Автореферат и диссертация по медицине (14.00.30) на тему:Эпидемиологическое маркирование изоляторов ВИЧ

РГБ ОД На правах рукописи

2 0 ■ "":

Бочкова Марина Сергеевна

ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ МАРКИРОВАНИЕ ИЗОЛЯТОВ ВИЧ

14.00.30. - эпидемиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1997

Работа выполнена в Центральном НИИ эпидемиологии Минздрава РФ и НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН

Научные руководители: член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор В.В.Покровский доктор медицинских наук Д.Н.Носик

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

Ю.В. Мартынов доктор биологических наук В.В. Зверев

Ведущая организация: Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова

Защита состоится " ¡0 1997 г. в 11 час.

на заседании диссертационного Совета Д 001.07.02 в Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (123098, Москва, ул. Гамалеи 18)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН

Автореферат разослан _1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук,

профессор Е.В. Русакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

ВИЧ-инфекция является глобальной проблемой для здравоохранения большинства стран мира, а борьба с вирусом, вызывающим это заболевание - одной из наиболее актуальных задач, стоящих перед современными учеными. Катастрофическое распространение вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) привело к тому, что это заболевание приняло размеры пандемии, которую охарактеризовали как " чума XX века" ( В.И. Покровский, В.В. Покровский, 1988; В.М. Жданов, 1988). По оценкам экспертов ВОЗ, в настоящее время в мире инфицированы ВИЧ от 10 до 20 миллионов человек. Рост заболеваемости ВИЧ-инфекцией на территории России привел к значительному увеличению количества инфицированных и появлению эпидемических очагов. Однако, в ряде случаев не удается выявить источник инфекции, вызвавший инфицирование. В тоже время бывают случаи, когда требуется документально подтвердить принадлежность ВИЧ-инфицированного к определенному эпидемическому очагу. В связи с этим возникает проблема тшшрования штаммов ВИЧ, циркулирующих на территории Российской Федерации. Для этих целей проводят поиск общего признака или маркера, по которому изоляты ВИЧ можно идентифицировать, и установить их принадлежность к конкретному эпидемическому очагу.

В настоящее время известно несколько методов, которые применяются для типирования изолятов ВИЧ:

а) определение клеточного тропизма;

б) определение чувствительности к лекарственным препаратам;

в) нейтрализация вируса сывороточными антителами;

г) анализ сравнения электрофоретической подвижности гетеродуплексов в полиакриламидном геле.

В России вопросы выделения, культивирования и типирования ВИЧ изучены сравнительно мало, поэтому эта проблема является актуальной для практического здравоохранения.

ЦЕЛЬ настоящего исследования - изучение различных методов типирования изолятов ВИЧ, выделенных от ВИЧ-инфицированных из разных эпидемических очагов для совершенствования системы эпидемиологического надзора за ВИЧ-инфекцией.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Вьщеление изолятов ВИЧ от ВИЧ-инфицированных лиц из разных эпидемических очагов на территории России.

2. Сравнительная характеристика выделенных изолятов ВИЧ из разных эпидемических очагов по спектру их клеточного тропизма и чувствительности к противовирусным препаратам.

3. Эпидемиологическое маркирование изолятов ВИЧ из разных эпидемических очагов с использованием методов: реакции нейтрализации, анализа сравнения электрофоретической подвижности гетеродуплексов в полиакриламидном геле.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые проведено сравнительное титрование изолятов ВИЧ от ВИЧ-инфицированных из разных эпидемических очагов на территории России, что позволило определить наиболее информативный метод для эпидемиологического маркирования циркулирующих штаммов ВИЧ.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Создана коллекция изолятов ВИЧ и банк сывороток крови от 52 ВИЧ-инфицированных из 33 эпидемических очагов.

Показано, что определение спектра клеточного тропизма, чувствительности к лекарственным препаратам, а также использование реакщш нейтрализации для целей эпидемиологического надзора при слежении за распространением ВИЧ-инфекции является нецелесообразным, так как ВИЧ обладает выраженной молекулярной изменчивостью.

Установлено, что для эпидемиологического маркирования может использоваться метод сравнения электрофоретической подвижности гетеродуплексов в полиакриламидном геле.

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ

Результаты исследования использовались при составлении методических рекомендаций "Методические рекомендации по выделению вирусов иммунодефицита человека от ВИЧ-инфицированных лиц и больных СПИДом". Д.Н.Носик, Л.Б.Калпнна,

A.Ю.Злобин,Н.В.Кузнецова, И.А.Киснлева, М.С.Петрова, Е.А.Гущнна,

B.В.Покровский, Е.А.Клещинова.М.С.Бочкова. Методические рекомендации были утверждены Ученым Советом НИИ вирусологии имени Д.И. Ивановского 17.06. ] 991, апробированы и используются в Институте микробиологии имени А.Кирхеиштейна АН Латвии, в Республиканском Центре особоопасных вирусных инфекций Грузии и других.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты работы были доложены на Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 70-летшо Института Пастера в мае 1993г. в г.Санкт-Петербурге. Основные материалы диссертации были представлены на УШ-ой Международной конференции по СПИДу в июле 1992 г. в Амстердаме; на 1Х-ой Международной конференции по СПИДу в июле 1993 г. в Берлине; на Х1-ой Международной конференции по СПИДу в августе 1994г. в Иокагаме. Предварительная экспертиза диссертации состоялась на совместной научной конференции лаборатории СНИЛЭПС ЦНИИЭ и лаборатории вирусов иммунодефицита НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН в ЦНИИ эпидемиологии ГКСЭН РФ 27 мая 1996 года.

ПУБЛИКАЦИИ. Основные положения диссдггации изложены в 14 опубликованных работах.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, состоящих из 4 глав, включая материалы и методы; заключения, выводов, указателя литературы, включающего 183 источника. Материалы диссертации изложены на 184 страницах, содержащих 21 таблицу, 17 рисунков и одну фотографию.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для проведения данного исследования были сформированы 3 группы наблюдения ВИЧ-инфицированных, которые набирались из пациентов КИБ N2 г. Москвы за период 1990-1993 годы.

1-ая группа - взрослые, 38 человек из 12 городов и 4-х областей СНГ, отсутствовал общий источник инфекции. Передача ВИЧ осуществлялась половым путем.

2-ая группа - дети, 9 человек из Элистинского очага 1988г. Передача вируса иммунодефицита человека осуществлялась парентеральным путем за счет использования нестерильных инструментов при парентеральных процедурах. Был установлен общий источник инфекции.

3-ья группа - пять человек из Смоленского очага 1987г. Передача ВИЧ осуществлялась парентеральным путем и половым путем. Был установлен общий источник инфекции.

Общее количество ВИЧ-инфицированных детей в группах наблюдения-11, а взрослых - 41. Дети в возрасте ог 2 до 13 лет, взрослые от 18 до 63 лет. Количество ВИЧ-инфицированных мужчин - 31, жешцин-21. Соотношение количества ВИЧ-инфицированных мужчин и женщин - 1:0,68. Данные по распределению больных в зависимости от стадии болезни показали, что среди взрослых и детей, 73°/о обследованных находились на стадии вторичных проявлений ВИЧ-инфекции. Для типирования изолятов ВИЧ применяли методы, основанные на изучении их биологических свойств, включая определение: спектра клеточного тропизма, чувствительности к лекарствашым препаратам, серологических различий изолятов ВИЧ и молекулярной изменчивости. Исследования по типированию изолятов ВИЧ методом сравнения электрофоретической подвижности гетеродуплексов в полиакриламидном геле проводились совместно с лабораторией острых лейкозов института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, заведующий лабораторией -А.Ф.Бобков.

Для детекции антигена р24 в культуральной жидкости использовали метод иммуноферментного анализа. Для определения антигена р24 в перевиваемых клеточных линиях: МТ-4, СЕМ, Jurkat tat, применяли метод непрямой иммунофлюоресценции, полимеразную цепную реакцию, электронную микроскопию.

У совершенствование методов, выделения изолятов ВИЧ от ВИЧ-инфицированных и культивирования изолятов ВИЧ, стало возможным при применении культуральной посуды небольших обьемов для достижения оптимальной плотности клеточной суспензии, как непосредственно в день выделения из о лята ВИЧ, так и на отдельных этапахкулътивирования изолятов ВИЧ. Более ранняя сокультивация инфицированных лимфоцитов с донорскими и с перевиваемыми клеточными линиями, добавление стимулирующих лимфоциты реагентов - позволило повысить эффективность метода выделения изолятов ВИЧ до 86%, вместо ранее известного интервала от 47% до 72%. Всего было выделено 59 изолятов ВИЧ от 52 ВИЧ-инфицированных, семь из них - парные.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Проведено выделение изолятов ВИЧ от инфицированных из 33 эпидемических очагов ВИЧ-инфекции, причем в семи эпидемических очагах источник инфекции был установлен, а для 26 ВИЧ-инфицированных источник инфекции не был установлен. Изучение эпидемиологических характеристик исследуемой группы ВИЧ-инфицированных показало, что доминировал половой путь передачи ВИЧ, который был зарегистрирован в 40 случаях от всех наблюдений. Гомосексуальные контакты были главным фактором заражения и отмечены в 22 случаях наблюдения, а гетеросексуальные контакты - в 18 случаях от всей выборки. Заражение ВИЧ детей и взрослых при переливании крови и кровепродуктов от ВИЧ-инфицированных доноров выявлено в двух случаях, а от пребывания в нозокомиальном очаге - в десяти. Наблюдаемые пациенты по эпидемиологическим показаниям: общие половые партнеры, дети ВИЧ-инфицированных и их ВИЧ-инфицированные матери; доноры и реципиенты инфицированной крови, а также дети, находившиеся в очаге ВИЧ-инфекции - объедеиены в эпидемиологические цепочки. В состав семи эпидемиологических цепочек вошло 26 ВИЧ-инфицированных, что составило 50 % от исследуемой группы. Это пациенты из эпидемических очагов в городах: Москва, Элиста, Фергана, Свердловск, Смоленск, Артемовск (Донецкая область). Половые партнеры с риском заражения ВИЧ при гетеросексуальных контактах представлены эпидемиологическими цепочками: N1 (19, 59) г.Москва, N4(55, 65) г. Фергана и N6 (17, 18) из Донецкой области.

Половые партнеры с риском заражения ВИЧ при гомосексуальных контактах объеденены в эпидемиологические цепочки N5 (45, 50, 51, 54) из г. Свердловска и N2 (23, 66) из г. Москвы. Донор и реципиенты крови - эпидемиологическая цепочка N7 (61, 62, 47, 48, 68), из г. Смоленска. В этой эпидемиологической цепочке присутствовало четыре фактора заражения ВИЧ: гомосексуальный контакт, переливание крови от ВИЧ-инфицированного донора, гетеросексуальный контакт, пребывание в нозокомиальном очаге. Дети, находившиеся в очаге ВИЧ-инфекции, представлены эпидемиологической цепочкой N3 (3, 12, 15, 26,31,32, 35, 56, 69), г. Элиста. Фактор заражения ВИЧ - пребывание в нозокомиальном очаге, когда могла быть реализована передача ВИЧ в результате многократного использования одного итого же шприца.

Определение в ИФА уровня одного из специфических антигенов ВИЧ показало, что при инфицировании изолятами ВИЧ перевиваемых лимфобластоидных клеточных линий максимальный уровень продукции антигена р24 в культуральной жидкости варьировал от 3-5 дней после заражения до 15-20 дней в зависимости от вида клеточной культуры и изолята ВИЧ. Наиболее часто в зараженных клетках обнаруживали образовавшиеся в результате вирусиндуцированных слияний клеточных мембран гигантские клетки - синцитии. В других случаях подобные структуры отсутствовали, однако отмечался сильный цитодеструктивный эффект. Цитопатическое действие изолятов ВИЧ-1 на различных перевиваемых клеточных линиях проявлялось по разному. Одни изоляты ВИЧ вызывали цитопатическое действие, сопровождавшееся сморщиванием, деградацией отдельных клеток с последующей их гибелью, а другие изоляты ВИЧ приводили к формированию клеточных конгломератов-синцитиев, в основном мелких, с разной степенью деградации внутри mix клеток. В зависимости от изолята и клеточной культуры происходило преобладание одного или другого процесса. Сроки образования синцитиев в инфицированных клетках были связаны с инфекционной активностью изолятов ВИЧ, у отдельных изолятов ВИЧ они появлялись на 2—5 сутки.

Типирование изолятов ВИЧ из разных эпидемических очагов на 3-х перевиваемых клеточных линиях: МТ-4, СЕМ, Jurkat tat - по уровню со дер жатая р 24, по числу погибших клегок, по способности инфицировать перевиваемые клеточные линии и образовывать синцитии показало, что в результате типирования по 4-м вышеперечисленным критериям все, выделенные штаммы ВИЧ можно

разделнть только на две группы: высокоинфекцпониые п шпкоинфекционные.

По уровню содержания р24 в культуральной жидкости все выделенные изоляты ВИЧ были также разделены на две группы: а) к высоконнфекционным нзолятам ВИЧ были отнесены 23 штамма (38,98 %) с содержанием р24 выше ЮОикг/мл: б) к низкоинфекционным изолятам ВИЧ были отнесены 36 штаммов (61,02%) с содержанием р24 ниже ЮОикг/мл. По проценту погибших клеток также наблюдалось деление на две группы. К высокоинфекционным изолятам ВИЧ были отнесены изоляты ВИЧ, которые па перевиваемых клеточных линиях вызывали цитопатическое действие 25% и выше. Высокоинфекционные изоляты ВИЧ инфицировали клеточные линии МТ-4, Jurkat tat, СЕМ в 100% случаев, а низкоинфекциошгые изоляты ВИЧ в 92% случаев инфицировали только клеточную линии Jurkat tat, а клеточные линии МТ-4 н СЕМ лишь в 2% и 4% соответственно. Высокоинфекцнонные изоляты ВИЧ в 95% случаев образовывали синцитии на этих клеточных линиях, а ннзкоинфекционные изоляты ВИЧ в 21% случаев образуют синцитии на трех клеточных линиях. Причем максимально эта способность реализовалась у высокоинфекционных изолятов ВИЧ на клеточной линии Jurkat tat, а на клеточных линиях МТ-4 и СЕМ от 30% до 15 % соответственно.

При типировании " близкородственных" изолятов ВИЧ, то есть из одной эпидемиологической цепочки, на 4-х клеточных линиях: СЕМ, Jurkat tat, МТ-4, Н9 по уровню содержания р24 и количеству погибших клеток было установлено, что в эпидемиологических цепочках присутствовали одновременно, как высокоинфекционные, так и низкоинфекционные изоляты ВИЧ, причем в разных соотношениях. Таким образом даже изоляты ВИЧ из одной эпидемиологической цепочки на клеточных линиях проявляли разную способность инфицировать клеточные линии.

Предварительноетипирование 23 изолятов ВИЧ из восьми эпидемических очагов, включая три парных изолята ВИЧ от трех ВИЧ-инфицированных, методом сравнения электрофоретической подвижности гетер о дуплексов в полиакриламидном геле позволило выявить особенности структуры генома ВИЧ-1 в области гена "env" и отнести их соответственно к 4-м субтипам: G,B,A,C. У филогенетически близких изолятов ВИЧ, принадлежащих к одному и тому же субтипу по гену "env" ВИЧ-1, определена разная чувствительность к противовирусным препаратам. У девяти (39,13 %) изолятов ВИЧ из 23 была обнаружена чувствительность к азидотимпдину и у 11 (47,82%)

изолятов ВИЧ - к ридостину. Репродукция изолятов ВИЧ-1 чувствительных к азидотимидину ингибировалась в концентрациях 0,05 - 0,001 мкМ, причем выраженный противовирусный эффект отмечался при одновременном введении препарата и ВИЧ. В этом случае жизнеспособность инфицированных клеток сохранялась от 70% до 80%. Концентрация азидотимидина 0,0005 мкМ была недостаточной для подавления цитодеструктивного действия ВИЧ. При использовании ридостина в дозах 50 - 100 мкг/мл пятьдесят процентов клеток оставались жизнеспособными после инфицирования к четвертому дню. К седьмому дню культивирования количество жизнеспособных клеток возрастало и составляло 70%- 75% при всех концентрациях препарата. При увеличении концентращш ридостина до 200 мкг/мл защитный эффект снижался из-за сильного цитопатического действия самого препарата. Степень защиты от цитопатического действия вирусов и уровень подавления вирусного антигена р24: различались у разных изолятов ВИЧ, что по-всей видимости, связано с их биологической неоднородностью.

Отмечено, что наиболее чувствительными к действию азидотимидина и ридостина были изоляты ВИЧ от бессимптомных пациентов, не принимавших противовирусные препараты. В тоже время изоляты ВИЧ от леченных азидотимидином были более устойчивыми к действию противовирусных препаратов, в сравнении с изолятами, выделенными от нелеченных (t>2, Р<0,05). В ряде случаев требовалось 10-кратное увеличение дозы препарата, чтобы достичь эффект ингибиции репродукции вируса. Причем даже у филогенетически близких изолятов ВИЧ, то есть из одной эпидемиологической цепочки или у парных изолятов ВИЧ, при наличии одинакового субтипа, но разной инфекционной активности была отмечена разная чувствительность к противовирусным препаратам, (таблица 1)

Исследование серологических свойств изолятов ВИЧ из разных эпидемических очагов проводили как с целью выяснения связи между выделенными штаммами, так и для гипирования изолятов ВИЧ. Для этого применялась перекрестная реакция нейтрализации на перевиваемой клеточной линии Jurkat. По данным эпидемиологического расследования эпидемический очаг в стационаре г. Элисты имел общий источник инфицирования. Им был ВИЧ-инфицированный пациент N1 - грудной ребенок, рожденный от ВИЧ-1 позитивных родителей. Отец инфицированного ребенка мог быть заражен в период с 1980 по 1981 годы, когда находился в республике Конго (В.В. Покровский,

Таблица 1

Результаты типирования изолятов ВИЧ-1 из разных эпидемиологических цепочек по их чувствительности к противовирусным препаратам

Номер эпид Номер изолята Инфекционная Чувств! цельность изолятов ВИЧ-1 к Субтип изолятов ВИЧ-1

цепочки ВИЧ-1 активность азидоти-мидину ридостину по гену "епу"

3 О нет +

3 31 О + + О

56 о + +

69 о нет нет

45 о + +

5 50 51 о о нет нет + нет В

54 о нет нет

6 17 18 о О нет нет + нет С

61 о нет +

7 62 47 О О + + нет нет А

48 о нет нет

® - Высокоинфекционные изоляты ВИЧ о - Низкоинфекционные нзоляты ВИЧ - подавляется репродукция вируса при концентрации азидотимидина 0,05 - 0,001 мкМ при дозе ридостина 50 - 100 мкг/мл

исоавт. 1991) Для подтвержден™ этого факта связи между- изолятами ВИЧ выделенными от разных ВИЧ-инфицированных из одного эпидемического очага была проведена перекрестная реакция нейтрализации, выделенных штаммов ВИЧ. В реакции были использованы: сыворотка крови N56 (г. Элиста, путь передачи вируса - шприцевой), аугоизоляг ВИЧ- 1/N56 (г.Элиста) и изолят BM4-1/N26 от ребенка (г. Элиста, путь передачи вируса - шприцевой). Было установлено, что сыворотка крови N56 в разведении 1:10 нейтрализовала вышеперечисленные изоляты ВИЧ, что указывало на принадлежность их к одному очагу.

Для подтверждения возможности типирования изолятов ВИЧ данным методом был выполнен эксперимент, в котором двумя сыворотками крови N56 (г. Элиста, шприцевой путь передачи ВИЧ) и N51 (г.Свердловск, полов ой путь передачи ВИЧ) в 3-хразведениях(1:10, 1:100, 1:1000) была проведена перекрестная реакция нейтрализации 8 изолятов ВИЧ. У семи вирусных штаммов (ВИЧ-1: N5, N23, N25, N27, N37, N39, N51) путь передачи вируса - половой и у ВИЧ-1/№ 1 (г.Элиста, путь передачи ВИЧ - шприцевой). Результаты эксперимента показали, что сыворотка крови N56 нейтрализовала 7 изолятов ВИЧ из разных эпидемических очагов, с которыми эпидемиологически эта сыворотка крови не связана, в тоже время она не нейтрализовала изолят BH4-1/N31, который из того же эпидемического очага, что и сыворотка крови N56. Сыворотка крови N51, напротив, не нейтрализовала ни один изолят ВИЧ, вкшочая изолят, выделенный от того же ВИЧ-инфицированного, от которого получена эта сыворотка крови.

Для того, чтобы выяснить насколько часто происходит нейтрализация изолятов ВИЧ сыворотками крови, полученными от ВИЧ-инфицированных, от которых выделен аутоизолят ВИЧ и каков разброс по нейтрализующей активности при перекрестной нейтрализации изолятов ВИЧ сыворотками крови, как эпидемиологически с ними связанными, так и эпидемиологически с ними несвязанными, был поставлен следующий эксперимент. Для реакции нейтрализации 56 изолятов ВИЧ-1 было взято соответственно 56 сывороток крови, полученных от тех же пациентов, от которых были выделены изоляты ВИЧ. Для перекрестной реакции нейтрализации 56 изолятов ВИЧ из 31 эпидемического очага были отобраны 6 сывороток крови из шести эпидемических очагов. Три сыворотки крови: 31, 51 и 61 - принадлежали к эпидемическим очагам, в которых имелись эпидемиологические цепочки и три

сыворотки крови : 5, 27 ц 39 от ВИЧ-инфицированных пациентов, для которых источник инфекции не был выявлен. Установлено, что только 24 изолята ВИЧ-1 из 56 нейтрализовались сыворотками крови, полученными от того же пациента, от которого выделен аутоштамм. У тридцати изолятов ВИЧ-1 из 56 отмечалась нейтрализация сыворотками крови, полученными не от тех ВИЧ-инфицированных, от которых выделены нзоляты ВИЧ, то есть от других ВИЧ-инфицированных, которые эпидемиологически между собой не связаны. Кроме этого наблюдался большой разброс по нейтрализующей активности среди сывороток крови. Так, для сыворотки крови N27 реакция нейтрализации регистрировалась в 30 случаях, а дата сыворотки крови N39 в 28 из 56 случаев. Для сыворотки крови N5 реакция нейтрализации отмечалась в 8 случаях из 56, а для сыворотки крови N51 - в 10 случаях. В таблице 2 представлены результаты перекрестной реакции нейтрализации шеста изолятов ВИЧ из шести разных эпидемических очагов. Три изолята ВИЧ-1/N5, BH4-1/N27, BH4-1/N51 не нейтрализовались сыворотками крови пациентов, от которых были выделены изоляты ВИЧ, а изоляты ВИЧ-1ЛЧ31, ВИЧ-1/Ы37, BH4-1/N39 -наоборот нейтрализовались. Наблюдался наибольший разброс по нейтрализующей активности у сывороток крови N27, N31, N37, N39.

Например, сыворотка крови N31 нейтрализовала изолят ВИЧ-1/N31 в разведении 1:1000, изолят BH4-1/N37 - в разведении 1:100, а изолят ВИЧ-1/N51 вразведении 1:1000. В тоже время следует отмстить, что три последних изолята ВИЧ были из разных эпидемических очагов.Таким образом, выявленный разброс по нейтрализующей активности у сывороток крови не позволяет применить этот метод для эпидемиологического маркирования изолятов ВИЧ из разных эпидемических очагов.

В г.Смоленске в 1987 году был выявлен очаг ВИЧ-инфекции, обусловленный переливанием кровепродуктов от ВИЧ-инфицированного и при расследовании которого выявлено пять ВИЧ-инфицированных: N61, N47, N48, N62, N68. Четверым из них диагноз ВИЧ-инфекции был поставлен в 1987 - 1988 годах, а ВИЧ-инфицированному N68 - лишь в 1991 году. Поэтому возникла необходимость подтвердить принадлежность этого пациента к эпидемическому очагу в стационаре, где он находился на лечении в 1987 году. ВИЧ-инфицированный донор, (пациент N61) был выявлен 23.4.87г. по эпидемическим показаниям, как контактный 1-ого ВИЧ-инфицированного пациента в бывшем СССР, военного

Таблица 2

Результаты типирования 6 изолятов ВИЧ-1 методом нейтрализации

Номера изолятов ВИЧ Максимальное разведение сыворотки крови, при котором происходила реакция нейтрализации

5 27 31 37 39 51

5 нет нет нет нет нет нет

27 нет нет нет 1:100 нет нет

31 нет нет 1:1000 нет 1:10 нет

37 нет 1:10 1:100 1:1000 нет нет

39 нет нет нет нет 1:100 нет

51 нет 1:100 1:1000 нет 1:1000 нет

переводчика длительное время работавшего в Танзании. Пациент N61 - бисексуал, донор - с мая 1985 года по февраль 1987 года сдавал кровь. Кровь от ВИЧ-инфицироваиного донора N61 была перелита женщине и ребенку. ВИЧ-инфицированная женщина (реципиент N47) инфицировала мужа половым путем. Диагноз ВИЧ-инфекция ему был поставлен год спустя, в 1988 году. ВИЧ-инфицированный ребенок - (N62) стал источником формирования нозокомиальпого очага. В 1991 году при очередной госпитализации был выявлен пациент N 68, убедительных данных о причине его заражения ВИЧ не было. По данным эпидемиологического расследования мать этого ребенка была серонегативна, так же как и доноры, от которых он получил переливание крови. Однако было установлено, что в 1987 году он находился на лечении в одной палате с пациентом N62, инфицированным ВИЧ, при переливании крови от ВИЧ-инфицированного донора (N61). Так как изоляты ВИЧ от ВИЧ-инфицированных из Смоленской вспышки оказались низкоинфекционными, то для их детекции применялся метод полимеразной цепной реакции. Типирование изолятов ВИЧ проводилось методом сравнения электрофоретической подвижности гетеродуплексов в полнакриламидном геле. Изоляты ВИЧ-1: N61, N62, N47, N48, выделенные от ВИЧ-инфицированных из данного эпидемического очага, методом сравнения электрофоретической подвижности гетеродуплексов в полнакриламидном геле, отнесены к субтипу "А" по гену env ВИЧ-1, так же как и изолят ВИЧ-1/N68, выделенный от пациента N68. В результате все изоляты ВИЧ-1 были отнесены по особенностям молекулярной структуры в области гена "env" к субтипу А. То есть в данном конкретном случае этот метод позволяет подтвердить возможность инфицирования пациента N68, находившегося в одной палате с ВИЧ-инфицированным ребенком. Путь передачи вируса -шприцевой. Так как в Смоленской области других эпидемиологических цепочек не было, то данные исследования подтвердили, что N68 мог быть заражен в стационаре из-за нарушений противоэпидемического режима. Таким образом было показано, что метод сравнения электрофоретической подвижности гетеродуплексов в полнакриламидном геле может иметь не только научное, но и прикладное значение.

Результаты проделанной работы показали, что обычные методы типирования: определение спектра клеточного тропизма и чувствительности к лекарственным препаратам, выявление нейтрализации ВИЧ ауто и гетер о логичными сыворотками крови,

приемлимые по-всей видимости для других нозологических форм при работе с вирусом иммунодефицита человека не пригодны в силу его выраженной молекулярной изменчивости.

ВЫВОДЫ:

1. Усовершенствование методов выделения и культивирования вирусов иммунодефицита человека позволило охарактеризовать 56 изолятов ВИЧ-1 и 3 изолята ВИЧ-2 от 52 ВИЧ-инфицированных лиц из 33 эпидемических очагов по гено-фенотипическим свойствам.

2. Показано, что изоляты ВИЧ отличались друг от друга по способности инфицировать клеточные линии, кинетике репродукции, цитопатическому эффекту, синцитиеобразованию, чувствительности к антивирусным препаратам и сывороткам крови, полученным от ВИЧ-инфицированных.

3. Сравнительный анализ биологических свойств изолятов ВИЧ по уровню антигена р24, способности инфицировать клеточные линии: МТ-4, СЕМ, Н9, Jurkat tat; синцитиеобразованию, цитопатическому эффекту, позволил разделить изученные изоляты ВИЧ на высокоинфекционные и низкоинфекционные.

4. Показано, что методы типирования изолятов ВИЧ,основанные на определении фенотипических характеристик: спектра клеточного тропизма, чувствительности к лекарственным препаратам не могут быть использованы для эпидемиологического маркирования, так как даже филогенетически близкие изоляты ВИЧ, могут быть представлены как низкоинфекционными, так и высокоинфекционными вирусахми.

5. Метод реакции нейтрализации мало эффективен для эпидемиологического маркирования ВИЧ, так как 24 изолята ВИЧ

нейтрализовались сыворотками крови пациентов, от которых они были выделены, а 30 изолятов ВИЧ нейтрализовались сыворотками крови, полученными от других ВИЧ-инфицированных лиц.

6. Показано, что для эпидемиологического маркирования может быть применен метод сравнения электрофоретической подвижности гетеродуплексов в полиакриламидном геле, поскольку каждый субтип ВИЧ, генетически обусловлен молекулярными особенностями в области гена "env" ВИЧ-1 и может рассматриваться как маркер.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Изоляция вируса иммунодефицита человека от носителей ВИЧ-инфекции/Д. К. Львов, В.И. Покровский, М.Н. Корнеева, Б.В. Гущин, Л.В. Урываев, В.В. Покровский, Л.Б. Калнина, И.А. Киселева, В.М.Стаханова, Д.Н. Носик М.С. Бочкова и др.//ДАН.СССР.-1989. -T.307.N.5.- С.1253-1255.

2. Применение индуктора интерферона для подавления репродукции вируса иммунодефицита человека / Д.Н. Носик, М.Н. Корнеева, М.С. Бочкова и др. //Сборник научных трудов Института ЭиМ им. Н.Ф.Гамалеи «Интерферон-89». - М., 1989 - С.117-120.

3.Подавление репродукции ВИЧ новыми германий органическими соединениями - индукторами интерферона /М.Н. Корнеева, М.С. Бочкова, М.А. Игнатенко и др. //Сборник научных трудов Института ЭиМ им. Н.Ф.Гамалеи « Интерферон - 89 ». -М., 1989 -С. 120-124.

4. Методические рекомендации по выделению вирусов иммунодефицита человека от ВИЧ-инфицированных лиц и больных СПИДом / Д.Н. Носяк, Л.Б. Калнина, М.С. Бочкова и др.//Сборник научныхтрудов Института вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН «Методы исследования в молекулярной, общей и медицинской вирусологии». -М., 1992 - С.170-179.

5. Характеристика штаммов вируса иммунодефицита человека, выделенных от ВИЧ-инфицированных лиц на территории СССР/Д.Н.Носик, Л.Б.Калнина, А.Ю.Злобин, Н.В.Кузнецова, М.С. Бочкова и др. //Вопросы вирусологии. -1992. - N 2.-С.92-94.

6. Характеристика вирусов иммунодефицита человека, выделенных от ВИЧ-инфицированных лиц и больных СПИДом на территории СНГ /Д.Н. Носик, Л.Б. Калнина, М.С. Бочкова и др.// Вестник PAMH.-1992.-N 11- С. 12-22.

7.Heterogenity of HIV isolates in Russia /D. Nossik, A. Zlobin, L. Kalnina, A. Zhigulin, M. Bochkova et all//VHIth International Conference on AIDS.Holland - Amsterdam, 1992.-V.2.-P. A14.

8. Чувствительность к противовирусным препаратам вирусов иммунодефицита человека, выделенных на территории России / Н.В. Кузнецова, М.С.Бочкова, М.С.Петрова и др. Мат.конф.«70 лет институту Пастера».-С.-Петербург.,1993.-Ч.2,- С. 154

9. Свойства вирусов иммунодефицита человека, выделенных

на территории СНГ/ Д.Н. Носик, Л.Б. Калнина, И.А. Киселева, М.С. Бочкова и др.//Мат.конф.<< 70 лет институту Пастера >> -С.-Петербург,1993.- 4.2.-С.163

10. Susceptibility of the HIV-1 isolates from Russia to antiviral agents /N. Nossik, N. Kuznetzova, M. Bochkova et all //IXth Internat. Conference on AIDS. Germany - Berlin, 1993. -V.1.-P.228.

11. Inhibition of HIV-1 by antisense DNA oligonucleotide/М. Bochkova, A. Zhigulin, M. Petrova et all //Xth International Conference on AIDS.Japan - Yokohama, 1994.-V.2.-P.85.

12. Морфологический анализ клеточных систем, инфицированных различными штаммами вируса иммунодефицита человека / Б.В.Гущин, Е.А.Гущина, Д.Н.Носик, Л.Б.Калнина, М.Н. Корнеева, М.С. Бочкова и др.// Вопросы вирусологии.- 1995.-N5,- С.227-230.

13. Sequense analysis of the glycoprotein 120 encording region of a new human immunodeficiency virus type 1 subtyp G from Russia/A.F Bobkov, A. Cheinsong-Popov, N.A. Karasyova, L.M. Selimova, M.S. Bochkova at all //AIDS Research and Human Retroviruses.-1996.-V.4-P.1386-1389.

14. Эпидемиологическая цепочка от первого зарегистрированного в СССР больного СПИДом. Использование анализа электрофоретической подвижности гетеродуплексов для эпидемиологического маркирования. /В.В.Покровский, А.Ф.Бобков, Н.Н.Ладная, Н.Г.Карасева, М.С.Бочкова и др.// Эпидемиология и инфекционные болезни. -1996.- N 1-С.30-34.