Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Элиминация белковых фракций при проведении экстракорпоральных методов детоксикации онкологическим больным с гнойно-септическими осложнениями

На правах рукописи

□0305Т380

ВОХМИНОВА ДАРЬЯ ВЛАДИМИРОВНА

ЭЛИМИНАЦИЯ БЕЛКОВЫХ ФРАКЦИЙ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНЫХ МЕТОДОВ ДЕТОКСИКАЦИИ ОНКОЛОГИЧЕСКИМ БОЛЬНЫМ С ГНОЙНО-СЕПТИЧЕСКИМИ ОСЛОЖНЕНИЯМИ

14.00.14. — онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2007

003057380

Работа выполнена в ГУ Российском онкологическом научном центре им. Академика Н.Н.Блохина РАМН

Научные руководители: д.м.н. Е.Г. Громова

д.м.н. Ф.В. Доненко

Официальные оппоненты:

д.м.н., профессор Л.С. Бирюкова д.б.н., профессор Л.Б. Горбачева

Ведущая организация: ФГУ Российский научный центр рентгенорадиологии Росмедтехнологий

Защита состоится " ^Ь " & & 2007 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета (К.001.017.01) при ГУ Российском онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУРОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Автореферат разослан " 2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета д.м.н., профессор

К^^^ЮЛ Барсуков

Введение

В настоящее время одной из наиболее актуальных проблем современной медицины является сепсис, летальность при котором, несмотря на интенсивную терапию, достигает 40-90% в зависимости от этиологических причин и степени органных нарушений [Bone R.C., 1997; Iwai H., et.al., 1998]. В онкологических клиниках проблема сепсиса особенно значима, так как присущие опухолевому процессу нарушения различных звеньев гомеостаза усугубляются инвазивными диагностическими исследованиями, лучевой и химиотерапией, применением больших доз глюкокортикоидов [Hirasawa H., et.al., 1996; Hoste E.A., et.al., 2004]. Современные тенденции хирургического лечения онкологических больных, характеризующиеся расширением объема и зон оперативных вмешательств, сопровождаются высоким риском развития послеоперационных осложнений [Шано В.П., с соавт. 1999]. Частота и тяжесть гнойно-септических осложнений неуклонно растет, несмотря на технические достижения в интенсивной терапии и поддерживающее лечение [Белобородов Б.В., 1997; 1998, 2001, Белломо Р., 2002, Громова Е.Г., 2004]. Неэффективность стандартного комплекса интенсивной терапии нарушений гомеостаза при сепсисе всё чаще приводит к необходимости применения экстракорпоральных методов детоксикации. Наиболее эффективными методами при лечении сепсиса признаются высокообъемная гемофильтрация и гемодиафильтрация [ Damas Р., 2002, Haraldsen Р., 2004]. В настоящее время в литературных источниках, а также в технических протоколах указывается, что при гемофильтрации элиминируются молекулы с молекулярной массой до 50 кД [Ronco С. et.al., 2002; O'Reilly 1 D.A. et.al., 2006]. Однако, идентификация этих белков и количественная оценка их потери не проводилась. Онкологические больные имеют ряд специфических нарушений гомеостаза (гипопротеинемия) , отличающихся от таковых, например, при почечной недостаточности, но исследований по потере и

идентификации белков при экстракорпоральной детоксикации у онкологических больных не проводилось. У больных с распространенным опухолевым процессом гипопротеинемия отмечается очень часто, и потеря минорных белковых фракций для них может быть весьма значимой, что требует изучения для проведения последующих компенсаторных мероприятий.

Цель работы

изучить элиминацию белковых фракций у онкологических больных с септическими осложнениями при проведении процедур экстракорпоральной детоксикации (ЭКД). Задачи исследования:

1. Изучить спектр белковых потерь при проведении различных процедур ЭКД онкологическим больным с сепсисом.

2. Исследовать элиминацию цитокинов при проведении процедур ЭКД.

3. Оценить потенциальные возможности сыворотки крови пациентов с сепсисом по связыванию избытка цитокинов.

4. Идентифицировать элиминируемые крупномолекулярные белковые фракции.

5. Провести количественную оценку потери белков при проведении различных процедур ЭКД онкологическим больным с сепсисом.

Научно-практическая значимость

Впервые исследован спектр белков, элиминируемых при проведении

экстракорпоральных методов детоксикации онкологическим больным с

гнойно-септическими осложнениями. Впервые произведена количественная

оценка белков сыворотки крови, теряемых при проведении

экстракорпоральных методов детоксикации пациентам со злокачественными

новообразованиями. Впервые показано истощение сыворотки крови по

минорным белкам (ретинол-связывающий белок, трансферрин, цинк-

4

связывающий белок). Впервые показано нарушение связывания цитокинов белками сыворотки крови и получены новые данные, характеризующие динамику элиминации цитокинов из системного кровотока при проведении гемофильтрации и гемодиафильтрации. Впервые показано восстановление способности белков сыворотки крови связывать избыток цитокинов после проведения гемофильтрации и гемодиафильтрации. Впервые показано участие провоспалительных цитокинов в развитии системной воспалительной реакции. Полученные результаты могут быть использованы для коррекции методов экстракорпоральной детоксикации и адекватного возмещения белков сыворотки крови.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 3 статьи в центральной печати, 6 тезисов в материалах международных конференций и съездов.

Апробация диссертации

Диссертация апробирована 25.10.2006 г. на совместной научной конференции лаборатории клеточного иммунитета, лаборатории комбинированной терапии опухолей, торакального отделения, отделения экспериментальной химиотерапии, лаборатории трансгенных препаратов, отделения биотерапии, отделения химиотерапии гемобластозов. Основные положения диссертации представлены на IX Российском онкологическом конгресс на конкурсе молодых ученых, Москва, 19 ноября 2005 г., а также на пятой международной конференции «Актуальные аспекты экстракорпорального очищения крови в интенсивной терапии», Москва, 25 -26 мая 2006 г. Современные подходы к диагностике и лечению злокачественных новообразований, на научно-практической конференции 7 декабря 2000. Москва. ГВКГ. Им. H.H. Бурденко, на межрегиональной конференции «Актуальные проблемы онкологии и канцерогенеза», Якутия, 2005, на 4-м Симпозиуме по экстракорпоральным лечения в Ницце, Франция,

5

ноябрь, 2005 г.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, материалов и методов исследования, семи глав экспериментальных исследований, заключения, выводов и указателя литературы; иллюстрирована 13 таблицами и 19 рисунками. Объем диссертации - 149 страниц машинописного текста.

Материалы и методы исследования.

Исследование основано на анализе биоматериалов (образцов сыворотки крови, мочи, ультрафильтратов), полученных в процессе лечения с применением экстракорпоральной детоксикации (ЭКД) 42 больных РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. В основную группу исследования включено 25 мужчин (59,5%) и 17 женщин (40,5%), которые находились на лечении в РОНЦ РАМН по поводу различных опухолевых заболеваний. Возраст пациентов варьировал от 12 до 79 лет с наибольшей численностью пациентов в возрастных группах 50 - 60 и 60 — 70 лет. Тяжесть состояния септических больных была примерно одинаковой (32 - 34 балла по шкале APACHE). В работе проанализировано 252 образца сыворотки крови и 126 образцов фильтратной жидкости. Контрольную группу составили 10 здоровых доноров, обследованных в период 2004 по 2006 гг.

Процедуры гемофильтрации и гемодиафильтрации выполняли в интермиггирующем режиме. Объемы ультрафильтратов составляли 24 - 30 л при продолжительности процедур 4-6 часов. Содержание цитокинов определено в моче и фильтратах, полученных при проведении ЭКД -ультрафильтратах, гемофильтратах, диализатах, плазмофильтратах, гемодиафильтратах.

Для определения уровня цитокинов использован твердофазный сэндвич-ИФА, разработанный для антигенов, имеющих не менее двух перекрывающихся эпитопов. С целью изучения белкового состава

полученных ультрафильтратов выделение белков проводилось с помощью ионно-обменной хроматографии, одномерного электрофореза по Лемли. Идентификацию белков осуществляли MALDI-TOF масс-спектрометрией совместно с институтом биомедицинской химии им. Ореховича РАМН. Белковые полосы вырезали из форезного геля, используя Proteome Works spot picking robot "Bio-Rad" (США). Масс-спектры были получены с помощью MALDI-TOF Reflex III масс-спектрометра "Bruker" (США) с УФ-лазером (336 нм) (граница масс положительных ионов от 500 до 8000 Да).

Результаты исследований и их обсуждение.

Потери белков при проведении экстракорпоральных методов детоксикации онкологическим больным

Проблема белковых потерь при сепсисе стоит особенно остро, так как в условиях гипопротеинемии и, в частности, гипоальбуминемии у септических больных дополнительная потеря белковых компонентов крови может создавать предпосылки к развитию анемии, а также других неблагоприятных клинических эффектов даже при адекватной нутритивной поддержке. В настоящем исследовании изучались белки с молекулярной массой свыше 5 кДа, так как именно эта часть белков, удаляемых при проведении ЭКД, к настоящему времени оставалась недостаточно изученной.

Совершенствование методик ЭКД и применение все более высокообъемных и длительных процедур заместительной терапии сепсиса требуют тщательного анализа потери белков и возможных эффектов такого удаления в условиях гиперметаболизма/гиперкатаболизма септических состояний, поэтому основное внимание было уделено изучению элиминации белков именно при проведении гемофильтрации и гемодиафильтрации онкологическим больным с сепсисом. На рис.1 приведены образцы электрофореграмм смесей выделенных из УФ белков, полученных после проведения гемофильтрации и гемодиафильтрации 10 больным с сепсисом. Практически во всех случаях обнаруживалась сходная картина белковых

7

компонентов, выделенных из ультрафильтратов. На электрофореграмме, отмечалось 6 полос с примерной молекулярной массой 10 кД, 25 кД, 30 кД, 50 кД, 70 кД и 75 кД, котрые затем идентифицировались с помощью

протеомных методов исследования.

Рие.1. Электрофоре грам м а белковых смесей, выделенных из ультрафи льтрато в, полученных при проведении интермиттирующей вено-венозной гем о фильтрации 10 онкологическим больным с сепсисом.

В таблице L приведен список идентифицированных белков, выделенных из ультрафильтратов онкологических больных с сепсисом, которым прозодились гемофильтрация и гемодиафильтрация в комплексе интенсивной терапии. Белки идентифицировали с помощью MALD1-TOF масс-спектрометрии и базы данных US National Center for В iotechno logical Information. Среди белков, обнаруженных в фильтратах, присутствовали 132-ми кро глобулин, ретинол-связывающий белок, al-антитрипсин, к-легкие цепи иммуноглобулинов, сывороточный альбумин, трансферрин и цинк-содержащий белок (zinc finger protein).

Таблица 1.

Список белков, идентифицированных с помощью МАЬОЬТОР масс-

спектрометрии и базы данных Ш ЫСВ1.

№ полосы на геле Название белка Масса белка (Да)

I р2-микроглобулин 12791

Р2-микроглобулин 13688

Р2-микроглобулин предшественник 13706

Р2-микроглобулин 13723

Цепь М, HLA-A2 11478

Цепь Н, HLA-A2 11724

ЦепьЕ, HLA-A2 11855

II Ретинол-связывающий белок 20945

Цепь F, Ретинол-связывающий белок 20403

Ш к-легкие цепи иммуноглобулинов вариабельный домен 29235

IV al-антитрипсин 44223

V сывороточный альбумин 69321

сывороточный альбумин предшественник 69321

сывороточный альбумин предшественник 69180

VI трансферрин 77030

трансферрин 77000

сывороточный альбумин 69349

сывороточный альбумин предшественник 69180

VII цинк содержащий белок (zinc finger protein) (единичный случай) 91729

В исследовании были выделены и идентифицированы белки с молекулярной массой свыше 50 кД, такие как альбумин (69 кД), трансферрин (77 кД) и цинк-содержащий белок (zinc finger protein) (91 кД). У значительного числа онкологических больных в критическом состоянии отмечается выраженная гипопротеин- и гипоальбуминемия. Белки плазмы крови выполняют важные функции, участвуя в создании и поддержании онкотического давления, транспорте железа, лекарственных препаратов, в том числе антибиотиков, поэтому неконтролируемая элиминация в процессе гемофильтрации альбумина, трансферрина, ретинол-связывающего белка и цинк-содержащего белка может вносить вклад в формирование, например, железодефицитных состояний у онкологических больных, что в свою

очередь осложнит лечение сепсиса. Состав белков, выделенных у исследуемой группы больных после проведения процедур детоксикации, качественно не отличался. Потеря идентифицированных белков была характерна практически для всех больных вне зависимости от локализации опухоли. Только в одном случае на электрофореграмме белков, выделенных из ультрафильтрата больного раком желудка в состоянии септического шока, был обнаружен цинк-содержащий белок (zinc finger protein), который конститутивно в плазме не присутствует. Этот белок является транскрипционным фактором и, как правило, локализуется в клеточном цитозоле. Появление данного белка в циркуляции может свидетельствовать о тяжелых изменениях в организме в результате массированного воспаления, приведшего к разрушению клеток.

Количественное определение белковых фракций, выделенных из ультрафильтратов, полученных при проведении гемофильтрации онкологическим больным с сепсисом.

Установленный нами факт потери белков сыворотки крови у онкологических больных с сепсисом, несомненно, свидетельствует о необходимости количественной оценки этих белков.

Количественное определение идентифицированных белков, выделенных из ультрафильтратов онкологических больных с сепсисом, проводилось с помощью сканирования электрофореграммы и обработки графических данных в программе ImageMaster™ ID Software version 4.10., a так же с помощью хроматографического анализа. При сканировании форезного геля и обработке данных в программе ImageMaster™ был получен набор пиков, каждый из которых соответствует определенному белку на электрофореграмме. Интенсивность каждого пика в оптических единицах соответствовала интенсивности окраски данной полосы на геле. При этом необходимо было учитывать общее количество белковой смеси, выделяемой из ультрафильтратов больных после каждой процедуры гемофильтрации (t -

4 часа, Ууф - 25-30 л). Определение общего количества выделенных белков осуществлялось гю методу Бредфорда в сконцентрированных ультрафильтратах. За процедуру гемофильтрации в среднем удалялось 552 ± 45 мг белка. Таким образом, зная общую массу белковой смеси и процентное содержание каждого белкового компонента в этой смеси, высчитывалось абсолютное содержание белков, представленных на электрофоретрамме,

Рис. 2. а - Электрофоре грамм а белковой смеси, выделенной из ультрафильтрата, полученного при проведении ингермиггирукшей вено-венозной гемофильтрации у онкологического больного с сепсисом. Римскими цифрами отмечен номер полосы на форезном геле. Уточнение молекулярных масс белков находится в таблице ! в соответствии с номером полосы на геле.

б - Данные электрофоре граммы сканированные с помощью прибора

CaivoScan N670 U, обработанные в программе imageMaster™ \D Software version 4.10. Римскими цифрами отмечен номер полосы на форезном геле.

На рис 2. показан образец количественного определения белков в белковой смеси, разделенной с помощью электрофореза. Картина распределения белков была сходной в данной группе больных, поэтому, в качестве иллюстрации, приводится один из наиболее характерных примеров.

Для более точной оценки белковых потерь на фоне лечебных процедур эти белки разделили с помощью гель-фильтрации, и также оценили их количество по сухому остатку. Па хромате грамме в результате разделения

11

белковой смеси, выделенной из ультрафильтратов онкологических больных с сепсисом, было получено 5 пиков, каждый из которых соответствовал определенному белку.

В таблице 2 приведены усредненные данные обоих методов количественной оценки белков в ультрафильтратах онкологических больных с сепсисом при проведении им сессий гемофильтрации и гемодиафильтрации (1-4 часа, Ууф - 25-30 л, гемофильтры АУбООБ).

Таблица 2.

Относительное и абсолютное содержание белков в белковой смеси, выделенной из фильтратов больных с сепсисом при проведении вено-венозной интермиттирующей гемофильтрации.

№ полосы на геле Название белка Содержание белка в смеси (%) Абсолютное содержание белка в смеси (мг)

I Р2-микроглобулин 26,6 146,8 ± 11,9

I ретинол-связывающий белок 9,5 52,4 ± 4,3

III к-легкие цепи иммуноглобулинов вариабельный домен 10,6 58,5 ±4,8

IV а 1-антитрипсин 12,8 70,7 ±5,8

V сывороточный альбумин 27,9 154,0 ± 12,7

VI трансферрин 9,7 53,6 ±4,5

Истощение белков сыворотки крови при проведении последовательных процедур вено-венозной гемофильтрации онкологическим больным с послеоперационным сепсисом

Продолжительность процедур гемофильтрации и

гемодиафильтрации колебалась от 4 до 14 часов и была лимитирована необходимостью продолжения интенсивной терапии с применением лекарственных препаратов (в том числе антибактериальных и кардиотропных) с высоким либо неизученным клиренсом через мембрану гемофильтра. Объём замещения варьировал от 20 до 35 литров. Частота

проведения операций при ЭКД варьировала от ежедневного до 2-4 раз в неделю. Общее число процедур для каждого пациента составляло от 2 до 43. Хотя, как указывалось выше, всем больным, получающим заместительную терапию, проводится обязательная нутритивная поддержка, такое значительное количество процедур не может не отражаться на белковом балансе организма. Это предположение может быть иллюстрировано данными, полученными в ходе исследования белков, элиминирующихся в ультрафильтрат, при проведении более 5 процедур при ЭКД онкологическим больным с тяжелым сепсисом.

В исследование вошли 5 онкологических больных с послеоперационным сепсисом, которым в комплексе интенсивной терапии применялась вено-венозная гемофильтрация и гемодиафильтрация в интермиттирующем режиме. При исследовании ультрафильтратов таких больных было показано, что некоторые белки более не обнаруживались на электрофореграммах. На электрофореграммах было видно, что белковая смесь разделилась только на три фрагмента с примерными молекулярными массами 14 кД, 60 кД и 70 кД соответственно. Для идентификации белковых компонентов, присутствующих в белковой смеси, выделенной из ультрафильтратов онкологических больных, получавших длительные процедуры ЭКД, также использовался метод МАЬ01-Т0Р масс-спектрометрии. В результате исследования были обнаружены белки, указанные в таблице 3.

Таким образом, видно, что в белковой смеси, выделенной из ультрафильтратов больных, получавших длительные серии ЭКД, отсутствуют белки, обнаруженные ранее в ультрафильтратах тех же больных после первого и второго сеансов гемофильтрации и гемодиафильтрации. Отсутствие белков в ультрафильтрате нельзя объяснить их сорбцией на гемофильтре при проведении процедуры. Такое исчезновение может свидетельствовать о снижении сывороточной концентрации этих белков,

осуществляющих важные функции в организме. Данный факт нуждается в тщательном мониторинге и разработке мер по определению клинического эффекта потери этих белков, а также по дизайну методов компенсации этих белков больным, получающим частые и продолжительные процедуры ЭКД.

Таблица 3

Список белков, идентифицированных с помощью МА1Х)1-ТОР масс-

спектрометрии и базы данных 118 N0131.

№ полосы на геле Название белка Номер белка в базе данных Масса белка (Да)

I р2-микроглобулин ^|34616 12791

Р2-микроглобулин ^|48146249 13688

р2-микроглобулин предшественник ^|40787843 13706

Цепь М, НЬА-А2 ЙХ|229995 11478

Цепь Н, НЬА-А2 81)47168707 11724

Цепь Е, Н1.А-А2 §¡1492585588 11855

II а 1-антитрипсин Й1942629 44223

III сывороточный альбумин 81128592 69321

сывороточный альбумин предшественник §¡14502027 69321

сывороточный альбумин предшественник ^6013427 69180

Элиминация цитокииов при проведении экстракорпоральной детоксикации онкологическим больным

Основными аргументами в пользу проведения процедур

детоксикации при сепсисе являются следующие: медиаторы воспаления

поддерживают ряд патологических процессов, ассоциированных с сепсисом;

ЭКД эффективна в случаях острого сепсиса; при гемофильтрации и

гемодиафильтрации из плазмы выводятся различные субстанции, в том числе

и медиаторы воспаления. Исходя из этого, считается, что ЭКД производит

положительный эффект, поскольку удаляет медиаторы воспаления. В

14

исследование были включены 42 онкологических больных, которым проводилась ЭКД в период с 2004 по 2006 гг. в ОРИТ№2 РОЩ, 30 из них были оперированы и имели различные послеоперационные осложнения.

Изучалась элиминация ЮТа, 1Ь-1р, 1Ь-6,1Ь-2 с помощью измерения их сывороточных концентраций до начала проведения процедуры детоксикации и после ее завершения. Кроме того, фиксировались концентрации этих цитокинов в диализате, полученном после процедуры, и моче, если был сохранен диурез. При исследовании сывороточных концентраций онкологических больных с острой полиорганной недостаточностью (ОПН) не было выявлено повышенных уровней основных провоспалительных цитокинов в сыворотке крови (таблица 4). Концентрация Т№а в сыворотке до проведения гемодиализа максимально достигала 60 пг/мл, а в среднем составляла 16,1±21,7 пг/мл. После окончания процедуры сывороточный уровень цитокина в среднем снизился и составил 8,8±17,2 пг/мл. В фильтрате и моче пациентов концентрация Т№а была на одном уровне и составила в среднем 30,1±27,9 пг/мл. 1Ь-1Ь не детектировался в сыворотке крови пациентов, а также не был обнаружен в моче и фильтрате. Те же данные были получены в отношении 1Ь-6 и 1Ь-2.

Таблица 4.

Средние значения концентрации цитокинов в сыворотке, фильтрате и моче

онкохирургических больных с ОПН.

Концентрация ЮТа (пг/мл) 1Ь-1Ь (пг/мл) 1Ь-6 (пг/мл) 1Ь-2 (пг/мл)

Сыворотка до ЭКД 16,1±21,7 1,2±3,3 0 0

Сыворотка после ЭКД 8,8±17,2 0 0 0

Фильтрат 36,1±25,9 0 6,9±13,7 0

Моча 30,1 ±27,9 — — 0

Таким образом, в группе больных с ОПН не были обнаружены повышенные сывороточные концентрации провоспалительных цитокинов, а также не было выявлено какого-либо влияния экстракорпоральной

15

детоксикации на уровень этих медиаторов в сыворотке крови. Значимые цифры концентраций были получены только в случае ЮТа, однако и они не превышали физиологической нормы. При этом в диализате и моче фиксировались небольшие концентрации данного цитокина.

Сывороточные концентрации и элиминация цитокинов при проведении экстракорпоральной детоксикации онкологическим больным множественной миеломой

В группу были включены 12 больных множественной миеломой, проходящих химиотерапевтическое лечение на базе отделения химиотерапии гемобластозов РОНЦ. В состав группы вошло 9 мужчин (75%) и 3 женщины (25%), средний возраст больных колебался в пределах 57,1±18,2 года. У пациентов наблюдалась повышенная секреция парапротеинов, в частности Р^А к-типа, Р^в к-цепи, белка Бенс-Джонса к-типа, и, в связи с этим, отмечалось повышение вязкости крови. У 6 больных заболевание сопровождалось расширенным остеодеструктивным процессом, протеинурией и анемией. В трех случаях отмечалась тромбоцитопения. Пациентам данной группы проводились серия процедур плазмофильтрации для снижения вязкости крови, характерной для больных множественной миеломой. 7 (58,3%) больных умерли вследствие прогрессирования основного заболевания, а 5 (41,7%) были выписаны в удовлетворительном состоянии после проведения соответствующих курсов химиотерапии.

В рамках исследования были изучены сывороточные концентрации основных противовоспалительных цитокинов ТЫБа, 1Ь-1р, 1Ь-6 и регуляторного 1Ь-2 (таблица 5).

Таким образом установили, что в данной группе пациентов отмечалось общее повышение сывороточных уровней Т№а и 1Ь-2. В моче концентрации исследованных цитокинов не детектировались.

Таблица 5.

Средние значения концентрации цитокинов в сыворотке и моче больных

множественной миеломой.

Концентрация ТИБа (пг/мл) 11.-1 Ь (пг/мл) 1Ь-6 (пг/мл) 1Ь-2 (пг/мл)

Сыворотка до ПФ 49,8±92,5 0,2±0,7 15,3±37,2 294,5±250,2

Сыворотка после ПФ 88,1±140,5 1,8±5,2 0 178,5±172,5

Моча — — — —

Сывороточные концентрации и элиминация цитокинов при проведении экстракорпоральной детоксикации онкологическим больным с сепсисом.

В данную группу было включено 23 пациента с послеоперационными осложнениями, 13 мужчин (56,5%) и 10 женщин (43,5%), средний возраст в группе составил 60,5±13,2 лет. В данной группе были изучены сывороточные концентрации цитокинов Т№а, 1Ь-1Ь, 1Ь-6,1Ь-2, 1Ь-10 и 1Ь-12, а также исследована элиминация этих цитокинов при проведении процедур гемофильтрации. Средние значения сывороточных концентраций исследованных цитокинов приведены в таблице 6.

Таблица 6.

Средние значения концентрации цитокинов в сыворотке и фильтратах онкологических больных с послеоперационными септическими

осложнениями при проведении ЭКД.

Концентрация тага (пг/мл) 1Ь-1Ь (пг/мл) 1Ь-6 (пг/мл) 1Ь-2 (пг/мл) 1Ы0 (пг/мл) 1Ь-12 (пг/мл)

Сыворотка до ЭКД 70,4±125,1 0,5±1,5 226,2±385 349,5±442 14,5±48,6 36,7±32,3

Сыворотка после ЭКД 72,9± 125,5 0,4±1,3 20б,9±389 191±399 2,6±7,3 29,7±26,8

Фильтрат 28,8±31,4 22,2±50,6 105,1±272 131,4±284 — 22,8±27,1

В исследованной группе онкологических больных с септическими послеоперационными осложнениями отмечались повышенные концентрации

ТОТа в сыворотке крови пациентов.

Таким образом, суммируя результаты по изучению сывороточных уровней и элиминации цитокинов во всех рассмотренных группах можно отметить следующие наблюдаемые отличия: максимальная сывороточная концентрация провоспалительных цитокинов ТЫТа и 1Ь-6 наблюдалась в группе онкохирургических больных с сепсисом, причем в данной группе также отмечалась элиминация значительных количеств этих медиаторов при проведении ЭКД, т.е. отмечались высокие концентрации этого цитокина, который рассматривается не только как информативный критерий тканевого повреждения, но и параметр тяжести сепсиса, септического шока, полиорганной недостаточности (ПОН). В группе больных с множественной миеломой концентрации Т№а в некоторых случаях также были повышены, однако средние концентрации этого цитокина были на порядок ниже, чем у больных с сепсисом. Содержание 1Ь-1Ь в сыворотке во всех случаях было низким, и лишь в группе больных с сепсисом отмечались значимые концентрации его в ультрафильтрате. Сывороточная концентрация 1Ь-2 была повышена у больных множественной миеломой и у больных с септическими осложнениями. В обоих случаях наблюдалась тенденция к снижению уровня цитокина при проведении ЭКД.

Нековалентный характер специфического связывания с рецепторными лигандами предполагает возможность диссоциации цитокина из его комплекса с рецептором. Локальное высвобождение значительных количеств цитокинов, обладающих вазоконстрикторными свойствами, в так называемых "шоковых" органах — почках, легких и т.д., может обусловливать их повреждение с последующим развитием ОПН, интерстициальных отеков легких и таких системных патологических процессов как шок, ПОН. Таким образом, цитокины сами по себе способны инициировать практически весь спектр наблюдаемых в послеоперационном периоде осложнений. Эти выводы согласуются с многочисленными

исследованиями патофизиологической роли цитокинов в избыточной продукции метаболитов арахидоновой кислоты, нарушении микроциркуляции, снижении артериального давления, внутрисосудистого свертывания крови — характерными клиническими проявлениями септического шока.

Существование недетектируемых, и не активных форм медиаторов, позволяет предположить факт их возможно более длительного персистирования в системном кровотоке, вопреки устоявшимся представлениям о местной продукции и метаболизме цитокинов. Уровень иммуномодулирующих медиаторов представляет проблемы в интерпретации, так как используемый анализ может определить только свободные, циркулирующие медиаторы, но не медиаторы, связанные с клетками или рецепторами. Следовательно, измеренное количество медиаторов может не соответствовать истинному их количеству. Другая проблема заключается в том, что анализ сывороточного уровня производится один раз в день или реже, хотя высвобождение медиаторов носит фазный характер. Учитывая это, представляется целесообразным исследование не самих цитокинов, а факторов, обусловливающих их специфическое связывание (и как следствие их инактивацию) в сыворотке — растворимых рецепторов к цитокинам. Однако и в этом случае исследователи сталкиваются с проблемами информативности методов при интерпретации результатов сывороточных уровней рецепторных молекул. При исследовании экспрессии т!ША цитокинов МНК онкологических больных [Тугуз А.Р. 2002] было, например, показано отсутствие корреляции между уровнями экспрессии тКЫА цитокинов и их количеством даже на внутриклеточном уровне, не говоря уже о системной концентрации последних.

Связывающая способность растворимых рецепторов сыворотки крови доноров по отношению к провоспалительным цитокинам

Для изучения влияния растворимых рецепторов сыворотки крови к

провоспалительным цитокинам на определение концентрации этих цитокинов было проведено исследование этих показателей у доноров и больных с сепсисом с помощью добавления избыточного количества экзогенного цитокина к сыворотке крови. Было проведено своеобразное «титрование» сыворотки экзогенными цитокинами, главная идея которого заключалась в том, чтобы обнаружить предел насыщения растворимых рецепторов цитокинами в заданном объеме сыворотки. При этом цитокины по возможности заведомо брались в концентрациях, превышающих физиологические значения и в десятки раз превышающие минимально определяемые уровни по методу ИФА, что исключает возможность ошибки определения цитокинов при добавлении образцов.

Было установлено, что у больных, погибших от сепсиса, при исходных повышенных уровнях 1Ь-6 связывающая способность сыворотки по отношению к этому цитокину отсутствовала. Отсутствие способности сыворотки крови связывать цитокины является неблагоприятным прогностическим признаком, так как выброс клетками даже минимального количества цитокинов приводит к возможности проявления его биологической активности не только в месте образования цитокина, но и на всем пути его распространения по организму с генерализованным ответом на данный цитокин, что представляет большую опасность для жизни больного. Поэтому важно, что связывающая способность сыворотки восстанавливается после проведения гемофильтрации. Вероятнее всего этот факт может объясняться удалением избытка цитокинов, которые были связаны с рецепторами и циркулировали в кровотоке в виде цитокин/рецепторных комплексов, а при проведении ЭКД такие комплексы диссоциировали на мембранах фильтров с высвобождением цитокинов, элиминируемых в ультрафильтрат, и свободных рецепторов.

Обсуждение.

До настоящего времени проводилось много исследований, в которых были предприняты безуспешные попытки найти корреляцию между уровнем различных цитокинов и тяжестью состояния больного сепсисом. Отсутствие результатов в таких поисках можно объяснить тем, что исследователи не учитывали факт возможности связывания цитокинов различными рецепторами. Поэтому проведенное нами исследование по титрованию образцов сыворотки крови экзогенными цитокинами является более адекватным по следующим критериям: 1)такое исследование можно назвать функциональным, т.е. в результате него можно сделать вывод о способности образца выдержать нагрузку в результате выброса цитокинов у больного; 2)такое исследование учитывает индивидуальные особенности больного, концентрацию рецепторов, их аффинность и авидность. Поэтому, с нашей точки зрения, более информативным является связывающая способность сыворотки при титровании экзогенным цитокином при выражении результата в количестве связанного цитокина на 1 мкл сыворотки крови. Использование этих данных позволило нам выделять группу крайне тяжелых больных, у которых сывороточная система блокировки цитокинов уже истощена. У этих больных, как было показано, добавление экзогенного цитокина к сыворотке крови не блокируется сывороточными рецепторами к данным цитокинам, а сопровождается изменением концентрации при проведении иммунофементного анализа ровно на те значения количества цитокина, которые были добавлены в сыворотку. Клинический прогноз этих больных был неблагоприятным. Другая важная для практической медицины проблема, изученная в настоящей работе, связана с потерей белков сыворотки крови при ЭКД. Принято считать, что при гемофильтрации через фильтр способны проникать лишь белки с молекулярной массой менее 50 кДа. Однако, количество удаляемого белка

зависит не только от молекулярного веса, но и от пространственной структуры молекулы, от тканевого и клеточного связывания. Следует учитывать также, что у онкологических больных происходят изменения в гликозилировании, и это может приводить к изменению пространственной укладки белковых молекул. В нашем исследовании из ультрафильтрата были выделены и идентифицированы белки с молекулярной массой свыше 50 кДа, такие как альбумин (69 кДа), трансферрин (77 кДа), причем их потеря на процедуру в абсолютном значении составила в среднем 160 и 55 мг на 10 л фильтрата соответственно. Но, с нашей точки зрения, потеря таких белков хоть и нежелательна для организма, но, учитывая их общее количество в сыворотке крови, может представлять не такую опасность, как потеря минорных белков. Ретинол-связывающий белок, содержание которого в организме составляет всего 3-6 мг/100 мл крови, а элиминация его за одну процедуру составляет около 50 мг на 10 л фильтрата или более 80% от его общего содержания в сыворотке крови. . Потеря минорного белка в данном случае означает нарушение или даже блокировку метаболизма ретинола в организме. Очевидно, что последствия таких потерь этого и других минорных белков сыворотки крови после ЭКД могут являться темой для дальнейших исследований.

Выводы

1. При проведении экстракорпоральной детоксикации (гемодиализа, гемофильтрации и гемодиафильтрации) из сыворотки крови удаляются молекулы с молекулярным весом до 90 кДа. Среди элиминируемых во время гемофильтрации и гемодиафильтрации белков обнаружены: Р2-микроглобулин; ретинол-связывающий белок; вариабельный домен к-легких цепей иммуноглобулинов; а 1-антитрипсин; сывороточный альбумин; трансферрин.

2. За одну процедуру гемофильтрации в среднем удаляется 552 мг белков сыворотки крови. Потеря отдельных минорных белков (ретинол-

связывающего белка) может составлять до 80% за одну процедуру от его общего содержания в сыворотке крови.

3. При проведении частых (более трех) и длительных процедур высокообъемной гемофильтрации и гемодиафильтрации наблюдается отсутствие минорных белков сыворотки крови в ультрафильтрате, что, возможно, указывает на истощение сывороточных уровней ретинол-связывающего белка; альбумина; трансферрина.

4. Использование экстракорпоральных методов детоксикации позволяет эффективно элиминировать провоспалительные цитокины из системного кровотока. Обнаружена элиминация ЮТа, 1Ь-1Р, 1Ь-6 и 1Ь-2 в ультрафильтрат. Сывороточные концентрации Т№а, 1Ь-1р, 1Ь-6 и 1Ь-2 повышены в группе послеоперационных онкологических больных с сепсисом в отличие от группы больных с изолированной почечной недостаточностью. Уровни ТЫРа и 1Ь-2 также достоверно повышены в группе больных с множественной миеломой.

5. Связывающая способность сыворотки крови здоровых доноров и больных по отношению к провоспалительным цитокинам достоверно различается. Проведение высокообъемных процедур гемофильтрации и гемодиафильтрации способствует восстановлению связывающей способности сывороточных цитокиновых рецепторов онкологических больных с сепсисом.

Список работ

1. А.Р.Тугуз, Е.Г.Громова, И.В.Нехаев, Н.В. Малахова, С.П.Свиридова, У.С.Горобец, Ю.В.Буйденок, Д.В. Данилина (Вохминова). Прогностическое значение уровня сывороточных цитокинов в развитии послеоперационных осложнений у онкологических больных. // Современные подходы к диагностике и лечению злокачественных новообразований. Тезисы докладов научно-практической конференции 7 декабря 2000. Москва. ГВКГ. Им. Н.Н. Бурденко.; 2000: 54-55

2. А.Р. Тугуз, Д.В. Данилина (Вохминова), Е.Г. Громова, В.Н. Блиндарь, М.В. Киселевский. Спонтанная и стимулированная интерлейкином-2 и гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором продукция цитокинов нейтрофильными гранулоцитами здоровых доноров // Иммунология.; 2002; 3: 156-158.

3. Д.В. Вохминова, Ф.В. Доненко, Е.Г. Громова, И.А. Курмуков. Динамика связывания цитокинов сывороточными белками и возможный клинический прогноз // Актуальные проблемы онкологии и канцерогенеза - материалы межрегиональной конференции.; Якутия. 2005., Июнь., прил. 1.: 225-227.

4. Е.Г. Громова, Д.В. Вохминова, Ф.В. Доненко, И.А. Курмуков, JI.C. Кузнецова, М.В. Киселевский. Качественная и количественная оценка белков, удаляемых при проведении гемофильтрации онкологическим больным с сепсисом // Тезисы докладов V международной конференции «Актуальные аспекты экстракорпорального очищения крови».; Москва., 2006., 25 - 26 Мая.: 110.

5. Д.В. Вохминова, Ф.В. Доненко, Е.Г. Громова. Элиминация цитокинов и других белков плазмы крови при проведении гемофильтрации онкологическим больным с сепсисом // Материалы международного конгресса «Иммунитет и болезни: от теории к терапии».; Москва, 2005. 3 -8 Окт.: 169.

6., Д.В. Вохминова, Е.Г. Громова, Ф.В. Доненко, М.В. Киселевский, И.А. Курмуков, Л.С. Кузнецова. Оценка элиминации цитокинов и других белковых фракций при проведении гемофильтрации онкологическим больным с сепсисом // Сопроводительная терапия в онкологии.; 2006., Т. 2.: 34 - 40.

7. Д.В. Вохминова, Е.Г.Громова, Ф.В. Доненко, М.В. Киселевский, Э.А.Курмуков. Элиминация крупномолекулярных фракций при проведении вено-венозной гемофильтрации онкологическим больным сепсисом// Вестник интенсивной терапии, 2006.-NO.1.-C.-3-6.

8. E.G.Gromova, I.A.Kurmukov, L.S.Kusnetsova, M.V.Kiselevsky, F.V.Donenko, D.V.Vokhminova. Continuous very high dose hemofiltration in the treatment of sepsis in ICU cancer patients: a prospective evaluation // 4-th Symposium Extra-Renal Therapy in Intensive Care. Nice, France.; 2005., 24-25 Nov.: 117.

9. D.V.Vokhminova. Intermitting veno-venous hemofiltration of cancer patients with sepsis eliminates high molecular protein fractions // Abstract book of UICC world cancer congress. Washington.; 2006., 8-12 Jul.: 9-21.

Подписано в печать 4,0^.07 г- Формат 60x84/16. Тираж 100 экз. Заказ №"12.1 Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ РАМН им. H.H. Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

В настоящее время одной из наиболее актуальных проблем современной медицины является сепсис, летальность при котором, несмотря на интенсивную терапию, достигает 40-90% [30,70,102] в зависимости от этиологических причин и степени органных нарушений [44]. В онкологических клиниках проблема сепсиса особенно значима, так как присущие опухолевому процессу нарушения различных звеньев гомеостаза усугубляются инвазивными диагностическими исследованиями, лучевой и химиотерапией, применением больших доз глюкокортикоидов [97,100]. Современные тенденции хирургического лечения онкологических больных, характеризующиеся расширением объема и зон оперативных вмешательств [20], сопровождаются высоким риском развития послеоперационных осложнений. Частота и тяжесть гнойно-септических осложнений неуклонно растет, несмотря на технические достижения в интенсивной терапии и поддерживающее лечение [1,2,3,4,7,12]. Лечение септических пациентов было и остается таким же сложным, как и увеличение степени выживаемости, а так же ясное клиническое определение картины сепсиса.

Неэффективность стандартного комплекса интенсивной терапии нарушений гомеостаза при сепсисе всё чаще приводит к необходимости применения экстракорпоральных методов детоксикации. В настоящее время многими исследователями показано, что одним из наиболее гемодинамически толерантных и эффективных методов интенсивной терапии сепсиса, независимо от почечной функции, является гемофильтрация [38,91,93]. Помимо адекватной коррекции азотемии [18], при гемофильтрации элиминируются также различные медиаторы воспаления. В литературе имеются многочисленные противоречия относительно качественного спектра молекул, элиминируемых в процессе 8 гемофильтрации, в зависимости от их молекулярной массы, структуры, тканевого и клеточного связывания [32,59,65]. Считается, что именно удаление провоспалительных медиаторов и ряда белков оказывает положительный эффект при лечении больных с сепсисом, так как провоспалительные цитокины и белки острой фазы играют важную роль в развитии септического шока и органной или полиорганной недостаточности [149]. В настоящее время в литературных источниках, а также в технических протоколах указывается, что при гемофильтрации элиминируются молекулы с молекулярной массой до 50 кД [162]. Однако, с другой стороны, известно, что при гемофильтрации из крови больных диабетом удаляются гликозилированные молекулы с молекулярным весом до 80 кД [82,144]. Недавние исследования, посвященные спектру белков, удаляемых при проведении длительной заместительной почечной терапии у пациентов с острой почечной недостаточностью, также обнаружили элиминацию протеинов с молекулярным весом выше 50 кД [124,136]. Факт потери молекул такого крупного размера косвенно подтверждает возможность удаления с помощью гемофильтрации медиаторов воспаления, которые имеют гораздо меньший молекулярный вес. Но, с другой стороны, этот же факт указывает на возможность потери в процессе гемофильтрации и более крупных белковых молекул, удаление которых может сказываться на общем состоянии пациента. Онкологические больные имеют ряд специфических нарушений гомеостаза, отличающихся от таковых при изолированной уремии. У ряда больных с распространенным опухолевым процессом отмечается гипопротеинемия, и потеря некоторых белковых фракций для них может быть весьма значимой, что требует уточнения для проведения компенсаторных мероприятий.

Цель работы - изучить элиминацию белковых фракций у онкологических больных с септическими осложнениями при проведении процедур экстракорпоральной детоксикации (ЭКД).

Задачи исследования:

1. Изучить спектр белковых потерь при проведении различных процедур ЭКД онкологическим больным с сепсисом.

2. Исследовать элиминацию цитокинов при проведении процедур ЭКД.

3. Оценить потенциальные возможности сыворотки крови пациентов с сепсисом по связыванию избытка цитокинов.

4. Идентифицировать элиминируемые крупномолекулярные белковые фракции.

5. Провести количественную оценку потери белков при проведении различных процедур ЭКД онкологическим больным с сепсисом.

Научно-практическая значимость

Впервые исследован спектр белков элиминируемых при гемофильтрации у онкологических больных с гнойно-септическими осложнениями.

Впервые была произведена количественная оценка белков сыворотки крови, теряемых при проведении экстракорпоральных методов детоксикации пациентам со злокачественными новообразованиями.

Впервые показано истощение сыворотки крови по минорным белкам (ретинол-связывающий белок, трансферрин, цинк-связывающий белок).

Впервые показано нарушение связывания цитокинов белками сыворотки крови и получены новые данные, характеризующие динамику элиминации цитоикинов из системного кровотока при проведении гемофильтрации.

Показано восстановление способности белков сыворотки крови связывать избыток цитокинов после проведения гемофильтрации. Показано участие провоспалительных цитокинов в развитии системной воспалительной реакции.

Полученные результаты могут быть использованы для коррекции методов экстракорпоральной детоксикации и адекватного возмещения белков сыворотки крови.

Полученные в работе результаты оптимизируют возможности практического использования метода гемофильтрации у онкологических больных с гнойно-септическими осложнениями.

Выводы

1. При проведении высокообъемных процедур гемофильтрации и гемодиафильтрации онкологическим больным с послеоперационными септическими осложнениями, происходит элиминация средне- и высокомолекулярных белков: цитокинов; р2-микроглобулина; ретинол-связывающего белка; вариабельного домена к-легких цепей иммуноглобулинов; а 1-антитрипсина; сывороточного альбумина; трансферрина. При проведении гемодиализа удаляются фракции с молекулярным весом только до 5 кД.

2. Проведение частых и длительных процедур высокообъемной ГФ и ГДФ может приводить к истощению сывороточных уровней ретинол-связывающего белка; альбумина; трансферрина.

3. Сывороточные концентрации TNFa, IL-ip, IL-6 и IL-2 повышены в группе послеоперационных онкологических больных с сепсисом в отличие от группы больных с изолированной почечной недостаточностью. Уровни TNFa и IL-2 также достоверно повышены в группе больных с множественной миеломой.

4. Использование экстракорпоральных методов детоксикации позволяет эффективно элиминировать провоспалительные цитокины из системного кровотока. Обнаружена элиминация TNFa, IL-ip, IL-6 и IL-2 в ультрафильтрат.

5. Связывающая способность сыворотки крови здоровых доноров и больных по отношению к провоспалительным цитокинам достоверно различается. Проведение высокообъемных процедур ГФ и ГДФ способствует восстановлению связывающей способности сывороточных цитокиновых рецепторов онкологических больных с сепсисом.