приведенные в таблице 5, иллюстрируют изменение фенотипа реципиента на фенотип доноров. В ряде случаев реципиенты приобретали антигены, отсутствовавшие у них до ТКМ (строки 2, 3, 5), в других - утрачивали (строки 1, 4, 6, 7), но и в том, и другом случае фенотип становился идентичным донорскому. В сроках формирования 100% химеризма не выявлено значительных различий между группами реципиентов.

Следует отметить, что в процессе замещения антигенов эритроцитов меняется не только фенотип, но и экспрессия антигенов.

Таблица 4

Сроки формирования 100% эритроцитарного химеризма при полном типе, завершенном срочном и завершенном отсроченном подтипах

№ группы Характер антигенных различий Сроки появления 100% химеризма (в днях) у реципиентов:

при завершенным срочном подтипе (п=33) при завершенном отсроченном подтипе (п=34)

I ABO разногруппные несовместимые 102+17,5 218+30,1

П ABO разногруппные совместимые 93 ±8,9 189±20,2

Ш ABO одногруппные, но с различиями по антигенам резус (D, С, с, Е, е) и по антигенам М, N, Рридр. 90+12,7 110±11,2 208+30,2 324+70,8

Таблица 5

Примеры антигенных замен у реципиентов при полном типе, завершенном подтипе

№ п/п Атигены эритроцитов

донора реципиепта до ТКМ реципиента после ТКМ

1. 0(1) (Мссее О(Г) БСсее 0(1) сйссее

2. А(П) БСсее А(П) сйссее А(П) Бссее

3 В(Ш) БСсее А(П) сИссее В(Ш) Бссее

4 АВ(1У) БссЕе М АВ(1У) БссЕе МЫ АВ(ГУ) БссЕе М

5. А(П) БссЕе 0(1) БссЕе А(П) БссЕе

6. 0(1) БссЕе Р- 0(1) БссЕе Р+ 0(1) БссЕе Р-

7. 0(1) сМссее БуА- 0(1) (Мссее БуА+ 0(1) (Иссее БуА-

Примером может служить восстановление выраженности антигена А после ТКМ у больного (Пл-ий), у которого до ТКМ присутствовали эритроциты, примерно 20%, с ослабленной экспрессией антигена А. Они не реагировали с реагентами анти-А, анти-АВ, анти-А1. В то же время выраженность антигенов системы резус и N была нормальной. Донор костного мозга имел одноименную с реципиентом группу крови по АВО и резус. Выраженность антигенов эритроцитов была без особенностей. Серологическим маркером для определения химеризма служили антигены системы М и N.

После ТКМ у реципиента, начиная с 82 суток, отмечалось постепенное восстановление выраженности антигена А. Полное восстановление экспрессии антигена совпало со сроками формирования 100% полного химеризма.

В третьей группе реципиентов химеризм носил смешанный характер и полного замещения эритроцитов реципиента на донорские ни у одного реципиента не отмечали, то есть он оказался незавершенным (рис.2). Смешанный тип, незавершенный подтип выявлен у 30 реципиентов, у 19 из которых концентрация эритроцитов с донорскими антигенами в среднем равнялась 77% (54% - 96%), а у других И реципиентов число химеричных эритроцитов не превышало в среднем 16% (10% - 42%). У большего числа больных развился ранний рецидив основного заболевания, который привел к их гибели.

Рисунок 2. Элиминация эритроцитов донорского фенотипа у 2-х реципиентов со смешанным типом незавершенным подтипом химеризма.

На диаграммах видно, как у двух реципиентов (Ду-ной и Пе-ва) после временного увеличения % эритроцитов донорского фенотипа произошло их уменьшение, что указывало на отторжение пересаженного КМ.

Таким образом, именно изучение сроков формирования эритроцитарного химеризма дало возможность охарактеризовать 2 типа — полный и смешанный; полный тип имеет 2 подтипа - завершенный срочный и завершенный отсроченный. Смешанный тип включает один подтип — незавершенный.

Незавершенный подтип смешанного типа химеризма характеризуется неприживлением костного мозга или развитием раннего рецидива, что может свидетельствовать о несостоятельности трансплантата.

ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОЧНОГО ВАРИАНТА, КОМБИНИРОВАННОГО И МОЗАИЧНОГО ПОДВАРИАНТОВ ЭРИТРОЦИТАРНОГО ХИМЕРИЗМА

Изучение особенностей антигенного состава эритроцитов у реципиентов после ТКМ позволило нам охарактеризовать клеточный вариант и выделить 2 подварианта эритроцитарных химер, одним из которых является комбинированный и мозаичный.

Комбинированный подвариант встречается практически у всех реципиентов, у 33 из 97 как временное краткосрочное состояние при переходе к завершенному химеризму, а у 34 из 97 реципиентов длительное время циркулировали эритроциты с собственными антигенами и эритроциты с

антигенами донора. На рисунке 3 приведен пример комбинированного подварианта химеризма, который наблюдали с 60 по 140 сутки у реципиента Р-С 0(1) при смене группы крови на донорскую. На 100-е сутки было отмечено равное соотношение эритроцитов донора и реципиента. К 175 дню произошла

полная замена группы крови реципиента на антигены донорского фенотипа. %

В%Эр.ДОН.

□% эр.рец.

Дни послеТКМ

Рисунок 3. Пример комбинированного подварианта клеточного варианта химеризма у реципиента Р-С 0(1) группы после ТКМ от донора А(П) группы

Аналогичную динамику комбинированного подварианта клеточного варианта химеризма наблюдали и у других реципиенов. Формирование этого подварианта химеризма не зависело от антигеных различий между донором и реципиентом.

Мозаичный подвариант химеризма необычен тем, что у части реципиентов выявлялись эритроциты, на которых одновременно присутствовали антигенные маркеры донора и реципиента. Иногда такие эритроциты имели антигены родительских гаплотипов (Зотиков Е. А. с соавт., 1999; 2000; 2002; Бабаева А. Г. с соавт., 2003). Такие эритроциты мы назвали мозаичными.

Эритроциты с таким необычным антигенным набором мы выявляли у 21 из 30 обследованных реципиентов. Мозаичные эритроциты чаще появлялись при ТКМ от доноров, отличающихся от реципиента по группе крови или антигенам резус. Однако мозаичность эритроцитов была установлена и при различиях по антигенам резус, М и N а также при идентичности антигенов донора и реципиента.

Так как это явление новое, то мы детально рассмотрим его проявление на конкретных больных (табл. 6).

Таблица 6

Варианты и сроки циркуляции мозаичных эритроцитов у реципиентов

после ТКМ

№ Группа крови % мозаичных эритроцитов мин / макс Сроки

я) а. о в § 1 в и а, мозаичных эритроцитов циркуляции мозаичных эритроцитов (в дн.) формирования 100% химе-изма (в дн.)

1 0(1) БссЕе А0(П) (Мссве 0(Т) сИссее 6/16 с 27 - 75 89

2 В(Ш) БССсее МЫ В(Ш) БСссе МЫ В(Ш)МЮ 8/14 с 31-68 117

3 А(П) БССее 0(0 БСсЕе 0(0 БССее 10/58 с 27 - 78 230

4 А(П)ОССее В(Ш) БСсЕе АВ(1У) 4/16 с 31-109 191

5 А(П) (Мссее В(Ш) БссЕе АВ(1У) Бссее, АВ(1У) сйссее 6/18 10/42 с 17 - 72 с 19-95 184

6 В0(Ш) БСсЕе А0(П) БссЕе 0(0,АВ(1У) 7/26 15/35 с 25-187 с 19-95 203

7. В(Ш) БссЕе А(П) ЕКХее АВ(1У) 19/35 с 15 - 80 206

8. В0(ПГ) БСсее В0(Ш) (Ыссее В(Ш)Бссее 30/57 с 32-234 80

9. В(ПГ) ЕЮсЕе 0© БССее В(Ш) БСсее 5/16 с 23 - 47 89

10. А0(П) БССее В0(Ш) БСсЕе 0(0 Бссее АВ(1У) 5/11 13/18 с 28 - 39 с 32 - 56 113

11. А10(П) 1)ссЕе А10(П) БссЕе 0(1) БссЕе 0(0 БссЕЕ 0(0 Е)ссее 10/35 7/35 10/40 с 10-370 до 3,5 лет

12. * А(П) сШссее МИ А(П) БссЕе N А(П) БссЕе МЫ 13/32 с 702 -832 195 210

13. А(Н) БссЕе В(Ш) БСсЕе АВ(1У) 7/21 с 30 -170 180

14. 0(1) Е>Ссее А^ОО БссЕе 0(01>ссее 9/27 с 31 -94

№ Г руппа крови % мозаичных эритроцитов мин /макс Сроки

я) о. О И о ч 1 о к о р< мозаичных эритроцитов м « I ® | Б £ а» Я 35 Л О' формирования 100% химеризма (в дн.)

15. 0(Г)Г>Ссее А0(П) ЕЮсЕе 0(1) Бссее А(П) БССее 11/30 11/22 с 34 - 81 с 34 - 54 217

16. А(П) с1<1ссее В(Ш) Бссее А(П) Бссее В(Ш) ddccee АВ(Г/)ГН 7/16 15/21 38-59 с 31 - 82 с 53 - 80 85

17. 0(1) БСсее МЫ ООО сИссее МЫ ММ NN 15/23 10/18 с 25 - 69 98

18. А0(П) БСсее А0(П) ddCcee 0(1) гн-0(1)0- 15/30 9/30 с 7-90 42 -130 120

19. А20(11)ВСсЕе А20(П) БСсЕе 0(1) ЕН- 10/15 с 30 - 241

20. Л(П) ОССее А2В(1У) БСсЕе В(Ш)Е>Се 12/19 с 19 -166 181 (80%)

21. В(Ш) сЫссее N 0(1) БссЕс М В(Ш)ГН-0(1) ddccee МЫ 8/16 8/53 19/30 с 5 - 82 86( 52%)

* - у больной мозаичные эритроциты А(П) D+ MN появились на фоне позднего рецидива основного заболевания, при неполной регрессии донорских эритроцитов А(П) DccEe N и восстановлении собственного кроветворения и эритроцитарного фенотипа А(П) dccee MN, после трансфузии донорских лимфоцитов.

Приживление костного мозга у больной Га-ко (№ 6), с группой крови А/0, после ТКМ от донора В/О сопровождалось появлением 35% эритроцитов AB(IV) группы крови и 20% эритроцитов с 0(1) группой. Мозаичные эритроциты А£(ГУ) группы циркулировали с 19 по 95 сутки, а эритроциты 0(1) группы - с 25 по 187 сутки после ТКМ.

Аналогичную картину наблюдали и у больной Ку-ной (№ 10), имевшей группу крови В/О, которой был пересажен костный мозг с группой крови А/0. Мозаичные эритроциты АВ(ГУ) группы в этом случае циркулировали до 56 дней, а эритроциты 0(1) группы выявлялись с 28 по 39 сутки. Важно отметить, что данной больной ни до, ни после ТКМ не проводили трансфузии крови.

Длительность циркуляции мозаичных эритроцитов у разных больных отличалась. Максимальный срок, 170 дней в течение которого циркулировали мозаичные эритроциты АВ(ГУ) группы наблюдали у реципиента Ры-ко В(Ш) группы (№13) при ТКМ от донора А(П) группы крови. У реципиента на 7 сутки после ТКМ появились одновременно с эритроцитами донорского

фенотипа В(Ш) группы и эритроциты, содержащие оба - А и В антигены. Максимальная концентрация мозаичных эритроцитов AB(ГV) у реципиента составила 35%, а продолжительность их циркуляции достигла 170 суток после ТКМ.

У реципиента Ив-вой (№7) А(П) группы крови после ТКМ от донора В(Ш) мозаичные эритроциты АВ(ГУ) появились на 15 сутки, продолжительность их циркуляции составила 80 суток, максимальная

концентрация не превышала 35% (рис. 4). %

О »10 +20 +30 +40 +50 +60 +70 +80 +90 +100 170

Дни после ТКМ

Рисунок 4. Динамика количества химеричных эритроцитов у реципиента В(Ш) после ТКМ от донора А(П), в том числе мозаичных АВ.

Однако циркуляция такого типа мозаичных эритроцитов, хотя и бывает продолжительной (до 5,5 месяцев), в итоге заканчивается их исчезновением из кровяного русла, так как они несут чужеродные антигены. Для реципиента Га-ко (№6) чужеродным являлся антиген В для реципиентов Ку-ной и Ры-ко (№10, 13) - антиген А, содержащийся в мозаичных АВ(!У) эритроцитах. Для костного мозга доноров чужеродным являлись антигены А, В, В соответственно. Можно предположить, что длительная циркуляция мозаичных эритроцитов, превышающая циркуляцию перелитых эритроцитов (3 мес), указывает на то, что мозаичные эритроциты являются потомками эритроидных клеток-предшественников, интегрировавших чужеродный генетический материал на стадии клеток, способных к репопуляции.

Мозаичные эритроциты АВ(ТУ) появлялись независимо от того, принадлежала ли группа А(П) и группа В(Ш) донору или реципиенту.

В таблице 6 приведён ещё один интересный случай. Реципиенту Ха-ву (№16) А(П)Б- трансплантировали КМ донора В(Ш)Б+. У больного были выявлены три варианта мозаичных эритроцитов: В(Ш)Б-, А(П)Б-, АВ(ГУ)В+. Сроки появления и продолжительности циркуляции, указанных видов мозаичных эритроцитов были разными.

Особый интерес представляет второй вариант образования мозаичных эритроцитов в случае ТКМ больному от идентичного донора по групповым антигенам, резус фактору и его разновидностям. Реципиенту Лу-ну (№ 11) А(ГГ) (БссЕе) пересадили костный мозг донора с идентичными антигенами.

При такой ситуации не возможно проследить за динамикой приживления костного мозга донора, а так же установить мозаичность эритроцитов. Тем не менее, мозаичные эритроциты появились и они имели 0(1) группу крови (рис. 5).

Пни после ТКМ

Рисунок 5. Динамика количества мозаичных эритроцитов у реципиента Лу-на после ТКМ от одногруппного донора A(II)D+.

Появление мозаичных эритроцитов мы объясняем тем, что отец сибсов имел 0(1) группу крови, а реципиент и донор костного мозга были гетерозиготными по групповому антигену А, то есть, имели генотип А/0. Резус фактор мозаичных эритроцитов изменился тоже и не соответствовал исходному. Эритроциты имели резус разновидности, соответствующие разновидностям родителей донора и реципиента, а именно DccEE и Dccee. В результате ТКМ у реципиента появилось 35% эритроцитов 0(1) группы, которые на таком уровне циркулировали примерно 170 дней. Далее их количество к 420 дню снизилось до 10% и на этом уровне они оставались более Зх лет.

Аналогичная ситуация имела место и у больной № 19. Однако у данной больной максимальное количество мозаичных эритроцитов 0/0 группы было ниже и достигало лишь 15%, а полное их исчезновение установлено к 241 дню. Следует отметить, что реципиенты №11 и №19 не получали трансфузии крови ни до, ни после ТКМ.

Другая больная № 18, и её донор костного мозга были А/0, но имели различия по резус фактору. Реципиент была резус отрицательной А/0 D-(ddccee), а донор резус положительный А/0 D+ (DCcee). У реципиента после ТКМ появились эритроциты с антигенами, не свойственными ни донору, ни реципиенту, а именно: 0(1) D+ и 0(1) D-. Они составляли после трансплантации костного мозга на 7 сутки 15%, на 10 сутки 30% (максимальное количество), а через 130 дней - 9%. В этом случае имелись две волны мозаичных эритроцитов. Сначала они, по всей видимости, появились на ранних сроках, когда эритроциты донорского фенотипа отсутствовали, а эритроидные клетки-предшественники реципиента ещё активно делились, обеспечивая достаточно высокий уровень эритроцитов фенотипа реципиента. После того, как эритроидные клетки-предшественники донора начали интенсивно делиться,

замещая эритроциты реципиента, появилась вторая волна циркуляции мозаичных эритроцитов. Данный пример указывает также на то, что этот вариант мозаичных эритроцитов можно распознать по резус фактору, не свойственному эритроцитам донора.

У значительного числа больных определение мозаичных эритроцитов затруднено в силу того, что при антигенных комбинациях донора и реципиента антигены мозаичных эритроцитов могут совпадать с таковыми донора. Не исключено, что мозаичных эритроцитов образуется значительно больше, чем это выявлено в настоящей работе.

И, наконец, в этой же таблице приведены 3 случая (№ 2, 12, 17), которые указывают на причастность к образованию эритроцитарной мозаичности М и N антигенов. На примере Но-вой (№ 12) удалось выявить очень важную особенность образования мозаичных эритроцитов в период рецидива основного заболевания. Способность к появлению эритроцитов с мозаичным набором антигенов не была утрачена у данного реципиента, несмотря на регрессию химеризма в период рецидива. Данной больной A(H)D+ (DccEe) N был пересажен костный мозг от донора А(П) D- (dee) MN. После успешной пересадки произошла полная замена эритроцитов реципиента на эритроциты донорского фенотипа. Через 1 год 1мес. после ТКМ развился рецидив заболевания с полной регрессией химеры, восстановлением кроветворения реципиента и возвращением исходной группы крови и резус фактора. Однако 24% из 100% резус положительных эритроцитов стали носителями не только N, но и М антигена, которого у реципиента не было до

ТКМ.

Обращает на себя внимание большая вариабельность срока циркуляции мозаичных эритроцитов 0/0 группы крови. Несомненно, что в тех случаях, когда клон мозаичных эритроцитов циркулирует 200 и более дней, до 3-х лет, указывает на то, что образование таких эритроцитов происходит на очень ранних стадиях эритропоэза, на уровне стволовых клеток. В то же время истощение этого клона клеток может указывать на то, что их образование произошло на уровне уже коммитированных стволовых клеток.

Интеграция чужеродного генетического материала, по-видимому, может происходить на любой стадии эритропоэза в клетках, способных к делению, с участием клеток способных к фагоцитозу: макрофагов, Т- и В-лимфоцитов (Бабаева А. Г., и др., 2003). Поэтому, чем ближе клетки к своей окончательной дифференцировке, тем меньше их способность к репопуляпии и циркуляции в периферической крови.

Таким образом существование такого явления при ТКМ, как мозаицизм не вызывает сомнений. В зарубежной печати в последние годы появились работы, подтверждающие образование мозаичных клеток у больных, а также в эксперименте на животных (Yamamoto F., 1995; Alison M.R et al, 2000; Gunser С, et al., 2004; Flesland O., et al., 2004). Как один из возможных механизмов этого явления рассматривается соматическая гибридизация кроветворных клеток донора и реципиента (Гогичадзе Г.А., 1989; Апап К., et al., 1999; Зотиков Е.А., 2000; Wang X., et al., 2003).

Количество и время циркуляции таких эритроцитов вариабельно. Длительность их циркуляции может указывать на то, что гибридизация произошла на ранних стадиях эритропоэза, на уровне стволовых клеток. Достаточно быстрое истощение этого клона клеток может указывать на то, что изменения происходят на уровне коммитированных стволовых клеток.

ОСОБЕННОСТИ КЛЕТОЧНО-ГУМОРАЛЬНОГО ВАРИАНТА, ПОДВАРИАНТОВ И ГРУПП ЭРИТРОЦИТАРНОГО ХИМЕРИЗМА

При разногруппной по ABO TKM наряду с изменением антигенов эритроцитов происходят сложные процессы, связанные с исчезновением изогемагглютинирующих антител реципиента и образованием антител, соответствующих донорской группе крови. В результате изучения изогемагтлютинирующих антител нами было установлено, что не всегда образются изогемагглютинины, специфичные для определенной группы крови. Отмечены необычные сочетания антигенов эритроцитов и изогемагглютининов в результате приживления костного мозга. Процесс этот носит непредсказуемый характер и отражает особенности приживления КМ. Появление изогемагглютининов донора и исчезновение изогемагглютининов реципиента - это ожидаемая ситуация, которая не всегда возникает в результате формирования 100% эритроцитарного химеризма. Мы наблюдали 3 различных ситуации, которые были определены как 3 подварианта:

- с естественными изогемагглютинами;

- без антител;

- с иммунными антителами.

Эритроцитарные химеры с естественными изогемагглютинирующими антителами характеризуются специфичностью и различными комбинациями естественных изогемагглютининов у реципиентов при полной 100% замене антигенов эритроцитов на донорские. Этот подвариант образует 3 группы: 1. с изогемагглютининами, характерными для изменившейся группы крови; 2. с наличием двух видов гоогемагглютининов - изогемагглютинины реципиента и специфичные для группы крови донора; 3. с сохранением изогемагглклинирующих антител, специфичных для группы крови реципиента при наличии эритроцитов группы крови донора.

У 35 реципиентов выявлялись изогемагглютинины, характерные для изменившейся группы крови. На примере 13 реципиентов приводим варианты изменения изогемагглютининов в соответствии с изменением группы крови на донорскую (табл. 7). У 7 реципиентов после разногруппной несовместимой и 6 реципиентов после разногруппной совместимой по АВО ТКМ произошла смена выработки антител. У реципиента № 12 донор имел AB0(IV) группу крови, поэтому ожидаемая смена антигенов эритроцитов реципиента на донорскую не предполагала выработки антител. Почти среди всех пар донор-реципиент, за исключением №5 и №12 присутствовала 0(1) группа крови, в сыворотке которой циркулировали антитела, одно из которых было

тождественным донору или реципиенту. Это обстоятельство не позволяет однозначно ответить на вопрос, кому принадлежат антитела донору или реципиенту.

Таблица 7

Варианты изогемагглютининов при изменении группы крови реципиента на

донорскую

Реципиенты Группа крови донора Группа крови реципиента

доТКМ после TKM

1. Ба- аш Aß (II) Oaß (Г) AßOD

2. Ва - ев Ар(П) Oaß (Т) Aß (II)

3. По - ва М OD Oaß (Т) AßOD

4. Ре - ас APOD Oaß (I) Aß(ü)

5 Ку - на AßOD Ва(Ш) AßOD

6. Кр - шс Ва(ПГ) Oaß (I) Ba (Ш)

7. Ул-ая* Ва (Ш) Oaß (I) Ва(Ш)

8. Ca - на Oaß(I) Aß(ll) Oaß (T)

9. Аб - на ОаЗ(Г) Aß(II) Oaß (!)

10. Хл - ов Oaß (Г) Aß (П) Oaß (I)

11. Ку-ин* Oaßfl) Ba(HT) Oaß (I)

12. Сы - ва АВо (IV) Ba (III) АВо (IV)

13.Ха-ва Oaß (Г) ABo(IV) Oaß (I)

* - у реципиентов развился рецидив основного заболевания

В литературе имеются данные о том, что зрелые лимфоциты реципиента являются химиорезистентными клетками и могут длительное время сохранять антителпродуцирующую функцию (Mielkcarek M. et al. 2000). Продолжающаяся выработка антител, специфичных для группы крови реципиента, может приводить к отсроченному приживлению эритроидного ростка, гемолизу, а в ряде случаев и к развитию рецидива (Barge A. J. et al. 1989; Heyll A. et al. 1991). Именно эти осложнения наблюдались у части больных этой группы. Так рецидив развился у 2-х больных (№ 7 и 11), а отсроченное приживление и развитие парциальной красноклеточной аплазии наблюдали у реципиентов № 2 и 3. Эти факты лишь косвенно могут говорить о том, что у данных реципиентов в результате полной замены группы крови на группу донора, антитела стали как бы комбинированными, а именно, специфичными к групповым антигенам донора и реципиента.

Таблица 8

Наличие комбинированных изогемагглютинирующих антител специфичных

для группы крови донора и реципиента.

Реципиенты Группа крови донора Груша крови реципиента

доТКМ после TKM

1. Ха-ов AßOD Ва(ПГ) Aßafll)

2. Ве-ев* Aß(II) Ва (Ш) Aßa (II)

3 Зи-ва Ва(Ш) Oaß (I) Baß (Ш)

4. Ши-ов Ва (Ш) Oaß (I) Baß (Ш)

5. Шу-ва* AßdD Oaß (I) Aßa (IT)

6. Bo-en* AßOD Oaß (I) Aßa(II)

*- у реципиентов развился рецидив основного заболевания

Другую группу составили 5 реципиентов, у которых сохранилась выработка собственных изогемагглютининов и появились гемагглютинины, характерные для группы крови донора (табл. 8).

Факт наличия такого сочетания антигенов и антител у реципиентов ставит много вопросов, на которые с помощью серологических методов исследования не представляется возможным дать ответы. Парадоксальность этой ситуации заключается в том, что присутствующие у реципиента антитела направлены к антигенам донора, но не вызывают гемолиза эритроцитов. По-видимому вырабатываются парциальные изогемаглютинины, не реагирующие с групповыми антигенами реципиента. Не исключено, что в основе этого явления лежит повышенная устойчивость мембраны регенерировавших эритроцитов к неблагоприятным воздействиям, в том числе и к гемолизу под воздействием антител (Газарян К.Г., Кульминская А.С., 1975).

Клинически эту ситуацию можно расценить как прогностически неблагоприятную, так как возможное сохранение лимфоцитов продуцирующих антитела, может стать причиной возврата основного заболевания. Следовательно, у реципиентов этой группы, как и у части реципиентов предыдущей группы, в большей степени сохраняется возможность возникновения рецидива заболевания.

У 3 других реципиентов, которым ТКМ осуществлена от доноров 0(1) группы крови, выявлены изогемагтлютинины специфичные для группы крови реципиента. При данном сочетании антигенов, должны образоваться изогемагглютинины (табл. 9). Однако этого не произошло.

У реципиентов №1 и 2 при смене А(П) группы на 0(1) после ТКМ оставались только изогемагглютинины (3, а а — отсутствовали. У третьего реципиента оставались изогемагглютинины специфичными для группы крови реципиента, то есть а, при смене группы крови В(Ш) на 0(1).

Таблица 9

Отсутствие антител донорской специфичности после ТКМ.

или

антител

*- у реципиентов развился рецидив основного заболевания

Мы предполагаем, что в данном случае отсутствие а изогемагглютинирующих антител можно объяснить адсорбцией тканями реципиента, в которых присутствуют групповые А и/или В антигены. Известно, что помимо эритроцитов групповые антигены находятся в клетках эпидермиса, в рецепторах нервов, сосудистом эндотелии и эндотелии многих органов, в клетках слизистых оболочек, то есть практически во всех тканях организма человека (Опо1 Я й а1., 1984; Еа^Ктё, 1998). Следует заметить, что в случаях, когда после ТКМ не обнаруживаются изогемагглютинины донорской специфичности, у реципиентов чаще возникали рецидивы заболевания. Это также может свидетельствовать в пользу того, что у

реципиента сохранились собственные антителпродуцирующие химиорезистентные лимфоциты, которые явились одной из причин возврата заболевания.

Эритроцитарные химеры без естественных изогемагглютинирующих антител.харакгеризуются отсутствием изогемаглютинирующих антитела при полной замене труппы крови на донорскую. Эта группа включала 9 реципиентов, трем из которых произведена АВО совместимая, а 6 - АВО несовместимая ТКМ (табл. 10). У реципиентов с 1 по 3 до ТКМ была АВ(ГУ) группа крови. В результате приживления КМ произошла замена этой группы крови на группу крови В(ГГГ), А(ГГ), А(ГГ) соответственно. Реципиент 4 исходно имел группу крови В(ГГГ), а донор - А(ГГ) группу крови, у остальных реципиентов с 5 по 9 была А(ГГ) группа крови, а доноры - В(ГГГ) группы. У всех указанных реципиентов не только не выработались соответствующие изогемагглютинины, но исчезли и собственные. У 8 реципиентов химеризм был завершенный отсроченный, у 1 - завершенный срочный подтип химеризма.

Таблица 10

Отсутствие изогемагтлютинирующих антител у реципиентов при полном типе эритроцитарного химеризма

Реципиенты Группа крови донора Группа крови реципиента

до ТКМ после ТКМ

1. Из-ов Ва (ПГ) ABo(IV) Во (ПГ)

2. Ка-на Ар (П) АВо (IV) Ао(П)

3. Си-ов Af? (II) АВо (IV) АО®

4. Ив-ва Ва(Ш) Ар(П) Во(П1)

5. Га-ко Ар (И) Ва (Ш) Ао(П)

6. Го-ко АР(П) Ва (III) Ао (1Г)

7. По-ак АР (П) Ва (III) Ао(П)

8. Ры-ко Ар (П) Ва(Ш) Ао(П)

9. Ку-на АР 01) Ва(Ш) Ао (II)

Следует заметить, что у части реципиентов изогемагглютинирующие антитела, специфичные для группы крови донора, либо не образовывались, либо присутствовали кратковременно и в низких титрах. Заслуживает внимания пациентка № 5 с исходным титром а антител 1:256. На протяжении 201 дня наблюдали циркуляцию собственных изогемагглютининов и 181 дня антител Р, принадлежащих донору. Максимальный титр донорских изогемагглютининов был равен 1:32. Через 6 месяцев антитела полностью исчезли, при этом завершенный 100% химеризм регистрировался на 203 сутки. У больной на протяжении всего срока исследования выявляли необычные сочетания групповых антител и антигенов. С 10 суток у нее одновременно с эритроцитами ее группы, то есть В(ГГГ), циркулировали оба изогемагглютинина аир.

После появления эритроцитов донорской группы у реципиента выявляли в определенных соотношениях эритроциты А(П) - донора, В(Ш) -собственные и соответственно а И Р изогемагглютинины. Только через 6 мес. антитела полностью исчезли, а полный 100% химеризм был выявлен несколько позже на 203 сутки после ТКМ. При этом у реципиента произошла замена группы крови на донорскую, а изогемагглютинины отсутствовали.

Исчезновение изогемагглютининов у реципиентов после ТКМ не достаточно изучены. У данной группы пациентов, по всей видимости, вовлечены в процесс иммунологической перестройки несколько механизмов. Один из них, как указывалось выше, предполагает адсорбцию антител тканями реципиента. Другим механизмом может являться реакция «трансплантат против хозяина», направлена против плазматических клеток хозяина и оказывает на них супрессивное воздействие (Bacigalupo A. et al., 1988; Melcarek M et а1., 2000).

Эритроцитарные химеры с иммунными противоэритроцитарными

антителами характеризуются наличием иммунных антител и подразделены нами на 2 группы: 1. - с иммунными антителами к антигенам донора КМ; 2) с иммунными антителами к антигенам реципиента.

У 3 реципиентов 0(1) группы крови образование иммунных антител происходило после ТКМ вследствии иммунизации эритроцитами доноров А(11) группы на этапе неполного химеризма или его отсутствия. У реципиентов отмечалась анемия, в костном мозге - красноклеточная аплазия.

Дни послеТКМ

Рисунок 6. Динамика титра агглютининов после плазмообменов. ПО указаны стрелками. По оси ординат-титр антител, по оси абсцисс - дни после трансплантации.

Для удаления вновь появившихся иммунных антител, специфичных к антигенам донора, были проведены 4 плазмообмена. (Во1ап СБ. et а1., 2001; Матвеенко А.А. и др. 2003). В результате устранения антител появились

эритроциты донорского фенотипа, что привело к установлению 100% эритроцитарного химеризма.

Рисунок 6 демонстрирует снижение у 3-х реципиентов изогемагглюти-нинирующих антител в результате проведения им плазмообменов.

Плазмообмены привели к снижению титра антител против антигенов доноров до минимальных значений и сопровождались увеличением количества эритроцитов донорского фенотипа.

о 5 10 20 30 40 50 00 М 120 «90 110 3«

Дни после ТКМ

Рисунок 7. Восстановление эритроцитарного химеризма после плазмообменов. По оси ординат - % эритроцитов донорского фенотипа, по оси абсцисс - дни после трансплантации. ПО указаны стрелками.

На рисунке 7 видно как резко возросло количество эритроцитов донорского фенотипа у 3-х больных после плазмообменов.

Таким образом, в результате АВО несовместимой ТКМ в трех случаях и совместимой в одном случае у реципиентов длительное время циркулировали собственные изогемагтлютинирующие антитела и образовались иммунные противогрупповые антитела к групповым антигенам донора. Антитела влияли на приживление эритроидного ростка костного мозга, вызывая красноклеточную аплазию и как следствие этого - анемию. Такое состояние, похоже на реакцию «хозяин против трансплантата», при которой имеет место отторжение трансплантата, в данном случае эритроидного ростка костного мозга.

В другом наблюдении (1 больной) вместе с костным мозгом донора реципиенту были перенесены антител продуцирующие клетки донора. В частности, резус положительному реципиенту был трансплантирован костный мозг резус отрицательной сестры, имевшей в анамнезе резус конфликтную беременность. У реципиента развился острый иммунный конфликт, проявившийся в виде бурного гемолиза собственных эритроцитов.

%

О 7 12 20 28 29 30 33 35 40 42 4в 56 51 101 137 150

Дни после ТКМ

Рисунок 8 Динамика эритроцитарного химеризма у больного Г-ва при образовании иммунных противорезусных антител к антигенам реципиента.

По оси абсцисс - сроки после ТКМ, по оси ординат слева - % эритроцитов: а - реципиента D+, б - химеричных D-, по оси ординат справа титр антител: в - анти-D антитела

На рисунке видно, как с нарастанием титра антител произошло резкое уменьшение количества собственных D+ эритроцитов и быстрое нарастание D" эритроцитов донора.

Эти факты еще раз подтверждают известное мнение о том, что женщина, имевшая в анамнезе конфликтной беременности, менее подходящий донор, чем не имевшая или донор-мужчина. Правомерен и другой вывод, о том что изменение титра является важным критерием для осуществления своевременной трансфузионно-эксфузионной терапии.

В литературе имеются подобные сведения, когда у резус положительного реципиента после ТКМ от резус отрицательного донора появились антитела IgM класса, которые приводили к гемолизу эритроцитов (Lee J.H, Mintz P.D., 1993; Esteve J. et al., 1995). Наиболее часто случаи связанные с образованием аллоиммунных антител возникали в результате ТКМ при наличии различиях донора и реципиента по антигенам АВО. Проявлением иммунного конфликтов при ТКМ является красноклеточная аплазия и гемолитическая анемия (Ohashi К. et al., 1994; Lopez A. et al., 1998; Gmur J.P. et al., 1990).

Итак, приведенные серологические особенности позволили нам выделить и охарактеризовать новый клеточно-гуморальный вариант эритроцитарного химеризма, который может быть подразделен на подварианты и группы. Этот вариант химеризма свидетельствует о иммуносерологической реконструкции реципиента в результате ТКМ. Ожидаемое образование изогемагглютининов и неожиданные сочетания антител и антигенов, отсутствие антител или появление иммунных антител к

антигенам, как реципиента, так и донора - все это характеризует сложность процессов приживления костного мозга и имеет значение для выбора тактики трансфузионно-эксфузионной терапии.

СВЯЗЬ ЭРИТРОЦИТАРНОГО ХИМЕРИЗМА С РЕАКЦИЕЙ «ХОЗЯИН ПРОТИВ ТРАНСПЛАНТАТА», «ТРАНСПЛАНТАТ ПРОТИВ ХОЗЯИНА» И РЕЦИДИВОМ ЗАБОЛЕВАНИЯ

Представляет определенный интерес рассмотреть проблему возникновения вторичной болезни или реакции «трансплантат против хозяина» при аллогенной ТКМ от доноров, имеющих отличия по антигенам эритроцитов. Проведенный нами ретроспективный анализ показал, что у 34 (35%) и у 19 (20%) из 97 больных трансплантация сопровождалась острой и хронической реакцией «трансплантат против хозяина». У реципиентов с завершенным срочным подтипом эритроцитарного химеризма чаще, чем у больных с завершенным отсроченным и, особенно, с незавершенным подтипом ЭХ возникала острая реакция «трансплантат против хозяина» (табл. 11). Хроническая форма реакции «трансплантат против хозяина»была установлена у 9 (27%) реципиентов с завершенным срочным и у 7 (23%) - с завершенным отсроченным химеризмом.

У больных с незавершенным химеризмом данное осложнение наблюдалось в 2 раза реже. Количество больных без реакции «трансплантат против хозяина» преобладало в группе с незавершенным химеризмом и составляло 14 (73%) пациентов, в группе с завершенным отсроченным химеризмом - 12 (35%) и только 7(21%) реципиентов с завершенным срочным подтипом.

Таблица 11

Частота вторичной болезни при различном подтипе эритроцитарного

химеризма

Подтип химеризма Число реципиентов Количество реципиентов (%)

с ОРТПХ сХРТПХ безРТПХ

Т.Завершенный срочный 33 17 (52%)* 9 (27%) 7 (21%)

П.Завершенный отсроченный 34 14 (42%) 8 (23%) 12 (35%)

ШНезавершенный 19 3 (16%)* 2(11%) 14 (73%)

Получены различия завершенного срочного и незавершенного подтипа химеризма при острой форме реакции «трансплантат против хозяина» оказались статистически достоверными р<0.05.

Уместно отметить, что в отдельных случаях антигены эритроцитов могут индуцировать реакцию «трансплантат против хозяина». Один случай (Га-ев) является примером участия эритроцитов в развитии острой реакции по типу «трансплантат против хозяина». В данном примере эритроциты играли

роль индикатора, отражающего остроту иммунного конфликта, развившегося за счет переноса с костным мозгом клеток памяти донора, имевшего контакт с антигеном, присутствующим у реципиента и отсутствующим у донора. Клетками мишенями стали эритроциты реципиента, которые были атакованы антителами, образовавшимися у реципиента. Возникшее гемолитическое осложнение проявлялось как реакция костного мозга донора против эритроцитов реципиента.

Связь эритроцитарного химергома с развитием рецидива заболевания.

У реципиентов с незавершенным подтипом химеризма в 2 раза чаще возникали рецидивы заболевания по сравнению с реципиентами, имевшими завершенный срочный подтип эритроцитарного химеризма. Прослеживается определенная тенденция увеличения частоты возникновения рецидивов заболевания у реципиентов с отсутствием 100% эритроцитарного химеризма и сокращения числа рецидивов, почти в два раза, у реципиентов с завершенным срочным подтипом химеризма. Следует заметить, что рецидивы сопровождались в 18% частичной или полной регрессией эритроцитарного химеризма, а в 26% это осложнение происходило на фоне полной химеры (табл. 12).

Таблица 12

Частота рецидивов заболевания при различных типах эритроцитарного

химеризма

Подтип химеризма Число реципиентов в группах Число (%) реципиентов с рецидивом Число реципиентов (%)

с регрессией химеры без регрессии химеры

1.3авершенный срочный 33 8(24%) 2 (6%) 6 (18%)

¡¡.Завершенный отсроченный 34 13 (38 %) 4 (12%) 9 (26%)

Ш.Лезавершенный 19 12 (63%) 10 (52%) 2(11%)

Можно констатировать увеличение частоты рецидивов в зависимости от подтипа химеризма. Так, при завершенном подтипе химеризма рецидивы развились у 8 (24%) больных, причем рецидив с полной регрессией эритроцитарного химеризма наблюдался у 2 (6%) реципиентов, а у 6 (18%) -рецидив не вызвал ни количественного, ни качественного изменения в эритроцитарной химере. Проводимое лечение с помощью адоптивной иммунотерапии у реципиента приводило к возврату полной эритроцитарной химеры,

Наблюдается достоверная зависимость между подтипом химеризма и количеством реципиентов с рецидивом основного заболевания. Так, при незавершенном подтипе химеры количество больных с рецидивом в 2.5 раза больше, чем при завершенном срочном подтипе. Между частотой развития

рецидива заболевания и регрессией химеризма достоверных различий не отмечено.

У 6 других пациентов, как уже отмечалось, ни рецидив заболевания, ни его лечение не отразились на количественном и качественном антигеном составе химер.

Полученные данные свидетельствуют, что эритроцитарный химеризм отражает сложные реконструктивные процессы, происходящие при приживлении костного мозга. Предлагаемая нами классификация эритроцитарного химеризма может быть использована для прогнозирования эффективности ТКМ и обоснованного выбора доноров для компонентной терапии, а также проведения эксфузионной терапии. На основании полученных результатов были разработаны практические рекомендации.

ТАКТИКАТРАНСФУЗИОННО-ЭКСФУЗИОННОЙ ТЕРАПИИ ПОСЛЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ КОСТНОГО МОЗГА (практические рекомендации)

Выбор доноров для трансфузионной терапии реципиентам после АВО разногрушшой трансплантации костного мозга является весьма ответственным моментом. Наряду с достижением лечебного эффекта необходимо сохранить возможность для дальнейшей оценки приживления костного мозга по эритроцитарным антигенам.

При необходимости трансфузионной терапии, которая чаще проводится в раннем посттрансплантационном периоде, в каждом конкретном случае вопрос о том, какой группы переливать эритроциты, тромбоциты и плазму, решался индивидуально для каждого больного. Выбор компонентов крови соответствующего донора основывается не только на клинических, но и на таких иммуногематологических показателях как соотношение эритроцитов реципиента и донора (химера); наличие или отсутствие изогемагглютинирующих антител и их специфичность.

Принципы подбора компонентов крови реципиенту сводятся к следующему:

1. При наличии эритроцитов реципиента, отсутствии эритроцитов донора костного мозга и наличии изогемагглютинирующих антител специфичных для группы крови реципиента рекомендуется переливать все компоненты крови такой же групповой принадлежности, как и у реципиента.

2. При наличии эритроцитов реципиента, отсутствии эритроцитов донора костного мозга, но при наличии изогемагглютинирующих антител специфичных для группы крови реципиента, а также и донора, рекомендуется переливать эритроциты, тромбоциты 0(1) группы крови, а плазму AB(IV) группы.

3. При наличии эритроцитов реципиента, отсутствии эритроцитов донора костного мозга и отсутствии каких-либо изогемагглютинирующих антител следует переливать эритроциты, тромбоциты и плазму группы крови реципиента.

4. При наличии у реципиента смешанного типа эритроцитарного химеризма, то есть эритроцитов реципиента и донора, и отсутствии

юогемагглютБнирующих антител рекомендуется переливать эритроциты и тромбоциты 0(1) группы с минимальным количеством плазмы, а плазму АВ(1У) группы.

5. При наличии у реципиента полного типа химеризма, то есть 100% эритроцитов донора, но с наличием изогемагтлютинирующих антител донора и реципиента следует переливать эритроциты 0(1) группы крови, тромбоциты той группы крови, которая имеется у реципиента. Плазму следует переливать АВ(1У) группы.

6. При наличии у реципиента полного химеризма, то есть 100% эритроцитов донора, но при отсутствии у него изогемагглютинирующих антител, следует переливать эритроциты и тромбоциты такой же групповой принадлежности, как у реципиента, а плазму АВ (IV) группы.

7. При наличии у реципиента полного химеризма, то есть 100% эритроцитов донора и изогемагглютинирующих антител, специфичных для группы крови донора, следует переливать все компоненты с такой же группой крови как у донора.

8. При наличии у реципиента полного химеризма, то есть 100% эритроцитов донора и изогемагглютинирующих антител специфичных для группы крови реципиента следует переливать эритроциты и тромбоциты 0(1) группы крови, а плазму АВ(1У) группы.

9. При наличии иммунных противогрупповых антител, препятствующих нормальному эритропоэзу, приводящих к парциальной красноклеточной аплазии, необходимо провести серию плазмообменов до значительного или полного выведения антител с заменой плазмы реципиента на плазму АВ(1У) группы. При необходимости следует переливать эритроциты и тромбоциты без тех антигенов, к которым имеются у реципиента иммунные противогрупповые антитела.

10.Реципиентам с иммунными противорезусными антителами, вызывающими гемолиз собственных эритроцитов рекомендуется осуществлять индивидуальный подбор доноров с учетом специфичности антител. Переливать эритроциты и тромбоциты следует без тех антигенов, против которых имеются антитела.

В связи с большой вариабельностью эритроцитарного химеризма вопрос

трансфузионной тактики решается отдельно для каждой ситуации, каждого

больного.

ВЫВОДЫ

1. Получены новые данные о вариабельности эритроцитарного химеризма при трансплантации аллогенного костного мозга.

2. Выделены и охарактеризованы 2 типа, 3 подтипа, 2 варианта, подварианты и группы эритроцитарного химеризма. Разработана классификация эритроцитарных химер.

3. Завершенный тип химеризм характеризуется полной заменой эритроцитов реципиента на эритроциты донора в течение 98+12,5 суток (срочный) или 234±37 суток (отсроченный); незавершенный тип

химеризма сопровождался транзиторной циркуляцией эритроцитов донора с последующей их элиминацией.

4. Установлено, что химеризм не зависит от различий донора и реципиента по сильным и слабым антигенам эритроцитов (сочетания донор —> реципиент: А —* В, В —* А, В —► 0; О —* ф, за исключением сочетания донор А реципиент О, при котором 100% химера формируется в три раза дольше, чем при других сочетаниях.

5. Показано, что химеризм проявляется в виде клеточного и клеточно-гуморального варианта. Клеточный химеризм имеет два подварианта: мозаичный и комбинированный. Мозаичный подвариант характеризуется появлением эритроцитов, на которых одновременно присутствуют антигены, как донора, так и реципиента. При комбинированном подварианте присутствуют эритроциты донора и реципиента, а мозаичные эритроциты отсутствуют.

6. Клеточно-гуморальный вариант химеризма, включает 3 подварианта: 1 -одновременное присутствие изогемагглютининов донора и реципиента,

2 - исчезновение ранее имевшихся изогемагглютининов (изогемагглютининов донора или реципиента или обоих одновременно);

3 - присутствие иммунных антител (донор против реципиента, реципиент против донора).

7. Показано, что выработка антител реципиентом против антигенов донора приводит к осложнениям по типу реакции «хозяин против трансплантата», а выработка антител клетками донора против антигенов реципиента приводит к реакции «трансплантат против хозяина».

8. Модифицирован и внедрен в лабораторную практику микрометод определения химер по имуносерологическим маркерам с помощью дифференциальной агглютинации эритроцитов.

9. Предложена классификация эритроцитарного химеризма, которая может быть использована как научное обоснование тактики трансфузионно-эксфузионной терапии реципиентов в различные сроки до и после алломиелотрансплантации, а также прогнозирования реакции «трансплантат против хозяина», «хозяин против трансплантата».

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кореневская М.И., Порешина Л.П., Богоявленская М.П., Манишкина Р.П., Орлов Г.П., Козинец Г.И. Изучение приживляемое™ трансплантированных аллогенных миелокариоцитов. Пробл.гемат.и перелив.крови.1976. 5. С. 24-28.

2. Порешина Л.П., Пискунова Т.М., Васильева М.Н., Красникова НА, Зотиков Е.А. Кровяные химеры при трансплантации костного мозга. Материалы Всесоюзн.симпозиума. Трансплантация костного мозга в клинике и эксперименте. М. 1984. С. 7-8.

3. Файнштейн Ф.Э., Любимова Л.С., Менделеева Л.П., Сукясян Г.В., Зотиков ЕА., Поре ' Кугыгаа Р.М.,. и др.

БИБЛИОТЕКА С Петербург

М М ю

Трансплантация костного мозга при острых лейкозах и апластической анемии. Методические рекомендации. М. 1986. 38 с.

4. Зотиков Е.А., Васильева М.Н., Порешина Л.П, Кутьина P.M., Головкина Л.Л., Любимова Л.С., и др. Оценка вторичной болезни на основании выраженности HLA в плазме реципиента аллогенного костного мозга. Бюлл. эксп. биол.и мед. М. 1995.12. С. 596-598.

5. Зотиков Е.А., Порешина Л.П, Кутьина P.M., Васильева М.Н., Головкина Л.Л., Любимова Л.С, Менделеева Л.П., Савченко В.Г. Иммунологическая реконструкция реципиентов после трансплантации костного мозга аТблизкородственного донора. Иммунология. М. 1996. 3. С. 56-60.

6. Savchenco V., Mendeleeva L., Lubimoya L., Parovitchnicova H., Gribanoba H., Poreshina L., Petrov M. Donor Leukocyte Infusions (DLI) in the Treatment AML Patients Relapsed After Allogeniec Bone Marrow Transplantation. Acute Leukemias V. Experimental Approaches and Management of Refractory Disease Hiddemann etal. (Eds.).Springer-Verlag Berlin.Heidelberg, 1996, p.383-387.

7. Зотиков Е.А., Порешина Л.П., Кутьина Р.М., Васильева М.Н., Любимова Л.С., Менделеева Л.П. Иммунологическая и гематологическая реконструкция реципиента при трансплантации костного мозга от близко родственного донора. Клинич. лаб. диагн. 1997.1. С. 10-13.

8. Порешина Л.П., Клясова Г.А, Любимова Л.С., Зотиков Е.А. Острая реакция трансплантант против хозяина по типу гемолитической болезни у реципиента костного мозга. Новое в трансф. 1997 И. Б. вып. 20. С 64-68.

9. Зотиков Е.А., Порешина Л.П., Любимова Л.С. Трансформация B(III) и A(II) группы крови на AB(IV) при трансплантации костного мозга от HLA идентичных сибсов группы A(II) и B(III). Бюлл. эксп. биол. и мед. 1998. Т. 12, С. 569-571.

10. Любимова Л.С, Савченко В.Г., Менделеева Л.П., Клясова Г.А., Грибанова Е.О., Демидова И.А, Гальцева И.В., Кузьмина Л.А., Момотюк К.С., Кулиев РТ., Зотиков Е.А., Порешина Л.П., Кутьина Р.М, Васильева М.Н., Шпакова А.П., Калинин Н.Н., Ольшанская Ю.В., Гласко Е.Н., Павлова О.А Виноградова О.А Эффективность трансплантации аллогенного костного мозга у больных острыми лейкозами в фазе полной ремиссии и у больных хроническим миелолейкозом в хронической фазе. Тер. архив. 1999. 7. С .27-32.

11.Порешина Л.П., Платонова Т.Л., Любимова Л.С. Эритроцитарный химеризм при алломиелотрансплантации. Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии. С - П. 2000. С. 248.

12.Порешина Л.П., Штырева Е.М., Петрова В.П., Стрельникова Т.Б., и др. Эффект плазмообмена на эритропоэз реципиента после разногрушшой трансплантации костного мозга. Труды IX конференции московского общества гемафереза. Москва. 2001.С. 79-80.

13.3отиков Е.А., Порешина Л.П. Терапевтические возможности трансплантаци аллогенного костного мозга. Иммунология. 2001. 1. С. 57 -58.

14 Demidova Y.A., Olshanskaia Y.V., Poreshina L.P., Misurin A.V., Lisovskaia E.V., Surin V.L, Parovitchmkova E.N., Savchenko V.G. Induction of mixed chimerism in patien after non-myeloablativ stem cell transplantation (SCT)

for high risk hématologie; malignancies. Acute Leukemias DC. 2001. P. 458-462.

15.Порешина Л.П, Васильева М.Н., Зеликов E.A., Любимова Л.С., Демидова И.А., и др. Изменение группы крови АВО системы у реципиентов в результате трансплантации костного мозга. Вестник транспланталогии и искусственных органов. 2002. 3, С. 12-13.

16. Демидова И.А., Ольшанская Ю.В., Порешина Л.П., Кутыша P.M., Сурин

B.Л., Мисюрин А.В., Домрачева Е.В., Паровичникова Е.Н. Савченко В.Г. Особенности приживления костного мозга у пациентов при низкодозных режимах кондиционирования. Пробл.гем.и трансф. 2002. 4. С. 34 -39.

17. Демидова И.А., Ольшанская Ю.В., Порешина Л.П., Паровичникова Е.Н.,и др. Особенности приживления костного мозга у пациентов в ранние сроки после аллогенной трансплантации. Проблемы гематологии и переливания крови. 2002. 3. С. 38-41

18. Демидова И.А., Ольшанская Ю.В., Порешина Л.П., Кутьина P.M., и др.Особенности приживления костного мозга у пациентов при низкодозных режимах кондиционирования. Пробл. гем. и трансф. 2002. 4. С. 34 -39.

19. Зотиков Е.А., Порешина Л.П, Кутьина Р.М., Васильева М.Н., Любимова Л.С., Менделеева Л.П., Демидова И.А., Савченко В.Г. Трансфекция генома реципиента при трансплантации костного мозга HLA идентичного сибса. Пробл. гемат. и переливания крови. 2002.1. С. 31.

20.Бабаева А.Г. Курило Л.Ф., Зотиков Е.А., Белан Е.И., Порешина Л.П., Юдина Н.В. Изменение антигенных свойств эритроцитов и численности хромосом метафазных пластинок клеток костного мозга при аллотрансплантации костного мозга в клинике и эксперименте. Бюлл. Эксп. Биол. 2003.1. С. 86 - 89.

21.Демидова И.А., Савченко В.Г., Ольшанская Ю.В., Порешина Л.П. и др. Аллогенная ТКМ после режимов кондиционирования пониженной интенсивности в терапии больных гемобластозами. Тер. Архив. 2003. 7.

C. 15-21.

22.Зотиков Е.А., Бабаева А.Г., Порешина Л.П. Клеточный химеризм и химеризм клетки при трансплантации костного мозга. М. 2003. 112 с.

23. Demidova LA., Olshanskaia Y.V., Poreshina L.P., Mismrin A.V., Lisovskaia E.y., Surin V.L., Parovichnikova E.N., Savchenko V.G. Induction of Mixed Chimerism in Patients After Non-Myeloablative Stem Cell Transplantation (SCT) for High Risk Haematological Malignancies. Acute Leukemias DC Springer. 2003. P. 514-519.

24. Зотиков Е.А., Бабаева А.Г., Порешина Л.П., Курило Л.Ф. Гибридизация клеток как проблема трансплантации костного мозга. Аллергология ииммунопатология. 2004. 5. С. 141-143.

25.Порешина Л.П., Донсков СИ., Любимова Л.С., Зотиков Е.А. Классификация эритроцитарных химер при трансплантации костного мозга. Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии. С-П. 2004. С. 149.

26.Порешина Л.П. Вариабельность эритроцитарного химеризма при близкородственной аллогенной трансплантации костного мозга. Оборонный комплекс - научно-техническому прогрессу России. М. 2004. Вып. 3. С. 64-72.

Отпечатано в ООО «Аведа» 117342, Москва, ул. Введенского, д.8, тел. 332-50-94.

Формат 60x90/16. Тираж 100 экз. 2,0 п.л. Бумага New SvetoCopy.

92280 8

170

Актуальность проблемы

Огромный опыт, накопленный в области трансплантации костного мозга (ТКМ), как в нашей стране [3, 6, 7, 40, 50, 53, 66, 67, 72, 73], так и за рубежом [94, 139, 190, 191, 192, 248], свидетельствует о том, что в процессе взаимодействия системы хозяин-трансплантат возникают выраженные генетические трансформации, приводящие к появлению химеричных тканей, обладающих новыми свойствами.

В отличие от трансплантации почки и других органов, а также трансфузий крови, при которых совместимость донора и реципиента по антигенам ABO и резус является непреложным правилом [1, 16, 17, 23, 30, 54, 60, 63, 64, 70, 71, 89], при ТКМ указанная совместимость оказалась не столь обязательной. Это обстоятельство указывает на особое место костного мозга среди трансплантируемых тканей и побуждает к поиску адекватных методов исследования посттрансплантационного статуса реципиента.

Взаимодействие генетического аппарата донора и реципиента после ТКМ представляет собой многогранный, часто непредсказуемый процесс, изучение которого сопряжено с большими трудностями и, в первую очередь, с недостатком знаний о механизме формирования химеричных тканей.

Вместе с тем химеризм является важнгым индикатором лечебного эффекта алломиелотранспланитации.

Несмотря на наличие большого арсенала методов исследования химер, основанных на цитогенетическом анализе полового хроматина [14, 87, 249], полимеразной цепной реакции [24, 76, 234], антигенов групповых систем [197], многие научные и методические аспекты этого чрезвычайно важного для трансплонталогии направления, остаются малоизученными.

Не определены типы эритроцитарного химеризма и особенности его формирования, немногочисленны сведения о корреляции химеризма с клиническими проявлениями при ТКМ, далеко не ясна связь эритроцитарного химеризма и реакции трансплантат против хозяина (РТПХ), а также роль собственно групповых антигенов эритроцитов в механизме отторжения трансплантата.

Цель исследования

Установить типы эритроцитарного химеризма при трансплантации аллогенного костного мозга и их корреляцию с приживлением трансплантата.

Задачи исследования

1. Изучить формирование эритроцитарного химеризма с помощью модифицированного микрометода дифференциальной агглютинации (по серологическим различиям системы ABO, Rh-Hr, MN, Р, Le, и др.).

2. Разработать классификацию эритроцитарного химеризма с учетом форм его проявления.

3. Оценить диагностическое значение эритроцитарного химеризма как показателя эффективности алломиелотрансплантации.

Научная новизна исследования

1. Установлено, что формы проявления эритроцитарного химеризма вариабельны. Выделены и охарактеризованы 2 типа, 3 подтипа, 2 варианта и 5 подвариантов эритроцитарных химер.

2. Показано, что типы, подтипы, варианты и подварианты эритроцитарного химеризма отражают характер приживления костного мозга.

3. Выявлена зависимость между типом эритроцитарного химеризма и развитием вторичной болезни.

4. Установлено, что смешанный химеризм ассоциирован с высоким риском возникновения посттрансплантационных рецидивов основного заболевания.

Практическая значимость работы

Предложена классификация эритроцитарного химеризма, которая позволяет прогнозировать РТПХ, развитие посттрансплантационного рецидива основного заболевания, служит критерием при выборе компонентов крови для трансфузионно-эксфузионной терапии реципиентам в различные сроки до и после алломиелотрансплантации.

Внедрение в практику

Основные положения диссертации внедрены в практику работы ГНЦ РАМН, отражены в методических рекомендациях МЗ СССР «Трансплантация костного мозга при острых лейкозах и апластической анемии» М., 1986, включены в цикл лекций по курсу «Основы клинической трансфузиологии», «Иммуносерология» и «Трансфузиология», доложены на конференциях, съездах, международных симпозиумах.

Показатели эритроцитарного химеризма, титра, специфичности антител учитываются при оценке приживления костного мозга и выборе трансфузионно-эксфузионной терапии реципиентам.

Положения, выносимые на защиту

1. Типы эритроцитарного химеризма коррелируют с эффективностью трансплантации костного мозга.

2. Химеризм проявляется в виде клеточного и клеточно-гуморального варианта, подвариантов и групп.

3. Предложенная классификация эритроцитарных химер при трансплантации костного мозга может быть использована для оценки показаний и противопоказаний при трансфузионно-эксфузионной терапии в до и посттрансплантационном периоде.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 26 научных работ, в том числе монография «Клеточный химеризм и химеризм клетки при трансплантации костного мозга» (2003 г) и 1 методические рекомендации « Трансплантация костного мозга при острых лейкозах и апластической анемии» (1986). Из указанного числа работ 17 опубликованы в центральных отечественных и зарубежных изданиях.

ВЫВОДЫ

1. Получены новые данные о вариабельности эритроцитарного химеризма при трансплантации аллогенного костного мозга.

2. Выделены и охарактеризованы 2 типа, 3 подтипа, 2 варианта, подварианты и группы эритроцитарного химеризма. Разработана классификация эритроцитарных химер.

3. Завершенный тип химеризма характеризуется полной заменой эритроцитов реципиента на эритроциты донора в течение 98± 12,5 суток (срочный) или 234±37 суток (отсроченный); незавершенный тип химеризма сопровождался транзиторной циркуляцией эритроцитов донора с последующей их элиминацией.

4. Установлено, что химеризм не зависит от различий донора и реципиента по сильным и слабым антигенам эритроцитов (сочетания донор —► реципиент: А —> В, В —> А, В —> 0; О —> <1), за исключением сочетания донор А реципиент О, при котором 100% химера формируется в три раза дольше, чем при других сочетаниях.

5. Показано, что химеризм проявляется в виде клеточного и клеточно-гуморального варианта. Клеточный химеризм имеет два подварианта: мозаичный и комбинированный. Мозаичный подвариант характеризуется появлением эритроцитов, на которых одновременно присутствуют антигены, как донора, так и реципиента. При комбинированном подварианте присутствуют эритроциты донора и реципиента, а мозаичные эритроциты отсутствуют.

6. Клеточно-гуморальный вариант химеризма, включает три подварианта: 1 - одновременное присутствие изогемагглютининов донора и реципиента, 2 — исчезновение ранее имевшихся изогемагглютининов изогемагглютининов донора или реципиента или обоих одновременно); 3 - присутствие иммунных антител (донор против реципиента, реципиент против донора). г

7. Показано, что выработка антител реципиентом против антигенов •• донора приводит к осложнениям по типу реакции «хозяин против трансплантата», а выработка антител клетками донора против антигенов реципиента приводит к реакции «трансплантат против хозяина».

8. Модифицирован и внедрен в лабораторную практику микрометод определения химер по имуносерологическим маркерам с помощью дифференциальной агглютинации эритроцитов.

9. Предложена классификация эритроцитарного химеризма, которая может быть использована как научное обоснование тактики трансфузионно-эксфузионной терапии реципиентов в различные сроки до и после алломиелотрансплантации, а также прогнозирования реакции «трансплантат против хозяина», «хозяин против трансплантата».

практические рекомендации)

Выбор доноров для трансфузионной терапии реципиентам после ABO разногруппной трансплантации костного мозга является весьма ответственным моментом. Наряду с достижением лечебного эффекта необходимо сохранить возможность для дальнейшей оценки приживления костного мозга по эритроцитарным антигенам.

При необходимости трансфузионной терапии, которая чаще проводится в раннем посттрансплантационном периоде, в каждом конкретном случае вопрос о том, какой группы переливать эритроциты, тромбоциты и плазму, решался индивидуально для каждого больного. Выбор компонентов крови соответствующего донора основывается не только на клинических, но и на таких иммуногематологических показателях как соотношение эритроцитов реципиента и донора (химера); наличие или отсутствие изогемагглютинирующих антител и их специфичность.

Принципы подбора компонентов крови реципиенту сводятся к следующему:

1. При наличии эритроцитов реципиента, отсутствии эритроцитов донора костного мозга и наличии изогемагглютинирующих антител специфичных для группы крови реципиента рекомендуется переливать все компоненты крови такой же групповой принадлежности, как и у реципиента.

2. При наличии эритроцитов реципиента, отсутствии эритроцитов донора костного хмозга, но при наличии изогемагглютинирующих антител специфичных для группы крови реципиента, а также и донора, рекомендуется переливать эритроциты, тромбоциты 0(1) группы крови, а плазму АВ(1У) группы.

3. При наличии эритроцитов реципиента, отсутствии эритроцитов донора костного мозга и отсутствии каких-либо изогемагглютинирующих антител следует переливать эритроциты, тромбоциты и плазму группы крови реципиента.

4. При наличии у реципиента смешанного типа эритроцитарного химеризма, то есть эритроцитов реципиента и донора, и отсутствии изогемагглютинирующих антител рекомендуется переливать эритроциты и тромбоциты 0(1) группы с минимальным количеством плазмы, а плазму АВ(1У) группы.

5. При наличии у реципиента полного типа химеризма, то есть 100% эритроцитов донора, но с наличием изогемагглютинирующих антител донора и реципиента следует переливать эритроциты 0(1) группы крови, тромбоциты той группы крови, которая имеется у реципиента. Плазму следует переливать АВ(1У) группы.

6. При наличии у реципиента полного химеризма, то есть 100% эритроцитов донора, но при отсутствии у него изогемагглютинирующих антител, следует переливать эритроциты и тромбоциты такой же групповой принадлежности, как у реципиента, а плазму АВ(1У) группы.

7. При наличии у реципиента полного химеризма, то есть 100% эритроцитов донора и изогемагглютинирующих антител, специфичных для группы крови донора, следует переливать все компоненты с такой же группой крови как у донора.

8. При наличии у реципиента полного химеризма, то есть 100% эритроцитов донора и изогемагглютинирующих антител специфичных для группы крови реципиента следует переливать эритроциты и тромбоциты 0(1) группы крови, а плазму АВ(1У) группы.

9. При наличии иммунных противогрупповых антител, препятствующих нормальному эритропоэзу, приводящих к парциальной красноклеточной аплазии, необходимо провести серию плазмаобменов до значительного или полного выведения антител с заменой плазмы реципиента на плазму АВ(1У) группы. При необходимости следует переливать эритроциты и тромбоциты без тех антигенов, к которым имеются у реципиента иммунные противогрупповые антитела.

10.Реципиентам с иммунными противорезусными антителами, вызывающими гемолиз собственных эритроцитов рекомендуется осуществлять индивидуальный подбор доноров с учетом специфичности антител. Переливать эритроциты и тромбоциты следует без тех антигенов, против которых имеются антитела.

В связи с большой вариабельностью эритроцитарного химеризма вопрос трансфузионной тактики решается отдельно для каждой ситуации, каждого больного.