Автореферат и диссертация по медицине (14.00.30) на тему:Эпидемиологические особенности и молекулярная диагностика HCV, HGV и TTV-инфекций

На правахрукописи

ПРОКОФЬЕВА Тамара Дмитриевна

ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА НСУ, HGV и ТТУ-ИНФЕКЦИЙ

14.00.30 - эпидемиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Иркутск - 2005

Работа выполнена на базе Иркутского городского центра молекулярной диагностики и кафедры инфекционных болезней Иркутского государственного медицинского университета Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

старший научный сотрудник Балахонов Сергей Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

старший научный сотрудник Иннокентьева Тамара Ивановна

доктор медицинских наук, доцент Владимиров Николай Иванович

Ведущая организация: Омская государственнаямедицинская академия Министерстваздра-воохранения и социальногоразвитияРоссийской Федерации

Защита состоится

.^С^ик—_2005 г. на заседании Диссертационного совета Д 001.038.01 при Научном центре медицинской экологии ВСНЦ СО РАМН по адресу: 664025, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института эпидемиологии и микробиологии Научного центра медицинской экологии ВСНЦ СО РАМН

г.

Ученыйсекретарь Диссертационногосовета кандидат медицинских наук, с.н.с.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Вирусные гепатиты с парентеральным механизмом передачи, несмотря на их активное изучение и внедрение современных способов детекции, лечения и профилактики, продолжают оставаться одной из приоритетных задач здравоохранения во всех странах мира (Онищенко Г.Г., 2003; Покровский В.И., 2004; Шипулин ГА, 2004; Smith D.V., 2003; Devidson F. et al., 2004 и др.). Это связано не только с их широкой распространенностью и высоким хрониогенным потенциалом, но и необходимостью совершенствования противоэпидемических мероприятий с учетом современных представлений о распространенности и эпидемиологических особенностях инфекций (Приказ комитета здравоохранения Москвы «О совершенствовании медицинской помощи больным вирусными гепатитами» № 283 от 06.07.2000 г., Нормативные документы МЗ РФ «Управление качеством клинических лабораторных исследований», 2002 г.).

Особую значимость в России в последние годы приобрел вирусный гепатит С, имеющий в ряде регионов высокую распространенность, а генетическая неоднородность HCV и высокая изменчивость вируса требуют постоянного изучения (Онищенко Г.Г., 2004). Однако в настоящее время данные о генотипической структуре вирусного гепатита С в Иркутской области и близлежащих регионах, включая Бурятию, Монголию, являются единичными.

Изучение распространенности этого вида гепатита на соседних территориях связано с необходимостью адекватного эпидемиологического надзора за инфекцией в связи с существующей естественной миграцией населения.

Особую значимость приобрели сравнительно недавно открытые вирусы HGV и TTV. Ряд существующих данных свидетельствуют об их патогенности и значимости для формирования затяжных, тяжелых форм при микст-инфицировании (Воусе N., 1996; Lin H.J., 1997; Pilot-Mathais T.J., 2000; Gimenez-Barcons M., 2001; Lu L, 2003). В то же время, на территории Иркутской области, по отчетным данным ЦГСЭН, случаи HGV и TTV инфицирования не регистрируются. Отчасти это связано с противоречивыми литературными данными о степени патогенности вирусов этой группы для человека и соответственно отсутствием их широкой детекции в клинической практике (Покровский В.И., 2003; Малов И.В., 2004).

Не только общемедицинскую, но и социальную значимость приобрел вопрос вирусного инфицирования донорской крови. Использующийся в практическом здравоохранении иммуноферментный анализ крови является косвенным и в серонегативный период не информативен, что увеличивает остаточный риск посттрансфузионных вирусных инфекций (Онищенко ГГ., 2003; Шипулин ГА, 2002; Черкасов Е.Г., 2002; Суханов Ю.С., 2002). Подобных исследований в Иркутской области не проводилось.

В связи с этим были определены следующие цель и задачи исследования.

Цель исследования:

Установитьэпидемиологические особенностиHCV,HGV, ТТУ- иНфекций усовершенствовать систему ихлабораторной диагностики на основеиспользованиягенно-амплификационныхметодов детекции вирусных ДНК (РНК).

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести эпидемиологический анализ заболеваемости вирусными гепатитами в Иркутской области по данным ЦГСЭН г. Иркутска и городской инфекционной больницы.

2. Оценить уровень инфицированности населения HCV в Иркутской области, Бурятии и Монголии на основе скринингового ПЦР-тести-рования образцов крови и сыворотки лиц различных возрастных и профессиональных групп.

3. Изучить генетическую вариабельность и определить доминирующие генотипы HCV в Иркутской области, а также в Бурятии и Монголии.

4. Определить распространенность HGV в Иркутской области и Монголии, ПУ в Монголии на основе скринингового ПЦР-тестирова-ния образцов крови различных профессиональных групп населения.

5. Оценить эффективность системы лабораторного контроля и факторы риска, связанные с гемотрансфузионными манипуляциями на станциях переливания крови ЛПУ г. Иркутска

6. Разработать комплекс эпидемиологических и молекулярно-ди-агностических мероприятий по уменьшению риска инфицирования реципиентов возбудителями парентеральных вирусных гепатитов С и G, а также ТТУ-инфекцией.

Научная новизна и теоретическая значимость

Впервые на территории Иркутской области, Бурятии и Монголии проведен молекулярно-генетический скрининг инфицированности населения НСУ, HGV и ТТУ. Определена частота встречаемости положительного амп-лификационного ответа по результатам ПЦР-тестирования крови как показателя инфицированности вирусами указанных видов. Частота инфицирования изучена в различных возрастных и профессиональных группах.

На территориях Иркутской области, Бурятии и Монголии по данным генетического исследования НСУ-позитивной крови, изучена структура циркулирующих генотипов вируса. Приведены сравнительные данные по частоте встречаемости генотипов на изучаемых административных территориях.

Впервые в г. Иркутске, а также в Монголии, определена частота обнаружения специфических геномов НСУ, HGV и ТТУ в серонегативной донорской крови, отобранной для дальнейшего целевого использования.

Разработана математическая модель расчета риска развития посттранс -фузионного гепатита при переливаниях препаратов донорской крови у лиц, проживающих в этих регионах.

Показано, что внедрение генно-амплификационных методов детекции вирусов в серонегативной донорской крови, а также в диагностический алгоритм клинической практики является одной из первоочередных медико-социальных задач, позволяющих контролировать, а значит и управлять существующей эпидемиологической ситуацией в области.

Практическая значимость работы

Результаты проведенных исследований позволили разработать рекомендации для врачей практического здравоохранения по применению метода ПЦР в клинической практике и совершенствованию лабораторной диагностики вирусных гепатитов (акт внедрения использования аналоговой M-MLV обратной транскриптазы для получения кДНК из генома РНК-содержащих вирусов, НИИПЧИ Сибири и Дальнего Востока от 08.03.2005).

Выявленные диагностически и эпидемиологически значимые особенности циркулирующих генотипов HCV на территории Иркутской области представлены для практического здравоохранения в виде публикаций в периодической печати и докладов на научно-практических конференциях.

Материалы работы используются в учебном процессе студентов лечебного, педиатрического и медико-профилактического факультетов Иркутского государственного медицинского университета и на базе подготовки кадров Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока.

В департаменте здравоохранения г. Иркутска принято к рассмотрению и внедрению в систему службы крови информационное письмо по совершенствованию лабораторного контроля донорской крови (информационное письмо от 10.03.2005).

Вследствие широкой распространенности неопределяемых вариантов генотипов HCV показана необходимость разработки и внедрения в лабораторную диагностику тест-систем для их расшифровки.

Положения, выносимые на защиту:

1. Эпидемиологическая ситуация в Иркутской области по заболеваемости населения вирусным гепатитом С остается напряженной и частота инфицированности населения превышает показатели по Российской Федерации. В структуре заболеваемости хроническое течение HCV-инфекции превалирует над острым.

2. RNA HCV обнаруживается в пробах крови среди всех возрастных категорий населения в Иркутской области, Бурятии и Монголии и не имеет достоверных половых отличий в частоте. В Иркутской области достоверно реже встречается у детей, чем у взрослых. В Бурятии максимальное число инфицированных регистрируется в молодом возрасте.

3. Генотипическая характеристика HCV в Иркутской области характеризуется преобладанием генотипа 1а. В Бурятии доминирующими генотипами являются 1а и 2. В Монголии ведущим циркулирующим генотипом является За и значительный процент (22 %) приходится на неопределенные виды генотипов. Различия в частоте встречаемости генотипов между Бурятией и Монголией касаются только 2 генотипа, чаще регистрирующегося в Бурятии.

4. Положительный амплификационный ответ в образцах крови монгольских пациентов на RNA HCV, RNA HGV и DNA TTV встречается с одинаковой частотой, но отличается у пациентов различных групп риска. HGV-инфицированность пациентов в Монголии регистрируется достоверно чаще, чем в Иркутской области.

По результатам скринингового молекулярно-генетического тестирования проб серонегативной донорской крови специфические вирусные геномы HCV и TTV встречаются с одинаковой частотой в Иркутске и Монголии, геномы HGV преобладают в г. Иркутске. Внедрение моле-кулярно-генетического тестирования возбудителей вирусных гепатитов является необходимым условием микробиологического мониторинга инфицированности, в том числе и препаратов донорской крови.

Апробация работы

Материалы работы доложены и обсуждены на:

- научно-практической конференции, посвященной пятилетию Иркутского городского центра молекулярной диагностики;

- IX Всероссийской конференции «Гепатология сегодня» (Москва, 22-24 марта, 2004);

- заседании кафедры инфекционных болезней ИГМУ с участием кафедры детских болезней с детскими инфекциями и кафедры эпидемиологии ИГМУ, лаборатории эпидемиологии антропонозных инфекций НЦ МЭ ВСНЦ СО РАМН, Противочумного НИИ Сибири и Дальнего Востока.

Публикации

По материалам работы опубликовано 11 печатных работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения и выводов. Материалы изложены на 125 страницах машинописного текста, иллюстрированы 19 рисунками, 40 таблицами. Список литературы состоит из 240 цитируемых работ, из них 133 отечественных и 107 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Настоящее исследование выполнено на базах кафедры инфекционных болезней Иркутского государственного медицинского университета

(зав. каф. - д.м.н., проф. И.В. Малов) и Иркутского городского центра молекулярной диагностики (ИГЦМД) (гл. врач Е.Г. Максимова).

Для выполнения эпидемиологической части работы (первый этап исследования) использовались отчетные материалы Иркутских ОЦГСЭН и ГЦСЭН (по данным годовых статистических отчетов по форме 85 — инфекция «О движении инфекционных заболеваний») по заболеваемости взрослого и детского населения вирусными гепатитами. Анализу подлежали данные за период с 1994 (первый год регистрации ГС) по 2003 гг. включительно.

Расчет показателей заболеваемости по годам, полу, возрасту, проводился на 100 000 населения. Для расчета показателей, отражающих интенсивность эпидемического процесса в различных возрастных группах, использовались сведения о количестве жителей г. Иркутска за соответствующий период времени. Анализ многолетней динамики заболеваемости включал оценку ее уровней, тенденций и т.д. Тенденции динамики заболеваемости определялись по параболе первого порядка, выровненной методом наименьших квадратов.

Второй этап включал исследование сыворотки крови методом ПЦР с целью выявления РНК ИСУ и ИвУ, ДНК ТТУ в следующих группах населения: больные хроническим гепатитом неясной этиологии, больные ЗППП (сифилис, гонорея, трихомониаз), больные туберкулезом, лица, злоупотребляющие алкоголем и употребляющие внутривенно наркотические средства, доноры и медицинские работники.

Третий этап включал определение генотипа ИСУ.

Всего было обследовано 3127 человек; из них жителей Иркутской области - 2338 (доноров - 308 чел.), Бурятии - 395, Монголии - 394 человека. Возрастной состав — от 1 года до 67 лет.

Обследование донорской крови проводилось только серонегативных образцов, полученных у доноров Монголии и г. Иркутска. Больные с алкогольной и наркологической зависимостью находились на учете у нарколога по месту жительства, а больные гепатитами являлись пациентами клинических отделений инфекционной больницы (г. Иркутск), городской инфекционной больницы (г. Улан-Удэ, Бурятия), Научного Центра исследования инфекционных болезней (г. Улаанбаатар, Монголия).

Обследование заключалось в заборе крови и заполнении эпидемиологической карты исследования. У всех пациентов проводился забор крови в количестве 3-5 мл в вакуумные пробирки «УасШатег», в тот же день сыворотка отстаивалась, затем хранилась при температуре ниже 20 °С в пробирке «Еррепёог1>>. Кровь на наличие РНК/ДНК ИСУ, ИвУ, ТТУ исследовалась в Иркутском городском центре молекулярной диагностики (зав. лаб. - И.С. -Акулич), с использованием соответствующих наборов Амплисенс, ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ (Лицензия № 15/002 Минпромнауки на производство), ООО "Компания БИОКОМ". Непосредственно ПЦР на наличие в образцах соответствующих возбудителей проводили с использованием тест-

систем АмгошСенс HCV, АмплиСенс HGV, имеющих регистрационные удостоверения Минздрава РФ и сертификаты производства ГИСК им. Л.А. Та-расевича, "Gene Pack DNA PCR TTVgen" OOO "Компинии БИОКОМ".

Объем проведенных исследований: ПЦР на RNA HCV - 2030 в Иркутской области, 395 - Бурятии, 394 - Монголии; ПЦР на RNA HGV - 479 в Иркутской обл. и 394 - Монголии; ПЦР на DNA TTV - 394 пробы из Монголии.

Расчеты показателей частоты признака проводились на 100 обследованных. Полученные в результате исследования материалы были подвержены сопоставлению, анализу и статистической обработке методами параметрической и непараметрической статистики: среднее значение и ошибка средней, сравнение средних с вычислением критерия Стьюдента, x2 (хи-квадрат) и дисперсионного анализа.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Согласно проведенному анализу (табл. 1) практически во все годы наблюдения уровень заболеваемости вирусными гепатитами (общее число случаев и случаи гепатита С) по Иркутской области был более высоким, чем по РФ. Острый гепатит С имеет тенденцию к снижению, начиная с 1999 г.

Таблица 1

Заболеваемость ВГв Российской Федерации инатерритории

Иркутской области (на100000населения)

Вид ВГ Территория Годы

1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003

овг РФ 139,9 165,9 131,9 96,1 81,5 94,9 121,0 129,9 76,2 48,5

Ирк. обл. 133,2 173,7 172,3 141,4 166,7 134,4 126,6 151,9 161,6 105,8

вгс РФ 3,1 6,8 8,4 9,1 11,6 20,9 21,1 16,5 7,1 5,2

Ирк. обл. 0,9 5,2 12,4 14,6 26,8 25,3 20,0 21,9 10,4 9,1

Но поскольку парентеральные вирусные гепатиты имеют высокий хрониогенный потенциал, то наибольший интерес представляют данные о хронических вирусных гепатитах (табл. 2).

Таблица 2

Характеристика заболев аемостихроническими вирусными гепатитамина

территории Иркутской области (на 100000населения)

Признак Годы

1999 2000 2001 2002 2003

Гепатит С 4,8 12,9 13,8 17,0 20,9

Гепатит неустановленной этиологии 2,7 4,7 3,4 2,0 1,7

Всего случаев гепатита (в т.ч. гепатита В) 12,1 26,7 30,7 32,8 36,0

Частота заболеваемости хроническим гепатитом С возрастает год от года.

Наиболее высокие показатели заболеваемости гепатитом С приходятся на возрастные группы 15—19 лет и 20-29 лет.

Среди контингентов риска, которые удалось официально установить среди заболевших, наиболее поражаемой группой является «прочее население» (лица, с неустановленным родом деятельности). При анализе вероятных причин инфицирования контактно-бытовой и половой путь составили 23,3 % случая в 2002 г., в 2003 г. - 31,1 %, вертикальный — в 0,5 % и 0,0 %, инфицирование после проведения медицинских манипуляций — 3,1 и 1,3 %, употребление внутривенных наркотиков - 47,4 и 43,2 %, неустановленные причины - 22,5 и 24,4 % соответственно. Контактно-бытовой и половой пути передачи НСУ активизируются год от года, реализуясь чаще среди молодых людей в возрасте 15—19, 20-29 , 30—39 лет. В то же время, согласно отчетным данным, частота инфицирования во внутрибольничных условиях год от года снижается.

За последние годы частота вирусных гепатитов неустановленной этиологии снижается: от 3,4 на 100 000 населения в 2001 г, до 1,97 в 2002 г. и до 1,7 в 2003 г. Хронический вирусный гепатит неустановленной этиологии вполне может быть также представлен гепатитом G, ТТУ-инфекцией, но их официальная регистрация в Иркутской области пока еще не ведется. Вместе с тем, эти данные лишь частично отражают истинную ситуацию в области, так как современные методы вирусологической диагностики доступны лишь в отдельно взятых районах.

Статистические данные структуры вирусных гепатитов, полученные по результатам обращаемости в городскую инфекционную больницу г. Иркутска, также отражают существующую эпидемиологическую ситуацию, согласно которой ежегодно число случаев острых гепатитов С снижается, а хронических возрастает — диагноз острого гепатита С в 2000 г. был установлен в 9,7 %, в 2001 г. - 8,9 %, в 2002 г. - 5,0 %, в 2003 г. - 2,5 % случаев, хронический - в 26,3, 30,6, 37,0, 46,5 % случаев по тем же годам. По всей видимости, это связано с продолжающимся эпидемическим ростом «парентеральной» группы гепатитов и совпадает с подобными прогнозами многих авторов относительно территории всей России (Они-щенко Г.Г., 2004). Гепатит неуточненной этиологии в 2003 г. зарегистрирован в 4,2 % случаев.

В результате проведенного исследования 2030 проб крови жителей Иркутской области оказалось, что в 348 была обнаружена РНК НСУ (17,1 ± 0,9 на 100 обследованных).

Образец характерной электрофореграммы при разделении ампли-фикатов в 1,3 % агарозе по завершении ОТ-ПЦР на НСУ представлен на рис. 1.

ш

■ л. ш m ** * • ж ш **

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1415 16 17

Рис. 1. Результаты ОТ-ПЦР-тестирования образцов сыворотки крови на HCV от пациентов с подозрением на гепатит. Примечание: 1 - положительный контроль; 2 -отрицательный контроль тест-системы; 3, 4, 7,10 и 12 треки - положительный результат амплификации участка кДНК 240 н.п вируса гепатита С; 5, 6, 8, 9,11, 13,14 и 15 треки - отрицательные результаты на HCV; 1 7 - маркерные фрагменты ДНК 100-1000 н.п.

Частота инфицирования взрослых (17,8 ±0,9) выше, чем детей -12,6 ± 2,0 (р < 0,05). Достоверность зависимости инфицирования от возраста также подтверждается и критерием х2. Более частое инфицирование взрослых возможно объяснить существованием иных путей инфицирования - половым, распространением «шприцевой наркомании». Вместе с тем, по нашим данным, частота инфицирования примерно одинакова у лиц молодого и старшего возраста (16-29, 30-49 и старше 50 лет) и составляет 17,7 ± 1,8 на 100 обследованных. Согласно статистическим материалам Иркутского областного центра санитарно-эпидеми-ческого надзора, впервые чаще заболевают молодые люди в возрасте 15— 19 и 20-29 лет. Вероятно, такие отличия связаны с тем, что в наше исследование были взяты пробы крови больных как острыми, так и хроническим формами гепатита С, а не только впервые выявленные.

При распределении по полу оказалось, что у мужчин и женщин частота инфицирования одинакова (17,1 ± 1,0 и 17,2 ± 1,4 соответственно) и не имеет статистически значимых отличий (p>0,05).

Возможный источник инфицирования пациентов представлен на рис. 2.

Из групп риска лидировали лица, употребляющие наркотики и практикующие частые «незащищенные» половые контакты. Полученные данные сопоставимы с данными официальной статистики: так, ведущими

путями передачи острого гепатита С в Иркутской области, были прием наркотиков (43,2 %) и «незащищенный» секс (31,1 %)

Рис.2. Вероятные пути инфицирования обследованных пациентов Примечание 1-прием наркотических средств 2 - половой путь инфицирования 3 - неизвестный путь инфицирования, 4 - медицинские манипуляции 5 - не ответили на вопросы

Следующим этапом работы явилось определение частоты распределения генотипов вирусного гепатита С Это позволяет решать проблему эпидемиологического надзора за инфекцией, прогнозирования исхода заболевания, разработки тактики противовирусной терапии (Хасин А А, 2003, Hans Lohr, 2001, Berg T et al, 2002 и др ) Из 348 проб HCV RNA-позитив-ной крови методом случайной выборки было взято 129 образцов для дальнейшего тестирования По нашим данным, генотип 1а занимает лидирующее положение (28,0 %), на втором месте по распространенности стоит генотип За (23,2 %), на третьем - 2 тип (20,1 %) Частота встречаемости генотипов 1Ь и неустановленного типов - 14,0 % и 14,7 % соответственно На рис 3 приведены генотипические особенности, полученные в результате нашего исследования и структура циркулирующих генотипов в Москве и Московской области (ЦНИИЭ МЗ РФ, 2003 г)

Рис. 3. Распределение генотипов HCV на территориях Московской и Иркутской областей Примечание: «?» - неустановленный вид генотипа

Учитывая, что неопределяемым вариантам генотипов в Иркутской области принадлежит существенный процент, очевидна необходимость разработки и внедрения в лабораторную диагностику тест-систем для их расшифровки.

Полученные данные отличаются от среднестатистических по России, согласно которым первое место по распространенности принадлежит 1Ь, а второе делят 1а и За генотипы. Данный факт может объясняться географическими особенностями расположения региона и высокими показателями миграции населения, в том числе из стран Азии.

Полученные нами данные также отличаются и от других регионов нашей страны — Омской, Ростовской, Самарской областей, где генотипи-ческая структура сходна с данными по Московской области (Чуланов В.П., 2004; Шипулин ГА, 2004).

Из всего числа определенных генотипов (п= 129) только в 4 пробах крови были обнаружены одновременно 2 вида генотипа: 1а/2, 1Ь/2, 1а/За, 1а/1Ь. Полученные данные также значительно отличаются от показателей по Московской области, где смешанные формы занимают до 40 % (Чуланов В.П. и соавт., 2004).

При сравнении частоты встречаемости генотипов у мужчин и женщин оказалось, что все виды генотипов встречаются одинаково часто. Генотип За несколько чаще встречается у мужчин, но это статистически не достоверно (р > 0,05). Эти данные отличаются от средних по Московской области (Чуланов В.П. и соавт., 2004), согласно которым у мужчин частота За генотипа достоверно выше, чем 1Ь.

Структура генотипов у детей и взрослых Иркутской области оказалась примерно одинаковой: 1а генотип встречался у детей в 27,0 %, у взрослых - 28,0 %, 1Ь генотип - соответственно 10,0 % и 14,0 %, 2 генотип - 27,0 % и 19,0 %, За генотип - 26,0 % и 24,0 %. Статистически достоверные отличия в частоте встречаемости генотипов у детей и взросл-дых не выявлены (р > 0,01).

Учитывая территориальную близость к Иркутской области, было проведено скрининговое ПЦР-обследование населения близлежащего региона — Бурятии. Оказалось, что выявление РНК НСУ среди диспансерных больных (установленный диагноз «НСУ-гепатит») составило 31,6 ± 4,7 (что расценивается как репликативная фаза гепатита) и максимальное число инфицированных приходилось на возрастную группу от 21 до 25 лет (46,0 %). При распределении инфицированных по полу, оказалось, что частота инфицированных мужчин составляет 31,4 ±6,5, женщин — 31,8 ± 7,0, что не имеет достоверных отличий (р > 0,05).

При анализе проб крови у 300 пациентов, относящихся к так называемым группам риска, РНК вируса гепатита С была обнаружена в 47 пробах (15,7 ± 2,1) с максимальным числом инфицированных в возрасте 21-30 лет. Выявление ККА-позитивных мужчин при этом составило 17,5 ±2,7, женщин - 12,0 ±3,2, что не имеет достоверных различий

(р > 0,05). Наибольшая частота выявления РНК ИСУ была у наркоманов (18 ± 3,8) и у лиц, страдающих заболеваниями, передающимися половым путем (19,0 ± 3,9), наименьшая - у лиц, злоупотребляющих алкоголем -10,0 ± 3,0 на 100 обследованных.

Данные по исследованию генотипов у всех выявленных ИСУ-пози-тивных лиц (77 проб крови) представлены на рис. 4.

1а 1Ь 2 За ?

Рис. 4. Генотипическая характеристика HCV-инфекции у обследованных лиц Бурятии.

Примечание: «?» - неустановленный вид генотипа.

Преобладающими генотипами в Бурятии являются 1а и 2, на втором месте по встречаемости — генотип За. Интересно, что в Иркутской области 1а генотип является также преобладающим, но генотип 2 встречается несколько реже, чем За.

В обследование лиц, проживающих в Монголии (на примере г. Улан-Батор) были включены 394 пациента из групп риска, в том числе медицинские работники, а также доноры. Особенностью организации медицинской помощи в Монголии является отсутствие в клинической практике генно-амплификационных способов диагностики вирусных инфекций. Частота позитивного амплификационного ответа наличия специфических вирусных геномов ИСУ составила 10,4 ± 2,4 (на 100 обследованных).

Оказалось, что частота встречаемости ИСУ у доноров составила 16,2 ± 3,4, что достоверно выше, чем у больных заболеваниями, передающимися половым путем и алкогольной зависимостью (р < 0,05).

Большой интерес представляет генотипическая характеристика ИСУ. Генотипирование проводилось во всех ПЦР ИСУ-позитивных пробах монгольских пациентов. Наиболее часто встречающимся генотипом оказался За — 29,3 %. Неопределенные с помощью используемой тест-системы виды регистрируются в 22,0 % случаев. 1а генотип, в отличие от полученных нами данных по Иркутской области и Бурятии, занимал предпоследнее место - 17,0 %. Генотипы 1Ь и 2 в структуре составили, соответственно, 19,5 и 12,2 %. Таким образом, полученные дан-

ные свидетельствуют о существующих генотипических особенностях региона.

Был проведен эпидемиологический анализ результатов ПЦР 479 проб крови жителей Иркутской области, обратившихся с направительным диагнозом «гепатит?» и отобранных методом случайной выборки, на ИвУ-инфицированность. Частота обнаружения генома вируса гепатита в (на 100 обследованных) составила 9,3 ± 1,3. В отличие от ИСУ-инфицирования, при котором частота выявления РНК выше у взрослых, чем у детей, на данном числе наблюдений достоверно значимых отличий по частоте инфицирования детей и взрослых обнаружено не было, в том числе при использовании х2 и дисперсионного анализа. Половых отличий при анализе частоты инфицирования также выявлено не было (р > 0,05).

Анализ вероятных путей ИвУ-инфицирования показал, что большинство опрошенных затруднилось указать на вероятный фактор риска (20 %). Лица, употребляющие наркотики, составили 11 %, практикующие частые «незащищенные» половые контакты — 7 %, а о возможном инфицировании через медицинские манипуляции заявило 13 % обследованных.

На территории Монголии также было проведено скрининговое обследование населения на наличие специфического генома ИвУ как показателя инфицированности данным видом вируса, частота которого составила 17,0 ± 3,0 на 100 обследованных, что является достаточно высоким показателем. При анализе частоты встречаемости у пациентов различных групп риска оказалось, что более высокое распространение вируса в имеется у пациентов с подозрением на гепатит - 34,6 ± 6,4, чем у доноров, медработников и лиц с ЗППП (р < 0,05). Частота среди больных туберкулезом и венерическим заболеваниями составила 18,2 ± 5,8 и 17,4 ± 5,6 соответственно. Самая низкая частота зарегистрирована у медработников - 7,5 ± 2,2 и доноров — 7,7 ± 2,4. Зависимость частоты инфицирования ИвУ от группы риска подтвердилась дисперсионным анализом и критерием х2.

Также впервые на территории Монголии был проведен скрининг населения на обнаружение ТТУ-инфекции. Частота позитивного амп-лификационного ответа наличия специфических вирусных геномов ТТУ составила 12,2 ± 2,6 на 100 обследованных. Данный вид вирусного инфицирования оказался более высоким у доноров — 21,4 ± 3,7, а у пациентов с ЗППП вирус обнаружен не был (р < 0,05). Высокой оказалась частота и у медработников - 28,4 ± 5,5. Полученные данные - зависимость инфицирования ТТУ от группы риска - были подтверждены дис-

2

персионным анализом и критерием х .

В последние годы появились данные о возможностях обнаружения различных вирусов гепатитов, находящихся в стадии «серологического окна», с помощью генодиагностических методов в препаратах донорской крови (Елов А.А., 2000; Суханов Ю.С., 2002; Черкасов Е.Г., 2002).

Впервые в Иркутске было проведено обследование 308 проб крови доноров методом ПЦР на наличие HCV, HGV, TTV вирусов. Все пробы крови были серонегативными по вирусам гепатитов и расценивались как пригодные для дальнейших трансфузий.

При анализе полученных данных оказалось, что в 65 образцах был обнаружен положительный амплификационный ответ на наличие специфических фрагментов вирусных геномов С, G и TTV. Общая частота инфицирования вирусами HCV, HGV, TTV составила 21,1 + 2,3 на 100 образцов. Это достаточно высокие значения для донорской крови. Фактически каждый пятый образец несет потенциальную угрозу инфицирования. Подобные показатели регистрировались в развитых странах Европы и Соединенных Штатах ранее, но принятие с 1998-1999 гг. программ тестирования минипулов донорской крови методом ПЦР полностью изменило ситуацию (Шипулин ГА и соавт., 2004).

По нашим данным, чаще остальных видов гепатитов в донорской крови выявляется РНК гепатита G - 15,9 + 2,1 (p < 0,05). РНК HCV и ДНК TTV встречаются с одинаковой частотой - 2,6 ± 0,8 (р < 0,01). Как уже отмечалось, частота инфицирования HCV по данным обращаемости в Иркутской области составляет 17,1 ± 0,9, что гораздо выше, чем у доноров (р< 0, 01). Эти данные закономерны, так как в общую популяцию вошли лица из групп риска (употреблявшие наркотические средства, с алкогольной зависимостью, с подозрением на гепатит и др.). Однако частота обнаружения специфической RNA HGV оказалась достоверно выше среди доноров (15,9 ± 2,1), чем в общей популяции - 9,3 ± 1,3 (р < 0,05) и это требует поиска ответа.

В Монголии общая частота инфицирования донорской крови была гораздо выше, чем зарегистрированная нами в Иркутске и составила 45,3 ± 4,6 на 100 образцов (р < 0,05). По этим данным, почти половина всех проб крови должна быть исключена из дальнейшего использования в медицинских целях. При анализе структуры инфицирования оказалось, что частота обнаружения в донорской крови RNA HCV составляет 16,2 ± 3,4; RNA HGV - 7,7 ± 2,4; DNA TTV - 21,4 ± 3,7.

При сравнении полученных данных между Иркутском и Улан-Батором, статистически достоверные отличия касаются всех видов вирусов: RNA HCV и DNA TTV встречаются чаще в пробах крови доноров Монголии, a RNA HGV - Иркутска (р < 0,05). Если учесть, что в целом среди всех обследованных нами лиц показатели частоты встречаемости HCV выше в Иркутске, чем Улан-Баторе, a HGV наоборот, ниже, выявленные особенности частоты этих видов гепатитов в донорской крови не являются отражением общей эпидемиологической ситуации на данных административных территориях.

Для выяснения вероятного риска инфицирования реципиентов при переливании препаратов крови был проведен расчет по формуле доверительного интервала вероятности для наступления события (инфици-

рования): Рл = Р - tm < Р < Pn= P + tm, где Р - вероятность, t - коэффициент Стьюдента, ш - ошибка средней величины.

Для HGV-инфицирования расчетные величины получились следующими: Вероятность при единичном переливании составила 0,159; Левый доверительный интервал — 0,118; правый — 0,199.

При единичном переливании препаратов крови риск инфицирования HGV-гепатитом составляет 0,159. 95 % - вероятность наступления инфицирования будет, по расчетным данным, если число переливаний составит 6 и более раз.

Расчетные данные для HCV и TTV-инфицирования получились одинаковыми, поскольку число полученных положительных проб было одинаковым: Вероятность для HCVu TTV-инфицирования составила 0,026; Левый доверительный интервал — 0,08; правый — 0,044.

То есть, при единичном переливании препаратов крови риск инфицирования HCV или TTV составляет всего 0,026, а 95 % - вероятность инфицирования будет при 38-кратном и более числе трансфузий.

Суммарный риск инфицирования составил 0,211, что означает критическое значение для реципиента 5 и более трансфузий.

Таким образом, донорская кровь при тестировании только с помощью иммуноферментного анализа не является полностью безопасной для целевого использования в лечебно-профилактических учреждениях.

ВЫВОДЫ

1. Заболеваемость населения в Иркутской области вирусным гепатитом С за весь период регистрации значительно превышает показатели по Российской Федерации; частота выявления случаев хронического вирусного гепатита С возрастает ежегодно.

2. Частота HCV-инфицированности в Иркутской области по данным обращаемости составляет 17,1 ± 0,9 (на 100 обследованных), достоверно чаще регистрируется у взрослых всех возрастных категорий и не имеет половых различий. Частота обнаружения RNA HCV в Бурятии у лиц с установленным диагнозом «вирусный гепатит С» составляет 31,6 ± 4,7; в целом по обращаемости — 15,7 + 2,1, не имеет половых отличий, с максимальным числом инфицированных в возрастной группе от 21 до 30 лет.

3. В структуре циркулирующих генотипов HCV преобладающим в Иркутской области является 1а - 28,0 %. В Бурятии основными генотипами являются 1а и 2 (28,0 %). В Монголии ведущим циркулирующим генотипом является За (29,3 %), значительный процент (22 %) приходится на неопределенные виды генотипов. Различия в частоте встречаемости генотипов в Бурятии и Монголии касаются только 2 генотипа, чаще регистрирующегося в Бурятии.

4. Частота положительного амплификационного ответа на RNA HCV, RNA HGV и DNA TTV в образцах крови монгольских пациентов встречается с одинаковой частотой и не имеет достоверных отличий. RNA HGV статистически чаще выявляется у пациентов Монголии, чем Иркутской области (9,3 ± 1,3 на 100 обследованных).

5. Общая частота обнаружения специфических вирусных геномов по результатам скринингового ПЦР-тестирования проб серонегатив-ной донорской крови в Иркутске составляет 21,1 ± 2,3, в Монголии -45,3 ± 4,6 (на 100 обследованных). Расчетный суммарный риск HCV, HGV и TTV-инфицирования лиц, получающих препараты крови составляет 0,211, что означает критическое значение для реципиента 5 и более трансфузий.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Возможности использования молекулярно-биологических методов диагностики в клинической практике / Т.Д. Прокофьева, Б.Е. Ким, Ю.П. Съемщикова // Актуальные вопросы современной клинической медицины в условиях обязательного медицинского страхования: Матер. Всеросс. науч.-практич. конф. с международным участием. - 2000. - Вып. 3. -С. 280-281.

2. Эпидемиологическая характеристика распространенности генотипов вируса гепатита С в городах Приангарья и Забайкалья / И.В. Ма-лов, Т.Д. Прокофьева // Гепатиты В, С, D — проблемы диагностики, лечения, профилактики: Матер. 5 Росс, научн.-практич. конф. — М., 2001. — С. 212.

3. Генотипические особенности вирусного гепатита С у детей с онкогематологической патологией / Т.Д. Прокофьева, Ю.П. Съемщикова // Детская гастроэнтерология: настоящее и будущее: Матер. 7 Конгресса педиатров России, Москва 12-14 февраля 2002 г. - М., 2002. -С. 227.

4. Генотипическая характеристика HCV инфекции в Приангарье / Т.Д. Прокофьева, И.В. Малов, Е.Г. Максимова // Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении: Матер, научн.-практич. симп., Москва 20-21 июня 2002г. - М., 2002. - С. 254.

5. Проблемы лабораторной диагностики вирусного гепатита С на современном этапе / Т.Д. Прокофьева, Ю.П. Съемщикова, Е.Г. Максимова // Сб. статей, посвящ. 10-летию организации Иркутской региональной ассоциации инфекционистов. - Иркутск, 2003. - С. 23-24.

6. Особенности течения HCV-инфекции у детей из группы риска / Т.Д. Прокофьева, Ю.П. Съемщикова, Е.Г. Максимова // Клинико-эпи-демиологические и этно-экологические проблемы заболеваний органов пищеварения: Матер. 3 Вост.-Сиб. гастроэнтерологической конф. - Красноярск, 2003. - С. 206.

7. Генотипическая характеристика вирусного гепатита С у жителей Иркутской области / И.В. Малов, Т.Д. Прокофьева, Е.Г. Максимова // Гепатология сегодня: Матер. 9 Росс. конф. - М., 2004. - С. 26.

8. HGV-инфицирование детей из группы риска / Т.Д. Прокофьева, Ю.П. Съемщикова // Гепатология сегодня: Матер. 9 Росс. конф. — М., 2004. - С. 22.

9. Использование ПЦР для тестирования донорской крови на наличие возбудителей вирусных гепатитов / Т.Д. Прокофьева, Ю.П. Съемщикова, Е.Г. Максимова, С.В. Балахонов // Генодиагностика инфекционных болезней: Сб. науч. работ. - М., 2004. - Т. 1. - С. 267-268.

10. Генодиагностика и некоторые эпидемиологические особенности вирусного гепатита С в Иркутской области / Т.Д. Прокофьева, С В. Балахонов, Ю.П. Съемщикова, И.В. Малов // Сибирь-Восток. - 2004. - № 11. - С. 7-9.

11. Assessment of clinical patterns of HCV-infection within children of risk group / T. Prokofieva, Y. Syomshikova // JRME Niigata. — 2004. — P. 184.

Список сокращений

Анти-HCV - суммарные антитела к вирусу гепатита С

ВБИ - внутрибольничные инфекции

ВГ - вирусный гепатит

ГС - гепатит С

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ДНК (DNA) - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИФА - иммуноферментный анализ

ЗППП - заболевания, передающиеся половым путем

ПЦР (PCR) - полимеразная цепная реакция

ОТ-ПЦР - ПЦР, совмещенная на первом этапе с обратной транскрипцией

н. п. - нуклеотидная пара

РНК (RNA) - рибонуклеиновая кислота

кДНК - копия ДНК, полученная обратной транскрипцией на матрице РНК

ЦГСЭН - центр Госсанэпиднадзора

HAV - вирус гепатита А

HCV - вирус гепатита С

HGV - вирус гепатита G

Подписано в печать 08.04.2005. Бумага офсетная. Формат 60х841/16.

Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 1,0 _Тираж 100 экз. Заказ № 069-05._

РИО НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН

(Иркутск, ул. Борцов Революции, 1. Тел. 29-03-37. E-mal: arleon@rol.ru)

07 m 2005