Автореферат и диссертация по медицине (14.01.16) на тему:Фармакотерапия лекарственных поражений печени при туберкулезе

На правах рукописи

СУХАНОВ Дмитрий Сергеевич

ФАРМАКОТЕРАПИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПОРАЖЕНИЙ ПЕЧЕНИ ПРИ ТУБЕРКУЛЕЗЕ (эксперимеитальио-клииическое исследование)

14.01.16 фтизиатрия 14.03.06 фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Санкт-Петербург 2014

г г апр

005567570

Работа выполнена на кафедре фтизиопульмонологии и торакальной хирургии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный консультант: Виноградова Татьяна Ивановна - доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории экспериментального туберкулеза и новых медицинских технологий ФГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Минздрава России

Официальные оппоненты:

Стаханов Владимир Анатольевич - доктор медицинских наук, профессор заведующий кафедрой фтизиатрии ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Мишин Владимир Юрьевич - доктор медицинских наук, профессор заведующий кафедрой фтизиопульмонологии ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Шабанов Петр Дмитриевич - доктор медицинских наук, профессор заведующий кафедрой фармакологии ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» Минобороны России

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Южно-Уральский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится ¿{ 2015 года в «-¿7» часов

на заседании диссертационного совета Д 208.092.01 при ФГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации (191036 Санкт-Петербург, Литовский пр., д. 2/4, тел. (812) 579-25-54).

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке и на официальном сайте www.spbniif.ru ФГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации (191036, Санкт-Петербург, Литовский пр д. 2/4, тел. (812) 579-25-87).

Автореферат разослан «/¿У» 2015 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Одной из ведущих проблем отечественной фтизиатрии остается низкая эффективность клинического излечения больных, составившая в 2011 г. 34,3 % (Нечаева О.Б., 2012). Это связано в известной степени с широким распространением лекарственно устойчивых штаммов микобактерий туберкулеза МЛУ МБТ - с 8,7 на 100 тыс. населения в 1999 г. до 24,3 в 2012 г., что требует длительного применения потенциально токсичных комбинаций химиопрепаратов (Вишневский Б.И. и др., 2008; Павлова М.В. и др., 2010; Васильева И.А. и др., 2012; Нечаева О.Б. и др., 2013; Стерликов С.А. и др., 2014; Gaude G.S. et al., 2014). Кроме того, огромную роль играет и высокая частота побочных эффектов противотуберкулезной терапии - от 7,7 % до 90,5 % (Мишин В.Ю., 2007; Мордык А.В. и др., 2010; Иванова Д.А. и др., 2012). Одно из первых мест среди осложнений комбинированной химиотерапии туберкулеза занимают лекарственные поражения печени (JI1111), частота которых составляет 7-74 %, на фоне применения препаратов основного ряда они регистрируются у 60 % пациентов, а при использовании препаратов резервного ряда - у 42,4 % (Вольф С.Б. и др., 2009; Борзакова С.Н. и др., 2010; Гельберг И.С. и др., 2011; Иванова Д.А., 2011). Лекарственные поражения печени препятствуют проведению полноценной этиотропной терапии и требуют ее отмены у 11-28% пациентов (Иванова Д.А. и др., 2013; Shang P. et al., 2011; Ramappa V. et al., 2012). Молекулярные механизмы патогенеза ЛПП включают дефицит АТФ вследствие тканевой гипоксии, свободнорадикальное окисление внутриклеточных субстратов и повреждение цитоскелета на фоне недостатка антиоксидантов, что приводит к развитию дистрофических и некробиотических процессов с последующим патологическим апоптозом поврежденных гепатоцитов (Радченко В.Г. и др., 2011; Шифф Ю.Р. и др., 2011; Zimmerman H.J., 1999; Arbex М.А. et al., 2010). Дефицит АТФ существенно отражается на течении и других энергозависимых про-

цессов - иммунных реакций, регенерации, воспаления и др. (Румянцева С.А. и др., 2010). Кроме того, существуют и другие пути влияния печени на иммунологическую реактивность, связанные с изменением ее функций: секреторной экскреторной, дезинтоксикационной и др. (Филиппов C.B. и др., 2003).

Общие механизмы повреждений паренхимы печени и иммунной дисфункции при туберкулезе определяют схожие направления патогенетической терапии. Наличие цитокинового дисбаланса обосновывает применение иммунокорректоров, в частности - индукторов эндогенного IFN-y, использующих механизмы естественного и адаптивного иммунитета (Киселев О.И. и др., 2007). В тоже время, для коррекции митохондриальной дисфункции, лежащей в основе внутриклеточных патологических процессов, требуется активация сукцинатоксидазного окисления, обладающего мощной энергопродукцией (Кожока Т.Г., 2007; Хазанов В.А., 2009). В последние годы появились оригинальные гепатопротекторные сукцинатсо-держащие препараты - реамберин, ремаксол и рунихол, положительное действие которых показано при поражении печени различного генеза (Са-ватеева-Любимова Т.Н. и др., 2010; Сологуб Т.В. и др., 2010; Романцов М.Г. и др., 2010; Коваленко А.Л. и др., 2011; Шикалова М.А. и др., 2012; Яковлев А.Ю. и др., 2012).

Степень разработанности темы исследования. В литературе отсутствуют сведения о влиянии фармакологических средств на основе янтарной кислоты на лечебное действие ПТП при экспериментальном туберкулезе и проявления гепатотоксичности, индуцированной химиотерапией. Остаются недостаточно изученными вопросы клинической эффективности реамберина и ремаксола и их антиоксидантное действие при поражении печени ПТП. Практически отсутствуют сведения о роли апоптотических процессов гепатоцитов в развитии повреждений печени, индуцированных специфической химиотерапией, а также о возможности коррекции гепато-

протекторными препаратами активности основных про- и антиапоптотиче-ских факторов. Недостаточно исследовано опосредованное гепатопротек-торное действие индукторов интерферона при экспериментальном туберкулезе и в клинике.

Цель исследования: совершенствование терапии туберкулеза органов дыхания за счет фармакологической коррекции поражений печени противотуберкулезными препаратами на основе экспериментальных данных. Задачи исследования

1. Дать оценку гепатопротекторного действия ремаксола и рунихола при поражениях печени, индуцированных противотуберкулезными препаратами, и их влияния на процессы репаративной регенерации печени в экспериментальных условиях.

2. Изучить возможности коррекции сункцинатсодержащими препаратами и циклофероном апоптотических процессов в гепатоцитах при воздействии противотуберкулезными препаратами в эксперименте.

3. Исследовать влияние сункцинатсодержащих препаратов и циклоферона в составе комплексной терапии на течение экспериментального туберкулеза с различным спектром лекарственной устойчивости возбудителя.

4. Оценить выраженность синдрома цитолиза у больных впервые выявленным туберкулезом легких с различным уровнем сывороточного ШИ-у при включении циклоферона в комплексную терапию.

5. Дать сравнительную оценку клинической эффективности реамберина, ремаксола и адеметионина при поражении печени противотуберкулезными препаратами.

Научная новизна исследования

Впервые доказана перспективность использования оригинальных лекарственных препаратов на основе янтарной кислоты при поражениях печени, индуцированных противотуберкулезными препаратами основного и резервного ряда. Раскрыты ранее неизвестные свойства реамберина, ре-

максола и рунихола- стимулировать репаративную регенерацию ткани печени.

Установлено, что сукцинатсодержащие препараты и циклоферон разнонаправленно влияют на апоптотические процессы гепатоцитов при введении противотуберкулезных препаратов экспериментальным животным.

Дано экспериментальное обоснование включения циклоферона и ре-максола с целью повышения эффективности терапии туберкулеза, вызванного возбудителями с различной степенью лекарственной чувствительности и устойчивости к ПТП.

Установлена обратная корреляция между исходно низким уровнем сывороточного ШЫ-у у больных туберкулезом и маркерами цитолитиче-ского синдрома.

Расшифрованы механизмы терапевтического воздействия реамберина и ремаксола на показатели антиоксидантной защиты организма.

Предложено новое направление терапии ЛПП у больных туберкулезом с использованием сукцинатсодержащих препаратов без отмены химиотерапии на основании оценки их сравнительного влияния на течение цитолитического и холестатического синдромов.

Теоретическая и практическая значимость

Расширены представления о фармакодинамике препаратов на основе янтарной кислоты (реамберин, ремаксол, рунихол), уточнены механизмы и выраженность их гепатопротекторного действия в комплексной терапии туберкулеза.

Разработана модель поражения печени противотуберкулезными препаратами резервного ряда, которая позволяет проводить доклиническую оценку гепатопротекторной активности лекарственных средств различного механизма действия.

Доказана информативность лабораторной оценки уровня сывороточного ГБИ-у у больных туберкулезом, что дает возможность выделить группу риска развития ЛПП, которая требует назначения индукторов интерфе-

рона для снижения частоты возникновения цитолитического синдрома и повышения эффективности химиотерапии.

Обоснован дифференцированный подход к назначению препаратов янтарной кислоты (реамберин, ремаксол) в зависимости от преобладания цитолитического или холестатического синдромов поражений печени, вызванных действием противотуберкулезных препаратов.

На основании результатов исследования разработана тактика терапии ЛПП у больных туберкулезом, пригодная для применения в практическом здравоохранении.

Методология и методы исследования

Теоретической и методологической основой диссертационной работы послужили труды отечественных и зарубежных ведущих ученых посвященных проблеме совершенствования комплексной терапии туберкулеза. Использованы нормативные документы и приказы Министерства здравоохранения Российской Федерации, регламентирующие лечение больных туберкулезом, проведение доклинических и клинических исследований лекарственных препаратов.

В работе применялись общенаучные (экспериментальные и теоретико-эмпирические) и специальные методы исследования: биохимические, бактериологические, иммунологические, морфологические, лучевые, инструментальные, статистические.

Легитимность исследования подтверждена решением Локального Этического комитета ГБОУ ВПО «Северо-Западный медицинский университет им. И.И. Мечникова» Минздрава России (протокол № 5 от 7.05.2014).

Положения, выносимые на защиту

1. Ранними проявлениями гепатотоксического воздействия противотуберкулезных препаратов основного и резервного ряда являются качественные и количественные характеристики нарушений структурно-функциональной полноценности печени экспериментальных животных.

Препараты на основе янтарной кислоты оказывают существенное протек-тивное действие на печеночную паренхиму, способствуют уменьшению степени выраженности биохимических и морфологических нарушений, стимулируют репаративную регенерацию ее паренхимы.

2. Включение ремаксола и циклоферона в комплексное лечение экспериментального туберкулеза, вызванного лекарственно чувствительными и лекарственно устойчивыми МВТ, сопровождается ускорением инволюции специфического воспаления легких, повышением поглотительной и переваривающей активности макрофагов, в результате чего повышается эффективность химиотерапии.

3. Сукцинатсодержащие гепатопротекторы и циклоферон разнонаправленно воздействуют на основные про- и антиапоптотические пути в гепатоцитах, а также на конечный уровень апоптоза. Наиболее выраженным антиапоптотическим эффектом обладают реамберин.

4. Индуктор эндогенного интерферона- циклоферон увеличивает продукцию интерферона-гамма у больных туберкулезом легких с исходно низким его уровнем, что способствует снижению риска развития и выраженности лекарственно обусловленного цитолитического синдрома.

5. Реамберин и ремаксол обладают положительным однонаправленным влиянием на биохимические проявления лекарственных поражений печени и антиоксидантный потенциал организма у больных туберкулезом органов дыхания.

Степень достоверности полученных результатов и апробация работы. Анализ результатов настоящего исследования основан на изучении репрезентативной выборки клинического и экспериментального материала и обработке полученных данных современными методами параметрической и непараметрической статистики.

Подана заявка на патент «Способ дифференцированного подхода к назначению индукторов интерферона при лечении больных туберкулезом легких» (приоритет № 20120388 от 13.07.2012).

Результаты исследования используются в клинической практике СПб ГБУЗ «Противотуберкулезный диспансер № 12», СПб ГБУЗ «Городской противотуберкулезный диспансер», ГБУЗ «Противотуберкулезный диспансер Калининградской области», ГБУЗ «Пензенский областной клинический центр специализированных видов медицинской помощи»; в учебном процессе кафедры фтизиопульмонологии и торакальной хирургии ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова», кафедры фтизиатрии ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет», кафедры фтизиопульмонологии и профпатологии УО «Гродненский государственный медицинский университет», кафедры фтизиопульмонологии ГБОУ ДПО «Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования».

Материалы диссертации включены в учебное пособие «Гепатотроп-ные средства в терапии поражений печени противотуберкулезными препаратами» (утверждено Ученым советом СПХФА, 2012), «Побочные действия противотуберкулезных препаратов и методы их устранения» (утверждено Ученым советом СПб МАПО, 2011), «Туберкулез. Особенности течения, возможности фармакотерапии» с грифом УМО по медицинскому и фармацевтическому образованию медицинских ВУЗов России (СПб., 2009).

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на 25 научно-практических мероприятиях различного уровня, в том числе на Международной научно-практической конференции «Первые итоги работы фтизиатрической службы по внедрению стратегии «5Юр-ТВ» в практическое здравоохранение» (Гродно, 2009), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Совершенствование медицинской помощи больным туберкулезом» (СПб., 2010, 2011), Международной научно-практической конференции студентов, молодых ученых и специалистов «Я могу остановить туберкулез» (Гомель, 2010), IX съезде фтизиатров России (Москва, 2011), ХП-Х1П 1пегпаПопа1 Еигоаз1ап

Congress of Surgery and Gastroenterology (Baku, 2011, 2013), IX международном симпозиуме гепатологов Беларуси «Актуальные вопросы гепато-логии» (Брест, 2011), XXXII Zjazd Polskiego Towarzystwa Chorob Plue (Wisla, 2012), IV съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012), научно-практической конференции с международным участием «Современные проблемы инфекционной патологии человека» (Минск, 2012), I и П Конгрессах национальной ассоциации фтизиатров (СПб., 2012, 2013), VII международной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 2013), 9-й международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук и возможности трансляционной медицины в решении актуальных проблем практического здравоохранения» (Астрахань, 2013), III науковом симпоз1уме «1мунопатолопя при захворюваннях оргашв дихання i травления» (Тернополь, 2013).

По теме диссертации опубликовано 52 работы, в том числе 32 в журналах, включенных в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий», рекомендуемых ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.

Личный вклад автора состоит в непосредственном участии на всех этапах выполнения диссертационной работы: разработка идеи исследования; постановка цели и задач, построение дизайна исследования; создание схем лечения, оценка их эффективности в эксперименте и клинике, статистическая обработка полученных результатов и их интерпретация; подготовка основных публикаций; апробация результатов исследования.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 273 страницах, состоит из введения, обзора литературы, 5 глав с изложением материалов и методов, а также результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы (208 отечественных и 160 иностранных источников). Работа иллюстрирована 36 таблицами и 92 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

В работе изучены оригинальные препараты, разработанные ООО «НТФФ» ПОЛИСАН» (Россия): на основе янтарной кислоты - реамберин (per. №001048/01) и ремаксол (per. № ЛСР-009341/09); рунихол (таблети-рованная лекарственная форма, проходит клинические исследования), а также циклоферон - индуктор раннего интерферона смешанного типа (per. №001049/03). Препаратом сравнения служил адеметионин (Хоспира С.п.А., Италия, per. № 011968/02) - инфузионная и таблетированная лекарственные формы.

Материал и методики, использованные в экспериментальных исследованиях

Экспериментальные исследования выполнены на базе лаборатории экспериментального туберкулеза и новых медицинских технологий ФГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопуль-монологии» Минздрава России (руководитель - д.м.н., профессор Виноградова Т.И.) и лаборатории сравнительной сомнологии и нейроэндокри-нологии ФГЪУН «Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова» РАН (зав. лабораторией - д.м.н. Оганесян Г. А.). Выборка животных включала 637 особей, в том числе 359 белых нелинейных крыс-самцов и 241 белых нелинейных мышей-самцов (питомник лабораторных животных ФГУП «Рапполово» РАМН).

Повреждение печени лабораторных животных воспроизводили на двух моделях:

1. Модель поражения печени противотуберкулезными препаратами

(11111) основного ряда выполнена по методике Ю.И. Сливки (1989) путем введения противотуберкулезных препаратов (ПТП) в дозах: изониазид (Н) 50 мг/кг, подкожно + рифампицин (R) 250 мг/кг, внутрижелудочно + пира-зинамид (Z) 45 мг/кг, внутрижелудочно. Длительность применения ПТП -14 дней.

2. Модель повреждения печени ПТП резервного ряда. В связи с отсутствием в литературе сведений по экспериментальному моделированию поражений печени ПТП резервного ряда, в опытах на белых беспородных мышах-самцах проведено тестирование доз ПАСК (PAS), протионамида (Pt), циклосерина (Cs), а также их сочетаний, вызывающих выраженный гепатотоксических эффект. Дальнейшие исследования выполнены на белых нелинейных крысах-самцах, получавших внутрижелудочно PAS(1400 мг/кг) + Pt(140 мг/кг) + Cs(140 мг/кг) курсом 14 дней.

Сукцинатсодержащие вещества (реамберин и ремаксол- в дозе 25 мл/кг внугрибрюшинно, рунихол - 160 и 278 мг/кг внутрижелудочно), а также препарат сравнения адемегаонин (в дозах 0,09мл/100 г - внугрибрюшинно и 105 и 161 мг/кг - внутрижелудочно) во всех опытах вводили экспериментальным животным за 1,5 часа до применения ПТП основного и резервного ряда, курсом 14 дней.

Регистрируемые показатели: а) биохимические показатели крови определяли на аппарате «Синхрон» производства «Бэкман» (США) - активность АлАТ (ЕД/л), АсАТ (ЕД/л), ЩФ(ЕД/л), уровень билирубина (мкмоль/л), общего белка (г/л), холестерина (ммоль/л) и триглицеридов (ммоль/л); б) содержание адеметионина в печени (SAM, мкг/г ткани печени) исследовали по оригинальной методике ФГБУН «Институт токсикологии» ФМБА России на хроматографе жидкостном Shimadzu LC-20 Prominence с диодно-матричным детектированием; в) гистологическое изучение микропрепаратов печени осуществляли с помощью Эргономичного микроскопа «Olympus ВХ45», снабженного программным обеспечением «Olympus DP-Soft».

Изучение апоптотических процессов в печени белых беспородных крыс-самцов проводили также на модели Ю.И. Сливки (1989). Исследуемые вещества- реамберин и ремаксол (в дозе 25 мл/кг внугрибрюшинно), цикиоферон (3,6 мг/кг внугрибрюшинно), рунихол (278 мг/кг внутрижелудочно), препарат сравнения адеметионин (в дозах 0,09мл/100 г внугрибрюшинно и 161 мг/кг

внугрижелудочно) - вводили за 1,5 часа до применения 11111 основного ряда в течение 14 дней.

Показатели апоптоза в ткани печени изучены: методом детекции TUNEL; методом ИГХ- экспрессия CD95 (Stemberger L.A., Joseph S.A., 1979), методом Western blotting с немечеными поликлональными антителами к анти-апоптотическим белкам Вс1-2 и Mcl-1 (Abeam), проапоптотическим белкам ка-сапаза-8 (Abeam) и каспаза-3 (Cell Signaling)- экспрессия апоптоз-ассоциированных молекул, а также методом Western blotting с немечеными моноклональными антителами - уровень онкосупрессора р53 (Abeam). Исследования выполнены совместно с Бажановой Е.Д. (д.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории сравнительной сомнологии и нейроэндокринолопш ФГБУН «Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова» РАН).

Методики исследования процессов репаративной регенерации печени

Модель частичной резекции печени для оценки репаративной регенерации выполняли по А. Фишеру (1961) в двух сериях опытов на белых нелинейных крысах-самцах. Для анестезиологического пособия использовали золетил (золозепам + тилетамин Вирбак СА, Франция) в дозе 15 мг/кг, подкожно. В первой серии оценивали эффективности реамберина, ремаксола и раствора адеметионина (п=100); во второй серии - рунихола и таблетирован-ной формы адеметионина (п-75). Исследуемые препараты вводили в день операции и послеоперационном периоде в течение 14 дней один раз в сутки с помощью атравматического металлического зонда в желудок. В каждой серии опытов выделяли группу контрольных крыс (оперированных, без лечения). На 4, 10, 14 и 25 сутки после операции животных контрольной и подопытных групп эвтаназировали с помощью гильотины. О скорости ре-паративных процессов судили по изменению коэффициентов соотношения массы регенерирующего органа и массы животного (в условных единицах) и морфометрическому исследованию срезов печени, окрашенных гематоксили-

ном и эозином, с подсчетом количества двуядерных гепатоцигов, незрелых ге-

патоцитов, а также гепатоцитов, содержащих более одного ядрышка в ядре.

Методики изучения эффективности включения исследуемых препаратов в комплексную терапию экспериментального туберкулеза

Для моделирования лекарственно чувствительного туберкулеза использовали лабораторный тест-штамм М. tuberculosis Erdman (чувствительный к известным ПТП) из коллекции ФГБУН «Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича» ФМБА России.

Экспериментальный лекарственно устойчивый туберкулез моделировали с использованием клинического изолята МБТ № 9660, выделенного от больного впервые выявленным туберкулезом легких, с устойчивостью к изониазиду (1 мкг/мл), рифамшщину (40 мкг/мл), стрептомицину (10, 50 мкг/мл), этионамиду (2 мкг/мл), канамицину (30 мкг/мл), а также с мутациями, ассоциированными с резистентностью к рифампицину- в гене rpoB: Ser531—>Leu и к изониазиду - в гене fartG:Ser315->Thr (1).

В обоих опытах суспензию, содержащую 106 КОЕ микобактерий туберкулеза, инокулировали в латеральную хвостовую вену (0,2 мл).

Базовая химиотерапия включала в первой серии опыта - три противотуберкулезных препарата: изониазид (Н), 10 мг/кг, подкожно; внутриже-лудочно- рифампицин (R), 10 мг/кг и пиразинамид (Z), 20 мг/кг; во второй серии - четыре резервных противотуберкулезных препарата: внутри-желудочно - левофлоксацин (Fq, 20 мг/кг), ПАСК (PAS, 140 мг/кг), цикло-серин (Cs 8 мг/кг) и подкожно - амикацин (А, 30 мг/кг). Циклоферон назначался в дозе 3,6 мг/кг (внутрибрюшинно) 3 раза в неделю, ремаксол - в дозе 25 мл/кг (внутрибрюшинно) 5 раз в неделю, 14 инъекций, рунихол - в дозе 396 от/кг (внутрижелудочно) ежедневно. Курс лечения составил 6 недель. В каждой серии опытов присутствовали группы шггактных (незара-женных, нелеченных) и зараженных нелеченных (контроль заражения) животных.

Эффективность комплексного лечения оценивали с учетом продолжительности жизни животных; динамики массы тела; коэффициентов массы легких, селезенки, печени; макроскопической оценки степени поражен-ности легких (Александрова А.Е. и др., 1993); высеваемости МБТ из гомо-генатов легкого (с подсчетом числа колоний МБТ).

Поглотительную и переваривающую способность перитонеальных макрофагов (пМф) оценивали в реакции фагоцитоза клеточной взвеси дрожжей рода Saccharomyces cerevisiae (lxlO7 клеток на 1 чашку), опсони-зированных сывороткой мышей. Результаты учитывали под микроскопом при увеличении х80 и выражали в фагоцитарной активности (ФА) - процент Мф, вовлеченных в фагоцитоз; фагоцитарном числе (ФЧ) - среднее количество клеток, поглощенных одним Мф; в показателе завершенности фагоцитоза (ПЗФ) - количество дрожжевых клеток, переваренных Мф за 1,5 ч культирирования и индексе завершенности фагоцитоза (ИЗФ)- отношение ФЧ за 1 ч культивирования к ФЧ за 2,5 ч культивирования.

Гистологическое исследование ткани легких проводили на срезах, окрашенных гематоксилином и эозином с помощью Эргономичного микроскопа «Olympus ВХ45», снабженного программным обеспечением «Olympus DP-Soft».

Учитывали индекс эффективности терапевтического действия ИЭ (%) как долевую разницу показателей тяжести поражения органов туберкулезом в контрольной группе и в группах животных, получавших исследуемые препараты.

Материал и методики, использованные в клинических исследованиях

Клинические исследования выполнены на базе кафедры фтизио-пульмонологии и торакальной хирургии ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И. И. Мечникова» Минздрава России (зав. кафедрой - д.м.н., проф. Елькин A.B.), СПб ГБУЗ «Противотуберкулезный диспансер № 12» Комитета по здравоохранению г. Санкт-Петербурга (гл. врач - к.м.н., Скрынник H.A.), а также совместно с

сотрудниками кафедры фтизиопульмонологии и профпатологии УО «Гродненский государственный медицинский университет» Минздрава Республики Беларусь (зав. кафедрой - к.м.н., доц. Алексо Е.Н.).

Обследовано 284 пациента, в том числе 155 (54,6 %) мужчин и 129 (45,4 %) женщин, средний возраст - 37,87±1,8 лет (18-56 лет). При рентгенологическом обследовании регистрировали инфильтративный туберкулез легких - у 202 (71,1 %) больных и диссеминированный - у 82 (28,9 %). Распад легочной ткани выявлен у 206 (72,5 %) пациентов, МБТ в мокроте обнаружены у 171 (60,2 %) больных, в том числе МЛУ МБТ-у 74 (26,1 %).

Пациентам исследуемых групп проводились общие и специальные методы обследования. Общие методы обследования включали в себя: клинические (динамика интоксикационного синдрома и клинических синдромов поражения печени- диспепсического, астеновегетативного, гепатомегалии), микробиологические (простая бактериоскопия мокроты на микроскопе МБР-1, посев мокроты на среду Левенштейна-Йенсена), молекулярно-генетические (GeneExpert МТВ для выявления ДНК Mycobacterium tuberculosis и его резистентности к рифампицину в образцах мокроты), лучевые (обзорная рентгенография и линейная томография на аппарате производства «ЭЛЕКТРОН» с разрешающей способностью 4 пл/мм; компьютерная томография - по показаниям), ультразвуковое исследование органов брюшной полости (на аппарате LOGIQ С5, GE), эндоскопические (фибробронхоскопия аппаратом Pentax FB-15V).

Клинические исследования состояли из двух разделов.

Первый раздел посвящен оценке частоты и выраженности синдрома цитолиза в зависимости от исходного содержания IFN-y. Исследования выполнены совместно с С.Н. Демидик (ассистент кафедры фтизиатрии и профпатологии УО «Гродненский государственный медицинский университет» Минздрава Республики Беларусь).

Критерии включения: больные впервые выявленным распространенным инфильтративным туберкулезом органов дыхания (с площадью пора-

жения 3 и более сегмента), исходно нормальная активность АлАТ (не более 32,7±3,8 МЕ/л).

Критерии исключения: положительные маркеры парентеральных вирусных гепатитов (ИВБ-антиген и/или апй-НСУ антитела сыворотки крови); изменения печени, выявленные при ультразвуковом исследовании; ВИЧ-инфекция.

Пациенты (п=104) были подразделены на основную группу (ОГ, п=63) и группу сравнения (ГС, п=41). Больные ГС получали только химиотерапию, пациентам ОГ дополнительно назначали циклоферон по 2,0 мл 1 раз в день внутримышечно согласно инструкции по медицинскому применению. Группа контроля включала 45 здоровых лиц.

Больные без МЛУ МБТ получали терапию по режиму I, при наличии МЛУ МБТ (41,3 % обследованных) - по режиму IV с учетом чувствительности возбудителя.

Специальные методы обследования: определение концентрации 1ПЧ-у (пг/мл) в сыворотке крови (исходно и через два месяца) методом имму-ноферментного анализа (тест-системы НПО «Цитокин»), а также активности АлАТ и АсАТ (МЕ/л) сыворотки крови (исходно, далее - ежемесячно в течение 4 месяцев) на аппарате «Синхрон» производства «Бэкман» (США).

В исследованиях, проведенных по второму разделу, оценивалн клиническую эффективность реамберина, ремаксола и адеметионина при поражении печени противотуберкулезными препаратами.

Критерии включения: больные впервые выявленным инфильтратив-ным/диссеминированным туберкулезом легких, активность АлАТ более 1,5 норм.

Критерии исключения: те же, что и в первом разделе клинических исследований.

Пациенты (п=180) были распределены на следующие группы: больные ОГ1 (п=45) получали реамберин в дозе 400 мл, пациенты ОГ2 (п=45) -ремаксол 400 мл, в группе ОГЗ (п=45) применяли адеметионин в дозе 400

мг в 400 мл физиологического раствора хлорида натрия; больным ГС (п=45) назначали 400 мл раствора глюкозы 5 %. Группу контроля составили 20 здоровых лиц. Исследуемые препараты вводились внутривенно ка-пельно 1 раз в сутки в течение 10 дней.

У 149 (82,8 %) обследуемых больных этиотропная терапия проводилась препаратами основного ряда (режим Т/ГП), у остальных (17,2 %) пациентов в связи с выявлением лекарственной устойчивости МВТ различного спектра - препаратами резервного ряда, исходя из чувствительности возбудителя.

Специальные методы обследования: а) показатели функции печени (АлАТ (МЕ/л), АсАТ (МЕ/л), ЛДГ (Ед/л), щелочная фосфатаза (Ед/л), ГГТП (Ед/л), общий и прямой билирубин (мкмоль/л) с помощью стандартных методик; б) уровень оксида азота по реакции Грисса (Голиков П.П. и др., 2004; Авдеева М.Г. и др., 2006); в) общая антиоксидантная способность- в миллимолярных эквивалентах тролокса по количеству ABTS **+ (2,2'-азино-бис-[3-этилбензтиазолин сульфонат]) (ОАС, тест-система Cayman Chemichal «Antioxidant Assay Kit»), г) общий антиоксидантный статус- фотометрический метод (ОАСт, тест-система Immundiagnostik «ImAnOx (TAS/TAC) Kit»), д) активность глутатионпероксидазы - «сэндвич» иммуноферментный метод (ГПО, тест-система AbFrontier «Glutathione Peroxidase 1 ELISA), e) активность глутатион-5-трансферазы -метод твердофазного ИФА (TST, тест-система Immundiagnostik «GST-jt ELISA»), ж) активность супероксиддисмугазы - фотометрический метод (СОД, тест-система Cayman Chemichal «Superoxide Dismutase Assay Kit).

Лабораторный индекс, характеризующий тяжесть поражения печени, рассчитывали по формуле Т.Н, Калачнюк (2011) = 0,54 (гемоглобин, г/л) -0,06(тромбоциты) + 0,6(белок, г/л) + 0,02(ЩФ, ЕД/л) + 0,06(ГГТП, ЕД/л) + 0,4(АлАТ, ЕД/л,) + 0,51 (АсАТ, ЕД/л) + 0,28 (прямой билирубин, мкмоль/л). Исходя из величины лабораторного индекса производили расчет: относительного риска (RR) / отношения шансов (OR) наступления не-

благоприятного/благоприятного исходов, число пациентов, которых необходимо пролечить (NNT) и сумму предполагаемых затрат на гепатопротек-тивную терапию.

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием программной системы STATISTICA for Windows (версия 5.5 Лиц. № AXXR402C29502 3FA). Сопоставление частотных характеристик качественных показателей осуществляли с помощью непараметрических методов: критерия х2 с поправкой Йетса и точного критерия Фишера. Количественные показатели подлежали проверке на нормальность с помощью теста Шапиро-Уилка и Колмогорова-Смирнова: при нормальном распределении - при наличии двух сравниваемых групп использовался t-тест Уэлча; при множественном сравнении - однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) и дисперсионный анализ с повторными измерениями (rANOVA). Показатели представлены в виде М±ш (среднее ± стандартная ошибка среднего). Сравнение количественных параметров при их распределении, не удовлетворяющем критериям нормальности, проводилось посредством Т-критерия Вилкоксона и U-критерия Манна-Уитни. Данные представлены в виде Me (25-75 %) (медиана и 25-75 % квартили). Доверительные интервалы для частотных показателей рассчитывали точным методом Фишера. Оценка корреляционных связей выполнена с помощью коэффициента линейной корреляции Пирсона и ранговой корреляции Спирмена. Критерием статистической значимости различий считалась величина р<0,05.

Оценка гепатопротекторного действия сукцннатсодержащих препаратов и их влияние на репаратнвную регенераторную способность печени в экспериментальных условиях

В результате 14-дневного введения ПТП основного ряда у крыс контрольной группы регистрировалось повышение в 1,5 раза уровня триглице-ридов (1,57±0,13 против 1,04±0,12 ммоль/л интактных, р<0,05), в 1,3 раза содержание холестерина (1,72±0,08 против 1,34±0,06 ммоль/л интактных,

р<0,05), рост активности ферментных маркеров цитолиза и холестаза (табл. 1). Это сопровождалось морфологическими нарушениями долько-балочной структуры печени, развитием углеводной, белковой и диффузной жировой дистрофии, некробиозом гепатоцитов в 83,3 % случаев (рис. 1 А), что свидетельствует о развитии экспериментального лекарственного поражения печени противотуберкулезными препаратами и соответствует данным литературы (Скакун Н.П. и др., 1991; Виноградова Т.И., 1994).

Ремаксол и реамберин оказали положительное влияние на показатели липидного обмена - уровень триглицеридов уменьшился в 1,9-1,4 раза (до 0,83±0,13 и 1,11±0,14 ммоль/л, р<0,001 и р<0,05 соответственно), а также ферментные маркеры повреждения печени, способствуя нормализации активности АлАТ и АсАТ (табл. 1). Рунихол обладал дозозависимым действием, статистически значимо уменьшал выраженность и синдрома цитолиза, и синдрома холестаза преимущественно в высшей терапевтической дозе, что вероятно связано с наличием в его составе таурина, способствующему экскреции желчных кислот (1асоЬзеп I. е1 а1., 1968). В то же время, адеметионин был в 1,4-2,4 раза менее активен изучаемых препаратов (табл. 1).

При морфологическом исследовании печени установлено, что параллельно с улучшением биохимических показателей реамберин и ремаксол уменьшали некробиоз гепатоцитов с сокращением распространенности жировой дистрофии, которая регистрировалась только на периферии долек и в междольковом пространстве, в то время как рунихол слабо влиял на некробиотические процессы паренхимы печени (рис. 1 Б, В). В условиях применения адеметионина (независимо от способа введения и дозы) в 45,5 % обнаруживали очаги некроза различной величины, что свидетельствовало о стимуляции альтерации печеночной ткани и, по мнению Е.Б. Ьее е1 а1. (2008), связано с процессом карбоксиметилирования белков, продуктами которого являются метанол, формальдегид и муравьинная кислота, обладающие цитотоксическим действием (рис.1 Г).

Таблица 1

Влияние реамберина, ремаксола, рунихола и адеметионина на показатели ферментных маркеров печени при ее повреждении противотуберкулезны-_ми препаратами основного ряда__

№ ^\Показатель Группы животных АлАТ (ЕД/л) АсАТ (ЕД/л) Щелочная фосфатаза (ЕД/л) Средний ИЭ (%)

1 Интактные (п=18) 47,5±2,12 172,7±5,2 211,9±9,3 —

2 контроль (НЯ7) (п=18) 66,3+1,90 рь2<0,001 235,3±16,6 р,-2<0,01 293,8+14,8 рЬ2<0,001 —

3 Н117+адеметионин раствор (п=5) иэ„ 44,2+3,28 р:-з<0,01 +33,4 191,6±10,8 р2.з<0,05 +18,6 279,6+21,2 Р1-з<0,01 +5,0 +19,0

4 НЯг+адеметионин таблетки, 105мг/кг (п=9) иэ2„ 47,0+3,8 р2-4<0,01 +29,2 202,9±14,3 +13,8 242,6+17,9 Рм<0,05 р2^(<0,05 +18,0 +20,3

5 НЯг+адеметиогаш таблетки, 161мг/кг (п=8) 51,9±1,99 Р2-5<0,001 +21,8 207,6±14,9 р,.5<0,05 +11,8 207,6+11,4 р2-5<0,01 р3_5<0,05 +29,4 +21,0

6 1Ш2+реамберин (п=6) ИЭ« 56,0±6,44 +15,6 175,1±13,2 Р2-6<0,01 +25,6 188,8+8,7 Р2-6<0,001 +36,0 +26,0

7 Н112+ремаксол (п=6) ИЭ,.7 49,8±4,17 р2-7<0,05 +24,9 162,9±11,4 р2.7<0,001 +30,8 219,7±17,2 р2.7<0,001 +26,0 +27,3

8 ЬШг+рунихол, 160 мг/кг (п=11) иэ2Х 55,0±2,21 Р1.8<0,05 р2.8<0,05 +17,1 211,0±15,6 +10,4 229,4±15,1 Р2-8<0,01 +22,0 +16,7

9 1Ш2+рунихол 278 мг/кг (п=6) иэ2., 50,2+1,93 р2-9<0,001 +24,3 175,8±12,2 р2.9<0,05 +25,3 185,2+7,7 р,.9<0,05 р2-9<0,001 р3.9<0,01 Р8-9<0,05 +37,0 +28,9

А

V-jC^Í-V^". . * •'* r-.'г.:''"-.

3 2 * J. О,,, » -.■¡у*. -Т"., '' - ......

'» > -

в -' 1 - - »- г

Рис. 1. Печень крыс на фоне введения ПТП основного ряда и гепатопро-текторов. Окраска PAS+амилаза. А. Комплекс ПТП. Нарушение балочного строения долек. Признаки белковой и жировой дистрофии х400. Б. Комплекс ПТП и ремаксол. Дольковое строение печени и балочная структура сохранена х200. В. Комплекс ПТП и рунихол (278 мг/кг). Сохранено долько-балочное строение печени. Белковая дистрофия отмечается преимущественно в междоль-ковых пространствах. хЗОО. Г. Комплекс ПТП и адеметионин. Крупный очаг некроза х200

Уровень внутриклеточного SAM под воздействием ПТП основного ряда увеличился на 18,2 % в сравнении с интактными. Ремаксол повышал указанный показатель на 58,7% в сравнении с интактными (р<0,01), его действие в 2 раза превосходило реамберин и на 72,1 % (р<0,001) - адеметионин. Рунихол в средней терапевтической дозе увеличивал содержание SAM с 16,7±1,7 до 25,1±2,2 мкг/г ткани печени, что на 38,7 % (р<0,05) выше, чем при его использовании в высшей терапевтической дозе. Согласно данным J.M. Mato (2008) при патологических воздействиях на печень син-

тез SAM ингибируется, вероятно, на фоне дефицита макроэргических веществ. В связи с этим можно предполагать, что ремаксол и рунихол (в средней терапевтической дозе), увеличивая уровень внутриклеточной АТФ и активируя метионинаденозилтрансферазную реакцию, повышают синтез эндогенного SAM. В то же время, рунихол в максимальной терапевтической дозе, возможно, блокирует процессы синтеза SAM по механизму отрицательной обратной связи.

В результате проведенного скринингового исследования гепатоток-сичности резервных ПТП на мышах установлено повышение активности АлАТ на фоне PAS - на 33,8% (р<0,001), комбинации резервных ПТП (PAS+Pt+Cs) - в 1,4 раза (р<0,01), что сочеталось с изменением гистологической картины ткани печени. По степени убывания гепатотоксического действия резервные ПТП располагались в следующем порядке: комбинация резервных ПТП (PAS+Pt+Cs) >PAS >Pt >Cs, что определило выбор модели для углубленного изучения на крысах.

При последующем введении крысам трех вышеуказанных резервных препаратов регистрировали повышение уровня билирубина (до 2,96±0,19 против 0,84±0,15 мкмоль/л, р<0,001), холестерина (до 2,8±0,07 против 2,12±0,08 ммоль/л, р<0,01), триглицеридов (до 1,18±0,07 против 0,77±0,06 ммоль/л, р<0,001), активности АлАТ (до 67,6±3,42 против 40,8+7,3 ЕД/л, р<0,01) и АсАТ (до 285,7+8,56 против 232,6±5,92 ЕД/л у ин-тактных, р<0,001), а также щелочной фосфатазы - в 1,5 раза (р<0,001). При этом отмечалось нарушение радиального расположения балок на двух третях площади дольки с признаками белковой дистрофии и некробиоза в сочетании с мононуклеарной инфильтрацией печени; у трети животных регистрировались мелкоочаговые скопления некротизированных гепатоци-тов, что сопадало с данными, полученными при введении ПТП основного ряда. Гепатотоксичность ПТП сочеталась с общетоксическим действием (показатель летальности составил 25 %, дефицит массы тела - 11,6 %).

Рунихол и ремаксол (в сравнении с контрольными крысами) снижали в крови уровень билирубина соответственно в 1,4-1,5 раза (р<0,05), холестерина (в 1,2-1,4 раза, р<0,05) и триглицеридов (в 1,7-2,1 раза, р<0,05 и р<0,001), маркеров цитолиза- АлАТ (в 1,2-1,5 раза, р<0,05) и АсАТ (на 12,0-16,8 %),а также маркера холестаза- щелочной фосфатазы (в 1,41,5 раза, р<0,05 и р<0,01). Исследуемые препараты способствовали нормализации долько-балочного строения органа, уменьшали проявления белковой и углеводной дистрофии гепатоцитов. Следует отметить положительное влияние ремаксола (в отличие от рунихола) на процессы некробиоза гепатоцитов и мононуклеарной инфильтрации.

В отличие от сукцинатсодержащих препаратов, адеметионин потенцировал общетоксические эффекты резервных ПТП, о чем свидетельствует увеличение летальности животных в данной группе в 2 раза. Действие адеметионина на биохимические маркеры повреждения печени было сопоставимо с эффектами ремаксола и рунихола. В то же время, препарат, как и рунихол, слабо влиял на проявления некробиоза гепатоцитов и мононуклеарной инфильтрации.

Таким образом, исследованные сукцинатсодержащие препараты отличались по выраженности гепатопротекторной активности. Ремаксол обладал преимущественно антицитолитическим типом действия, реамберин и рунихол - смешанным. Важно отметить, что из всех изученных препаратов лишь ремаксол оказал четко выраженный эффект восстановления гис-тоархитектоники органа, сокращения распространенности углеводной, белковой и жировой дистрофии, уменьшения некробиотических явлений. Гепатопротекторный эффект ремаксола, реамберина и рунихола, выявленный нами при экспериментальном поражении печени противотуберкулезными препаратами, можно объяснить активацией аэробного звена энергетического обмена янтарной кислотой, содержащейся в составе этих препаратов, что ранее было показано на моделях токсического и вирусного по-

вреждения печени (Петров А.Н., 2003; Коваленко А.Л. и др., 2005, 2011; Власов А.П. и др., 2006; Смирнова Н.Г. и др., 2010).

При оценке влияния сукцинатсодержащих на процессы репаратив-ной регенерации печени в экспериментах на крысах установлено, что применение ремаксола приводило к более интенсивному и раннему накоплению массы печени, которая к 14 суткам после операции была на уровне интактных животных (9,17±0,3 и 9,9±0,7 г соответственно), а реамберин и рунихол не оказывали существенного влияния на темп восстановления массы регенерирующего органа.

Ремаксол и рунихол, в отличие от реамберина, способствовали более быстрому восстановлению общей архитектоники печени, начиная уже с 4-х суток после операции (рис. 2). В то же время, в условиях применения ру-нихола, как и адеметионина, на 10 сутки после частичной резекции в печени регистрировались фокусы некротизированных гепатоцитов, число которых снижалось к 25 суткам наблюдения (рис. 2). При морфометрическом исследовании показано, что ремаксол (по сравнению с контролем операции) уже на 4 день после операции улучшал качество течения компенсаторного процесса, стимулировал внутриклеточные регенераторные реакции, что проявлялось в увеличении в 2,1 раза (р<0,001) относительного количества двуядерных гепатоцитов, в 2,2 раза (р<0,001) - количества незрелых гепатоцитов, в 1,3 раза (р<0,05)- процента гепатоцитов, содержащих более одного ядрышка. Рунихол на этом же сроке повышал только содержание двуядерных гепатоцитов (до 6,28±0,59 против 4,1±0,64 % в контроле операции), максимальный репаративный эффект препарата отмечен только через 14 дней после оперативного вмешательства.

В

Рис. 2. Печень крыс после частичной резекции на фоне применения гепа-топротекторов. Окраска гематоксилином и эозином, х 300 А. Контроль (прооперированные нелеченные) через 4 суток после частичной резекции. Балочная структура печени нарушена. Видны признаки «шоковой печени». Б. Ремак-сол через 4 суток после частичной резекции. Архитектоника частично восстановлена. Прослеживается балочное строение органа. Признаки «шоковой печени» выражены меньше. В. Рунихол через 4 дня после частичной резекции. Балочное строение сохранено в центральной трети дольки. Г. Адеметионин через 10 дней после частичной резекции Крупные сливные очаги некроза

Положительное действие изученных нами сукцинатсодержаших препаратов на процессы репаративной регенерации печени, равно как и их гепатопротек-торная активность, обеспечивается компонентами, входящими в их состав (янтарная кислота, метионин, никотинамид и др.). Так, янтарная кислота, увеличивая синтез АТФ, активирует пластические энергозависимые процессы в клетках печени, оказывает рецепторно-опосредованное действие на БИСМИ (ОРК91) перицитов, участвующих в регенераторных процессах (Граник В.Г., 2006; Кожока Т.Г., 2007; Соп-еа Р.К. е! а1„ 2007). Активацию НАД-зависимых процессов сите-

за АТФ обеспечивает и никотинампд. Метионин, превращаемый гепатоцитами в SAM, участвует в реакциях трансметилирования (синтез мембранных фосфоли-пидов) и аминопропилирования (синтез биогенных аминов), стимулирующих митотические процессы печени (Кухта В.К. и др., 2008; Оков1Пый и др., 2010).

Таким образом, реамберин, ремаксол и рунихол обладают способностью существенно снижать выраженность морфо-функциональных нарушений печени, вызванных ПТП основного и резервного ряда, улучшать качество течения компенсаторного процесса, стимулировать внутриклеточные регенераторные реакции.

Влияние сукцинатсодержащих препаратов и циклоферона на процессы апоптоза клеток печени при ее повреждении противотуберкулезными препаратами

В ходе эксперимента по изучению апоптоза гепатоцитов установлено, что применение ПТП основного ряда приводит к увеличению в ткани печени числа FAS-рецепторов (CD95) в 1,3 раз (р<0,05) и инициаторной каспазы-8 в 2,1 раза (р<0,05) в сочетании с повышением уровня проапоп-тотического онкосупрессорного белка р53 в 1,7 раза (р<0,05) и активности эффекторной каспазы-3 в 1,6 раза (р<0,05) (рис. 3). Кроме того, регистрировали увеличение синтеза Мс1-1 в 1,4 раза (р<0,05), что, вероятно, обусловлено высоким уровнем клеточной гибели и активацией в связи с этим антиапоптотической системы. На этом фоне синтез другого антиапоптоти-ческого маркера - Вс1-2- в гепатоцитах снижался в 1,5 раза (р<0,05). Результатом нарушения баланса про- и антиапоптотических белков явилось резкое повышение числа апоптотических клеток в 5,4 раза (р<0,01).

Применение препарата сравнения адеметионина (в обеих лекарственных формах) на фоне ПТП приводило к уменьшению экспрессии Вс1-2 в 1,8-1,6 раза (р<0,05), что не коррелировало с уровнем программированной клеточной гибели (i=0,31, р>0,05). При назначении раствора адеме-

тионина регистрировали увеличение процента апоптотических клеток в 8,8 раза (р<0,05) по сравнению с его таблетированной формой.

В условиях применения реамберина апоптозная активность гепато-цитов снизилась в 2,6 раза (р<0,05) в сравнении с животными, получавшими комплекс ПТП. Однако на этом фоне повышалась активность каспазы-3 в 1,4 раза (р<0,05) по сравнению с группой интактных животных, что, по мнению У. Ьи й а1. (2011), может указывать на неапоптотическую функцию данного фермента. Концентрация антиапоптотического белка Вс1-2 под влиянием реамберина повышалась в 1,8 раза (р<0,05) в сравнении с группой животных, получавших только комплекс ПТП. В то же время, уровень белка Мс1-1 сохранялся на уровне у интактных.

0,12

0,1

4

ш

5 0,08

г

о

Ё 0,06 т

£ 0.04 № а и

0,02

\

Г

.Л

ь

ю i

DCD95 -nacnaaa-i

12345678 Группы животных

Рис. 3. Влияние изучаемых препаратов на количество CD95 (FAS)- и кас-паза-8-иммунореактивного материала в гепатоцитах крыс исследуемых групп. Группы животных: 1 - интактные, 2- HRZ, 3- ремаксол, 4- раствор адеме-тионина, 5- циклоферон, 6- рунихол, 7- адеметионин таблетки, 8- реамберин.*-р<0,05 в сравнении с интактными # - р<0,05 в сравнении с группой HRZ

Применение рунихола или ремаксола в комплексе с ПТП не оказало существенного влияния на количество апоптотических клеток и актив-

ность эффекторной каспазы-3 в печени. Под действием ремаксола незначительно повышался уровень CD95 (на 12,2 % в сравнении с интактной группой), активность инициаторной каспазы-8 и белка р53 была в 1,9-1,8 раза (р<0,05) ниже, чем у животных, получавших только ПТП (рис.3). На этом фоне, равно как и при введении реамберина, регистрировалось увеличение в 1,8 раза (р<0,05) антиапоптотического белка Вс1-2. Рунихол не влиял на экспрессию CD95 и уровень Вс1-2, что, возможно, говорит о преобладании митохондриального пути в противоположность внешнерецеп-торному, зарегистрированному при введении ремаксола.

Циклоферон в комплексе с ПТП показал проапоптотическое действие в 1,7 раза (р<0,05), увеличение активности каспазы-8 на 45,5 % (р<0,05) в сочетании с повышением на 25,5 % белка р53(р<0,05), а также тенденцию к снижению Вс1-2 (в 1,2 раза) в сравнении с животными, получавшими ПТП, что говорит об индукции обоих путей апоптоза (рис. 3). Вместе с тем, данные о влиянии IFN-y, концентрация которого увеличивается в условиях применения циклоферона, на состояние печени противоречивы. По мнению М.Е. Gershwin et al. (2007), Lüth S. et al. (2011), являясь провоспалительным цитокином, в условиях гиперпродукции он способен запускать процессы лекарственно опосредованной клеточной гибели в печеночной паренхиме, активировать р53-зависимый апоптоз гепатоцитов при хроническом воспалении, что подтверждает полученные нами данные. С другой стороны, в литературе имеются сведения об апоптозингибирую-щем и гепатопротекторном действии IFN-y в условиях гепатотоксического воздействия (Biburger М. et al., 2005).

Следует отметить, что изученные препараты (кроме реамберина) снижали в 1,5-2,6 раза (р<0,05) концентрацию антиапоптотического белка Мс1-1, повышенную на фоне введения ПТП.

Таким образом, в проведенном эксперименте выявлены особенности влияния изученных препаратов на процессы апоптоза в печени: реамбе-рин - антиапоптотическое действие; ремаксол и рунихол - практически не

влияли на активность апоптотических процессов в печени; циклоферон-умеренное проапоптотическое действие по обоим путям апоптоза. Полученные данные дополняют известные сведения о фармакодинамике изученных препаратов, уточняют механизмы их гепатопротекторного действия при поражении печени, вызванного ПТП.

Влияние сукцннатсодержащих препаратов и циклоферона на течение экспериментального туберкулеза

Установлено, что химиотерапия в течение 2 месяцев приводила к снижению тестируемых показателей тяжести течения лекарственно чувствительного туберкулеза: коэффициента массы легких (с 4,15±0,65 усл. ед. в контроле заражения до 1,33±0,23 усл. ед.) и индекса их поражения (сЗ,1±0,05 усл. ед. до 2,05±0,06 усл. ед.), обсемененности легких (с 171,4±22,69 КОЕ против 25,4±1,72 КОЕ, р<0,001). Активность фагоцитоза по двум (фагоцитарное число и индекс завершенности фагоцитоза) из четырех исследованных показателей была значимо ниже, чем у животных группы контроля заражения (рис. 4).

Циклоферон и ремаксол способствовали повышению эффективности ХТ на 27,9 % и 20,4 % соответственно, о чем свидетельствовали следующие показатели: снижение индекса поражения легких в 1,2 раза (до 1,65±0,02 и 1,75±0,03 усл. ед. соответственно, р<0,001) и числа КОЕ МБТ в посевах гомогенатов легких в 4,9-3,8 раза (до 5,2±1,76 - 6,7±2,5 КОЕ соответственно,р<0,001); стимуляция активности макрофагов по всем изученным тестам - ФЧ, ФА, ПЗВ, ИЗФ (р<0,05 - 0,01, рис. 4). Рунихол не оказывал влияние на течение экспериментального туберкулеза по всем оцениваемым показателям.

12 3 4 5 6

С ТП] Фатцигарная активное ;., %

—4— Показатель завершенности фагоци тоза, ксл-во дгажжегых клеток

Рис. 4. Показатели поглотительной и переваривающей способности макрофагов животных, зараженных лекарственно чувствительным штаммом МБТ, при введении изучаемых препаратов. Группы животных: 1 - ин-

тактные, 2- контроль заражения, 3 - контроль химиотерапии, 4- циклоферон, 5 - ре-максол, 6 - рунихол

У животных, зараженных лекарственно устойчивым штаммом МБТ, при проведении ХТ также отмечено достоверное снижение показателей тяжести течения инфекции: коэффициента массы легких (с 2,96±0,22 усл. ед. в контроле заражения до 1,75±0,13 усл. ед., р<0,05) и индекса их поражения (с 3,16±0,05 усл. ед. до 2,75±0,07, р<0,001), а также в 2,8 раза роста КОЕ МБТ в посевах гомогенатов легких (р<0,05). Степень ингибирования макрофагов по всем четырем показателям составила: ФА - 42,6 %, ФЧ - 34,5 %, ПЗФ -87,2%, ИЗФ- 61,4% от соответствующих значений у интактных мышей (р<0,01, рис. 5). При гистологическом исследовании легких отмечалась меньшая распространенность туберкулезного процесса по сравнению с контролем заражения, специфическое воспаление было представлено отдельными некрупными очагами инфильтрации с гранулемами преимущественно эпителио-идно-клеточного характера с включением нейтрофильных гранулоцитов.

Циклоферон и ремаксол повышали суммарную эффективность комплексной терапии экспериментального лекарственно устойчивого в среднем на 22,7 % и 23,7 % соответственно. Под влиянием изученных препаратов по сравнению с группой контроля лечения снизились в 1,2—1,1 раза индексы по-

ражения легких (до 2,36±0,07 и 2,42±0,06 усл. ед. соответственно, р<0,001) и в 2,4-2,0 раза обсемененность легких МБТ (р<0,001); достоверно повысилась ФА макрофагов в 1,4-1,5 раза (р<0,05), ПЗФ - в 2,3-2,8 раза (р<0,01, рис. 5).

На фоне применения рунихола параметры тяжести течения инфекции и фагоцитарной функции макрофагов достоверно не отличались от таковых у мышей группы контроля ХТ, что совпадает с данными, полученными нами на модели лекарственно чувствительного туберкулеза (рис. 5).

СПЗФаг цитарна] актив! ость, %

По1: затель зг! зерше I ности фагоцитоз? кол-во £.:ожжевь>: клеток

Рис. 5. Показатели поглотительной и переваривающей способности макрофагов животных, зараженных ЛУ МБТ, при введении изучаемых препаратов. Группы животных: 1 - интактные, 2 - контроль заражения, 3 - контроль химиотерапии, 4 - циклоферон, 5 - ремаксол, 6 - рунихол

Циклоферон и ремаксол в комплексной терапии экспериментального туберкулеза, в сравнении с контролем ХТ, снижали распространенность воспалительного процесса в легких, активировали продуктивный компонент специфического воспаления, меняя клеточный состав гранулем с преимущественно эпителиоидного на преимущественно лимфоидный, а также стимулировали местный иммунитет легких, усиливая лимфогистиоцитар-ную инфильтрацию. На фоне введения ремаксола в трети случаев обнаружены и некрупные эпителиоидно-клеточные гранулемы.

Повышение эффективности комплексной терапии экспериментального туберкулеза на фоне циклоферона и ремаксола можно объяснить, исходя из механизма их действия. Положительный вклад циклоферона, вероятно, обусловлен его индуцирующим влиянием на синтез ЕПЧ-у, высокий уровень продукции которого обеспечивает протективный эффект и предопределяет более благоприятный исход туберкулезного процесса (Иванов А.К. и др., 2010; Никулина Е.Л. и др., 2010; Ершов Ф.И. и др.2012; БЬеп С. й а1., 2013; Бипёагаш В. е1 а1., 2013). Антигипоксантные свойства ремаксола в сочетании с паракринным действием на 8иС№11 дендритных клеток и Т-лимфоцитов способствуют презентации антигена (ЯиЫс Т. й а1., 2008) и активации процессов фагоцитоза, ингибированных длительной (более месяца) терапией противотуберкулезными препаратами (Виноградова Т.И., 1994; Заболотных Н.В., 2003; Васильева С.Н., 2004; Витовская М.Л., 2005).

Таким образом, при экспериментальном лекарственно чувствительном и устойчивом туберкулезе исследованные препараты (ремаксол и цик-лоферон) снижают тяжесть течения и распространенность специфического процесса, повышают эффективность фагоцитоза перитонеальных макрофагов. Рунихол не оказывал влияния на эффективность химиотерапии.

Оценка комплексной терапии с включением циклоферона на возникновении цитолитического синдрома и эффективность лечения больных туберкулезом легких с различным уровнем интерферона-гамма

В наших предыдущих исследованиях (совместно с Демидик С.Н., 2012) показано, что при распространенном инфильтративном туберкулезе легких уровень ЮТ-у был в 1,2 раза ниже в сравнении со здоровыми лицами (р<0,05), что явилось основанием для назначения им индуктора интерферона.

В группе больных туберкулезом легких (п=22) с исходной концентрацией сывороточного ЮТ-у < 194,1 пг/мл (внутрилабораторная норма) повышение активности АлАТ и АсАТ в 2,1 раза (р<0,001) отмечалось уже

к концу 1-го месяца терапии, а к концу второго - соответственно в 3,1-2,7 раза (р<0,001), что в 2,4 раза больше уровня здоровых лиц (р<0,001) (рис. 6). За весь период наблюдения нарастание активности АлАТ отмечено у 81,8 % пациентов, АсАТ - у 72,7 %.

В то же время, в группе пациентов (п=19) с исходным уровнем ПРИ-у> 194,1 пг/мл активность АлАТ повышалась к концу 2-го месяца терапии только на 32,6 % от исходного уровня (р>0,05), а активность АсАТ значимо не менялась на протяжении двух месяцев лечения. Частота повышения активности АлАТ и АсАТ в этой группе была соответственно в 1,9 и 1,4 раза реже, чем у больных с низким уровнем ТПЧ-у.

Исходно 12 3 4

Рис. 6. Динамика показателей активности АлАТ у больных туберкулезом легких с исходным уровнем 1Ш-у <194,1 пг/мл

Установлено наличие умеренной обратной корреляции у пациентов с исходно низким уровнем 1Ш-у (<194,1 пг/мл) между концентрацией этого цитокина и активностью ферментов цитолиза: АлАТ (г=- 0,56, р<0,05) и АсАТ (г=М),44, р<0,05).

После 2-х месяцев лечения концентрация ПТЧ-у у больных ОГ (п=63) повысилась на 48,0 % (р<0,05) по сравнению с исходным уровнем. Следует отметить, что прирост содержания ШМ-у был существенно выше (в 2,0 раза, р<0,05) у пациентов ОГ с исходными значениями цитокина ниже внутрилабораторной нормы. В то же время в ГС (п=41) достоверных различий в динамике концентрации ШЫ-у в процессе химиотерапии не выявлено.

Оказалось, что выраженность цитолиза в условиях применения циклоферона в комплексной терапии больных туберкулезом легких (ОГ) зависела от исходного уровня IFN-y. Так, у пациентов с исходным уровнем IFN-y<194,l пг/мл активность АлАТ к концу 1-2-го месяца терапии была достоверно в 1,4-1,5, а АсАТ- в 1,5 раза ниже в сравнении с пациентами ГС (р<0,05). Частота выявления повышенной активности АлАТ к концу 2-го месяца терапии у таких пациентов составила 30,6 % против 59,1 % в группе сравнения (р<0,05). Это говорит об ограничении поражения печени на фоне применения препарата и согласуется с данными A.B. Беляниной (2009). При исходном уровне IFN-y>194,l пг/мл средняя активность АлАТ в течение периода наблюдения была только на 14,3-25,3 %, а АсАТ - на 14,2-21,2 % ниже, чем у пациентов ГС.

При анализе показателей эффективности стационарного лечения установлено, что ликвидация интоксикационного синдрома в течение первого месяца лечения наблюдалась у 44,4 % больных ОГ против 24,3 % в ГС (р<0,05). Прекращение бактериовыделения через 4 месяца терапии подтверждено у 69,8 % пациентов в основной группе (в ГС - 43,9 %, р<0,01), закрытие полостей распада в эти же сроки происходило в 39,7 % случаев (в ГС - у 24,3 %), сходные результаты были описаны и в литературе (Шкуру-пий В.А. и др., 2006). При этом положительная динамика рассасывания очагово-инфильтративных изменений наблюдалась у 79,4 % пациентов ОГ против 46,3 % в ГС (р<0,001).

Клинико-лабораторная эффективность сукцинатсодержащих препаратов и адеметионина при лекарственных поражениях печени на фоне противотуберкулезной терапии

Проведенными исследованиями, как и нашими предварительными данными (совместно с Шевыревой Е.В. и др., 2012), установлено, что концентрация эндогенного нитрита у больных туберкулезом легких с активностью АлАТ более 1,5 норм была в 4,5 раза выше, чем у здоровых лиц

(р<0,01). Аналогичные данные представлены в работе В.В. Лебедева и др. (2010), где при токсическом повреждении печени, в отличие от вирусного, в сыворотке крови определяли достоверное повышение уровня эндогенного нитрита, что было предложено авторами в качестве дифференциально-диагностического теста. Выявлено, что 45,6 % всех случаев лекарственной гепатотоксичности регистрируется в течение первого, а 29,4 % - до конца второго месяца терапии, что совпадает с данными A.A. Возненко (2012).

Исходные клинические проявления лекарственной гепатотоксичности обнаружены у 20,0%, 24,4%, 26,7% и 20,0% пациентов ОГ1, ОГ2, ОГЗ и ГС соответственно (р>0,05). Установлено, что все исследованные препараты ликвидируют клинические синдромы ЛПП: диспепсический на 3-4-е сутки; астеновегетативный - на 5-6 сутки; гепатомегалия - 7-8 сутки, что на 1-2 дня раньше в сравнении с больными, получавшими раствор 5 % глюкозы (ГС).

Ремаксол снижал активность АлАТ в 3 раза у 88,9 % пациентов, в то время как реамберин и адеметионин - в 2,5 и 2,2 раза у 73,3 и 68,9 % пациентов соответственно, а в ГС у 51,1 % больных - в 1,4 раза (табл. 2). В период проведения наших исследований в литературе появились сообщения об антицитолитическом эффекте сукцинатсодержащих препаратов в условиях комплексной терапии туберкулеза, полученные на небольшом количестве наблюдений (Визе-Хрипунова М.А., 2011; Шурыгин A.A., 2012).

При оценке активности АсАТ прослеживались тенденции, аналогичные АлАТ: снижение в 3,2 и 2,8 раза по окончании терапии реамбери-ном и ремаксолом соответственно, в 2,3 раза - адеметионином. Индивидуальная динамика величины снижения активности фермента у больных основных групп была в 2,1, 2 и 1,6 раза выше, чем в группе сравнения (р<0,01-0,001). Величина другого цитолитического маркера - лактатдегид-рогеназы (ЛДГ) уменьшилась на 10,0-25,0 %, достоверно (р<0,001) только под влиянием ремаксола.

Таблица 2

Динамика биохимических показателей у больных туберкулезом _легких с лекарственными поражениями печени_

Показатель Группы больных

ОГ1 (реамберин, п=45) ОГ2 (ремаксол, п=45) ОГЗ (адеметионин, п=45) ГС (глюкоза 5 %, п=45)

АлАТ, I 196,9±20,1 198,1±21,3 207,3±21,9 176,2±19,8

МЕ/л П 78,3±9,1** /-128,7±10,1 65,6±7,1** /-153,6±13,3 91,4±9,9** /-111,9±9,9 Р2- 3<0,05 125,5±12,8* /-61,3±5,7 р1-4<0,001 Р2-4<0,001 рЗ-4<0,001

ГГТП, I 106,7±10,1 102,4±9,9 109,3±9,9 101,2±10,2

Ед/л п 90,1±8,8 81,9±8,7 59,4±6,2*** 97,7±10,0

/-18,9±1,95 /-26,5±3,21 /-53,8±5,87 р1-3<0,001 р2-3<0,001 /-5,8±0,64 р 1-4 <0,001 р2-4 <0,001 рЗ-4 <0,001

Примечания: I- до начала терапии, II- по окончании терапии/индивидуальная динамика; различия статистически значимы по сравнению с показателем до начала терапии: * -р<0,05; ** -р<0,01, *** -р<0,001

Уровень общего билирубина у пациентов, получавших ремаксол и реамберин, был в 2,8-6,1 выше, чем у больных по окончании терапии аде-метионином (р<0,001). В группе пациентов, получавших адеметионин, также отмечено уменьшение в 1,9 раза концентрации прямого билирубина (ЦБР), а его индивидуальная динамика снижения была в 3,5, 2,7 и 6,1 раза (р<0,001) выше, чем у больных ОГ1, ОГ2 и ГС соответственно. Активность у-глутамилтранспептидазы (ГГТП) по окончании терапии адеметионином была в 2-2,8 раза ниже аналогичной в группах, получавших сукцинатсо-держащие препараты (р<0,001, табл. 2).

По окончании терапии изучаемыми препаратами отмечена тенденция роста уровня мочевой кислоты (МК), максимально (на 14,8 % от исходного) выраженная у пациентов, получавших ремаксол, тогда как у больных ГС показатель снизился на 11,2 %. Установлена обратная корреляция между уровнем МК и активностью АлАТ (г=^0,41, р<0,05).

Наблюдаемая гиперурикемия отражает антигипоксическое и гепато-протекторное действие ремаксола, указывая на восстановление активности ферментативных каскадов катаболизма пуриновых нуклеотидов в ткани печени, поскольку образование мочевой кислоты из гипоксантина возможно только в гепато- и энтероцитах и не происходит в других клеточных структурах организма (Зайчик А.Ш., 2007).

Ремаксол повышал общую антиоксидантную способность (ОАС) сыворотки крови на 47,4 % (р<0,01) против 11,2 и 10,1 % в группах больных, получавших реамберин и адеметионин соответственно. Рост общего антиокси-дантного статуса (ОАСт) по окончании курса ремаксола в 3,3 (р<0,001) и 2,0 (р<0,001) раза превышал аналогичный в ОГЗ и ОГ1. При этом выявлена корреляция между активностью АлАТ, ОАС (1=^0,74, р<0,01) и ОАСт (г=Ч),7, р<0,01). Активность ГПО у больных, получавших ремаксол, была выше в 3,7 раза, чем на фоне терапии адеметионином (р<0,001), значимо не меняясь при введении реамберина. Реамберин, как и адеметионин, уменьшал активность Г5Т (р<0,05), ремаксол не оказал значимого снижения величины показателя. Активность СОД повышалась у пациентов всех трех основных групп (р<0,001), в то время как у больных ГС имелась лишь тенденция к росту данного показателя. Установлены корреляционные связи между активностью АлАТ и ОАС (г=Ч),74, р<0,01), АлАТ и ОАСт (г=-0,7, р<0,01), ГГТП и ОАС (г=—0,53, р<0,05), ГГПТ и ОАСт (г=Ч),41, р<0,05), АлАТ и СОД (г=-0,53, р<0,05), АлАТ и ГПО (т=-0,41, р<0,05), ГГТП и ГПО (г=Ч),56, р<0,05).

На фоне применения гепатопротекторов исходно повышенный в 1,71,8 раза лабораторный индекс - интегральный показатель, характеризующий тяжесть поражения печени, достоверно снизился в 1,5-1,3 раза (в ОГ1-2 и ОГЗ, р<0,001 и р<0,01 соответственно), в то время как у больных группы сравнения - только в 1,2 раза. При этом величина лабораторного индекса у больных после курса ремаксола была на 22,4 % и 27,7 % ниже по сравнению с пациентами, получавшими адеметионин и раствор 5 % глюкозы соответственно.

Анализ результатов расчета относительного риска (RR=risk l-3/risk 4) и отношения шансов (OR=odds l-3/odds 4) позволил сделать вывод о большей вероятности наступления благоприятного исхода (RR<1, 0R<1) при использовании гепатопротекторов в комплексном лечении больных туберкулезом легких. Относительный риск (RR= risk 2/risk 3) и отношение шансов (OR= odds 2/odds 3) отсутствия снижения лабораторного индекса у больных на фоне терапии ремаксолом и адеметионином составили 1,89 и 2,31 соответственно. Это свидетельствует о большей вероятности наступления благоприятного исхода при использовании ремаксола в комплексной терапии больных туберкулезом легких. Число пациентов, которых необходимо пролечить (NNT=1/ARR), для того чтобы избежать хотя бы одного случая отсутствия снижения лабораторного индекса в группе пациентов, получавших ремаксол, оказалось в 1,6 и 4,4 раза ниже, чем в условиях применения соответственно реамберина (ОГ1) и адеметионина (ОГЗ). Исходя из расходов на приобретение гепатопротекторов, а также величины коэффициента NNT, общая сумма затрат, позволяющая предотвратить развитие хотя бы одного неблагоприятного исхода (NNT х сумма затрат), при использовании ремаксола в 5,6 раза ниже, чем адеметионина.

Таким образом, сукцинатсодержащие препараты положительно влияют на клинические проявления, биохимические маркеры ЛПП, вызванных противотуберкулезными препаратами, и состояние антиоксидант-ной системы организма. Индуктор интерферона циклоферон в составе комплексной терапии туберкулеза легких снижает частоту развития цито-литического синдрома, прежде всего у больных с исходно сниженным уровнем INF-y. Это обосновывает применение указанных препаратов в комплексном лечении пациентов с туберкулезом органов дыхания.

Заключение

В экспериментальных условиях доказано протективное и апоптозин-гибирующее действие сукцинатсодержащих препаратов при поражении печени противотуберкулезными препаратами основного и резервного ряда,

стимулирующее действие на процессы репаративной регенерации печени, а также повышение эффекта химиотерапии на модели туберкулеза, вызванного МБТ с различной лекарственной чувствительностью. Показано однонаправленное положительное влияние сукцинатсодержащих препаратов у больных туберкулезом легких на ведущие клинико-лабораторные синдромы ЛПП и антиоксидантный потенциал. Установлена антицитоли-тическая активность циклоферона и его положительное влияние на основные показатели эффективности лечения больных туберкулезом. В результате работы достигнута цель и решены задачи исследования.

ВЫВОДЫ

1. Сукцинатсодержащие препараты при повреждении печени экспериментальных животных противотуберкулезными препаратами положительно влияют на проявления синдрома цитолиза и холестаза, нормализуют нарушения ли-пидного обмена, повышают синтез эндогенного Б-аденозил-Ь-метионина, нормализуют гистологическую картину, после частичной резекции печени -стимулируют процессы репаративной регенерации.

2. Ремаксол и рунихол при поражении печени 1III1 повышают синтез ангаапопто-тического фактора Вс1-2, но не влияют на интенсивность процессов апоптоза гепатоцитов, в то время как циклоферон и раствор адеметионина обладают умеренным проапоптотическим, а реамберин - антиапоптотическим действием.

3. Включение циклоферона и ремаксола в состав комплексной терапии экспериментального лекарственно чувствительного и лекарственно устойчивого туберкулеза способствует улучшению биометрических, бактериологических показателей, положительно влияя на процессы фагоцитоза и гистологическую картину легких, при этом введение рунихола не оказывает влияния на терапевтическую активность противотуберкулезных препаратов.

4. Больные впервые выявленным инфильтративным туберкулезом органов дыхания с исходным уровнем интерферона-гамма ниже уровня здоровых лиц (194 пг/мл) имеют повышенный риск развития гепатотоксических ре-

акций на фоне противотуберкулезной терапии в течение 1-2-го месяца специфической терапии.

5. Циклоферон в комплексной терапии больных впервые выявленным ин-фильтративным туберкулезом при исходно низком уровне сывороточного ШЫ - у снижает частоту и выраженность развития синдрома цитолиза, повышает эффективность комплексного лечения специфического процесса.

6. Использование сукцинатсодержащих препаратов у больных туберкулезом органов дыхания при лекарственных поражениях печени, вызванных противотуберкулезной терапией, способствует ликвидации диспепсического и астено-вегетативнош синдромов, снижению уровня индикаторных ферментов цитолиза и холестаза, восстановлению антиоксидантного потенциала клеток.

7. Применение ремаксола в сравнении с адеметионином при лекарственных поражениях печени на фоне противотуберкулезной терапии способствует более выраженному снижению лабораторного индекса, характеризующего тяжесть поражения печени, повышает вероятность наступления благоприятного исхода, существенно уменьшает величину показателя №ГГ и затраты, связанные с использованием гепатопротекторов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для экспериментальной оценки гепатопротекторного эффекта новых фармакологических веществ оптимальными моделями поражения печени, вызванными противотуберкулезными препаратами резервного ряда, являются: ПАСК (2000 мг/кг, внутрижелудочно), а также ПАСК в сочетании с протионамидом и циклосерином (200 мг/кг, внутрижелудочно).

2. Сукцинатсодержащие препараты рекомендуется использовать в качестве препаратов сравнения при доклинической оценке новых фармакологических веществ: гепатопротекторной эффективности - ремаксол (в дозе 25 мл/кг внутрибрюшинно в течение 10 дней); антиапоптотической активности - реамберин (в дозе 25 мл/кг внутрибрюшинно в течение 10 дней).

3. Для прогнозирования риска возникновения гепатотоксических реакций у больных, получающих противотуберкулезную терапию, в качестве одного из показателей рекомендуется определение исходного уровня интерферона-гамма.

4. Сукцинатсодержащие гепатопротекторы и циклоферон необходимо назначать больным впервые выявленным инфильтративным туберкулезом органов дыхания с исходно низким уровнем интерферона-гамма и проявлениями гепатотоксичности химиотерапии.

5. Для лечения циголитических поражений печени, вызванных воздействием противотуберкулезных препаратов, показано назначение реамберина и ремаксола по 400 мл, при наличии холестатического компонента обосновано применение раствора адеметионина 400 мг внутривенно. Курс лечения -10 дней.

6. Лабораторный индекс, характеризующий тяжесть поражения печени, может быть использован для оценки относительного риска/отношения шансов наступления неблагоприятного/благоприятного исхода гепатопротективной терапии и суммы предполагаемых затрат на ее проведение.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской

Федерации

1. Вольф, С.Б. Медикаментозные поражешм печени при полихимиотерапии туберкулеза / С.Б. Вольф, Д.С. Суханов, М.Г. Романцов // Вестн. Санкт-Петербургской медицинской академии им. И.И. Мечникова. - 2009 - № 1 -С, 172-176.

2. Гельберг, И.С. Применение циклоферона в комплексном лечении больных туберкулезом легких / И.С. Гельберг, С.Б. Вольф, С.Н. Демидик, B.C. Авла-сенко, E.H. Алексо, Д.В. Шевчук, Д.С. Суханов, А.Л. Коваленко // Вестн. Санкт-Петербургской медицинской академии им. И.И. Мечникова - 2009 -№ 1.-С. 176-183.

3. Суханов, Д.С. Лечение гепатотоксических осложнений противотуберкулезной терапии сукцинатсодержащими препаратами / Д.С. Суханов, А.К. Иванов, М.Г. Романцов, А.Л. Коваленко // Рос. мед. журн. - 2009. - № 6. - С. 22-25.

4. Суханов, Д.С. Цитопротекторная активность сукцинатсодержащих препаратов на функциональную активность печени в эксперименте / Д.С. Суханов, А.Л.

Коваленко, М.Г. Романцов, А.Ю. Петров, Т.Н. Саватеева // Эксперим. и клин, фармакология. - 2010. - № 8 (73). - С. 35-38.

5. Суханов, Д.С. Возможности коррекции нарушений иммунитета при туберкулезной инфекции /Д.С. Суханов, А.К. Иванов, М.Г. Романцов, A.JI. Коваленко, И.В. Кучко, С.Н. Демидик // Клин, медицина. - 2010. - № 6 (88). - С. 14-19.

6. Суханов, Д.С. Влияние сукцинатсодержащих препаратов на процессы репара-тивной регенерации печени в эксперименте / Д.С. Суханов, Т.И. Виноградова, Н.В. Заболотных, С.Н. Васильева, АЛ. Коваленко, М.Г. Романцов // Хирургия. Журн. им. Н.И. Пирогова. - 2011 - № 1 - С. 56-60.

7. Виноградова, Т.И. Сравнительная оценка влияния ремаксола и адеметионина на репаративно-регенераторные процессы печени в условиях хирургического вмешательства в эксперименте / Т.И. Виноградова, Д.С. Суханов, Н.В. Заболотных, АЛ. Коваленко, С.Н. Васильева, М.Г. Романцов // Эксперим. и клин, фармакология. - 2011. - № 2 (74). - С. 34-39.

8. Суханов, Д.С. Фармакологическая активность сукцинатсодержащих препаратов при хроническом поражении печени различными инициирующими агентами / Д.С. Суханов, А.Ю. Петров, М.Г. Романцов, М.Н. Бизенкова, A.B. Сава-теев, Л.Н. Александрова, АЛ. Коваленко // Фундам. исслед. - 2011. - № 5. -С. 159-168.

9. Суханов, Д.С. Сравнительное изучение гепатопротективного действия ремаксола, реамберина и адеметионина при повреждении печени противотуберкулезными препаратами (экспериментальное исследование) / Д.С. Суханов, Т.И. Виноградова, Н.В. Заболотных, А.Л. Коваленко, С.Н. Васильева, М.Г. Романцов // Антибиот. и химиотерап. - 2011. - № 1-2 (56). - С. 13-17.

Ю.Баласанянц, Г.С. Некоторые аспекты патогенетической терапии при туберкулезе в современных условиях / Г.С. Баласанянц, Д.С. Суханов // Терапевт, арх. - 2011. - № 8 (83) - С. 21-25.

П.Суханов, Д.С. Индукция эндогенного Б-аденозил-Ь-метионина в гепатоцитах при фармакотерапии токсических и лекарственных пражений печени в эксперименте / Д.С. Суханов, А.Ю. Петров, А.Л. Коваленко, М.Г. Романцов // Эксперим. и клин, фармакология. - 2011. - № 10(74). - С. 34-39.

12.0ковитый, C.B. Гепатотропные средства: современное состояние проблемы / C.B. Оковитый, Д.С. Суханов, М.Г. Романцов // Терапевт, арх,- 2012-№2(83).-С. 62-69.

13.Суханов, Д.С. Изучение эффективности ремаксола в условиях комплексной терапии экспериментального генерализованного туберкулеза у мышей / Д.С. Суханов, Т.И. Виноградова, A.B. Елькин, Н.В. Заболотных, С.Н. Васильева, М.Л. Витовская // Антибиот. и химиотерапия. - 2012. - № 1-2 (57). - С. 17-22.

14. Суханов, Д.С. Влияние сукцинат- и метионинсодержащего препарата «Руни-хол» и адеметионина на процессы репаративной регенерации печени в условиях экспериментальной частичной гепатэктомии / Д.С. Суханов, Т.И. Виноградова, А.Ю. Петров, Н.В. Заболотных, А.Л. Коваленко, С.Н. Васильева, М.Г. Романцов // Эксперим. и клин, фармакология. - 2012. - № 4 (75). - С. 20-23.

15. Суханов, Д.С. Внутрипеченочная индукция эндогенного Б-аденозил-Ь-метионина на фоне различных путей введения комплекса метионин+сукцинат и ее роль в коррекции лекарственного поражения печения / Д.С. Суханов, А.Ю. Петров, A.JI. Коваленко, М.Г. Романцов // Вестн. РАМН,- 2012 -№3,-С. 86-90.

16. Демидик, С.Н. Циклоферон в комплексной терапии больных с распространенными формами туберкулеза легких / С.Н. Демидик, Д.С. Суханов // Эксперим. и клин, фармакология. - 2012. - № 5 (75). - С. 17-21.

17. Суханов, Д.С. Взаимосвязь уровня эндогенного интерферона-гамма и риска гепатотоксических реакций у больных туберкулезом органов дыхания / Д.С. Суханов, C.B. Оковитьш, С.Н. Демидик, А.К. Иванов, М.Г. Романцов // Эксперим. и клин, фармакология. - 2012. - № 6 (75). - С. 40-43.

18. Суханов, Д.С. Эффективность циклоферона при генерализованном туберкулезе легких с лекарственной устойчивостью (экспериментальное исследование) / Д.С. Суханов, Т.И. Виноградова, С.Н. Демидик, А.В. Елышн, Н.В. Заболот-ных, С.Н. Васильева, М.Л. Витовская, М.Г. Романцов // Эксперим. и клин, фармакология. - 2012. - № 9(75). - С. 32-37.

19. Суханов, Д.С. Сравнительное влияние рунихола и экзогенного S-аденозил-Ь-метионина на морфологическую картину печени при гепатотоксическом воздействии противотуберкулезных препаратов резервного ряда / Д.С. Суханов, Т.И. Виноградова, Н.В. Заболотных, С.Н. Васильева, МЛ. Витовская // Арх.' патологии. - 2012. - № 5(74). - С. 51-57.

20. Оковитый C.B. Антигипоксанты в современной клинической практике / C.B. Оковитьш, Д.С. Суханов, В.А. Заплутанов, А.Н. Смагина // Клин, медицина. -2012.-№9(90).-С. 63-69.

21. Суханов, Д.С. Эффективность гепатопротекторного действия и оценка рисков при использовании реамберина, ремаксола и адеметионина у больных туберкулезом органов дыхания с лекарственными поражениями печени / Д.С. Суханов // Терапевт, арх. - 2012. - № 11 (84). - С. 26-30.

22. Суханов, Д.С. Иммунотропная терапия туберкулезной инфекции /Д.С. Суханов // Терапевт, арх. - 2013. - № 3(85). - С. 110-118.

23. Суханов, Д.С Гепатопротекорная активность ремаксола и S-адснозил-Ь-метионина при поражении печни противотуберкулезными препаратами резервного ряда / Д.С. Суханов, Т.И. Виноградова, Н.В. Заболотных, С.Н. Васильева, МЛ. Витовская // Арх. патологии. - 2013. - № 2(75). - С. 25-29.

• 24. Суханов, Д.С. Сравнительная эффективность клинического применения реамберина, ремаксола и адеметионина у больных туберкулезом органов дыхания с лекарственными поражениями печени / Д.С. Суханов, М.В. Павлова, П.К. Яблонский, Т.И. Виноградова // Антибиот. и химиотерап. - 2013 - № 1-2 (58) -С. 13-18.

25. Суханов, Д.С. Иммунотропная и антишпоксантная терапия экспериментального лекарственно-чувствительного и лекарственно-устойчивого туберкулеза / Д.С. Суханов, Т.И. Виноградова, С.Н. Демидик, Н.В. Заболотных, С.Н. Ва-

сильева, АЛ. Коваленко, М.Л. Витовская // Патол. физиология и эксперим. терапия. - 2013. - № 1. - С. 65-70.

26. Суханов, Д.С. Антиоксидантные свойства ремаксола реамберина и адеметио-нина при лекарственных поражениях печени у больных на фоне противотуберкулезной терапии / Д.С. Суханов // Эксперим. и клин, фармакология.-2013. -№ 4(76). - С. 45-48.

27.Гельберг, И.С. Применение реамберина при химиотерапии туберкулеза и его влияние на функцию печени / И.С. Гельберг, С.Б. Вольф, Д.С. Суханов, B.C. Авласенко, ЮА. Шейфер // Антибиот. и химиотерап. - 2013. - № 3-4(58). -С. 34-37.

28. Суханов, Д.С. Клиническая эффективность инфузионных растворов на основе янтарной кислоты в терапии поражений печени, вызванных противотуберкулезными препаратами / Д.С. Суханов, М.В. Павлова, Т.И. Виноградова // Туб. и болезни легких. - 2013. -№ 8. - С. 50-56.

29. Суханов, Д.С. Участие некоторых гепатопротекторов и иммуномодуляторов в регуляции апоптоза гепатоцитов, индуцированного противотуберкулезными препаратами основного ряда / Д.С. Суханов, Е.Д. Бажанова, Д.Л. Теплый // Веста. РАМН. - 2013. -№ 8. - С. 45-50.

30. Суханов, Д.С. Фармакологическая активность рунихола и 8-аденозил-Ь-метионина при экспериментальном повреждении печени противотуберкулезными препаратами резервного ряда / Д.С. Суханов, Т.И. Виноградова, Н.В. За-болотных, C.B. Оковитый, С.Н. Васильева, М.Л. Витовская // Эксперим. и клин, фармакология. - 2013. - № 9(76). - С. 27-31.

31. Теплый, Д.Л. Механизм апоптоза при экспериментальном токсическом повреждении печени / Д.Л. Теплый, Д.С. Суханов, Е.Д. Бажанова // Морфология. - 2013. - № 6. - С. 58-62.

32. Суханов, Д.С. Гепатотропное действие рунихола и адеметионина при повреждении печени противотуберкулезными препаратами основного ряда в эксперименте / Д.С. Суханов, Т.И. Виноградова, Н.В. Заболотных, М.Л. Витовская, А.Л. Коваленко // Арх. патологии. - 2014. - № 2(76). - С. 26-32.

Работы, опубликованные в других изданиях

1. Суханов, Д.С. Терапия лекарственных поражений печени у больных туберкулезом органов дыхания / Д.С. Суханов, А.Л. Коваленко, Т.В. Сологуб, М.Г. Романцов // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии.-2009.— №5 (19).— Прил. № 34: мат. 15-й Рос. гастроэнтерологической недели. - С. 102.

2. Демидик, С.Н. Эффективность стационарного лечения больных туберкулезом легких с применением иммуномодулятора циклоферона / С.Н. Демидик , И.С. Гельберг, С.Б. Вольф, B.C. Авласенко, E.H. Алексо, Д.В. Шевчук, Д.С. Суханов // Первые итоги работы фтизиатрической службы по внедрению стратегии «Stop-ТВ» в практическое здравоохранение: мат. международной науч.-практ. конф. ; редкол.: проф. И.С. Гельберг (отв. ред.) [и др.]. - Гродно: УО ГрГМУ, 2009.-С. 250-257.

3. Суханов, Д.С. Рсмаксол- сукцинатсодержащий препарат для коррекции лекарственной гепатотоксичности противотуберкулезных химиопрепаратов / Д.С. Суханов, А.К. Иванов, М.Г. Романцов, A.JI. Коваленко// Я могу остановить туберкулез : сб. мат. I международной науч.-практ. конф. студентов, молодых ученых и специалистов ; под ред. Д.Ю. Рузанова, С.Б. Вольфа. - Гомель: УО ГГМУ, 2010. - С. 132-134.

4. Коваленко, A.JI. Эффективность оригинального препарата «Ремаксол, раствор для инфузий» при поражениях печени разного генеза / A.JI. Коваленко, Д.С. Суханов, М.Г. Романцов // Фармацевтическая пром-сть. - 2010. - № 4. - С. 5861.

5. Суханов, Д.С. Ремаксол - новый препарат для коррекции гепатотоксических реакций противотуберкулезной терапии / Д.С.Суханов, А.К. Иванов, М.Г. Романцов // Совершенствование медицинской помощи больным туберкулезом: мат. Всерос. науч.-практ. конф. с международным участием ; под ред. проф. П.К. Яблонского, член-корр. РАМН, проф. Ю.Н. Левашева. - СПб., 2010. — С. 229-230.

6. Суханов, Д.С. Гепатопротекторная активность метаболических средств при поражении печени химиопрепаратами в эксперименте / Д.С. Суханов, Т.И. Виноградова, М.Г. Романцов // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, ко-лопроктологии. - 2011,- № 1(21).- Прил. № 37: мат. 16-го Рос. конгресса «Гепатология сегодня». - С. 233.

7. Суханов, Д.С. Влияние сукцинатсодержащих препаратов на регенерацию печени в эксперименте / Д.С. Суханов, Т.И. Виноградова, М.Г. Романцов // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2011. — №1(21).- Прил. № 37: мат. 16-го Рос. конгресса «Гепатология сегодня».-

C. 271.

8. Sukhanov, D.S. Experimental and clinical reasoning of succinates use for chronic liver disease treatment / D.S. Sukhanov, A.Yu. Petrov, M.G. Romantsov, A.L. Kovalenko // Programm abstracts: Intemationaller medizinischer congress «Moderne Aspekte der Prophylaxe, Behandlung und rehabilitation».- Hannover, 2011. — P. 153-154.

9. Sukhanov, D.S. The use succinates in therapy of toxic damages of liver /

D.S. Sukhanov, A.Yu. Petrov, A.L. Kovalenko, M.G. Romantsov // Abstacts of ХП international euroasian congress of surgery and gastroenterology. - Baku, 2011. - P 190-191.

10. Sukhanov, D.S. The influence of interferon gamma on frequency of drug hepatotoxi-city in patients with pulmonary tuberculosis / D.S. Sukhanov, A.K. Ivanov, S.N. Demidik, M.G. Romantsov // Abstacts of XII international euroasian congress of surgery and gastroenterology. - Baku, 2011. - P. 310-311.

11. Демидик, C.H. Влияние циклоферона на концентрацию интерферона-гамма и интерлейкина-4 в крови у пациентов с туберкулезом легких /С.Н. Демидик, С.Б. Вольф, Д.С. Суханов // Совершенствование медицинской помощи больным туберкулезом: мат. Всерос. науч.-практ. конф. ; под ред. проф. П.К. Яблонского. - СПб., 2011. - С. 164-166.

12. Суханов, Д.С. Внутрипеченочный синтез Б-аденозил-Г^мешонина (адеметио-ннна) при фармакотерапии экспериментальных поражений печени противоту-берклезными препаратами / Д.С. Суханов, Т.И. Виноградова // Актуальные проблемы диагностики, лечения и профилактики туберкулеза в свете стратегии «STOP ТВ: сб. статей науч.-практ. конф., посвященной 50-летию кафедры фтизиопульмонологии ; под ред. д.м.н. С.Б. Вольфа. - Гродно: УО ГрГМУ, 2011.-С. 28-30.

13. Суханов, Д.С. Влияние рунихола и Б-аденозил-Ь-метионина на морфологическую картину печени при ее повреждении противотуберкулезными препаратами резервного ряда в эксперименте / Д.С. Суханов, Т.И. Виноградова // Актуальные вопросы инфекционных болезней : сб. статей республиканской науч.-практ. конференции с международным участием, посвященной 50-летию кафедры инфекционных болезней ; под ред. проф. В.М. Цыркунова. — Гродно: ГрГМУ, 2012. - С 245-248.

14. Суханов, Д.С. Клинико-экспериментальная оценка эффективности ремаксола и адеметионина при поражении печени, вызванном противотуберкулезными препаратами / Д.С. Суханов, Т.И. Виноградова, М.В. Павлова // Актуальные проблемы и перспективы развития противотуберкулезной службы в Российской Федерации: мат. 1-го Конгресса Ассоциации «Национальная Ассоциация фтизиатров»; под ред. проф. П.К. Яблонского. - СПб., 2012. - С. 103-105.

15. Суханов, Д.С. Доклиническое и клиническое изучение гепатопротективного действия ремаксола и адеметионина при поражении печени противотуберкулезными препаратами / Д.С.Суханов, C.B. Оковитый // Проблемы военного здравоохранения: сб. науч. трудов Украинской воен.-мед. академии; под ред. проф. В.Я. Белого. - Киев: Минобороны Украины, 2012.- Вып. 35. - С. 268273.

16. Суханов, Д.С. Сравнительная гепатотропная активность ремаксола и адеметионина при экспериментальном поражении печени противотуберкулезными препаратами резервного ряда / Д.С. Суханов // Акт. вопр. мед. науки: сб. тез. научн. работ студентов и молодых ученых Всерос. науч.-практ. конф. с международным участием, посвященной 85-летию проф. E.H. Дормидонтова-Ярославль: ЯГМА, 2013. - С. 48-49.

17. Bajanova, E.D. Influence of hepatoprotectors of hepatocyte apoptosis induced by antituberculosis drugs of the main line / E.D. Bajanova, D.S. Sukhanov // Abstacts of ХШ international euroasian congress of surgery and gastroenterology. - Baku, 2013.-P. 92-93.

Учебные пособия

1. Туберкулез. Особенности течения, возможности фармакотерапии : учеб. пособие для врачей / [А. К. Иванов, Т.В.Сологуб, Д.С.Суханов и др.] ; под ред. А. К. Иванова. - СПб.: Тактик-студио, 2009.- 108 с.: ил, - ISBN 978-5-91644-013-3.-5000 экз.

2. Побочные действия противотуберкулезных препаратов и методы их устранения: учеб. пособие / Г.С. Баласанянц, Д.С. Суханов, Д.Л. Айзиков. - 2-е изд.,

доп.- СПб.: Тактик-Студио, 2011,- 88 е.- ISBN 978-5-91644-036-2,5000 экз.

3. Гепатотропные средства в терапии поражений печени противотуберкулезными препаратами: учеб. пособие / Д.С. Суханов, C.B. Оковитый. - СПб.: Тактик-студио, 2012. - 64 с. - ISBN 978-5-91644-043-0. - 3000 экз.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АлАТ — аланинаминотрансфераза

АсАТ - аспартатаминтрансфераза

АТФ - аденозинтрифосфорная кислота

ГГТП - гамма-глугамилтранспептидаза

ГПО - глутатионпероксидаза

ГС - группа сравнения

rST - глутатион-8-трансфераза

ИЗФ - индекс завершенности фагоцитоза

ИЭ - индекс эффективности

КОЕ -колониеобразующая единица

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

ЛПП - лекарственные поражения печени

МБТ - микобактерия туберкулеза

МЛУ - множественная лекарственная устойчивость

ОАС - общая антиоксидаптная способность

ОАСт - общий антиоксидантный статус

ОГ - основная группа

ПЗФ - показатель завершенности фагоцитоза

ПТП - противотуберкулезные препараты

СОД - супероксиддисмугаза

ФА - фагоцитарная активность

XT - химиотерапия

ФЧ - фагоцитарное число

ЩФ - щелочная фосфатаза

Am - амикацин

Cs — циклосерин

Et - этионамид

Fq - фторхинолоны

GAPDH - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа

H - изониазид

IFN-v - интерферон - гамма

К — канамицин

OR (odds ratio) - отношение шансов PAS - парааминосалициловая кислота Pt - протионамид R - рифампищш

RR (relative risk) - относительный риск S - стрептомицин

SAM - З-аденозин-Ь-метионин (адеметионин) SUCNR1 — сукцинатные рецепторы 1 -го типа

TUNEL - Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling (нерадиоактивное мечение биотином, выявление диаминобензидином) Z — пиразинамнд

Подписано в печать 12.03.2015 Формат 60x90/16. Объем 1,615 усл.п.л. Печать ризографическая. Бумага офсетная. Тираж 130 экз. Заказ №57 Отпечатано в типографии ООО "Фирма "Стикс" 196128, Санкт-Петербург, ул. Кузнецовская, 19.