Автореферат и диссертация по медицине (14.02.02) на тему:Эпидемиологическая характеристика лихорадки Западного Нила и молекулярно-генетические особенности изолятов, циркулирующих на территории Волгоградской области

На правах рукописи

ЖУКОВ Кирилл Вадимович

ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИХОРАДКИ ЗАПАДНОГО НИЛА И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИЗОЛЯТОВ, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ ВОЛГОГРАДСКОЙ ОБЛАСТИ"

14.02.02 - эпидемиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Волгоград - 2013

17 АПР 2014

005547096

Работа выполнена в ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор кафедры управления и технологий в туризме и сервисе ФГБУ ВПО Сочинский государственный университет Минобрнауки

доктор медицинских наук, профессор Антонов Валерий Алексеевич

Брюханова Галина Дмитриевна

кандидат медицинских наук, заведующий кафедрой

эпидемиологии ФГПУ ВПО Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского

Минобрнауки Ерёмин Вячеслав Иванович

Ведущая организация:

ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора

Защита диссертации состоится « »_2014 г. В_часов на заседании

диссертационного совета Д 208.078.01 по присуждению ученой степени доктора (кандидата) наук при ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт "МИКРОБ" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Университетская, д.46.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Волгоградского научно исследовательского противочумного института Роспотребнадзора

Автореферат разослан « »_2014 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Слудский Александр Аркадьевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Арбовирусные инфекции в связи с их широким географическим распространением, видовым многообразием и тяжестью клинического течения привлекают к себе особое внимание здравоохранения и медицинской науки во всем мире.

Наиболее значимой арбовирусной инфекцией для Волгоградского региона является лихорадка Западного Нила, возбудителем которого является вирус Западного Нила. (Антонов В.А., с соавт., 2012; Батурин А.А., с соавт., 2012; Липницкий А.В., с соавт., 2011; Львов Д.К., с соавт., 2004). Природные климатические условия Волгоградского региона оказывают существенное влияние не только на численность основных переносчиков и их взаимодействие с возбудителем, но опосредованно, за счет температурного влияния на репликативные процессы и на сам вирус (Платонов А. Б., 2006; Липницкий А.В., с соавт., 2011 ). Большое количество крупных открытых водоемов, глубина которых в основном составляет от 1 до 1,5-2 метров, имеют свои экосистемные особенности. Такие условия наиболее благоприятны не только для массового выплода кровососущих насекомых, но' и для гнездования большого количества видов птиц водного и околоводного комплексов (Чернобай В.Ф., 2004; Platonov А. Е., et al., 2008; Rosenthal J., et al., 2008).

Подавляющее большинство из них зимуют именно на африканском континенте, с которого первично начал распространяться ВЗН. Около 100 тысяч птиц ежедневно пролетает через дельту Волги в период сезонной миграции (Батурин А.А., с соавт., 2012; Чернобай В.Ф., 2004). В связи с высокими темпами урбанизации происходит проникновение вируса в антропогенные биоценозы, что и является основным механизмом возникновения вспышек на территории Волгоградской области (Липницкий А.В., с соавт., 2011).

Эти факты обеспечивают не только благоприятную среду для размножения и накопления возбудителя ЛЗН, но и его постоянную экспансию на территории Волгоградской области и близлежащих регионов Поволжья. Примером этому могут послужить периодические вспышки ЛЗН, начиная с 1999 года, с характерной клинической картиной, преобладанием менингеальной симптоматики и высокой летальностью (около 10 %), что характерно именно для 1 генотипа вируса ЗН. В 2007-

2010 годах произошла смена генотипов, и подавляющее большинство зарегистрированных клинических случаев ЛЗН были обусловлены уже 2-м геновариантом вируса (Антонов В.А., с соавт., 2012;). На территории Волгоградской области второй генотип, обнаруженный в 2007 году, до 2010 года вызывал лишь единичные случаи заболевания. Помимо Волгоградской области в 2010 году больные с диагнозом ЛЗН зарегистрированы еще в 9 субъектах РФ (Путинцева Е.В., с соавт., 2011). По данным Референс-центра по мониторингу за возбудителем лихорадки Западного Нила, созданного по приказу Роспотребнадзора от 17.03.2008 г. № 88 на базе ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт

Роспотребнадзора», в 2010-2012 гг. экспансия ВЗН охватила новые территории 21 субъекта Российской Федерации.

Вышеизложенное свидетельствует об актуальности проблемы, что обусловило выбор целей и задач данного исследования.

Цель работы - выявить эпидемиологические особенности проявлений ЛЗН на основе пространственного анализа территории Волгоградской области с оценкой ее эпидемического потенциала и информации о молекулярно-эпидемиологических характеристиках региональных изолятов ВЗН. -Основные задачи исследования:

1. Провести ретроспективный анализ вспышек ЛЗН на территории Волгоградской области с учетом основных условий, повлиявших на рост заболеваемости.

2. На основе совокупных данных лабораторных исследованийоценить инфицированность комаров, перелетных и синантропных птиц вирусом ЗН.

3. Провести картографический анализ территории Волгоградской области на основе заболеваемости населения ЛЗН с использованием ГИС-технологий

4. Определить генотипическую принадлежность изолятов ВЗН, циркулирующих на территории Волгоградской области, на основе сравнительного анализа РНК, выделенной из клинического материала, с доступными на интернет ресурсах полноразмерными последовательностями ВЗН.

5.Изучить определяющие факторы способствующие формированию константных природных очагов ЛЗН в Волгоградской области, с последующей пространственной визуализацией данных.

6. Создать Интернет-ресурс с интегрированной системой информирования и адаптации населения Волгоградской области в условиях формирования очага ЛЗН.

Научная новизна работы

Впервые проведен кластерный анализ 390 полноразмерных геномов ВЗН, доступных на интернет ресурсе http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, и определены генотипы изолятов, циркулирующих на территории Волгоградской области. Секвенированы и депонированы в генетической базе данных ОепВапк нуклеотидные последовательности, полученные с использованием разработанных секвенационных праймеров, детектирующих фрагменты кодирующих последовательностей рпН С, рго1 Е, N83 и N85 генома ВЗН всех генотипических вариантов.

Предложено обоснование возможности формирования природного очага лихорадки Западного Нила на территории Волгоградской области и впервые сформирован алгоритм молекулярно-эпидемиологического мониторинга в целях оптимизации эпидемиологического надзора за ЛЗН.

Выявлены основные эпидемиологические характеристики заболевания ЛЗН, и особенности её клинического течения в пределах Волгоградской области в период с 19992011гг..

На основе пространственного анализа основные районы Волгоградской области разделены на стандартные участки, отражающие эпидемиологическую степень риска возникновения заболеваемости ЛЗН. С использованием технологий геоинформационных систем определены условные границы и приблизительная площадь очагов ЛЗН на территории Волгоградской области, позволяющие локализовать зоны проведения противоэпидемических мероприятий.

В результате исследования, проведенного в рамках гранта РГНФ № 11-16-34-011 а/В, впервые создана информационная система социально-медицинской адаптации и информирования населения в условиях формирования очага ЛЗН на территории Волгоградской области.

Теоретическая и практическая значимость работы

Сформирована современная аналитическая система, позволяющая осуществлять мониторинг зон риска заболевания ЛЗН и основных мест концентрации популяций дикоживущих видов птиц, определять диапазон проведения противоэпидемических мероприятий и прогнозировать эпидемическую обстановку по ЛЗН на территории Волгоградской области. Данная система предусматривает применение молекулярно-генетических методов и ГИС-технологий и может быть использована в практике

5

работы Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор) с целью оптимизации прогнозирования и профилактики заболеваемости ЛЗН на других эндемичных территориях страны.

Проведен молекулярно-генетический анализ изолятов ВЗН, циркулирующих на территории области, установлена их генетическая принадлежность и возможные механизмы проникновения вируса, выявлены особенности клинических проявлений заболевания в зависимости от генотипа вируса.

Созданный информационный ресурс www.lzn-vlg.ru, в первую очередь, касающийся проблем диагностики и профилактики лихорадки Западного Нила, используется в рамках функционирования Референс-центра по мониторингу за возбудителем ЛЗН.

Полученные результаты диссертационной работы включены в проект санитарно-эпидемиологических правил «Профилактика лихорадки Западного Нила», лекционный материал для врачей, лаборантов учреждений санитарно- эпидемиологического профиля клинических диагностических лабораторий, биологов, эпидемиологов и курсов усовершенствования по вопросам специфической индикации и лабораторной диагностики особо опасных заболеваний, проводимых на базе ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора». Кроме того, материалы настоящей работы используются при чтении лекций и проведении практических занятий для студентов медико- биологического факультета Волгоградского государственного медицинского университета.

Основные положения выносимы на защиту:

1. Смена генотипа ВЗН, смещение клинической картины заболевания в сторону более легкого течения и экспансия вируса на новые территории являются имманентными эпидемиологическими особенностями проявления возбудителя ЛЗН в Волгоградской области на современном этапе.

2. Для оптимизации системы эпидемиологического надзора необходимо расширение объектов исследования и сроков проведения мониторинга за ВЗН, что позволит оценить уровень инфицированное™ основных переносчиков, промежуточных хозяев и населения региона, усовершенствовать качество лабораторной диагностики и противоэпидемических мероприятий.

3. Пространственный анализ территории Волгоградской области позволяет районировать ее с учетом степени эпидемиологического риска заболеваемости ЛЗН и определять условные границы очагов возбудителя.

4. Генотипическая принадлежность штаммов ВЗН, циркулирующих в Волгоградском регионе, неоднородна, что не исключает эпидемической активности нескольких геновариантов возбудителя ЛЗН.

5. Климатические условия Волгоградской области, обилие узлов концентрации перелетных птиц и основных переносчиков способствуют формированию константных природных очагов ВЗН и расширению территорий, на которых регистрируется заболеваемость и выявляются маркеры циркуляции вируса.

Апробация работы. Основные результаты диссертации представлены на 69-й открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальнойи клинической медицины» 27-30 апреля 2011 года; III Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням - Москва, 28-30 марта 2011 года; научно-практической конференции молодых ученых и специалистов г. Волгограда 24 апреля 2012 года; Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора «Фундаментальные и прикладные аспекты анализа риска здоровью населения» г. Пермь, 16-18 мая 2012 года; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы болезней, общих для человека и животных», г. Ставрополь, 23-24 мая 2012 года; Заседании Волгоградского регионального отделения всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов 21 июня 2013 года.

Основное содержание диссертации выполнено в рамка НИР38-1-09 «Совершенствование санитарной охраны территории Российской Федерации на основе реализации стратегии ВОЗ по применению Международных медико-санитарных правил (2005 г.) до 2013 г. и концепция Федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации»» (2009.012013.12); 055-1-11 «Совершенствование системы эпидемиологического мониторинга за опасными и природно-очаговыми инфекциями в Волгоградской области» (2011.01 -2015.12); 4.1 Отраслевая научно-исследовательская программа «Научные исследования и разработки с целью обеспечения санитарно- эпидемиологического благополучия и снижения инфекционной заболеваемости в Российской Федерации» (2011.01-2015.12); 063-4.10-11 «Совершенствование эпидемиологического надзора в природных очагах арбовирусных инфекций на территории Нижнего Поволжья» (2011.01 -2015.12).

Публикации. Материалы диссертации представлены в 10 научных работах, в том

числе 6 - в рецензируемых периодических изданиях, рекомендованных ВАК для защиты докторских и кандидатских диссертаций.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 134 листах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, 3-х разделов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 155 источников, в том числе 45 отечественных и 110 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 7 таблицами и 33 рисунками, содержит приложение в виде таблицы на 8 истах.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и методы. Основой методологии нашего исследования был комплексный эпидемиологический подход. При проведении эпидемиологического анализа заболеваемости были использованы карты эпидемиологического обследования очагов, статистические данные о текущей заболеваемости, и заболеваемости за предшествующий период. В исследовании были анализированы кровь, моча и ликвор больных людей с клиническим диагнозом лихорадка Западного Нила, кровь здоровых доноров и реконвалесцентов, перенесших нейроинвазивную форму инфекции, аутопсийный материал от умерших больных ЛЗН, а также полевой материал (кровь лошадей и суспензии органов птиц, суспензии комаров и клещей). Для анализа использовали пробы, полученные Референс-центром в период 2010-2012 г.г.

Сбор и подготовку проб выполняли в соответствии с СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)», МУ 4.2.2039-05 «Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории», МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности», МУ 3.1.3.2600- 10 «Мероприятия по борьбе с лихорадкой Западного Нила на территории Российской Федерации», МУ 3.1.1027-01 «Сбор, учет и подготовка к лабораторному исследованию кровососущих членистоногих -переносчиков возбудителей природно-очаговых инфекций».

Выделение РНК из плазмы крови проводили методом нуклеосорбции на силикагеле с гуанидинизотиоцианатом коммерческими наборами реагентов «РИБО- сорб» и «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия). Для экстракции РНК из проб органов и полевого материала использовали коммерческий набор «Рибо- золь-С» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия) с последующим применением набора «РИБО-преп».

8

Для проведения обратной транскрипции были использованы комплекты реагентов «PEBEPTA-L» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия). ПЦР проводили с помощью амплификационной тест-системы «АмплиСенс WNV-FL» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия).

Кроме того, в работе были использованы экспериментальная тест-система «Набор реагентов для выявления РНК вируса Западного Нила методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с элекгрофоретическим учетом результатов (ГенНил - РЭФ)», производства ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб», а также набор амплификационных и секвенационных праймеров, фланкирующих фрагменты генома - 5TJTR, prot С, prot Е, NS3, NS5 ВЗН, разработанный во ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора.

Учёт продуктов амплификации производили методом электрофореза в 3% агарозном геле (Маниатис Т., с соавт., 1984).

Для постановки реакции секвенирования использовали набор Big Dye Terminator vl.l Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США). Для очистки продуктов реакции терминирования использовался комплект Big Dye XTerminator Purification Kit (Applied Biosystems, США). Определение последовательностей нуклеотидов проводилось с помощью автоматического секвенатора ABI Prism 3130 (Applied Biosystems, США).

Дня проведения иммунодиагностических исследований применяли тест- системы «Векто-НИЛ-IgG», «ВектоНИЛ-^С-авидность» (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск), «Anti-West Nile Virus ELISA (IgM)», «Anti-West Nile Virus ELISA (IgG)», «Avidity AntiWest Nile Virus (IgG) ELISA» («Euroimmun AG», Германия) H«3H-IgM» («Биосервис», г. Боровск).

Молекулярно-генетические и иммунодиагностические исследования проведены совместно с сотрудниками лаборатории генной диагностики и типирования микроорганизмов и группой иммунологических исследований Референс-центра по мониторингу за возбудителем лихорадки Западного Нила на базе ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, соответственно.

Для определения молекулярно-генетических характеристик штаммо ВЗН in silico в работе были использованы 390 полноразмерных последовательностей генома ВЗН всех генотипов, представленные в международной генетической базе данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Поиск последовательностей генов ВЗН осуществлялся в генетической базе

9

данных GenBank, гомологичных исследуемым, с использованием алгоритма Basic Local Alignment Search Tool (BLASTn) на web-сервере Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).

Следующим шагом являлось проведение сравнительного анализа секвенированных последовательностей, которые сопоставлялись с аналогичными последовательностями генов ВЗН генетической базы данных GenBank. Выравнивание последовательностей осуществлялось с помощью алгоритма ClustallW программного пакета Vector NTI® Express Static Academic License (Life Technologies.inc, США). Установление принадлежности к филогенетической группе осуществлялось также с помощью программы Vector NTT. Группирование штаммов и построение филогенетических деревьев проводили при помощи метода присоединения соседей, NJ (Neighbour-Joining method).

Для подбора олигонуклеотидных последовательностей праймеров, обладающих специфической детекцией фрагментов генов prot С, prot Е, NS3, NS5 и 5'UTR всех генотипов возбудителя JI3H также был использован программный пакет Vector NTI® Express Static Academic License (Life Technologies.inc, США). Проверка структуры праймеров для идентификации генотипов ВЗН (образование димеров, шпилек и других вторичных структур) и наличия в нуклеотидных последовательностях сайтов неспецифической гомологии была осуществлена с использованием поисковой системы BLASTn на веб сайте (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/, NCBI, США).

Статистическая обработка эпидемиологических и других данных, а также создание электронных баз данных проводилась в приложении Microsoft Office 2010, Microsoft Exel 2010 (Microsoft, США).

Для построения эпидемиологических карт и пространственной визуализации и анализа эпидемиологических данных в нашей работе был использован программный пакет ArcGis 9 for windows (Компания ERSI, США).

Результаты исследований. Условия формирования природных очагов JI3H в Волгоградской области Климат Волгоградской области засушливый, с резко выраженной континентальностью. Температурный максимум тепла обычно наблюдается в июле-августе и составляет до +44 °С, минимальные значения температуры воздуха отмечаются в январе-феврале и составляют от -36 до -42°С.

Температура окружающей среды оказывает воздействие на различные

10

характеристиками жизненного цикла переносчиков арбовирусов - их выживаемость, количество популяций, и скорость репликативных процессов вируса (Платонов А. Е., 2006; Веш1ег М., 2009; РЫопоу А. Е., й а1., 2008). Необходимое для инфицирования человека через укус комара количество вируса накапливается при +14 °С через 58, при 18 °С через 22, при 23,5°С - через 15, при 30 через 11 суток.

Таким образом климатические условия (температура окружающей среды, количество выпавших осадков, общая влажность) являются одним из основных факторов, влияющих на циркуляцию ВЗН.

Географически Волгоградская область расположена па пути Восточно- Европейского миграционного русла перелетных птиц, являющимся основным маршрутом миграции, соединяющим Африку и Европу. Дальние мигранты летят из Африканского континента и Центральной Азии, близкие мигранты из Центральной и Южной Европы, бассейнов Черного и Каспийского морей, Крыма, Кавказа и Турции (Батурин А.А., с соавт., 2012). Во время сезонных миграций через дельту Волги ежедневно пролетает до 100 тыс. птиц. Большинство (около 90%) этих видов птиц зимуют на Африканском континенте. Из дельты Волги и Средне-Ахтубинской поймы вирус проникает в антропонозные биоценозы в непосредственной близости от жилья человека. Этот процесс лежит в основе развития эпидемических вспышек в Волгоградской области (Львов, Д.К., с соавт., 2004).

Суммируя все эти факты можно сделать вывод о том, что территория Волгоградской области обладает всеми факторами благоприятными для укоренения вируса ЗН и функционирования сформировавшихся природных очагов. Это свидетельствует о том, что исследование членистоногих переносчиков ЛЗН и птиц, для оценки и прогнозирования эпидемической обстановки остается одной из первоочередных задач, несмотря на сложность данного этапа исследования.

Анализ вспышек лихорадки Западного Нила в Волгоградской области

Начиная с 1997 года, в Волгоградской области был выявлен рост случаев менингитов и менингоэнцефалитов неизвестной этиологии, что стало предвестником крупной вспышки ЛЗН в 1999 году в городах Астрахань и Волгоград, по итогам которой было зафиксировано 380 случаев в Волгограде и 95 - в городе Астрахань. Начало роста заболеваемости в 1999 году было отмечено в начале июня, пик наблюдался в августе и сентябре, с дальнейшим спадом в октябре. Важно отметить, что эти эпидемии оказались идентичными по временным показателям со вспышкой на территории США в Нью-Йорке. Анализ вспышки в Волгоградской области в 1999 году

11

показал, что центром очага являлись города Волгоград, Волжский и некоторые близлежащие районы (Светлоярский, Городищенский, Среднеахтубинский). С 1999 по 2007 года регистрировались периодические не значительные вспышки заболевания. Можно предположить, что начиная с 2007 года, когда ьперные был выделен 2 генотип ВЗН из объектов внешней среды, произошло изменение вирусной активности, и в 2010 году возникла крупнейшая вспышка на территории Волгоградской области, вызванная 2 геновариантом возбудителя ЛЗН. Было зарегистрировано 413 лабораторно зафиксированных случаев, 5 из которых с летальным исходом (таблица 1).

Таблица 1.

Распределение случаев заболеваний ЛЗН Волгоградской области по районам за

1999-2012 гг.

Населённые 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

г. Волгоград 260 13 4 11 _ _ 3 1?. 53 2 4 318 46 144

г. Волжский 95 11 2 _ _ _ 8 1 33 - 1

Алексеевский _ 1

Быковский _ _ _ _ _ „ _ 2 _ - - _ 1

Старополтавский 9 1

Светлоярский 7 1 _ 3 1 1

Горолишенский 5 13 7 2

Октябрьский 2 _ 1

Ольховский 1 _ 1 - -

Палласовский 1 4 - 1

Среднеахтубинский _ _ : _ _ _ 1 _ _ 2 1 4

Ленинский _ _ _ _ _ _ _ _ 1 _ _ _ _

Иловлинский _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 1 _ -

Камышинский 3 3

Калачёвский _ 1 1 -

Клетский _ 1

Михайловский _ 7 8

Котельниковский 2 1

Фроловский _ 4 _ 4

Чернышковский _ 1 _ 1

Николаевский 4 _ -

Руднянский район _ _ _ _ _ _ _ _ - - 4 - -

Даниловский _ 1

Цубовский 5 _ 3

Урюпинский 5 _ -

Суровикинский _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ 1 _ -

Еланский 1 -

Итого: всего/смертность 380/38 32/5 15/0 15/1 0 0 3 12 63/2 2/0 5/1 413/5 60/0 210/4

Эпидемиологические показатели не имели значительных отклонений от таковых при эпидемических осложнениях 1999 - 2007 гг., за исключением существенного снижения тяжелых форм заболевания и уменьшения количества клинических проявлений, связанных с поражением ЦНС и как следствие снижение процента

летальных исходов, что может быть связано с генотипической принадлежностью штаммов ВЗН, обусловивших рост заболеваемости (рисунок 1).

Анализ заболеваемости в период с 1999 по 2012 годы показал, что по характеру клинического течения ЛЗН встречаются как легкие формы заболевания, так и тяжелые нейроинвазивные формы с высокой летальностью. В Волгоградской области начиная с 2010 года наблюдается смещение клиники в сторону более легкого протекания болезни и снижение смертельных исходов, причем в последние годы в 35 % случаев заболевания ЛЗН у больных выявлялась аллергоподобная сыпь. Вполне вероятно, что изменение клинических проявлений связано с изменением (сменой) генотипа ВЗН, вызывающего заболеваемость. Кроме этого, наибольшее количество случаев ЛЗН наблюдалось в возрастных категориях 20-59 лет (рисунок 2).

15

1

5 5 л

- 1 Л ° ° ш 1,1 "-fU

1999 2ООО 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

Рисунок 1. Количество смертельных случаев больных ЛЗН на территории

Волгоградской области в период с 1999 по 2012 г.г.

1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

В 0-14 лет ■ 15-19 лет ■ 20-29 лет ■ 30-39 лет к 40-49 лет ■ 50-59 лет ■ 60 лет и старше Рисунок 2. Процентное соотношение количества случаев заражения ЛЗН в

различных возрастных группах

К отличительным особенностям вспышки 2011 года можно отнести относительно постоянное значение количества нейроинвазивных форм течения заболевания (3,3 %) (рисунок 3). Отмечено изменение мест и условий инфицирования. В остальном эпидемиологическая картина 2011 года была схожа со вспышкой ЛЗН в 2010 году.

В 2012 году на территории Волгоградской области зарегистрировано уже 210 случаев заболеваний лихорадкой Западного Нила, причем количество случаев заболевания на 100 тысяч населения составляло уже около 8,0 случаев по сравнению с 2,3 в 2011 году.

За 36 |

2010 2011 2012 2010 2011 2012

■ нероимваэивные формы ■ общее число заболевших ЛЗН

Зв

—

0.5» 3.3» - ТО*Х ш

2010 2011 2012 ш нероинвазивные формы ■ общее количество

Рисунок 3. Распределение тяжести клинических проявлений ЛЗН

За. Процентный показатель нейроинвазивных форм ЛЗН среди заболевших в России в период 2010 - 2012 гг. 36. Сравнительная характеристика (в %) больных ЛЗН с нейроинвазивными формами заболевания на территории «новых» и «старых» очагов Российской Федерации.

Зв. Сравнительная характеристика (в %) больных ЛЗН с нейроинвазивными формами заболевания в Волгоградской области.

Пространственный эпидемиологический анализ территории Волгоградской области, отражающий степень эпидемиологического риска

Пространственный анализ территории области позволил произвести подсчет площади зон повышенного и высокого эпидемиологического риска заболеваемости (рисунок 4). Для этого территория области была разделена на стандартные участки полигональной сетки, составной единицей сетки был выбран правильный квадрат с длинной стороны 4,57 км2. Кластеризация была осуществлена по средствам внесения данных по заболеваемости ЛЗН в области в период с 1999-2012 г.г. в атрибутивны, поля таблицы слоев. Кластеры, содержащие более 1 случая заболевания, вошли в группу

14

повышенного эпидемиологического риска. Оставшиеся кластерные группы I формировались в соответствии с пространственной удаленностью от кластеров 1-й группы. Общее количество кластеров составило 5,393, что соответствует 113,000 км2 : общей площади Волгоградской области. Проведенный анализ показал, что около 67,790 км2 территорий Волгоградской области находятся в зоне повышенного и высокого эпидемиологического риска, что соответствует примерно 60 % территории области, и

1 позволяет говорить о функционировании природных очагов ЛЗН на всей территории

!

! Волгоградской области.

■ зона наивысшего

■ зона высокого зона среднего

■ зона низкого И общая площадь

Рисунок 4. Кластерный анализ территории Волгоградской области по степени эпидемиологического риска инфицирования ВЗН.

На основе данных анализа нами была создана картограмма, отражающая условные границы природных очагов ЛЗН, которая позволяет сконцентрировать проводимые противоэпидемические мероприятия на наиболее неблагополучных территориях области и способствует увеличению эффективности прогнозирования эпидемиологической обстановки (рисунок 5).

I

Нами были нанесены основные узлы концентрации перелетных птиц и основные направления их перемещений. Один из наиболее значимых узлов концентрации птиц, в

!

; районе Волго-Ахтубинского междуречья и Сарпинских озёр, расположен в непосредственной близости от густонаселенных территорий области, где наблюдается основная масса случаев заболевания. Это является подтверждением влияния сезонных миграционных процессов на формирование и распространение очагов возбудителя ЛЗН в Волгоградской области.

■ Зона повышенного риска

■ Зона высоко риска Зона среднего рискка

■ Зона низкого риска Узлы

концентрации

Направления движения

€1

А Волго-Ахтубинское междуречье и Сарпинские озёра & Эльтонско-Булухтинекое «бутылочное горлышко» $ Щербаковско-Еруслэнский узел 4} Средне-Донская излучина

Рисунок 5. Распределение зон риска заболеваемости ЛЗН на территории Волгоградской области.

Молекулярно-генетический анализ геномов ВЗН

Исследование молекулярно-генетической структуры 390 полноразмерных последовательностей генома ВЗН т ¡Шсо позволило нам подтвердить высокую гомологию Волгоградских изолятов со штаммами, выделенными на африканском континенте, в Европе и США. На основе проведенного кластерного анализа геномов были сформированы 6 генетических групп, соответствующих современной классификации геномов ВЗН (рисунок 6).

Генотипическая принадлежность возбудителя ЛЗН на территории ЮФО неоднородна. Ранее в этом регионе доминировал 1а генотип (АУ277252, АУ278442, АРЗ17203), по результатам анализа, имеющий высокую гомологию с африканскими, европейскими и североамериканскими штаммами. В 2004 г. в Ростовской области впервые зарегистрирован 2 генотип (Платонов А.Е., с соавт., 2011). До 1999 года 2 генотип встречался лишь на территории Южной Африки. В Волгоградской области в 2007 году выявлены изоляты 2 геноварианта (Р1257721), что свидетельствуют о тенденции к расширению эндемичных территорий этого генотипа ВЗН. Кроме того, в этом регионе в 2005-2006 обнаружен 4 генотип (АУ277251, РЛ59120-30), выделенный из комаров рода игапо1еша. Данный генотип обнаружен только на территории России.

Таким образом на территории ЮФО сформировались очаги ВЗН, с преобладанием изолятов 2 генотипа. Наличие в регионе выделенных ранее 1 и 4 генотипов диктует

необходимость постоянного мониторинга за возбудителем и проведения дальнейших исследований, направленных на создание диагностических ПЦР тест-систем, способных детектировать все генотипы ВЗН. В связи с этим нами были разработаны т ¡Шсо олигонуклеотидные затравки, способные специфически детектировали фрагменты кодирующих последовательностей ртШ С, рг(П Е, N83, N85 и 5'иТК всех генотипов возбудителя ЛЗН.

Рисунок 6. Дендорграмма кластерного анализа 390 исследуемых штаммов ВЗН.

В 2010 году методом секвестрования нами была подтверждена принадлежность изолята ВЗН, выделенного из клинического материала, ко 2 генотипу. В 2011 году в двух пробах, полученных от больных ЛЗН из Волгоградской и Воронежской области. Оба изолята также принадлежали ко второму генотипу вируса. Последовательности нуклеотидов возбудителя были депонированы в генетической базе вепВапк, 1ЧСВ1 (США).

В 2012 были исследованы пробы от больных из Волгоградской, Астраханской, Саратовской, Ростовской областей и Ставропольского края. В результате было выявлено, что изоляты из Волгоградской, Ростовской и Саратовской областей принадлежали ко 2 генотипу вируса, а изоляты из Астраханской области и Ставрополья - к 1 геноварианту вируса. Результаты секвенирования представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Результаты секвенирования изолятов ВЗН 2010-2012 году.

Год Изолят Регион Генотип Источник выделения Локус Статус Идентификационный номер

2010 VOLGOGRAD-00/328-2010 Волгоградски область 2 Человек, сыворотка коови protC не депонирован

гон VOLGOGRAD-CD 1/91 8-2011 Волгоградская область 2 Человек, моча protC депонирован JQ014115

protE депонирован Q014116

NS3 яе депонирован

VORONEZH-01/845-2011 Воронежская область 2 Человек, кровь protC депонирован IN627243

2012 VOLGOGRAD- 02/513-2012 Волгоградская область 2 Человек, сыворотка крови protC представлен к депонированию JX844660

protE яе депонирован

VOLGOGRAD-04/410-2012 Волгоградская область 2 Человек, сыворотка крови protE не депонирован

VOLGOGRAD-03/619-2012 Волгоградская эбласть 2 Человек, головной мозг protE представлен к депонированию JX844662

NS3 1редставлен к цепониро ванию FX844661

ASTRAKHAN-01/925-2012 Астраханская область 1 Человек, сыворотка крови protC представлен к депонированию 1X891481

SARATOV 01/1367-2012 Саратовская область 2 Человек, гыворотка крови protC не депонирован

SARATOV 32/1375-2012 Саратовская область 2 Птица, головной мозг protC не депонпрован

STAVROPOL 01/810-2012 Ставропольски йкрай 1 Человек, сыворотка крови protC яе депонирован

ROSTOV ON DON 01/1464-¡2012 Ростовская область 2 Человек, сыворотка крови protC не депонирован

ROSTOV ON DON 02/14712012 Ростовская область 2 Человек, сыворотка крови protC не депошфован

По результатам секвенирования можно сделать вывод, что на территории ЮФО циркулирует как минимум 2 генотипа ВЗН, причем с превалированием 1 генотипа до 2007 года и активизацией 2 генотипа с 2010 года. Необходимо отметить наличие устойчивых природных очагов 1 геноварианта в соседних с Волгоградской областью регионах, что не исключает возможность переключения эпидемической активности между генотипами возбудителя ЛЗН в последующие годы.

Таким образом, полученные результаты данной работы свидетельствуют о необходимости расширения сроков проведения мониторинга за ВЛЗ, с захватом межэпидемического периода, увеличения объемов и объектов исследования на наличие возбудителя ЛЗН. Влияние климатогеографических условий Волгоградской области, способствующих формированию природных очагов, контактирующих с другими очагами ЛЗН в Европе и Африке, посредством ежесезонных миграционных перелетов птиц, в сочетании с обилием переносчиков и возможной циркуляцией нескольких генотипов ВЗН, требуют непрерывного эпидемиологического наблюдения. Проведение расширенного мониторинга за возбудителем ЛЗН в сочетании с применением возможностей ГИС-технологий и других современных подходов, позволят осуществлять более точное прогнозирование эпидемической ситуации в рамках совершенствования эпидемиологического надзора за лихорадкой Западного Нила.

ВЫВОДЫ

1. Ретроспективный анализ вспышек ЛЗН и эпидемической ситуации в Волгоградской области в период 1999-2012 гг. показал, что природно-климатические особенности региона, молекулярно-генетические характеристики возбудителя и основные факторы, способствующие росту заболеваемости, определяют напряженную эпидобстановку по ЛЗН и расширение ареала инфекции.

2. Показано, что важным компонентом эпидемиологического надзора за ЛЗН являются иммунодиагностические и молекулярно-генетические методы, обеспечивающие необходимую информацию, как при изучении структуры природных очагов, так и при осуществлении мониторинга за заболеваемостью ЛЗН.

3. Доказана целесообразность мониторинга объектов внешней среды на наличие РНК возбудителя ЛЗН и определения степени инфицированное™ основных переносчиков и промежуточных хозяев ВЗН, что позволит прогнозировать развитие заболеваемости ЛЗН в Волгоградской области.

4. Выявление специфических АТ к возбудителю ЛЗН и его РНК в пробах крови

19

доноров определяет необходимость их обследования в период эпидемического сезона по JI3H и изменения стандарта лабораторной диагностики ЛЗН.

5. Показано, что РНК изолятов ВЗН, выделенных в Волгоградской области в период 2010-2012 гг., входит в кластерную группу штаммов вируса лихорадки Западного Нила, принадлежащих ко 2 генотипу. Подтверждена высокая генетическая гомология штаммов, циркулирующих на территории Волгоградской области с африканскими изолятами, что позволяет предположить занос возбудителя ЛЗН на территорию Волгоградской области во время сезонных миграций птиц. Циркуляция изолятов ВЗН с различным генотипом не исключает эпидемической активности нескольких геновариантов возбудителя ЛЗН в регионе Нижнего Поволжья.

6. Продемонстрировано, что полученные картограммы и векторные карты Волгоградской области, отражают распределение зон эпидемического риска инфицирования ВЗН и основные узлы сосредоточения мигрирующих видов птиц.

7. Проведен кластерный анализ территории Волгоградской области и визуализация основных зон эпидемического риска инфицирования и условных границ очагов ЛЗН, что позволяет совершенствовать мероприятия в области эпидемиологического благополучия населения, а также' применить предложенный алгоритм мониторинга возбудителя в эндемичных регионах и «новых» очагах инфекции.

Список опубликованных работ

1. Путинцева Е. В., Липницкий А. В., Алексеев В. В., Смелянский В. П., Антонов В. А., Мананков В. В., Погасий Н. И., Злепко А. В., Чайка А. Н., Крючкова Т.П., Савченко С. Т., Жуков К. В. Распространение лихорадки Западного Нила в мире и Российской Федерации в 2010 г. / Е. В. Путинцева, А. В. Липницкий, В. В. Алексеев, В. П. Смелянский, В. А. Антонов, В. В. Монанков, Н. И. Погасий, А. В. Злепко, А. Н. Чайка, Т. П. Крючкова, С. Т. Савченко, К. В. Жуков // Пробл. особо опасных инф. - 2011, № 107. -С. 38-41. (Журнал из перечня ВАК)

2. Жуков К. В., Савченко С. С., Антонов В. А., Смелянский В. П. Лихорадка Западного Нила в 2010 году и ее эпидемиологические особенности в Волгоградской области / К. В. Жуков, С. С. Савченко, В. А. Антонов, В. П. Смелянский // Инф. болезни — 2011 г., том 9, №1. - С.123. (Журнал из перечня ВАК)

3. Савченко С. С., Антонов В. А., Ткаченко Г. А., Алексеева В. В., Зинченко О.В., Жуков К. В., Шпак И. М., Батурин А. А., Смелянский В. П., Путинцева Е. В.

20

Молекулярный мониторинг вируса лихорадки Западного Нила / С. С. Савченко, В. А. Антонов, Г. А. Ткаченко, В. В. Алексеева, О. В. Зинченко, К. В. Жуков, И. М. Шпак, А. А. Батурин, В. П. Смелянский, Е. В. Путинцева // Вестник ВолГМУ. - 2012. - № 2. - С. SS-SS. (Журнал из перечня ВАК)

4. Смелянский В. П., Алексеев В. В., Липницкий А. В., Антонов В. А., Иоанниди Е.

A., Божко В. Г., Путинцева Е. В., Мананков В. В., Савченко С. Т., Жуков К. В. Особенности клиники и эпидемиологии лихорадки Западного Нила в сезон 2010 года в Волгоградской области / В. П. Смелянский, В. В. Алексеев, А. В. Липницкий, В. А. Антонов, Е. А. Иоанниди, В. Г. Божко, Е. В. Путинцева, В. В. Мананков, С. Т. Савченко. К. В. Жуков // Инф. Болезни. - 2011. - т.9, № 4. - С. 75-78. (Журнал из перечня ВАК)

5. Батурин А. А., Антонов В. А., Смелянский В. П., Жуков К. В., Чернобай В. Ф., Колякина H. Н. Роль птиц как потенциальных резервуаров вируса Западного Нила на территории Российской Федерации / А. А. Батурин, В. А. Антонов, В. П. Смелянский, К.

B. Жуков, В. Ф. Чернобай, H. Н. Колякина // Пробл. особо опасных инф. - 2012. -№ 114. -С. 18-21. (Журнал из перечня ВАК)

6. Путинцева Е. В., Антонов В. А., Викторов Д. В., Смелянский В. П., Мананков В. В., Погасий Н. И., Ткаченко Г. А., Шпак И. М., Жуков К. В., Снатенков Е. А. Особенности эпидемической ситуации по лихорадке Западного Нила в 2012 г. на территории Российской Федерации / Е. В. Путинцева, В. А. Антонов, Д. В. Викторов, В. П. Смелянский, В. В. Мананков, Н. И. Погасий, Г. А. Ткаченко, И. М. Шпак, К. В. Жуков // Пробл. особо опасных инф. -№1 2013.-С. 25-29. (Журнал из перечня ВАК)

7. Жуков К. В., Савченко С. С., Антонов В. А. Молекулярно-эпидемиологические особенности вируса лихорадки Западного Нила, циркулирующего на территории южного федерального округа РФ / К. В. Жуков, С. С. Савченко, В. А. Антонов // Материалы 69-й открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной клинической медицины» 27-30 апреля 2011 г. - С. 169.

8. Сборник материалов по вспышке лихорадки Западного Нила В Российской

Федерации в 2010 году: сборник / Под. ред. Академика РАМН Г. Г. Онищенко.,

составители: Г. Г. Онищенко, Ю. В. Демина, Н. Д. Пакскина, В. А. Антонов, Д.В.

Викторов, В. П. Смелянский, Е. В. Путинцева, С. Т. Савченко, В. В. Алексеев, Г. А.

Ткаченко, К. В. Жуков, А. В. Злепко, Т. П. Крючкова, М. В. Монастырский, А. Н.

Чайка, С. Т. Савченко, Г. А. Заболотняя, В. В. Шкарин, И. В. Ковтунов, Г. Л. Шендо, М.

21

И. Чубирко, Т. Н. Платунина, О. М. Гунина, Ю. И. Степкин, В. П. Клиндухов, Н. С. Сухинина, В. В. Пархоменко, К. Б. Яшкулов, С. П. Савченко, Н. И. Чимидова, С. Д. Джамбинов, Л. Б. Михаляева, М. Ю. Соловьев, Н. В. Леоненко, О. В. Гончарова, Г. Т. Айдинов, А. В. Ермаков, И. В. Ковальчук, А. А. Герасименко, А. Н. Куличенко, Н. Ф. Василенко, О. В. Малецкая, Н. Г. Варфоломеева, Г. П. Шкарлет, А. С. Волынкина, И. Н. Заикина, А. И. Семенов, Н, Н. Валеуллина - Волгоград: ООО «Волга-Паблишер», 2011-244с.

9. Жуков К. В., Савченко С. С., Ткаченко Г. А., Алексеева В. В., Шпак И. М., Батурин А. А., Зинченко О. В., Дрефс Н. М., Смелянский В. П., Путинцева Е. В., Антонов В.

A. Совершенствование мониторинга за лихорадкой Западного Нила на территории волгоградской области в 2011 году / К. В. Жуков, С. С. Савченко, Г. А. Ткаченко, В.

B. Алексеева, И. М. Шпак, А. А. Батурин, О. В. Зинченко, Н. М. Дрефс, В. П. Смелянский, Е. В. Путинцева, В. А. Антонов // Всероссийская научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора «Фундаментальные и прикладные аспекты анализа риска здоровью населения» г. Пермь, 16-18 мая, 2012 г. — Т. 1. - С. 197200.

10. Шпак И. М., Батурин А. А., Савченко С. С., Жуков К. В. Алексеева В. В., Ткаченко Г. А., Зинченко О. В., Смелянский В. П., Антонов В. А. Генотипирование возбудителя лихорадки Западного Нила во время вспышки в 2011 году / И. М. Шпак, А.

A. Батурин, С. С. Савченко, К. В. Жуков, В. В. Алексеева, Г. А. Ткаченко, О. В. Зинченко,

B. П. Смелянский, В. А. Антонов // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы болезней, общих для человека и животных», г. Ставрополь, 23-24 мая 2012 г. - С.149-150.