Автореферат и диссертация по медицине (14.01.30) на тему:Экспрессия сигнальных факторов дифференцировки фибробластов при старении и возраст-ассоциированных опухолях предстательной железы

004661374

На правах рукописи

ХЕЙФЕЦ Олег Владимирович

ЭКСПРЕССИЯ СИГНАЛЬНЫХ ФАКТОРОВ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ФИБРОБЛАСТОВ ПРИ СТАРЕНИИ ИВОЗРАСТ-АССОЦИИРОВАННЫХ ОПУХОЛЯХ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

14.01.30 - геронтология и гериатрия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 3 МАЙ 2010

Санкт-Петербург-2010

004601874

Работа выполнена в отделе клеточной биологии и патологии Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН

Научный руководитель:

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Кветной Игорь Моисеевич

Официальные оппоненты:

заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Аничков Николай Мильевич

заслуженный врач РФ,

доктор медицинских наук, профессор

Аль-Шукри Сальман Хасунович

Ведущая организация:

ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская медицинская академия после дипломного образования» ФАЗСР

Защита состоится "_" _ 2010 года в _ часов на

заседании диссертационного Совета Д 601.001.01 при Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН по адресу: 197110, Санкт-Петербург, пр. Динамо, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН (197110, Санкт-Петербург, пр. Динамо, 3).

Автореферат разослан "_"_2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, доцент

Л.С. Козина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Для конца XX - начала XXI века характерно увеличение, как абсолютной численности, так и доли лиц старшего возраста, т.е. людей, перешагнувших 60-летний рубеж в общей популяции населения земного шара [Лазебник Л.Б., 1999]. Старение населения, рассматривавшееся ранее как тенденция, характерная лишь для развитых стран, признается в настоящее время глобальным явлением. Пожилые люди старше 60 лет являются самой быстро растущей группой населения. Ожидается, что средняя продолжительность жизни в России к 2015 году достигнет 70 лет.

Однако в настоящее время большинство людей не достигает биологического предела продолжительности жизни, а период старости, как правило, связан со снижением активности и ухудшением здоровья. Следовательно, увеличение продолжительности активного долголетия является одной из наиболее важных и сложных проблем геронтологии и гериатрии [Хавинсон В.Х., Морозов В.Г., 2001], а изучение механизмов, лежащих в основе регуляции важнейших гомеостатических функций организма в процессе старения представляет собой одно из приоритетных направлений современной биологии и медицины [Хавинсон В.Х. и соавт., 2000].

Нейроиммуноэндокринная регуляция гомеостаза занимает важное место в сложной цепи процессов, приводящих к старению клеток, тканей, органов и организма в целом [Пальцев М.А., Кветной И.М., 2006, 2008]. Морфо-физиологическим эквивалентом старения является инволюция жизненно важных органов. Ведущую роль в процессах старения, развивающихся в мужском организме, играют нарушения синтеза и секреции андрогенов. Доброкачественная гиперплазия предстательной железы (ДГПЖ, аденома простаты) является наиболее часто встречающимся заболеванием мочеполовой системы у мужчин, ассоциированным со старением. Это заболевание является следствием гиперплазии стромы железы и наблюдается примерно у 75% мужчин в возрасте 70 лет и старше. Заболеваемость карциномой (раком) предстательной железы в пожилом и старческом возрасте за последние 1015 лет постоянно возрастает и по скорости прироста эта локализация опухолей, наряду с раком мочевого пузыря, занимает второе место после меланомы кожи. Среди причин смерти у мужчин раковые опухоли предстательной железы занимают второе место после рака легких [Лопаткин H.A., 1998; Франк Г.А., 1999; Аничков Н.М. и соавт., 2004].

Современные методы исследования (гистохимия, иммуногистохимия, электронная микроскопия и др.) позволяют более глубоко изучать механизмы старения клеток и тканей. Они дают возможность разработать новые неинвазивные информативные методы диагностики опухолевых

процессов, среди которых особенно важное место занимают биологические маркеры - сигнальные молекулы, синтезируемые в клетках предстательной железы.

В последние годы появились новые данные о роли микроокружения простаты, особенно фибробластов, в процессах старческой инволюции и возраст-ассоциированном онкогенезе предстательной железы [Cunha G.R. et al., 2003; Dean J.P., Nelson P.S., 2008].

Несмотря на достаточно большое количество работ, посвященных структурно-функциональной организации микроокружения простаты, функция и биологическое значение фибробластов в предстательной железе изучены недостаточно. Существует мнение, что сигнальные молекулы, вырабатываемые фибробластами необходимы для роста и дифференцировки клеток простатического эпителия, а также для регуляции локального гомеостаза секреторных процессов в зрелой предстательной железе [Bavik С. et al., 2006].

Противоречивы данные о том, что популяция фибробластов увеличивается в предстательной железе при малигнизации гиперпластического процесса [Singh S. et al., 2004]. Недостаточно изучен вопрос об изменении ультраструктуры фибробластов при старении и возраст-ассоциированных заболеваниях простаты. До сих пор остается открытым вопрос о том, могут ли нормальные (немалигнизированные) фибробласты служить локальными мишенями в предстательной железе для воздействия на них биологически активных факторов, регулирующих экспрессию факторов дифференцировки с целью профилактики и коррекции инволютивных нарушений, развивающихся в предстательной железе при старении. Эти и другие важные вопросы требуют дальнейшего изучения.

Цель и задачи исследования

Целью диссертационного исследования явилось изучение функциональной морфологии фибробластов крыс и человека при старении и возраст-ассоциированных гиперпластических процессах предстательной железы.

Для достижения поставленной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

1. изучить особенности структурно-функциональной организации фибробластов предстательной железы крыс и человека при старении;

2. верифицировать транскрипционные факторы - протеины CXCL12 и WEDC1 в фибробластах предстательной железы и изучить изменения их экспрессии при естественном и индуцированном (радиационном) старении;

3. описать изменения экспрессии протеинов СХСЫ2 и WEDC1 в фибробластах предстательной железы человека при развитии в ней гиперпластических процессов, ассоциированных со старением;

4. определить онкопрогностическую значимость экспрессии протеинов СХСЫ2 и в фибробластах предстательной железы человека при возраст-ассоциированных гиперпластических процессах;

5. изучить роль фибробластов и экспрессируемых ими транскрипционных факторов дифференцировки в регуляции пролиферативной активности эпителиальных клеток простаты;

6. оценить биологическую активность коротких пептидов Т-32, Т-38 и кардиогена на функциональную активность фибробластов как потенциальных геропротекторных препаратов.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые проведено детальное исследование структурно-функциональной организации основных клеток микроокружения предстательной железы - фибробластов при естественном старении у человека и при моделировании старения у крыс. Изучена функциональная морфология фибробластов при развитии в предстательной железе человека гиперпластических процессов, ассоциированных со старением — ДГПЖ и карциномы. Показано, что среди всей популяции фибробластов предстательной железы человека и крыс наиболее распространены клетки, экспрессирующие транскрипционные факторы дифференцировки -протеины \VEDC1 и СХСЫ2. Установлено, что ультраструктура \УЕВС1/СХСЫ2 - экспрессирующих фибробластов отражает их высокую функциональную активность в процессе всего онтогенеза простаты, что дает основание предполагать активное влияние транскрипционных факторов, экспрессируемых фибробластами, на развитие инволюционных процессов в предстательной железе. Показано достоверное снижение экспрессии протеинов СХСЫ2 и в фибробластах предстательной

железы человека при естественном старении, что свидетельствует о недостаточной сигнальной регуляции функции предстательной железы в пожилом и старческом возрасте.

Впервые установлено, что при развитии в предстательной железе гиперпластических процессов, ассоциированных со старением, происходит достоверное изменение экспрессии транскрипционных факторов фибробластов, которое характеризуется различной динамикой при ДГПЖ и карциноме.

Установлено, что синтетические короткие пептиды Т-32, Т-38 и кардиоген обладают способностью активно усиливать экспрессию протеинов СХСЫ2 и \VEDC1, синтез которых достоверно снижается в стареющих культурах фибробластов предстательной железы. Показано, что параллельно с усилением экспрессии сигнальных факторов

дифференцировки фибробластов в монокультурах при их старении, пептиды Т-32, Т-38 и кардиоген значительно усиливают пролиферативную активность эпителиальных клеток простаты, ко-культивированных с фибробластами и поднимают ее практически до уровня, свойственного молодым культивируемым клеткам.

Полученные данные позволяют считать, что фибробласты простаты, являясь основными клетками ее микроокружения, принимают активное участие в паракринных механизмах регуляции развития гиперпластических процессов в предстательной железе, ассоциированных со старением, через изменение экспрессии ключевых факторов их дифференцировки - протеинов СХСЫ2 и .

Основные положения, выносимые на защиту

1. Среди всей популяции фибробластов предстательной железы человека и крыс наиболее распространены клетки, экспрессирующие транскрипционные факторы дифференцировки - протеины \VEDC1 и СХСЫ2. Ультраструктура WEDC1/CXCL12 - экспрессирующих фибробластов отражает их высокую функциональную активность в процессе всего онтогенеза простаты.

2. При преждевременном (радиационном) старении у крыс отмечается дезорганизация органоидов фибробластов с сохранением секреторными гранулами достаточной морфологической стабильности, что отражает активное влияние транскрипционных факторов, экспрессируемых фибробластами, на развитие инволюционных процессов в предстательной железе.

3. При естественном старении в фибробластах предстательной железы человека происходит достоверное снижение экспрессии транскрипционных факторов дифференцировки - протеинов СХСЫ2 и \VEDC1, что существенным образом негативно сказывается на сигнальной регуляции функции предстательной железы в пожилом и старческом возрасте.

4. При развитии в предстательной железе гиперпластических процессов, ассоциированных со старением, происходит достоверное изменение экспрессии транскрипционных факторов фибробластов, которое характеризуется различной динамикой при ДГПЖ и карциноме.

5. Короткие пептиды Т-32, Т-38 и кардиоген обладают способностью активно усиливать экспрессию протеинов СХСЫ2 и \VEDC1, синтез которых достоверно снижается в стареющих культурах фибробластов предстательной железы, что приводит к усилению пролиферативной активности эпителиальных клеток простаты, ко-культивированных с фибробластами.

6. Фибробласты простаты, являясь основными клетками ее микроокружения, принимают активное участие в паракринных механизмах регуляции развития гиперпластических процессов в

предстательной железе, ассоциированных со старением, через изменение экспрессии ключевых факторов их дифференцировки -протеинов СХС1Л2и\¥ЕОС1.

Апробация и реализация результатов исследования Материалы диссертации доложены и обсуждены на XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2008), мемориальной конференции патологов, посвященной памяти члена-корреспондента РАМН Ю.Л. Перова (Москва, 2009), Российско-белорусском симпозиуме «Роль коммуникационных систем в развитии опухолей» (Смоленск, 2009), межобластной геронтологической конференции (Белгород, 2009), Межрегиональной научно-практической конференции «Медицинские проблемы пожилых» (Йошкар-Ола, 2009), V научно-практической геронтологической конференции с международным участием «Пушковские чтения» (2009).

Результаты исследований используются в научно-педагогической и практической деятельности Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН, клиники «Оркли» (Санкт-Петербург), медицинском факультете Белгородского государственного университета.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 1 статья в журнале по перечню ВАК, 2 статьи в сборниках и 5 тезисов.

Связь с научно-исследовательской работой Института

Диссертационная работа является научной темой, выполняемой по основному плану НИР Санкт-Петербургского института биоретуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Струкпура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с изложением материала и методов исследования, 3 глав собственных исследований, главы обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Работа иллюстрирована 30 рисунками и содержит 4 таблицы. Текст диссертации изложен на 144 страницах. Список литературы содержит 277 источников (25 отечественных и 252 зарубежных).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал н методы исследования Моделирование преждевременного старения животных. Данная серия исследований выполнена на 40 самцах белых крыс линии Вистар (масса тела 120-130 г.), из которых 16 животных составили контрольную

группу. В опытной группе крысы (24 особи) подвергались однократному облучению (радиационное моделирование преждевременного старения). Для моделирования изменений, сходных с процессами, возникающими в ходе старения, проводили общее однократное гамма-облучение животных в дозе 6 Гр на кобальтовом аппарате «ГУБ 20000» при мощности дозы 200 рад/мин. Гамма-облучение проводилось с помощью установки «Эксперимент» (источник 137Cs; мощность поглощенной дозы в прямом пучке 5,32 мГр/час). Облучение и взятие экспериментального материала проводилось в лаборатории радиационной патоморфологии МРНЦ РАМН (г. Обнинск), за что автор выражает глубокую благодарность доктору мед. наук В.В. Попучиеву и канд. мед. наук. В.В. Южакову. После облучения животные были переведены в виварий и содержались в тех же условиях, как крысы контрольной группы. Через 7 суток после облучения у крыс опытной и контрольной групп после декапитации была взята предстательная железа для исследования.

Изучение предстательной железы у человека. Для исследования предстательной железы человека был использован биопсийный и операционный материал, полученный в клинической больнице №122 им. Л.Г. Соколова и городской больнице № 3 Св. Георгия (Санкт-Петербург) у 48 больных с ДГПЖ и у 32 больных карциномой простаты. В контрольной группе исследовался аутопсийный материал (предстательная железа), полученный в Ленинградском областном судебно-медицинском бюро у 22 погибших мужчин от разных причин без патологии предстательной железы.

Средний возраст лиц, у которых были взяты биопсийный или аутопсийный материал в контрольной группе составил 34,1 года, у больных с ДГПЖ - 66,4 года (варьировал от 50 до 74 лет) и у больных с карциномой - 66,3 года (варьировал от 58 до 84 лет). Объем опухоли варьировал от 1,5 мм до 10,6 мм, в среднем составлял 6,1 мм.

Уровень сывороточного PSA (по данным анализов из историй болезней) перед оперативным лечением у пациентов с карциномой в среднем составил 9,35 нг/ мл (варьировал от 1,6 до 20,84) и у пациентов с ДГПЖ - 6,08 нг/ мл (варьировал от 0,69 до 15,68).

Гистологические и иммуногистохимические методы. Кусочки предстательной железы объемом 1 см3 фиксировали в 10% нейтральном формалине (рН 7,2), обезвоживали и заливали в парафин. В качестве обзорной окраски использовали гематоксилин и эозин. При исследовании опухолей предстательной железы использовали метод тканевых матриц. Иммуногистохимическое исследование проводили с использованием первичных моноклональных антител к протеинам CXCL12 и WEDC1 (1:100, Torrey Pines Biolabs). В качестве вторых антител использовали универсальный набор, содержащий биотинилированные анти-мышиные и анти-кроличьи иммуноглобулины. Визуализацию окрасок проводили с применением комплекса авидина с биотинюшрованной пероксидазой

(ABC-kit, Novocastra). Проявление пероксидазы проводили

диаминобензидином (Dako).

Морфометрические исследования. Морфометрические исследования проводили с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящей из микроскопа Nikon Eclipse Е400, цифровой камеры Nikon DXM1200, персонального компьютера на базе Intel Pentium 4 и программного обеспечения «Видеотест-Морфология 5.0». В каждом случае анализировали 10 полей зрения при увеличении *400. Среднее количество иммунопозитивных клеток определяемое при увеличении х200 рассчитывали на 1 мм2 площади среза. Оптическую плотность экспрессии сигнальных молекул измеряли в условных единицах. Также определяли площадь экспрессии (которая представляла собой отношение площади иммунопозитивных клеток к общей площади всех клеток), выражаемое в процентах.

Изучение эффектов действия пептидов на культивируемые фибробласты предстательной железы человека. Исследования проводились на культуре фибробластов предстательной железы человека (клон CX3CR1, Cambrex Bioscience), прошедших 1, 4 и 7 пассажей. Культуры клеток, прошедшие 1 пассаж расценивали как молодые, 4 пассажа - как зрелые, 7 пассажей - как старые культуры. В качестве эпителиальных клеток использовали клетки предстательной железы человека линии 2NIPC-3 (Cambrex Bioscience). Фибробласты и эпителиальные клетки культивировали в 24-луночных планшетах (Costar) при температуре 37°С в атмосфере с 5% СОг в среде RPMI 1640 (Flow) с добавлением 10 % сыворотки эмбрионов теленка (Sigma), L-глутамина (300 мкг/мл; Flow), HEPES-буфера (0,02 M; Serva) и гентамицина (100 мкг/мл; Фармахим). Исходная концентрация составляла 106 клеток/мл. Каждая проба ставилась в двух повторностях.

Эпителиальные клетки культивировали в монокультурах и в ко-культурах с фибробластами (соотношение 5:1). Короткие пептиды Т-32 (Glu-Asp-Ala), Т-38 (Lys-Glu-Asp) и кардиоген (Ala-Glu-Asp-Arg) вводили в культуры в дозе 10 дМ однократно, и клетки забирали на исследование через 1 час после введения пептидов.

Иммуно флуоресцентную конфокальную микроскопию (ИКФМ) проводили на нефиксированных суспензиях клеток. Мазки клеток обрабатывались первичными моноклональными антителами (Torrey Pines Biolabs) к протеинам CXCL12 (1:200), WEDC1 (1:150), и грелину (1:100). Визуализация экспрессии указанных сигнальных молекул проводилась с использованием наборов для иммунофлуоресцентной визуализации щелочной фосфатазы Vector Red (Vector Lab). Левамизол (1.25 mM) добавлялся при инкубации со щелочной фосфатазой набора для блокады эндогенной активности фермента.

Изучение препаратов проводили в конфокальном микроскопе Leica TCS SP5 при увеличении х400 и хЮОО с использованием системы MRC-

1024, укомплектованной программой компьютерной обработки конфокальных микроскопических изображений для построения трехмерных изображений LaserSharp 5.0 (Bio-Rad). В каждом случае анализировали 10 полей зрения при увеличении х400.

Оптическую плотность экспрессии измеряли в условных единицах. Также определяли площадь экспрессии, которая представляла собой отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения, выражаемое в процентах.

Электронно-микроскопическое исследование. Образцы ткани предстательной железы нарезали на кусочки размером 1 мм3 в капле глютаральдегида (2,5%). Для фиксации использовали смесь Карновского. Для получения полутонких и ультратонких срезов использовали ультрамикротом LKB-7A (LKB) и изготовитель ножей KMF - MARKER LKB-91 (LKB). Срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу. Электронно-микроскопические исследования проводились на электронном микроскопе JEM - 100S (JEOL) в трансмиссионном режиме. Фотосъемка проводилась встроенной фотокамерой при автоматическом экспонировании с маркировкой на фотопластинках увеличения и номера кадра.

Статистическая обработка результатов. Результаты морфометрических исследований обрабатывали с помощью компьютерных программ EXCEL и STATISTICA 5.0 (Statsoft). Для оценки межгрупповых различий (сравнение средних значений) применяли t-критерий Стьюдента. Взаимозависимость уровня экспрессии сигнальных молекул и возраста устанавливали при помощи корреляционного анализа.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспрессия сигнальных факторов дифференцировки фибробластов предстательной железы крыс в радиационной модели преждевременного старения Контрольная группа. У интактных крыс молодого возраста фибробласты, экспрессирующие протеины WEDC1/CXCL12, верифицируются в строме по всей железе и равномерно представлены во всех ее отделах. Фибробласты чаще всего имели грушевидную форму, реже определялись цилиндрические и треугольные клетки. Ядра клеток были сферическими, нежная хроматиновая сеть наиболее была выражена по периферии ядра в виде тонкого слоя. CXCL12/WEDC1 продуцирующие фибробласты, в основном, располагались в строме базальных отделов железы среди желез, выстланных эпителиальными клетками поодиночке или в виде скоплений из 5-7 клеток.

При электронно-микроскопическом исследовании

в WEDC1/CXCL12 - экспрессирующих фибробластах выявляется округлое или овальное ядро с небольшим ядрышком. В цитоплазме обнаруживается

большое количество свободных рибосом. Шероховатый эндоплазматический ретикулум и митохондрии развиты хорошо. Пластинчатый комплекс (аппарат Гольджи) представлен скоплениями коротких трубочек и пузырьков. В цитоплазме присутствуют секреторные гранулы, являющиеся местом депонирования коллагена и белков цитоскелета.

Проведенные исследования показали, что общая популяция фибробластов в нормальной предстательной железе у крыс контрольной группы, достигших половозрелого возраста, была довольно многочисленной. Общее число CXCL12/WEDC1 - экспрессирующих фибробластов в этом возрасте составляло 320±41 клеток на 1 мм2.

Подопытная группа (модель преждевременного старения). В простате у крыс при моделировании преждевременного старения CXCL12/WEDC1 - экспрессирующие фибробласты встречались реже, чем в контрольной группе. У животных опытной группы через 7 дней после однократного облучения при электронно-микроскопическом исследовании в фибробластах выявлялось округлое или овальное крупное ядро, иногда видоизмененной формы с изрезанными контурами кариолеммы. В цитоплазме отмечалась вакуолизация, наблюдалось присутствие единичных лизосом и липофусциновых включений. Шероховатый и гладкий эндоплазматический ретикулум четко контурировался, часто с заметным расширением цистерн, пластинчатый комплекс был функционально активен и гиперплазирован. В цитоплазме присутствовало различное количество полиморфных секреторных гранул. Митохондрии были набухшие, с дезорганизацией крист, иногда причудливой формы, встречалось много свободных рибосом и полисом.

400

350

о

Юо

feo

О

200

о

$50

loo о

* - р<0,05 по сравнению с контрольным показателем.

Рис. 1. Динамика изменения количества фибробластов предстательной железы крыс при радиационном старении.

Популяция фибробластов в предстательной железе у подопытных крыс через 7 дней после однократного облучения (модель преждевременного старения) сохраняла общую структуру, выявленную у

ÍT—■i- ¡вfif ■¡¡¡¡¡¡¡¡¡я *

lie

Siilliie жШШЯШш

Контрольная группа Подопытная группа

Ш CXCL12/WEDC1 -экспрессирующие фибробласты

животных контрольной группы. При этом имело место достоверное снижение общего числа СХСЬ12Л¥ЕОС1 - экспрессирующих фибробластов (рис. 1).

Фибробласты предстательной железы человека при возрастных гиперпластических процессах Контрольная группа. В контрольной группе в фибробластах предстательной железы была отмечена выраженная экспрессия исследуемых маркеров: \УЕОС1 и СХСЫ2 (рис. 2).

| ЕШЕРС1_РСХС1_12 . ] возрастные группы

* - р<0,05 по сравнению с экспрессией маркера WEDC1 в группе 25-29 лет.

Рис. 2. Площадь экспрессии протеинов \\Т1ЮС1/СХС1Л2 в фибробластах предстательной железы людей различных возрастных групп (контроль).

Площадь экспрессии \VEDC1 достоверно снижалась с увеличением возраста. Так у молодых пациентов величина площади экспрессии ^УЕОС1 составила 5,34±0,03%, что в 4 раза больше, чем в группе 60-69 лет (1,35±0,04), а площадь экспрессии СХСЫ2 была равна 4,48±0,02 (р<0,05). С увеличением возраста площадь экспрессии СХСЫ2 и "УУЕОСЛ уменьшается. Между возрастом пациентов и значениями площади экспрессии \VEDC1 выявлена положительная корреляция (к=0,06).

Оптическая плотность в фибробластах, экспрессирующих \VEDC 1 и СХСЫ2, достигает максимального значения в группе 25-29 лет (0,34±0,01 у.е. и 0,31±0,02 у.е. соответственно); у пациентов пожилого возраста, наблюдается достоверное снижение этого показателя (рис. 3).

Фибробласты в предстательной железе человека при опухолевых

процессах

Доброкачественная гиперплазия предстательной железы (ДГПЖ). Опухолевые узлы в большинстве случаев имеют аденоматозную структуру и построены из тесно расположенных ветвистых желез причудливой формы, образующих многочисленные крипты и сосочковые выросты. Железы выстланы 1-2 слоями клеток высокого призматического эпителия, в области сосочков количество слоев увеличивается. В просвете

желез выявляется густой секрет, немногочисленные амилоидные тельца, слущенные эпителиальные клетки, макрофаги, скопления лейкоцитов.

0,4

0,35 0,3 ¡5 0,25 -

I 0,2 -

§ _ 0,15 -

| I 0,1 -

| 0,05 -1 0 -

{¡Р

25-29

30-39

ЕШЕОС1

ш

* -4- * гЬ

ш шй

!|

.

ЛНу

40-49

Ц;-

□ СХС1.12

50-59 60-69

возрастные группы

* - р<0,05 по сравнению с экспрессией \VEDC1/ СХСЫ2 в группе 25-29 лет.

Рис. 3. Оптическая плотность экспрессии \¥ЕБС1/СХС1Л2 в предстательной железе людей различных возрастных групп (контроль).

Полученные данные свидетельствуют о достоверном снижении экспрессии СХСЫ2 и ШЮС1 в фибробластах предстательной железы человека с увеличением возраста.

Часть желез умеренно кистозно расширена. Значительно реже встречаются «фиброзно-аденоматозные» узлы, построенные из немногочисленных редко разбросанных трубочек выстланных кубическим или низким призматическим эпителием с хорошо очерченными границами, слабо заметной цитоплазмой и довольно крупным ядром. Вокруг эпителиальных трубочек нередко встречались пролифераты миоэпителиальных клеток, образующих подушковидные выпячивания, симулирующие пролиферацию эпителия. Строма узлов богата вытянутыми клетками типа фибробластов, образующих беспорядочно расположенные пучки и кольцевидные структуры. Фиброзно-мышечные узлы наблюдались почти во всех случаях, наряду с узлами железистого и смешанного строения. Они, как правило, множественные, редко превышают 1-2 см в диаметре, чаще бывают микроскопических размеров.

При электронно-микроскопическом исследовании существенные различия в ультраструктуре эпителиальных клеток ДГПЖ и нормальной железы практически отсутствуют. При иммуногистохимическом исследовании установлено, что площадь экспрессии \VEDC1 в ДГПЖ

снижается при увеличении возраста пациентов, в то время как площадь экспрессии СХСЫ2 с возрастом увеличивается (рис. 4).

в

2 1 О

группы

* - р<0,05 по сравнению с показателем группы 50-59 лет.

Рис. 4. Доброкачественная гиперплазия предстательной железы. Площадь экспрессии \VEDC 1 /СХСЬ12 в различных возрастных группах.

Величина площади экспрессии '\\'ЬЮС1 в ДГПЖ составила 4,32±0,01% у 50-59-летних пациентов, что в 2 раза больше чем у пациентов в группе 60-69 лет, а для СХСЬ 12 она была равна 4,34 в группе 50-59 лет (р<0,05). С увеличением возраста оптическая плотность экспрессии СХСЬ 12 (рис. 5), увеличивается, особенно у пациентов ДГПЖ в возрасте 70 лет и старше (5,36±0,02).

Карцинома предстательной железы. Все случаи карцином простаты по гистологическому строению были представлены аденокарциномами. Микроструктура аденокарцином предстательной железы в исследованных случаях характеризовалась полиморфизмом. В одной и той же опухоли обычно обнаруживалась различная дифференцировка раковых клеток. В отличие от ДГПЖ отмечался гиперхроматоз ядер, клеточный полиморфизм, исчезновение соединительнотканных сосочков в просвете желез.

При ультраструктурном исследовании в карциноме, независимо от степени ее дифференцировки, во всех случаях присутствовало три типа клеток. Клетки 1 типа содержали бледное крупное округлое ядро и узкий слой светлой цитоплазмы с немногочисленными органеллами, которые напоминают малодифференцированные базалы-ше элементы предстательной железы; клетки 2 типа имели темное полиморфное ядро и широкий слой темной цитоплазмы, содержащей многочисленные органеллы, в том числе секреторные вакуоли; клетки 3 типа характеризовались темным пикнотичным ядром и широким слоем вакуолизированной цитоплазмы, вероятно, представляя собой гиперсекретирующие и дегенеративные формы опухолевых клеток.

* Т |—ЗЬ"

л.

'•'А^ЧчЙ

■ -гФ-

шшш *

Щш

' - Ш?'

тшоы

□ СХСИ2

70 и старше

возрастные

0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0

1 рЬ

1 *

Ш5 г *

Ч'-^ШШ 8ЙЙ5588

ШШ8 ЙйШЙЙ

щ!§ г.

щр: •

шшш кЙй®

50-59

60-69

ШУУЕРС1

□ СХСИ2

70 и старше

возрастные группы

* - р<0,05 по сравнению с показателем группы 50-59 лет.

Рис. 5. Оптическая плотность экспрессии \УЕБС1/СХСЫ2 в предстательной железе у пациентов различных возрастных групп при ДГПЖ.

Также встречались переходные формы между всеми этими типами клеток. При этом некоторые опухолевые клетки настолько хорошо дифференцированы, что по своей ультраструктурной характеристике практически неотличимы от нормального эпителия предстательной железы.

Во всех случаях карцином были обнаружены СХСЬ12Л\ТЮС 1 -продуцирующие фибробласты. Обширные и множественные скопления фибробластов в основном обнаруживались в высокодифференцированных опухолях. При этом опухолевые фибробласты не демонстрировали признаков пролиферативной активности.

Площадь экспрессии \VEDC1 в карциномах достоверно снижалась с увеличением возраста (р<0,05), в то время как для СХСЫ2 отмечалось увеличение соответствующих показателей (2,33±0,02). У пациентов 50-59 лет величина площади экспрессии \¥ЕОС1 составила 3,34±0,01%, в группе 60-69 лет она была равна 3,28±0,02%, а для СХСЫ2 она составила 2,02±0,01% (рис. 6).

Оптическая плотность '№ТЮС1 достигает максимального значения в группе 50-59 лет (0,35±0,01 у.е.), у СХСЫ2 наблюдается обратная тенденция (0,43±0,02 у.е.) (рис. 7).

50-59

Ш \Л?ЕОС1

60-69

□ CXCL12

70 и старше

возрастные группы

* - р<0,05 по сравнению с показателем группы 50-59 лет.

Рис. 6. Карцинома простаты. Площадь экспрессии \УЕОС1/СХСЫ2 в предстательной железе у пациентов различных возрастных групп.

50-59

Ш1Л/ЕОС1

60-69

□ СХС1_12

70 и старшие

возрастные группы

* - р<0,05 по сравнению с показателем группы 50-59 лет.

Рис. 7. Карцинома предстательной железы. Оптическая плотность экспрессии \УЕБС1/СХСЫ2 в различных возрастных группах.

Таким образом, проведенные иммуногистохимические исследования показали, что в раковых опухолях предстательной железы содержатся опухолевые фибробласты, ответственные за синтез СХСЫ2 и '\¥ЕБС1.

Сравнение экспрессии изученных транскрипционных протеинов в ткани нормальной предстательной железы, ДГПЖ и карциноме выявили различия, представленные в табл. 1,2.

Таблица 1

Экспрессия \VEDC1 в предстательной железе у здоровых мужчин, при доброкачественной гиперплазии и карциноме

Группы мужчин Количество пациентов в группе Экспрессия \VEDC1

в пределах нормы повышена

абс.ч. % абс.ч. %

контроль 22 20 90,9 2 9,1

ДГПЖ 48 42 87,5 6 12,5

карцинома 32 13 40,6 19' 59,4"

* - р<0,05 по сравнению с количеством пациентов с неизмененным показателем.

Из представленных в таблице 1 данных следует, что в исследуемых образцах предстательной железы экспрессия \VEDC1 в интактной железе была в пределах нормы чаще, чем в аденокарциноме. При этом не наблюдались различия в экспрессии \VEDC1 в аденокарциноме и в интактной железе в 33% образцов, а в 59% образцах экспрессия \VEDC1 в аденокарциноме была выше, чем в интактной железе. Разница в продукции ■\УЕБС1 в аденокарциноме по сравнению с интактной железой была статистически достоверна (р<0,05).

Такое же наблюдение экспрессии было характерно и для СХСЫ2, что представлено в таблице 2.

Таблица 2

Экспрессия СХСЫ2 предстательной железой у здоровых мужчин, при доброкачественной гиперплазии и карциноме

Группы Всего Экспрессия СХСЫ2

мужчин в пределах нормы повышена

абс.ч. % абс.ч. %

контроль 22 21 95,5 1 4,5

ДГПЖ 48 45 93,7 3 6,3

карцинома 32 И 34,3 21' 65,Г

* - р<0,05 по сравнению с количеством пациентов с неизмененным показателем.

Так, в частности, в 65,7% образцов экспрессия СХСЫ2 была сильнее в аденокарциноме, чем в интактной железе. Также приблизительно в 1/3 образцов экспрессия СХС1Л2 наблюдалась в одинаковой степени, как в

17

аденокарциноме, так и в интактной железе. Было установлено, что экспрессия как ШЮС1, так СХСЫ2 была сильнее выражена в аденокарциноме, чем в ДГПЖ (р<0,05 и р<0,02 соответственно).

Таким образом, результаты проведенных исследований позволяют считать, что фибробласты простаты, являясь основными клетками ее микроокружения, принимают активное участие в паракринных механизмах регуляции развития гиперпластических процессов в предстательной железе, ассоциированных со старением, через изменение экспрессии ключевых факторов их дифференцировки - протеинов СХСЫ2 и \VEDC1.

Пептидергическая регуляция экспрессии сигнальных факторов дифференцировки фибробластов предстательной железы при клеточном старении

Применение метода конфокальной микроскопии для изучения влияния пептидов Т-32, Т-38 и кардиогена на экспрессию сигнальных факторов дифференцировки фибробластов предстательной железы, являющихся основными клетками ее микроокружения, - протеинов СХС1Л2, ,ШЮС1 и грелина при старении культур показало, что все три исследуемых пептида обладают способностью активно усиливать экспрессию вышеуказанных маркеров, синтез которых достоверно снижается в стареющих культурах (табл. 3).

При этом обращает на себя внимание тот факт, что показатели экспрессии указанных факторов в старых культурах (прошедших 7 пассажей) под действием пептидов имеют тенденцию даже превышать соответствующие показатели контроля (молодые культуры, прошедшие 1 пассаж). При этом наибольшей активностью среди изученных пептидов обладает пептид Т-38.

Известно, что экспрессия транскрипционных протеинов является ключевым механизмом регуляции функционирования эпителиальных клеток простаты [Вау1к С., й а1., 2006]. Резкое снижение уровня синтеза транскрипционных протеинов, зарегистрированное нами в фибробластах простаты человека при старении, естественно влечет и значительную редукцию эпителиальных клеток в пожилом и старческом возрасте, что приводит к возникновению локальных нейроиммуноэндокринных дисфункций, запускающих развитие гиперпластических процессов в железе.

Параллельно с усилением экспрессии сигнальных факторов дифференцировки фибробластов в монокультурах при их старении, пептиды Т-32, Т-38 и кардиоген усиливают пролиферативную активность эпителиальных клеток простаты, ко-культивированных с фибробластами. Об этом свидетельствуют показатели количества эпителиальных клеток простаты в старых культурах (прошедших 7 пассажей), которые практически приближаются к контрольным значениям (при действии пептида Т-32) и даже превышают их (при действии пептида Т-38 и

кардиогена). Наибольшей активностью в этом отношении также обладает пептид Т-38 (табл. 4).

Таблица 3

Морфометрические показатели экспрессии факторов днфференцировки фибробластов предстательной железы при действии пептидов в стареющих

культурах

количество пассажей СХС1Л2 (% площади экспрессии) \VEDC1 (% площади экспрессии) ГРЕЛИН (% площади экспрессии)

конт Т-32 Т-38 КРД конт Т-32 Т-38 КРД конт Т-32 Т-38 КРД

1 пассаж (молодые культуры) 2,22± 0,08 2,54± 0,06 2,72± 0,05* 2,17± 0,09 1,72± 0,06 1,91± 0,20 2,66± 0,09* 1,65 ±0,05 2,04 ±0,16 2,66 ±0,06* 4,13 ±0,26* 2,14 ±0,05

4 пассажа (зрелые культуры} 1,14± 0,04* 5,62± 1,05* 5,13± 1,72* 3,44± 0,21* ),70± 3,03* 3,14± 0,32* 5,73± 3,16* 1,62± 0,03* 2,15± 0,08 4,62± 0,25* 5,82± 0,64* 4,10± 0,68*

7 пассажей (старые культуры) 0,3 7± 0,01* 2,70± 0,09* 2,81± 0,20* ),84± 0,15* 0,32± 0,01* 4,51± 0,31* 5,23± 0,21* 2,52± 0,09* 2,3 6± 0,12* 4,83± 0,32* 6,23± 1,16* 4,23± 0,82*

Примечание: конт — контроль; КРД - кардиоген

*- р<0,05 по сравнению с аналогичным показателем в контрольной группе.

Таблица 4

Количество эпителиальных клеток простаты (на 1 мм2) в стареющих ко-культурах (с фибробластами) при действии пептидов

количество пассажей контроль Т-32 Т-38 кардиоген

1 пассаж {молодые культуры) 23258±1270 27389±1314* 29055±1419* 24627±1254

4 пассажа (зрелые культуры 18675±1178 28627±1228* 32163±1527* 23416±1330*

7 пассажей (старые культуры 14242±927 24225±1264* 30263±1464* 26262±1038*

*- р<0,05 по сравнению с аналогичным показателем в контрольной группе

Таким образом, проведенные исследования демонстрируют несомненную перспективность детальной разработки методов пептидергической регуляции старения и коррекции возрастных нарушений функционирования предстательной железы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенный анализ собственных исследований позволил уточнить и расширить представления о сигнальных механизмах регуляции старения предстательной железы и развития в ней возраст-ассоциированных гиперпластическиЗс процессов.

Полученные нами данные показали, что в норме имеется определенный уровень экспрессии транскрипционных факторов CXCL12, WEDC1), необходимый для нормальной функции предстательной железы у человека. Под действием определенных неблагоприятных факторов (экспериментальная модель преждевременного старения, возраст) происходит нарушение регуляторных механизмов, что приводит к снижению количества фибробластов, изменению продукции CXCL12, WEDC1, что создает благоприятные локальные условия для развития в простате ДГПЖ и карциномы.

Нами было установлено, что среди всей популяции фибробластов предстательной железы человека и крыс наиболее распространены клетки, экспрессирующие транскрипционные факторы дифференцировки -протеины WEDC1 и CXCL12. Показано, что ультраструктура WEDC1/CXCL12 - экспрессирующих фибробластов отражает их высокую функциональную активность в процессе всего онтогенеза простаты.

При преждевременном (радиационном) старении нами описана дезорганизация органоидов фибробластов, однако, при этом, секреторные гранулы в фибробластах обладают достаточной морфологической стабильностью, сохраняя типичные признаки и тинкториальные свойства при индуцированном старении, что дает основание предполагать активное влияние транскрипционных факторов, экспрессируемых фибробластами (в основном, CXCL12 и WEDC1) на развитие инволюционных процессов в предстательной железе.

Полученные данные показали, что при естественном старении в фибробластах предстательной железы человека происходит достоверное снижение экспрессии протеинов CXCL12 и WEDC1. Это свидетельствует о недостаточной сигнальной регуляции функции предстательной железы в пожилом и старческом возрасте. В последние годы получены убедительные данные о том, что CXCL12 является митогенным агентом и может регулировать пролиферативную активность эпителиальных клеток [Tutton К., Barkla D., 1987; Pakala М. et al., 1994; Iken S., et al., 1995].

Впервые установленный нами факт достоверного изменения экспрессии транскрипционных факторов фибробластов при развитии в предстательной железе гиперпластических процессов, ассоциированных со старением имеет практическое значение.

Анализ биологических свойств транскрипционных факторов, вырабатываемых клетками микроокружения простаты, позволяет предположить их важную роль в механизмах старения железы. С одной стороны, сигнальные молекулы могут выполнять роль локальных регуляторов нормального функционирования железы; с другой стороны,

эти вещества в той или иной степени принимают участие в патогенезе таких нарушений как ДГПЖ и карцинома.

Мы присоединяемся к мнению авторов [Kitajima К., Kaji Y., Fukabori У., et ai., 2010; Lee Y.C., Cheng C.J., Huang M., et al., 2010; Lum A.M., Wang B.B., Beck-Engeser G.B., et al., 2010], которые считают, что, обладая указанными свойствами, протеины CXCL12, WEDC1 могут активно влиять на развитие патологических процессов, возникающих вследствие старения как прямо, потенцируя или снижая развитие патологических процессов, так и опосредованно - через их участие в механизмах развития отдельных синдромов.

Анализ данных литературы и результатов проведенных нами исследований свидетельствует о том, что именно сигнальные молекулы микроокружения играют важную роль в механизме дисфункций, возникающих при старении.

Нами показано, что транскрипционные факторы дифференцировки фибробластов, являющихся основной клеточной популяцией микроокружения простаты, протеины CXCL12 и WEDC1 играют значительную роль в развитии гиперпластических процессов в предстательной железе.

Изменение их экспрессии при возраст-ассоциированной опухолевой патологии является неблагоприятным фактором в отношении прогноза опухолевого процесса в предстательной железы. Снижение экспрессии этих протеинов при ДГПЖ и особенно при карциноме является фактором, стимулирующим прогрессию опухолей.

Данные литературы последних лет [Cunha G.R., Hayward S.W., Wang Y.Z., et al., 2003; Dean J.P., Nelson P.S., 2008] позволяют предположить, что механизм действия протеинов WEDC1 и CXCL12 более сложен, чем простая стимуляция ими транскрипционной функции эстроген-рецепторов.

Показано, что действие WEDC1 складывается из комбинации последовательно развивающихся «ранних и поздних событий» [Powlikowski F, Wincuk A, Karasek M, 2002]. Ранние события включают трансдукцию регуляторного сигнала и реализуются через снижение экспрессии TGF-a, TGF-p, белков pS2, c-myc и c-fos. К поздним событиям относится ослабление регуляции эстроген-рецепторов с последующей модуляцией действия эстрогена, связанного с факторами роста.

Одним из наиболее интересных проявлений антиопухолевой активности WEDC1 является его способность замедлять рост опухолей через стимуляцию эффектов ряда гормонов и факторов роста [Biask D. et al., 1994]. При этом следует подчеркнуть, что в цепь событий, вовлеченных в ингибирующее действие WEDC1 на пролиферацию клеток, может быть включен и прямой эффект действия WEDC1 на опухолевые клетки.

Косвенно онкоингибирующие эффекты WEDC1 могут быть обусловлены его прооксидантными свойствами, поскольку показано, что активирующий эффект физиологических концентраций WEDC1 на

пролиферацию опухолевой культуры MCF-7 реализуется в присутствии высоких концентраций глютатиона [Heiter R. et al., 1993].

Вполне вероятны и другие возможные механизмы, которые могут быть вовлечены в онкоингибирующее действие протеинов WEDC1 и CXCL12 на опухолевые клетки. Один из них может быть связан с эффектами этих белков на организацию цитоскелета, в качестве Са1+ - кальмомодулиновош антагониста.

Другой интересный механизм, который' предстоит детально изучить — это возможные эффекты протеинов WEDC1 и CXCL12 на формирование адгезионных межклеточных связей. Большинство злокачественных опухолей имеют нарушения в адгезии клеток, связанные с дефектами в объединении клеток или с отсутствием функциональных межклеточных связей. Имеются предположения о том, что исследуемые протеины могут усиливать экспрессию молекул адгезии и, тем самым, замедлять рост опухоли [Blask D., et al., 1994].

Дальнейшее изучение механизмов, из-за которых нарушается синтез WEDC1 и CXCL12 в фибробластах предстательной железы при старении, возможно, откроет пути к разработке новых методов в терапии возраст-ассоциированной опухолевой патологии.

Кроме того, нами установлено, что короткие пептиды Т-32, Т-38 и кардиоген обладают способностью активно усиливать экспрессию протеинов CXCL12 и WEDC1, синтез которых достоверно снижается в стареющих культурах фибробластов предстательной железы.

Показано, что параллельно с усилением экспрессии сигнальных факторов дифференцировки фибробластов в монокультурах при их старении, пептиды Т-32, Т-38 и кардиоген значительно усиливают пролиферативную активность эпителиальных клеток простаты, ко-культивированных с фибробластами и поднимают ее практически до уровня, свойственного молодым культивируемым клеткам.

Таким образом, полученные данные позволяют считать, что фибробласты простаты, являясь основными клетками ее микроокружения, принимают активное участие в паракринных механизмах регуляции развития гиперпластических процессов в предстательной железе, ассоциированных со старением, через изменение экспрессии ключевых факторов их дифференцировки - протеинов CXCL12 и WEDC1.

Результаты работы позволяют рассматривать фибробласты предстательной железы в качестве потенциальных мишеней для направленной фармакотерапии, что открывает новые перспективы для детальной разработки методов пептидергической регуляции старения и коррекции возрастных нарушений функционирования предстательной железы.

выводы

1. Среди всей популяции фибробластов предстательной железы человека и крыс наиболее распространены клетки, экспрессирующие транскрипционные факторы дифференцировки - протеины "^еЬС! и СХСЫ2.

2. Ультраструктура \\ТЮС1/СХСЫ2 - экспрессирующих фибробластов отражает их высокую функциональную активность, о чем свидетельствует крупное округлое или овальное ядро с выраженным ядрышком; обилие свободных рибосом в цитоплазме, развитый шероховатый эндоплазматический ретикулум и многочисленные митохондрии; выраженная секреторная активность пластинчатого комплекса (аппарата Гольджи) и большое количество секреторных гранул, являющихся местом синтеза и депонирования коллагена и белков цитоскелега.

3. Общая популяция фибробластов в нормальной предстательной железе у крыс, достигших половозрелого возраста, является многочисленной. Среднее количество СХСЫ2/ШЮС1 экспрессирующих фибробластов составляет 320±41 клеток на 1 мм2. В простате у крыс при моделировании преждевременного старения количество СХСЬ12/\УЕБС 1 - экспрессирующих фибробластов достоверно снижается и составляет 280±34 клеток на 1 мм2.

4. При преждевременном (радиационном) старении отмечается дезорганизация органоидов фибробластов с преимущественной гиперплазией митохондрий с разрушенными кристами и просветленным матриксом. Однако, при этом, секреторные гранулы в фибробластах обладают достаточной морфологической стабильностью, сохраняя типичные признаки и тинкториальные свойства при индуцированном старении, что дает основание предполагать активное влияние транскрипционных факторв, экспрессируемых фибробластами (в основном, СХСЫ2 и WEDC1) на развитие инволюционных процессов в предстательной железе.

5. При естественном старении в фибробластах предстательной железы человека происходит достоверное снижение экспрессии протеинов СХС1Л2 и WEDC1. Так у молодых мужчин величина площади экспрессии ^ЕБС1 составила 5,34±0,03%, что в 4 раз больше чем в группе 60-69 лет. Оптическая плотность ^^ЕБС! и СХСЫ2 достигает максимального значения в группе 25-29 лет, у пациентов пожилого возраста, наблюдается достоверное снижение этого показателя. Полученные данные свидетельствуют как об общем уменьшении популяции фибробластов в предстательной железе человека в процессе старения, так и о снижении выработки транскрипционных факторов в отдельных клетках, что существенным образом негативно сказывается на сигнальной регуляции функции предстательной железы в пожилом и старческом возрасте.

6. При развитии в предстательной железе гиперпластических процессов, ассоциированных со старением, происходит достоверное изменение экспрессии транскрипционных факторов фибробластов. Так, площадь экспрессии ШЮС1 в ДГПЖ снижается, а площадь экспрессии СХС1Л2 увеличивается, особенно у пациентов ДГПЖ в возрасте 70 лет и старше. Оптическая плотность экспрессии WEDC1 достигает максимального значения у пациентов в группе 50-59 лет, а СХСЫ2 в группе 60-69 лет. У пациентов с ДГПЖ с увеличением возраста, наблюдается достоверное снижение оптической плотности WEDC1, а у СХСЫ2 она увеличивается.

7. Во всех случаях карцином простаты были обнаружены СХСЬ12А¥ЕОС1-продуцирующие фибробласты. Обширные и множественные скопления фибробластов в основном обнаруживались в высокодифференцированных опухолях. При этом опухолевые фибробласты не демонстрировали признаков пролиферативной активности. Площадь экспрессии протеина \VEDC1 в раковых опухолях достоверно снижалась с увеличением возраста, в то время как для СХСЫ2 отмечается тенденция к значительному увеличению показателей. Оптическая плотность \VEDC1 при раке простаты достигает максимального значения у пациентов в группе 50-59лет, у СХСЫ2 наблюдается обратная тенденция.

8. Сравнительная оценка экспрессии транскрипционных факторов фибробластов показала, что в исследуемых образцах предстательной железы экспрессия МТЮС1 в интактной железе была в пределах нормы чаще, чем в аденокарциноме. При этом не наблюдались различия в экспрессии Д¥ЕБС1 в аденокарциноме и в интактной железе в 33% образцов, а в 59% образцах экспрессия \VEDC1 в аденокарциноме была выше, чем в интактной железе. Установлено, что как ШЮС1, так и СХСЫ2 сильнее экспрессировался в аденокарциноме, чем в ДГПЖ.

9. Короткие пептиды Т-32, Т-38 и кардиоген обладают способностью активно усиливать экспрессию протеинов СХС1Л2 и \VEDC1, синтез которых достоверно снижается в стареющих культурах фибробластов предстательной железы. При этом наибольшей активностью среди изученных пептидов обладает пептид Т-38.

10. Параллельно с усилением экспрессии сигнальных факторов дифференцировки фибробластов в монокультурах при их старении, пептиды Т-32, Т-38 и кардиоген значительно усиливают пролиферативную активность эпителиальных клеток простаты, ко-культивированных с фибробластами, и поднимают ее практически до уровня, свойственного молодым культивируемым клеткам.

11. Результаты проведенных исследований позволяют считать, что фибробласты простаты, являясь основными клетками ее микроокружения, принимают активное участие в паракринных механизмах регуляции развития гиперпластических процессов в предстательной железе, ассоциированных со старением, через изменение экспрессии ключевых

факторов их дифференцировки - протеинов CXCL12 и WEDC1. Следует считать перспективной детальную разработку методов пептидергической регуляции старения и коррекции возрастных нарушений функционирования предстательной железы.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. С диагностической и прогностической целью при ДГПЖ и карциноме простаты целесообразно определять в ткани экспрессию протеинов CXCL12 и WEDC1.

2. Показано, что короткие пептиды Т-32, Т-38 и кардиоген обладают способностью активно усиливать экспрессию протеинов CXCL12 и WEDC1, синтез которых достоверно снижается в стареющих культурах фибробластов предстательной железы. В связи с этим следует рекомендовать детальную разработку методов пептидергической регуляции старения и коррекции возрастных нарушений функционирования предстательной железы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статья в журнале по перечню ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации

1. Хейфец О.В. Пептидергическая регуляция экспрессии сигнальных факторов дифференцировки фибробластов предстательной железы при клеточном старении/ О.В. Хейфец, В.О. Полякова, И.М. Кветной// Успехи геронтологии. - 2010. - Т. 23,. №1. - С. 68-70.

Статьи

2. Нейроэндокринные клетки предстательной железы человека при опухолевых процессах, ассоциированных с возрастом/ Хейфец О.В., Полякова В.О.// Сб. статей «Актуальные проблемы патологии» (материалы мемориальной конференции, посвященной памяти члена-корр. РАМН Ю.Л. Перова). - М. - 2009. С. 82-87.

3. Тканевые матрицы: роль и значение в онкоморфологии / Пальцев М.А., Кветной И.М., Бондарев Н.Э., Бондарев И.Э., Костючек И.Н., Полякова В.О., Клещев М.А., Хейфец О.В., Левдик Н.В. // Сб. «Роль коммуникационных систем в развитии опухолей». - Смоленск. -2009-С. 23-28.

Тезисы докладов

4. Мелатонин и другие сигнальные молекулы: молекулярная иммуногистохимия на тканевых матрицах // Кветной И.М., Бондарев Н.Э., Костючек И.Н., Полякова В.О., Кветная Т.В., Клещев М.А.,

Хейфец О.В. / XV Росс. нац. конгресс «Человек и лекарство»/ - М. -2008.-С. 154.

5. Хейфец О.В. Нейроэндокринные клетки предстательной железы при старении и возраст-ассоциированных опухолевых процессах / Материалы осенней геронтологической конференции в Белгороде. -Белгородский государственный университет. - Белгород. - 2009. - С. 27.

6. Тканевые матрицы: молекулярная иммуногистохимия возраст-ассоциированной патологии / Кветной И.М., Бондарев Н.Э., Хейфец О.В., Левдик Н.В. // Матер, межрешон. научно-практ. конфер. «Медицинские проблемы пожилых». — Йошкар-Ола. - 2009. — С. 2627.

7. Нейроиммуноэндокринные взаимодействия в норме и патологии: роль сигнальных молекул в диагностике возраст-ассоциированных заболеваний/ Кветной И.М., Полякова В.О., Коновалов С.С., Кветная Т.В., Хейфец О.В., Левдик Н.В., Абдулрагимов Р.И., Севастьянова Н.Н. // Матер. V научно-практ. геронтол. конфер. с межд. участием «Пушковские чтения». - Санкт-Петербург. - 2009. - С. 222-224.

8. Хейфец О В. Фибробласты и опухолевые процессы в предстательной железе, ассоциированные со старением / Матер. Российско-белорусского симпозиума «Роль коммуникационных систем в развитии опухолей». - Смоленск. - 2009. - С. 53-54.

Хейфец Олег Владимирович ЭКСПРЕССИЯ СИГНАЛЬНЫХ ФАКТОРОВ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ФИБРОБЛАСТОВ ПРИ СТАРЕНИИ И ВОЗРАСТ-АССОЦИИРОВАННЫХ ОПУХОЛЯХ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ // Автореф. дис. канд. мед. наук: 14.01.30 - СПб., 2010. -26 с.

Подписано в печать 22.03.2010. Формат 60*84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ К" Отпечатано с готового оригинал-макета. ЗАО "Принт - Экспресс" 197376, С.-Петербург, ул. Большая Монетная, 5 лит. А

~> /

Актуальность темы

Для конца XX - начала XXI века характерно увеличение как абсолютной численности, так и доли лиц старшего возраста, т.е. людей, перешагнувших 60-летний рубеж, в общей популяции населения земного шара [Лазебник Л.Б., 1999]. Старение населения, рассматривавшееся ранее как случайная тенденция, характерная лишь для развитых стран, признается в настоящее время глобальным явлением. Пожилые люди старше 60 лет являются самой быстро растущей группой населения. Ожидается, что средняя продолжительность жизни в России к 2015 году достигнет 70 лет. Наметившаяся тенденция увеличения продолжительности жизни объясняется как улучшающимся здоровьем населения, так и развитием гериатрической службы.

Однако в настоящее время большинство людей не достигает биологического предела продолжительности жизни, а период старости, как правило, связан со снижением активности и ухудшением здоровья. Следовательно, увеличение продолжительности активного долголетия является одной из наиболее важных и сложных проблем геронтологии и гериатрии [Хавинсон В.Х., Морозов В.Г., 2001].

Старение - закономерный процесс, возникающий вследствие многих причин, которые постепенно вызывают изменения во всех органах и тканях. Старению подвержены все организмы животного и растительного мира. Поэтому изучение механизмов, лежащих в основе регуляции важнейших гомеостатических функций организма в процессе старения, представляет собой одно из приоритетных направлений современной биологии и медицины [Хавинсон В.Х. и соавт., 2000]

Нейроиммуноэндокринная регуляция гомеостаза занимает важное место в сложной цепи процессов, приводящих к старению клеток, тканей, органов и организма в целом [Пальцев М.А., Кветной И.М., 2006, 2008]. Морфо-физиологическим эквивалентом старения является инволюция жизненно важных органов, и прежде всего основных регуляторных («управляющих») систем - нервной, эндокринной и иммунной.

Ведущую роль в процессах старения, развивающихся в мужском организме, играют нарушения синтеза и секреции андрогенов, что приводит к снижению всех гормональных функций. Доброкачественная гиперплазия предстательной железы (ДГПЖ, аденома простаты) является наиболее часто встречающимся заболеванием мочеполовой системы у мужчин, ассоциированным со старением. Это заболевание является следствием гиперплазии стромы железы и наблюдается примерно у 75% мужчин в возрасте 70 лет и старше. Заболеваемость карциномой (раком) предстательной железы в пожилом и старческом возрасте за последние 10-15 лет постоянно возрастает и по скорости прироста эта локализация опухолей, наряду с раком мочевого пузыря, занимает второе место после меланомы кожи. Среди причин смерти у мужчин раковые опухоли предстательной железы занимают второе место после рака легких [Лопаткин Н.А., 1998; Франк Г.А., 1999; Аничков Н.М. и соавт., 2004].

Современные методы исследования (гистохимия, иммуногистохимия, электронная микроскопия и др.) позволяют более глубоко изучать проблему и выяснять механизмы старения клеток и тканей. Они дают возможность разработать новые неинвазивные информативные методы диагностики опухолевых процессов, среди которых особенно важное место занимают биологические маркеры - сигнальные молекулы, синтезируемые в клетках предстательной железы.

В последние годы появились новые данные о роли микроокружения простаты, особенно фибробластов, в процессах старческой инволюции и возраст-ассоциированном онкогенезе предстательной железы [Cunha G.R. et al., 2003; Dean J.P., Nelson P.S., 2008].

Несмотря на достаточно большое количество работ, посвященных структурно-функциональной организации микроокружения простаты, функция и биологическое значение фибробластов в предстательной железе изучены недостаточно. Существует мнение, что сигнальные молекулы, вырабатываемые фибробластами, необходимы для роста и дифференцировки клеток простатического эпителия, а также для регуляции локального гомеостаза секреторных процессов в зрелой предстательной железе [Bavik С., Coleman I., Dean J., et al., 2006].

Противоречивы данные о том, что популяция фибробластов увеличивается в предстательной железе при малигнизации гиперпластического процесса [Singh S., Singh U., Grizzle W., et al., 2004]. Недостаточно изучен вопрос об изменении ультраструктуры фибробластов при старении и возраст-ассоциированных заболеваниях простаты. До сих пор остается открытым вопрос о том, могут ли нормальные (немалигнизированные) фибробласты служить локальными мишенями в предстательной железе для воздействия на них биологически активных факторов, регулирующих экспрессию факторов дифференцировки с целью профилактики и коррекции инволютивных нарушений, развивающихся в предстательной железе при старении. Эти и другие важные вопросы требуют дальнейшего изучения.

Цель и задачи исследования

Целью диссертационного исследования явилось изучение функциональной морфологии фибробластов предстательной железы крыс и человека при старении и возраст-ассоциированных гиперпластических процессах предстательной железы.

Для достижения поставленной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

1. изучить особенности структурно-функциональной организации фибробластов предстательной железы крыс и человека при старении;

2. верифицировать транскрипционные факторы - протеины CXCL12 и WEDC1 в фибробластах предстательной железы и изучить изменения их экспрессии при естественном и индуцированном (радиационном) старении;

3. описать изменения экспрессии протеинов CXCL12 и WEDC1 в фибробластах предстательной железы человека при развитии в ней гиперпластических процессов, ассоциированных со старением;

4. определить онкопрогностическую значимость экспрессии протеинов CXCL12 и WEDC1 в фибробластах предстательной железы человека при возраст-ассоциированных гиперпластических процессах;

5. изучить роль фибробластов и экспрессируемых ими транскрипционных факторов дифференцировки в регуляции пролиферативной активности эпителиальных клеток простаты;

6. оценить биологическую активность коротких пептидов Т-32, Т-38 и кардиогена на функциональную активность фибробластов как потенциальных геропротекторных препаратов.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые проведено детальное исследование структурно-функциональной организации основных клеток микроокружения предстательной железы — фибробластов при естественном старении у человека и при моделировании старения у крыс. Изучена функциональная морфология фибробластов при развитии в предстательной железе человека гиперпластических процессов, ассоциированных со старением — доброкачественной железистой гиперплазии простаты (ДГПЖ) и карциномы. Показано, что среди всей популяции фибробластов предстательной железы человека и крыс наиболее распространены клетки, экспрессирующие транскрипционные факторы дифференцировки - протеины WEDC1 и CXCL12. Установлено, что ультраструктура WEDC1/CXCL12 - экспрессирующих фибробластов отражает их высокую функциональную активность в процессе всего онтогенеза простаты, что дает основание предполагать активное влияние транскрипционных факторов, экспрессируемых фибробластами, на развитие инволюционных процессов в предстательной железе. Показано достоверное снижение экспрессии протеинов CXCL12 и WEDC1 в фибробластах предстательной железы человека при естественном старении, что свидетельствует о недостаточной сигнальной регуляции функции предстательной железы в пожилом и старческом возрасте.

Впервые установлено, что при развитии в предстательной железе гиперпластических процессов, ассоциированных со старением, происходит достоверное изменение экспрессии транскрипционных факторов фибробластов, которое характеризуется различной динамикой при ДГПЖ и карциноме.

Установлено, что синтетические короткие пептиды Т-32, Т-38 и кардиоген обладают способностью активно усиливать экспрессию протеинов CXCL12 и WEDC1, синтез которых достоверно снижается в стареющих культурах фибробластов предстательной железы. Показано, что параллельно с усилением экспрессии сигнальных факторов дифференцировки фибробластов в монокультурах при их старении, пептиды Т-32, Т-38 и кардиоген значительно усиливают пролиферативную активность эпителиальных клеток простаты, ко-культивированных с фибробластами и поднимают ее практически до уровня, свойственного молодым культивируемым клеткам.

Полученные данные позволяют считать, что фибробласты простаты, являясь основными клетками ее микроокружения, принимают активное участие в паракринных механизмах регуляции развития гиперпластических процессов в предстательной железе, ассоциированных со старением, через изменение экспрессии ключевых факторов их дифференцировки — протеинов CXCL12 и WEDC1.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Среди всей популяции фибробластов предстательной железы человека и крыс наиболее распространены клетки, экспрессирующие транскрипционные факторы дифференцировки - протеины WEDC1 и CXCL12. Ультраструктура WEDC1/CXCL12 - экспрессирующих фибробластов отражает их высокую функциональную активность в процессе всего онтогенеза простаты.

2. При преждевременном (радиационном) старении у крыс отмечается дезорганизация органоидов фибробластов с сохранением секреторными гранулами достаточной морфологической стабильности, что отражает активное влияние транскрипционных факторов, экспрессируемых фибробластами, на развитие инволюционных процессов в предстательной железе.

3. При естественном старении в фибробластах предстательной железы человека происходит достоверное снижение экспрессии транскрипционных факторов дифференцировки - протеинов CXCL12 и WEDC1, что существенным образом негативно сказывается на сигнальной регуляции функции предстательной железы в пожилом и старческом возрасте.

4. При развитии в предстательной железе гиперпластических процессов, ассоциированных со старением, происходит достоверное изменение экспрессии транскрипционных факторов фибробластов, которое характеризуется различной динамикой при ДГПЖ и карциноме.

5. Короткие пептиды Т-32, Т-38 и кардиоген обладают способностью активно усиливать экспрессию протеинов CXCL12 и WEDC1, синтез которых достоверно снижается в стареющих культурах фибробластов предстательной железы, что приводит к усилению пролиферативной активности эпителиальных клеток простаты, ко-культивированных с фибробластами.

6. Фибробласты простаты, являясь основными клетками ее микроокружения, принимают активное участие в паракринных механизмах регуляции развития гиперпластических процессов в предстательной железе, ассоциированных со старением, через изменение экспрессии ключевых факторов их дифференцировки — протеинов CXCL12 и WEDC1.

Связь с научно-исследовательской работой Института

Диссертационная работа является научной темой, выполняемой по основному плану НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с изложением материала и методов исследования, 3 глав собственных исследований, главы обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Работа иллюстрирована 30 рисунками и содержит 4 таблицы. Текст диссертации изложен на 143 страницах. Список литературы содержит 277 источников (25 отечественных и 252 зарубежных).

выводы

1. Среди всей популяции фибробластов предстательной железы человека и крыс наиболее распространены клетки, экспрессирующие транскрипционные факторы дифференцировки — протеины WEDC1 и CXCL12.

2. Ультраструктура WEDC1/CXCL12 - экспрессирующих фибробластов отражает их высокую функциональную активность, о чем свидетельствует крупное округлое или овальное ядро с выраженным ядрышком; обилие свободных рибосом в цитоплазме, развитый шероховатый эндоплазматический ретикулум и многочисленные митохондрии; выраженная секреторная активность пластинчатого комплекса (аппарата Гольджи) и большое количество секреторных гранул, являющихся местом синтеза и депонирования коллагена и белков цитоскелета.

3. Общая популяция фибробластов в нормальной предстательной железе у крыс, достигших половозрелого возраста, является многочисленной. Среднее количество CXCL12/WEDC1 - экспрессирующих фибробластов составляет 320±41 клеток на 1 мм2. В простате у крыс при моделировании преждевременного старения количество CXCL12/WEDC1 экспрессирующих фибробластов достоверно снижается и составляет 280±34 клеток на 1 мм2.

4. При преждевременном (радиационном) старении отмечается дезорганизация органоидов фибробластов с преимущественной гиперплазией митохондрий с разрушенными кристами и просветленным матриксом. Однако, при этом, секреторные гранулы в фибробластах обладают достаточной морфологической стабильностью, сохраняя типичные признаки и тинкториальные свойства при индуцированном старении, что дает основание предполагать активное влияние транскрипционных факторов, экспрессируемых фибробластами (в основном, CXCL12 и WEDC1) на развитие инволюционных процессов в предстательной железе.

5. При естественном старении в фибробластах предстательной железы человека происходит достоверное снижение экспрессии протеинов CXCL12 и WEDC1. Так у молодых мужчин величина площади экспрессии WEDC1 составила 5,34±0,03%, что в 4 раз больше чем в группе 60-69 лет (1,35±0,04), а у CXCL12 она была равна 4,48±0,02% (р<0,05). Оптическая плотность WEDC1 и CXCL12 достигает максимального значения в группе 25-29 лет (0,34±0,01 у.е. и 0,31±0,02 у.е. соответственно), у пациентов пожилого возраста, наблюдается достоверное снижение этого показателя. Полученные данные свидетельствуют как об общем уменьшении популяции фибробластов в предстательной железе человека в процессе старения, так и о снижении выработки транскрипционных факторов в отдельных клетках, что существенным образом негативно сказывается на сигнальной регуляции функции предстательной железы в пожилом и старческом возрасте.

6. При развитии в предстательной железе гиперпластических процессов, ассоциированных со старением происходит достоверное изменение экспрессии транскрипционных факторов фибробластов. Так, площадь экспрессии WEDC1 в ДГПЖ снижается, а площадь экспрессии CXCL12 увеличивается, особенно у пациентов ДГПЖ в возрасте 70 лет и старше. Оптическая плотность экспрессии WEDC1 достигает максимального значения в группе 50-59 лет, a CXCL12 в группе 60-69 лет. У пациентов с ДГПЖ с увеличением возраста, наблюдается достоверное снижение оптической плотности WEDC1, а у CXCL12 она увеличивается.

7. Во всех случаях карцином простаты были обнаружены CXCL12/WEDC1 -продуцирующие фибробласты. Обширные и множественные скопления фибробластов в основном обнаруживались в высокодифференцированных опухолях. При этом опухолевые фибробласты не демонстрировали признаков пролиферативной активности. Площадь экспрессии протеина WEDC1 в раковых опухолях достоверно снижалась с увеличением возраста, в то время как для CXCL12 отмечается тенденция к значительному увеличению показателей. Оптическая плотность WEDC1 при раке простаты достигает максимального значения в группе 50-59лет, у CXCL12 наблюдается обратная тенденция.

8. Сравнительная оценка экспрессии транскрипционных факторов фибробластов показала, что в исследуемых образцах предстательной железы экспрессия WEDC1 в интактной железе была в пределах нормы чаще, чем в аденокарциноме. При этом не наблюдались различия в экспрессии WEDC1 в аденокарциноме и в интактной железе в 33% образцов, а в 59% образцах экспрессия WEDC1 в аденокарциноме была выше, чем в интактной железе. Установлено, что как WEDC1, так и CXCL12 сильнее экспрессировался в аденокарциноме, чем в ДГПЖ.

9. Короткие пептиды Т-32, Т-38 и кардиоген обладают способностью активно усиливать экспрессию протеинов CXCL12 и WEDC1, синтез которых достоверно снижается в стареющих культурах фибробластов предстательной железы. При этом наибольшей активностью среди изученных пептидов обладает пептид Т-38.

10. Параллельно с усилением экспрессии сигнальных факторов дифференцировки фибробластов в монокультурах при их старении, пептиды Т-32, Т-38 и кардиоген значительно усиливают пролиферативную активность эпителиальных клеток простаты, ко-культивированных с фибробластами и поднимают ее практически до уровня, свойственного молодым культивируемым клеткам.

11. Результаты проведенных исследований позволяют считать, что фибробласты простаты, являясь основными клетками ее микроокружения, принимают активное участие в паракринных механизмах регуляции развития гиперпластических процессов в предстательной железе, ассоциированных со старением, через изменение экспрессии ключевых факторов их дифференцировки - протеинов CXCL12 и WEDC1. Таким образом, следует считать перспективной детальную разработку методов пептидергической регуляции старения и коррекции возрастных нарушений функционирования предстательной железы.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. С диагностической и прогностической целью при ДГПЖ и карциноме простаты целесообразно определять в ткани экспрессию протеинов CXCL12 и WEDC1.

2. Поскольку показано, что короткие пептиды Т-32, Т-38 и кардиоген обладают способностью активно усиливать экспрессию протеинов CXCL12 и WEDC1, синтез которых достоверно снижается в стареющих культурах фибробластов предстательной железы, следует рекомендовать детальную разработку методов пептидергической регуляции старения и коррекции возрастных нарушений функционирования предстательной железы.