Автореферат и диссертация по медицине (14.00.03) на тему:Эпидемиология и молекулярная генетика дефицита 21-гидроксилазы у детей

На правах рукописи

Карева Мария Андреевна

Эпидемиология и молекулярная генетика дефицита 21-гидроксилазы у детей

14.00.03 - Эндокринология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2004

Работа выполнена в ГУ Эндокринологический научный центр Российской академии медицинских наук (директор - академик РАН и РАМН Дедов И.И.)

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Семичева Татьяна Валентиновна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Козлов Геннадий Ильич

кандидат медицинских наук Захарова Екатерина Юрьевна

Ведущая организация:

Российский государственный медицинский университет

Защита диссертации состоится «

2004 года

в 14.00 часов на заседании диссертационного Совета Д 001.013.01 в ГУ Эндокринологический Научный Центр РАМН по адресу: 117036, Москва, ул. Дм. Ульянова, 11.

»

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ ЭНЦ РАМН.

Автореферат разослан «_»_2004г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, доктор медицинских наук

Семичева Т.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Акт уальност ь т ипы.

Врожденная дисфункция коры надпочечников (ВДКН) - это группа аутосомно-рецессивных наследственных болезней, обусловленных дефектами ферментов стероидогенеза. Наиболее распространенной формой является дефицит 21-гидроксилазы, который составляет от 90 до 95% всех вариантов ВДКН. Частота 21-гидроксилазной недостаточности чрезвычайно высока, и в классическом варианте встречается в общей популяции у 1 на 14 199 новорожденных Данные о частоте этого заболевания в России отсутствуют.

Поздняя диагностика ВДКН и несвоевременно начатое лечение приводят к многочисленным осложнениям, таким как смерть в неонатальном периоде вследствие водно-электролитных нарушений, снижение репродуктивной функции, низкорослость и психологические проблемы в связи с необходимостью перемены пола.

Применяемые в настоящее время клинико-лабораторные методы диагностики не всегда позволяют окончательно верифицировать диагноз. Современным дополнительным методом является молекулярно-генетический анализ гена CYP21, кодирующего фермент 21-гидроксилазу. Ген локализован на коротком плече б хромосомы (6р), имеет 10 экзонов и тесно связан с HLA комплексом. На сегодняшний день описано более 50 мутаций в гене CYP21, причем около 90% всех случаев дефицита 21-гидроксилазы приходится на 12 наиболее распространенных мутаций, являющихся результатом конверсии гена 21-гидроксилазы CYP21 с псевдогеном СЭТ"21Р.

В ряде стран проводится неонатальный скрининг для выявления ВДКН. Для этого определяется 17-гидроксипрогестерон - классический маркер 21-гидроксилазного дефицита, в последующем возможно подтверждение диагноза молекулярно-генетическим анализом. Так же возможна пренатальная диагностика в семьях, имеющих детей с данной патологией. В настоящее время проводится внутриутробное лечение плодов женского пола, что снижает степень вирилизации наружных гениталий и позволяет избежать в дальнейшем оперативной коррекции пола.

Для проведения неонатального скрининга необходимо иметь данные о распространенности различных форм ВДКН в российской популяции и о частоте встречаемости различных мутаций гена СУР21 среди российских пациентов. Проведение пренатальной диагностики в семьях с ВДКН возможно при наличии базы данных мутаций СУР21 у больных, их родителей и сибсов.

На сегодняшний день нет единой оптимальной схемы лечения врожденной дисфункции коры надпочечников. Сложность терапии заключается в том, что необходимо добиться подавления избыточной секреции надпочечниковых андрогенов и, следовательно, избежать ускоренного скелетного созревания, одновременно не вызывая торможения скорости роста высокими дозами глюкокортикоидных препаратов. Применяются различные глюкокортикоидные препараты, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки. В мировой практике препаратом выбора у детей является гидрокортизон, в нашей стране до недавнего времени наиболее распространен был преднизолон.

Цель исследования.

Эпидемиологический анализ дефицита 21-гидроксилазы в московской популяции и проведение молекулярно-генетических исследований гена CYP21 у пациентов с врожденной дисфункцией коры надпочечников.

Для осуществления этой цели поставлены следующие задачи

1. создание московского регистра больных ВДКН с базой данных мутаций гена

СТ?21;

2. верификация диагноза с использованием клинических, гормональных и молекулярно-генетических методов исследования;

3. выявление корреляции клинической формы заболевания с генетическим дефектом гена CYP21, определение генетических дефектов, вызывающих тяжелые формы ВДКН;

4. анализ эффективности применяемой терапии, оценка достигаемого конечного роста в зависимости от сроков начала лечения и схемы терашш.

Научная новизна.

Впервые в России на примере московской популяции проведен эпидемиологический анализ 21-гидроксилазной недостаточности. Показана эффективность и необходимость ДНК-диагностики в дополнение к клинико-гормональным методам у пациентов с подозрением на дефицит 21-гидроксилазы. Впервые в России применен метод детекции химерного гена для оценки частоты различных мутаций гена CYP21 в популяции.

Практическая значимость:

Проведенный эпидемиологический анализ позволил оценить распространенность классических форм дефицита 21-гидроксилазы в московской популяции, что является необходимым для подготовки процедуры неонатального скрининга.

По результатам работы показано, что препаратом выбора в терапии 21-гидроксилазной недостаточности у детей допубертатного возраста является гидрокортизон.

Создание базы данных мутаций гена CYP21 в московской популяции позволяет проводить пренатальную диагностику и лечение в семьях, имеющих больных детей.

Апробация работы:

Результаты проведенного исследования доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Клиническая эндокринология: достижения и перспективы» (С.-Петербург, 2003); на 2-ой международной научно-практической конференции «Врачи мира пациентам» (С.-Петербург, 2003); на II Всероссийской научно-практической конференции детских эндокринологов "Эндокринологические аспекты здоровья детей" (Москва, 2003), на 43 конференции Европейского общества педиатров-эндокринологов, (Базель, Швейцария 2004), на межотделенческой научной конференции ЭНЦ РАМН (Москва, 2004).

По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ.

Структура и объем диссертации:

Диссертация состоит из оглавления, введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственного исследования и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Диссертация изложена на 102 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц, иллюстрирована 22 рисунками. Библиография содержит 12 отечественных и 162 зарубежных источников

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Планирование исследования

Исследование планировалось провести по двум направлениям:

1. С целью изучения эпидемиологических характеристик 21-гидроксилазной недостаточности у детей города Москвы планировалось создание регистра, включающего в себя всех московских пациентов с классическими формами данного заболевания в возрасте от 0 до 18 лет.

2. С целью изучения молекулярной генетики 21-гидроксилазной недостаточности в российской популяции планировалось обследование всех детей с данной формой врожденной дисфункции коры надпочечников, обратившихся в Эндокринологический научный центр РАМН с 2001 по 2003 годы.

Характеристика объектов исследования.

Согласно принятым требованиям к созданию регистра нами было использовано 3 независимых источника информации. В регистр были включены пациенты в возрасте от 0 до 18 лет:

1. состоящие на учете у детских окружных эндокринологов города Москвы (10 округов);

2. пациенты, наблюдающиеся в Московском городском эндокринологическом диспансере;

3. пациенты, проходившие стационарное или амбулаторное обследование в детском отделении ЭНЦ РАМН и проживающие в г. Москве.

Кроме того, во избежание утери данных о диагностированных случаях ВДКН, все эндокринологические стационары и амбулатории города Москвы были уведомлены о создании регистра посредством специального информационного письма.

Общеклиническое обследование проводилось в отделении патологии пола и развития (рук. - д м.н. Семичева Т.В.) Института детской эндокринологии (рук. - проф. Петеркова В.А.) Эндокринологического научного центра РАМН (рук. - академик Дедов ИИ.) и включало в себя:

• сбор анамнеза жизни и анамнеза заболевания с учетом предыдущих обследований (фиксировались ежегодные антропометрические данные, доза получаемых препаратов, данные рентгенологического и гормонального обследования);

• клинический осмотр по стандартной методике.

Расчет целевого роста производился по формулам

(рост отца +рост матери + 13см)/2 - для мальчиков

(рост отца +рост матери - 13см)/2 - для девочек.

Вычисление предполагаемого конечного роста производилось по таблицам Вау1еу-Pinneau.

Лабораторные методы исследования включали в себя:

• биохимические исследования (калий, натрий, хлориды, глюкоза), которые проводились в биохимической лаборатории ЭНЦ РАМН (рук. - Ильин А.В.)

• рентгенография кистей для оценки костного возраста (1раз/год) проводилась в рентгенологическом отделении ЭНЦ РАМН (рук. - д м.н. Бухман А.И.);

• гормональные исследования проводились в гормональной лаборатории ЭНЦ РАМН (рук. - проф. Гончаров Н.П), определялись 17-гидроксипрогестерон (17ОНП), активность ренина плазмы (АРП), адренокортикотропный гормон (АКТГ).

При оценке степени компенсации заболевания учитывались следующие параметры: наличие сольтеряющих кризов, темпы физического развития, темпы костного созревания, уровень 17ОНР и АРП.

Молекулярно-генетический анализ проводился в отделе иммуногенетики ЭНЦ РАМН (рук. - км.н. Прокофьев С.А.) и в лаборатории Института молекулярной биологии им. Энгельгардта (рук. - проф. Рубцов П.М.). Помимо детей московской популяции молекулярно-генетические исследования проводились всем детям с классическими формами ВДКН обследованными в Институте детской эндокринологии ЭНЦ РАМН в период с 2001 по 2003 годы.

Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови пациентов по модифицированной методике NJ.GemmeU и S.Akiyama (высаливание хлористым литием)

Детекцию точечных мутаций в гене CYP21 проводили по методике Л. WedeU и Н. Luthman с модификациями. Селективно амшгафицировали фрагменты гена СУР21, используя праймеры, комплементарные участку 8 п.н. в экзоне 3; полученные в результате

амплификации специфические фрагменты ДНК использовали для генотипирования 12-ти точечных мутаций методом аллель-специфической ПЦР.

Детекцию химерного гена CYP21P/CYP21 осуществляли методом Lee EH. и соавт. с модификациями. В первом раунде амплифицировали ген CYP21 и химерный ген CYP21P/CYP21 , во втором — проводили дифференциацию между этими генами амплификацией с набором специфических праймеров.

Прямое секвенирование гена CYP21 проводилось ручным методом и на автоматическом секвенаторе «ABI prism 310» в тех случаях, когда методом аллель-специфической амплификации была выявлена мутация только в одном аллеле.

Статистический анализ.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась с помощью параметрических и непараметрических критериев статистического анализа. Результаты представлены следующим образом: для параметрических критериев - среднее значение ± стандартное отклонение; для непараметрических критериев - медиана (минимальное и максимальное значение). Статистическая обработка производилась на ЮМ-совместимом компьютере с использованием программы SPSS for Windows.

Распространенность 21-гидроксилазной недостаточности, т.е. совокупность всех больных детей (независимо от времени постановки диагноза), приходящихся на 100 000 детского населения, рассчитывалась по формуле:

Распространенность = число выявленных больных детейх 100 000/число детского населения.

При анализе корреляции генотип-фенотип использовался критерий позитивной предсказательной ценности (ППЦ) для различных групп мутаций, который вычислялся по формуле:

ППЦ = количество пациентов с определенной клинической формой / количество пациентов с генотипом соответствующей группы х 100%.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Нами был составлен регистр московских пациентов с классическими формами 21-гидроксилазной недостаточности, в который вошло 88 детей в возрасте от 0 до 18 лет.

На основании полученных нами данных и официальных данных о численности детского населения в Москве мы рассчитали распространенность классических форм 21-гидроксилазной недостаточности в московской популяции, которая составила 5,8 на 100 000 детского населения. Рассчитанная нами распространенность классических форм дефицита 21-гидроксилазы оказалась ниже этого показателя в Европейской популяции, рассчитанной по данным неонатального скрининга, которая составляет 7 на 100 000 детского населения.

Различные формы 21-гидроксилазной недостаточности среди наших пациентов распределились следующим образом: 71 пациент (80,3%) имеет сольтеряющую форму заболевания и 17 пациентов (19,7%) имеют простую вирильную форму (рис. 1). Эти результаты расходятся с мировыми данными, полученными в результате неонатального скрининга Исходя из того, что средняя частота мутаций в гене CYP21 в нашей работе и в работах российских авторов совпадает с европейскими данными, удельный вес мутаций, коррелирующих с сольтеряющей и простой вирильной формами в российской популяции аналогичен мировым данным. И мы вправе ожидать соотношение сольтеряющей и вирильной формы 70% и 30% соответственно. Следует также отметить, что критерием постановки диагноза сольтеряющей форме в нашей работе было повышение активности ренина плазы, т.к. такие дети нуждаются в терапии минералокортикоидами. Если за критерий сольтеряющей формы заболевания брать наличие сольтеряющих кризов у пациента, то и удельный вес сольтеряющей формы в структуре 21-гидроксилазной недостаточности будет ниже.

В созданный московский регистр вошло 48 девочек (54,5%) и 40 мальчиков (45,5%). Таким образом, соотношение жен/муж составило 1 : 0,83. Среди пациентов с сольтеряющей формой заболевания соотношение девочек и мальчиков составило 1 : 1, тогда как среди пациентов с простой вирильной формой -1:0,42 (рис. 1).

При аутосомно-рецессивном варианте наследования болезни, характерном для ВДКН, вероятность развития заболевания у мальчиков и девочек одинаковая. Следовательно, теоретически соотношение мальчиков и девочек, страдающих 21-гидроксилазной недостаточностью, должно составлять 1:1. Несоответствие наших данных предполагаемым результатам у детей с вирильной формой может объясняться

трудностями в диагностике этого заболевания у мальчиков Поэтому мы предполагаем, что у 8 пациентов мужского пола диагноз не установлен

Рис. 1. Распределение пациентов, вошедших в московский регистр, по форме заболевания и полу.

При анализе составленного регистра нами определен средний возраст постановки диагноза при сольтеряющей и простой вирильной формах заболевания в зависимости от пола пациентов В наиболее ранние сроки удается диагностировать сольтеряющую форму заболевания у девочек вследствие наличия у них такого клинического признака, как неправильное строение наружных гениталий Медиана возраста постановки диагноза в данной группе составила 9 дней (2-94) В группе мальчиков с сольтеряющей формой заболевания медиана возраста постановки диагноза составила 30 дней (2-96) (рис 2) Минимальный срок постановки диагноза в этой группе составил 2 дня для пациентов с отягощенным анамнезом (наличие больного ребенка в семье) и 11 дней для остальных мальчиков, максимальный возраст мальчиков на момент постановки сольтеряющей формы 21-гидроксилазной недостаточности составил 96 дней

Рис. 2. Возраст постановки сольтеряющей формы ВДКН

При вирильной форме заболевания сроки постановки диагноза оказались чрезвычайно поздними даже для девочек, которые имеют разную степень вирилизации наружных гениталий. Медиана возраста постановки диагноза в группе девочек составила 0,9 лет (5 дней - 6,3 года), а в группе мальчиков - 5,7 лет (2,3 - 6,4 года) (рис 3). Следует отметить, что минимальный возраст постановки диагноза простой вирильной формы у девочек составил 5 дней Простая вирильная форма 21-гидроксилазной недостаточности установлена до 3 лет жизни лишь у 1 мальчика.

Кол-к

пациента! дмочки мальчики

Возраст (голы)

Рис 3. Возраст постановки вирильной формы ВДКН

Средний костный возраст для мальчиков с вирильной формой заболевания на момент постановки диагноза составил лет Предполагаемый конечный рост

(рассчитанный по таблице Bayley-Pinneau) в этой группе пациентов составил 152 см при целевом росте 174,5 см. Таким образом, дефицит роста в этой группе больных составит около 22 см.

Рис. 4. Уровень калия придиагностике сольтеряющей формы ВДКН Очевидно, что средний возраст постановки диагноза сольтеряющей формы превышал тот срок, при котором манифестирует сольтеряющий синдром у этих детей.

Поэтому интерес представляет уровень электролитов, при котором диагностировано заболевание у наших детей Средний уровень калия на момент постановки диагноза оказался равен 7,0±0,5 ммоль/л (п=59) Неожиданным оказалось, что средний уровень калия достоверно не различался в группе мальчиков и в группе девочек (рис 4) Приходится констатировать, что у 48% девочек диагноз был установлен уже при наличии клинической картины сольтеряющего криза

Интерес представляет уровень 17ОНП крови при постановке диагноза, как основного гормонального критерия 21-гидроксилазной недостаточности Почти у 90% всех детей уровень 17ОНП превышал верхнюю границу чувствительности метода, т е 38,7 нмоль/л для нашей лаборатории. У оставшихся 6 детей уровень 17ОНП колебался в широких пределах, вплоть до нормальных значений (рис 5) В литературе встречаются описания детей с классическими формами 21-гидроксилазной недостаточности, у которых подъем 17ОНП отмечается только к концу 1-го месяца жизни.

Для сравнения нами была обследована группа новорожденных с повышенным уровнем 17ОНП, у которых мы в результате обследования исключили дефицит 21-гидроксилазы В эту группу вошло 5 мальчиков, которые имели клинические проявления сольтеряющего синдрома и 2 девочки с неправильным строением наружных гениталий Уровень 17ОНП у этих детей представлен на рисунке 5 При сравнении этих двух групп пациентов становится очевидным, что уровень 17ОНП у новорожденных не может считаться единственным и абсолютным критерием постановки диагноза

Рис. 5. Уровень 17-гидроксипрогестерона при постановке диагноза ВДКН При анализе терапии у детей с 21-гидроксилазной недостаточностью выявлено, что на сегодняшний день 37 человек (42,0%) получают гидрокортизон, 16 человек (18,3%) принимают преднизолон и 35 человек (39,7%) находятся на сочетанной терапии

гидрокортизоном и преднизолоном (рис 6) Необходимо отметить, что среди детей допубертатного возраста лишь трое получают преднизолон (7%), оставшиеся 42 пациента получают либо гидрокортизон (21 человек - 46%), либо гидрокортизон в сочетании с преднизолоном (22 человека - 47%)

все пациенты пациекты долубертатного возраста

Рис. 6. Распределение схем терапии среди пациентов

Мы проанализировали динамику роста и средние дозы глюкокортикоидных препаратов у детей, вошедших в регистр На рисунке 7 представлены данные роста пациентов, получающих терапию с первого года жизни, т ев данную группу не вошли мальчики с вирильной формой ВДКН. Мы видим, что до 3-5 лет рост наших пациентов не отличается от нормативов, но к пубертатному возрасту (11 лет для девочек и 13 лет для мальчиков) все показатели роста оказались ниже 50 перцентили

дмочки мальчики

Рис.7. Показатели роста на фоне терапии глюкокортикоидами

Мы проанализировали 8Б8 роста у детей, получающих преднизолон с раннего возраста, которые регулярно наблюдались у эндокринолога и, следовательно, имели лучшую компенсацию заболевания Обращает на себя внимание тенденция к снижению

SDS роста с возрастом. Причем в двух крайних возрастных группах мы нашли достоверную разницу, т.е. в группе детей младше 2 лет SDS роста был достоверно выше, чем в группе детей старше 13 лет. Из этого мы сделали вывод, что терапия преднизолоном оказывает негативное влияние на рост, даже при постоянном наблюдении и коррекции дозы препаратов.

Ряс 8. SDS роста в разных возрастных группах на фоне лечения преднизалоном.

Как уже отмечалось, ростовой прогноз у мальчиков с вирильной формой заболевания значительно хуже вследствие поздней диагностики. К моменту постановки диагноза SDS роста при пересчете на костный возраст у этих больных был от -2,6 до -4,4. На сегодняшний день на фоне стандартной терапии глюкокортикоидами (2 пациента дополнительно получали лечение аналогами ГнРГ) SDS роста при расчете на костный возраст составляет от -0,9 до -3,3. Один из наших пациентов достиг своего конечного роста, который составил 164 см

Таблица 1

Динамика роста у мальчиков свирильной формой ВДКН

пациент На момент диагностики На сегодняшний день

возраст SDSpocтa/KB рост возраст SDSpocTa/KB рост

1 6,4 -4,4 145 12,2 -3,3 153

2 5,7 -3,5 148 11,1 -2,1 155

3 5,1 -2,8 161 14,6 -0,9 162

4 2,8 -2,6 154 16,6 -1,6 164

При анализе средней дозы глюкокортикоидных препаратов в перерасчете на мг гидрокортизона/м2 поверхности тела мы получили значительный разброс этого

показателя. При этом медиана дозы получаемых глюкокортикоидов достоверно не отличалась в разные возрастные периоды и составила около 17 мг/м2 (Рис. 9). О»

■

■ в

- % ■ ■ * тт

1

1

0 2 им» 4 » » 10 МЦМИ1 12 14 11 к а

I I

Рис 9. Суточная доза глюкокортикоидных препаратов

Терапия таблетированным гидрокортизоном в Москве проводится в течение последних 6 лет. Мы выделили группу детей, получающих гидрокортизон с первого года жизни. Она включила в себя 18 пациентов. Мы попытались сравнить динамику роста в этой группе с динамикой роста пациентов в группе, аналогичной по возрасту, но получавших преднизолон (всего 31 человек). На рисунке представлены показатели роста в этих двух группах (рис. 10).

4 5 6

возраст(пда)

Рис. 10. Сравнение темпов роста на различных схемах терапии

При сравнении роста в этих двух группах пациентов мы нашли достоверную разницу. К 5-ти годам жизни на фоне терапии гидрокортизоном роста составил +1,1,

а на фоне терапии преднизолоном -1,1 (рис. 11). При этом костный возраст пациентов достоверно не отличался. Следовательно, можно прогнозировать, что конечный рост детей, получающих гидрокортизон, будет выше.

Рис 11. Сравнение SDS роста на различных схемах терапии

Молекулярно-генетический анализ гена СУР21 был проведен 154 пациентам с классическими формами 21-гидроксилазной недостаточности. Мутации в обоих аллелях выявлены у 130 человек, что составляет 84,4%. Из оставшихся 24 пациентов мутация в одном аллеле (т.е. в гетерозиготном состоянии) выявлена у 14 человек, и у 10 пациентов мутаций в гене СУР21 применяемыми нами методами обнаружено не было (табл. 2). Таким образом, эффективность метода аллель-специфической ПЦР для анализа гена СУР21 составила 84,4%.

Таблица 2

Частота обнаружения мутаций гена СУР21

Сольтеряющая форма Вирильная форма Всего

п % при СТ п % при ПВ п %

Мутации в 60 80% 40 81,6% 130 84,4%

2 аллелях

Мутации в 7 9,3% 7 14,3% 14 9,1%

1 аллеле

Мутаций 8 10,7% 2 4,1% 10 6,5%

не выявлено

СТ - сольтеряющая форма, ПВ - простая вирильная форма

Недостатком метода аллель-специфической ПЦР является невозможность различать гомозиготы (одинаковая мутация имеется в двух аллелях) и гемизиготы

(мутация имеется в одном аллеле, а второй при этом делегирован). Это не мешает подтверждению диагноза у этих пациентов и не влияет на прогнозирование тяжести клинических проявлений (т.к. фенотип определяется менее поврежденным аллелем). Однако это не позволяет определить истинную распространенность мутаций в популяции. Решить эту проблему помогает метод детекции химерного гена, разработанный Lee IIH. с соавторами. С помощью данного метода нами выявлено, что каждая мутация присутствует как в гомозиготном, так и в гемизиготном состояниях.

Методом аллель-специфической ПЦР с праймерами для 12 мутаций в сочетании с методом детекции химерного гена проанализировано 308 аллелей. Мутации несут в себе 274 аллеля (88,96%). Распределение мутаций представлено в таблице 3. Таким образом, основной процент всех мутаций приходится на делецию гена (32,47%), на сплайсинговую мутацию во 2-ом интроне (20,78%) и на мутацию в 4-ом экзоне I172N (20,45%).

Таблица 3

Частота различных мутаций гена CYP21

мутация Число аллелей % от аллелей

Del 100 32,47%

I2splice 64 20,78%

I172N 63 20,45%

Q318X 15 4,87%

R356W 14 4,55%

P30L 6 1,95%

V281L 4 1,3%

норма 34 11,04%

Наши данные в целом согласуются с европейскими данными. Распределение мутаций в российской популяции ближе всего к данным шведской и финской популяций. Особенностью российской популяции можно считать относительно высокий удельный вес мутации П72^ Данная точковая мутация приводит к образованию фермента, обладающего активностью 1-2% от нормальной, что достаточно для сохранения минералокортикоидной функции. Следовательно, мутация I172N должна наблюдаться при вирильной форме заболевания. В нашем исследовании мутация I172N встречается у 35 пациентов с вирильной формой (80%) и у 9 пациентов (20%) с сольтеряющей формой

заболевания. Значительная вариация клинических проявлений данной мутации отмечается и другими исследователями.

Мы провели исследование корреляции генотип-фенотип у наших пациентов. Известно, что характер мутации определяет степень потери ферментативной активности и, следовательно, клиническую картину заболевания. Все мутации подразделяют на 3 группы в зависимости от степени функциональной активности мутантного фермента. Соответственно выделяют группу А, куда относят мутации, приводящие к образованию фермента с активностью менее 1% по сравнению с интактным, группу В - активность фермента от 1 до 5% и группу С - активность фермента составляет 40-60%. Мутации группы А, как правило, приводят к сольтеряющей форме заболевания, группы В - к простой вирильной и группы С - к неклассической формам. Так как ВДКН имеет аутосомно-рецессивный тип наследования, то при наличии сочетанных мутаций клиническую картину определяет менее тяжелая, она названа нами определяющей.

Для количественной оценки корреляции генотип-фенотип предложен критерий позитивной предсказательной ценности для генотипов группы А, В и С соответственно. Он рассчитывается как отношение пациентов с соответствующей клинической формой к количеству генотипов данной группы (табл. 4). В нашей работе показатель предсказательной ценности для группы А составил 88,6% и для группы В - 82,86%.

Таблица 4

Корреляция генотип-фенотип в группах мутаций

Группа мутаций Определяющая Число пациентов

(ППЦ) мутация С сольтеряющей формой С вирильной формой

Группа А (88,6%) del 31 -

I2spl 30 6

Q318X 6 1

R 356 W 3 2

Группа В (82,8%) I 172 N 9 35

Группа С P30L - 6

При проведении прямого секвенирования в тех образцах, где были выявлены мутации лишь в 1 аллеле, обнаружены 2 ранее не описанные мутации. Обе мутации точковые: в первом случае замена аргинина на цистеин в 426 положении, во втором

случае это замена глицина на аргинин в 178 положении. Говорить о характере этих мутаций можно лишь после проведения исследования их функциональной активности, поскольку они выявлены у пациентов с вирильной формой заболевания в сочетании с мутацией Т172№

1. По данным регистра определена распространенность классических форм дефицита 21-гидроксилазы в московской популяции, которая составила 5,8 случаев на 100 000 детского населения. Соотношение между девочками и мальчиками при сольтеряющей форме ВДКН составляет 1:1, при вирильной форме - 1 : 0,42, что свидетельствует о недостаточной диагностике вирильной формы заболевания у мальчиков.

2. Результаты исследования свидетельствуют о том, что уровень 17-гидроксипрогестерона не может служить единственным и абсолютным критерием постановки диагноза 21-гидроксилазной недостаточности у новорожденных. У 10% пациентов с ВДКН уровень 17ОНП не был повышен до диагностически значимых показателей, в то время как у такого же количества детей без ВДКН показатели 17ОНП оказались выше нормы.

3. Выявлены поздние сроки диагностики вирильной формы ВДКН у мальчиков (5,7 лет), что значительно ухудшает ростовой прогноз пациентов. На момент постановки диагноза SDS роста в пересчете на костный возраст составил от -2,6 до - 4,4, на данный момент конечный прогнозируемый рост составляет 152 ± 7 см.

4. SDS роста пациентов, получающих терапию гидрокортизоном, был достоверно выше к 5-ти годам жизни, чем у пациентов, получающих терапию преднизолоном. Это делает гидрокортизон препаратом выбора у детей младшего возраста.

5. Наиболее частыми мутациями в нашей группе пациентов являются del, I2splice, I172N. Частота различных мутаций в нашей когорте пациентов существенно не отличается от данных в североевропейской популяции.

6. Нами рассчитан критерий позитивной предсказательной ценности для двух групп генотипов (мутации группы А, при которых активность мутантного фермента менее 1% и мутации группы В, при которой активность мутантного фермента от 1 до 5%). Благодаря этому с вероятностью 88,6% можно прогнозировать развитие сольтеряющей формы заболевания у пациентов с генотипом группы А в российской популяции. Это

позволяет назначать пациентам с генотипом группы А терапию минералокортикоидными препаратами до начала развития сольтеряющего криза.

Практические рекомендации;

1. У новорожденных с неправильным строением наружных гениталий и/или синдромом потери соли обязательным является определение уровня 17ОНП:

• если уровень 17ОНП превышает 40 нмоль/л, то пациентам необходимо незамедлительно начинать глюкокортикоидную терапию и проводить молекулярно-генетический анализ гена CYP21 для прогнозирования формы заболевания и определения тактики дальнейшего лечения.

• если уровень 17ОНП находится в пределах от 20 нмоль/л до 40 нмоль/л, то пациентам показано проведение молекулярно-генетического исследования с диагностической целью.

2. Проведение молекулярно-генетического исследования необходимо в семьях детей с врожденной дисфункцией коры надпочечников для обеспечения возможности пренатальной диагностики.

3. Для лечения врожденной дисфункции коры надпочечников у детей допубертатного возраста препаратом выбора является гидрокортизон в суточной дозе 15мг/м2.

Список публикаций:

1. «Молекулярная диагностика классических форм врожденной дисфункции коры надпочечников (дефицит стгроид-21-гидроксилазы) методом аллель-специфической ПЦР»// 2004 Молекулярная медицина №2, 60-65// Соавторы: Дедов И.И., Орловский И.В., Лоскутова Л.И., Батенева Е.И.., Семичева Т.В., Петеркова ВА.

2. «Врожденная дисфункция коры надпочечников у детей», Пособие для врачей, Москва, 2003//Соавторы: Петеркова ВА., Семичева Т.В., Кузнецова Э.С., Яровая И. С.

3. «Современные методы диагностики и лечения ВДКН у детей»//Материалы 2-ой международной научно-практической конфереции «Врачи мира пациентам» С.-Петербург, 2003 год//Соавторы: Семичева Т.В.

4. «Врожденная дисфункция коры надпочечников у детей (недостаточность 21 -гидроксилазы)»// Информационное письмо (№15)//Москва 2003//Соавторы: Петеркова ВА., Семичева Т.В., Духарева О.В., Андрейченко А.П., Колесникова Г.С., Яровая И.С., Прокофьев С.А, Акжигитова ДА

5. «Метод аллель-специфической ПЦР в диагностике 21-гидроксилазной недостаточности»//Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Клиническая эндокринология: достижения и перспективы». С.-Петербург, 2003// Соавторы: Орловский И.В., Акжигитова Д.А, Лоскутова Л.А, Семичева Т.В., Петеркова В.А.

6. «The spectrum of CYP21 gene mutations in patients with congenital adrenal hyperplasia ofRussian Federation/»/ Abstract of 6th European congress of Endocrinology Lyon, France, April 2003, Р0044//Соавторы: Orlovski I.V., Bateneva E.I., Akzhigitova D.A., Loskutova L.A., Ivoilov V.S., Kuznetsova E.S., Semitcheva T.V., Peterkova VA

7. «Epidemiology and genetics of 21-hydroxylase deficiency»// European Society for Paediatric Endocrinology (ESPE2004), Basel, Switzerland, September 10-13 2004\ Соавторы Akjigitova D, Prokofiev S.A., Semicheva T.V., Peterkova VA

Отпечатано в ООО«Аведа» 117342, Москва, ул. Введенского, д.8, тел. 332-50-94. Формат 60x90/16. Тираж 100 экз. 1,0 п.л. Бумага New SvetoCopy.

»2 65 8 4

Актуальность темы

Врожденная дисфункция коры надпочечников (ВДКН) — это группа аутосомно-рецессивных наследственных болезней, обусловленных дефектами ферментов стероидогенеза. Наиболее распространенной формой является дефицит 21-гидроксилазы, который составляет от 90 до 95% всех вариантов ВДКН. Частота 21-гидроксплазной недостаточности чрезвычайно высока, и в классическом варианте встречается в общей популяции у 1 на 14 199 новорожденных. Данных о частоте этого заболевания в России нет.

Поздняя диагностика ВДКН и несвоевременно начатое лечение приводят к многочисленным осложнениям, таким как смерть в неонатальном периоде вследствие водно-электролитных нарушений, снижение репродуктивной функции, низкорослость и психологические проблемы в связи с необходимостью перемены пола.

Применяемые в настоящее время клинико-лабораторные методы диагностики не всегда позволяют окончательно верифицировать диагноз. Современным дополнительным методом является молекулярно-генетический анализ гена CYP21, кодирующего фермент 21-гидроксилазу. Ген локализован на коротком плече 6 хромосомы (6р), имеет 10 экзонов и тесно связан с HLA комплексом. На сегодняшний день описано больше 50 мутаций в гене CYP21, причем около 90% всех случаев дефицита 21-гидроксилазы приходится на 12 наиболее распространенных мутаций, являющихся результатом конверсии гена 21-гидроксилазы CYP21 с псевдогеном CYP21P.

В ряде стран проводится неонатальный скрининг для выявления ВДКН, основанный на гормональном обследовании (определение 17-гидроксипрогестерона, классического маркера 21-гидрокеилазного дефицита), с последующим подтверждением диагноза молекулярно-генетическим анализом. Так же возможна пренатальная диагностика в семьях, имеющих детей с данной патологией. В настоящее время проводится внутриутробное лечение плодов женского пола, что снижает степень вирилизации наружных гениталий и позволяет избежать в дальнейшем оперативной коррекции пола.

Для проведения неонатального скрининга необходимо иметь данные о распространенности различных форм ВДКН в Российской популяции и о частоте встречаемости различных мутаций гена CYP21 среди российских пациентов. Проведение пренатальной диагностики в семьях с ВДКН возможно при наличии базы данных мутаций CYP21 у больных, их родителей и сибсов.

На сегодняшний день нет единой оптимальной схемы лечения врожденной дисфункции коры надпочечников. Сложность терапии заключается в том, что необходимо добиться подавления избыточной секреции надпочечниковых андрогенов и, следовательно, избежать ускоренного скелетного созревания, одновременно не вызывая торможения скорости роста высокими дозами глюкокортикоидных препаратов. Применяются различные глюкокортикоидные препараты, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки. В мировой практике препаратом выбора у детей является гидрокортизон, в нашей стране до недавнего времени наиболее распространен был преднизолон.

Дель исследования.

Эпидемиологический анализ дефицита 21-гидроксилазы в московской популяции и проведение молекулярно-генетических исследований гена CYP21 у пациентов с врожденной дисфункцией коры надпочечников.

Для осуществления этой цели поставлены следующие задачи:

1. создание московского регистра больных ВДКН с базой данных мутаций гена CYP21;

2. верификация диагноза с использованием клинических, гормональных и молекулярно-генетических методов исследования;

3. выявление корреляции клинической формы заболевания с генетическим дефектом гена CYP21, определение генетических дефектов, вызывающих тяжелые формы ВДКН;

4. анализ эффективности применяемой терапии, оценка достигаемого конечного роста в зависимости от сроков начала лечения и схемы терапии.

Научная новизна.

Впервые в России на примере московской популяции проведен эпидемиологический анализ 21-гидроксилазной недостаточности. Показана эффективность и необходимость ДНК-диагностики в дополнение к клинико-гормональным методам у пациентов с подозрением на дефицит 21-гидроксилазы. Впервые в России применен метод детекции химерного гена для оценки частоты различных мутаций гена CYP21 в популяции.

Практическая значимость:

Проведенный эпидемиологический анализ позволил оценить распространенность классических форм дефицита 21 -гидроксилазы в московской популяции, что является необходимым для подготовки процедуры неонатального скрининга.

По результатам работы показано, что препаратом выбора в терапии 21-гидроксилазной недостаточности у детей допубертатного возраста является гидрокортизон.

Создание базы данных мутаций гена CYP21 в московской популяции позволяет проводить пренатальную диагностику и лечение в семьях, имеющих больных детей.

2. Результаты исследования свидетельствуют о том, что уровень 17-гидроксипрогестерона не может служить единственным и абсолютным критерием постановки диагноза 21-гидроксилазной недостаточности у новорожденных. У 9% пациентов с ВДКН уровень 170НП не был повышен до диагностически значимых показателей, в то время как у такого же количества детей без ВДКН показатели 170НП оказались выше нормы.

3. Выявлены поздние сроки диагностики вирильной формы ВДКН у мальчиков (5,7 лет), что значительно ухудшает ростовой прогноз пациентов. На момент постановки диагноза SDS роста в пересчете на костный возраст составил от -2,6 до — 4,4, на данный момент конечный прогнозируемый рост составляет 152 ± 7 см.

4. SDS роста пациентов, получающих терапию гидрокортизоном, был достоверно выше к 5-ти годам жизни, чем у пациентов, получающих терапию преднизолоном. Это делает гидрокортизон препаратом выбора у детей младшего возраста.

5. Наиболее частыми мутациями в нашей группе пациентов являются del, I2splice, I172N. Частота различных мутаций в нашей когорте пациентов существенно не отличается от данных в североевропейской популяции.

6. Нами рассчитан критерий позитивной предсказательной ценности для двух групп генотипов (мутации группы А, при которых активность мутантного фермента менее 1% и мутации группы В, при которой активность мутантного фермента от 1 до 5%). Благодаря этому с вероятностью 88,6% можно прогнозировать развитие сольтеряющей формы заболевания у пациентов с генотипом группы А в российской популяции. Это позволяет назначать пациентам с генотипом группы А терапию минералокортикоидными препаратами до начала развития сольтеряющего криза.

Практические рекомендации:

1. У новорожденных с неправильным строением наружных гениталий и/или синдромом потери соли обязательным является определение уровня 170НП:

• если уровень 170НП превышает 40 нмоль/л, то пациентам показано незамедлительное назначение глюкокортикоидной терапии и проведение молекулярно-генетического анализа для прогнозирования формы заболевания и определения тактики терапии.

• если уровень 170НП находится в пределах от 20 нмоль/л до 40 нмоль/л, то пациентам показано проведение молекулярно-генетического исследования с диагностической целью.

2. Проведение молекулярно-генетического исследования необходимо в семьях детей с врожденной дисфункцией коры надпочечников для обеспечения возможности пренатальной диагностики.

3. У детей допубертатного возраста препаратом выбора в терапии врожденной дисфункции коры надпочечников является гидрокортизон.