Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Экспрессия генов и функциональная активность молекул TLR9-опосредованного сигнального пути при герпесвирусной инфекции у беременных женщин
- Ученая степень
- кандидата медицинских наук
- ВАК РФ
- 14.03.09
Автореферат диссертации по медицине на тему Экспрессия генов и функциональная активность молекул TLR9-опосредованного сигнального пути при герпесвирусной инфекции у беременных женщин
005000787
На правах рукописи
И
Григорьева Оксана Юрьевна
ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ МОЛЕКУЛ ТЬЯ9-ОПОСРЕДОВАННОГО СИГНАЛЬНОГО ПУТИ ПРИ ГЕРПЕСВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ У БЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН
14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология
1 7 НОЯ 2011
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Москва-2011
005000787
Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН \
Научные руководители:
доктор медицинских наук доктор медицинских наук, профессор
Ганковская Оксана Анатольевна
Лавров Вячеслав Федорович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук доктор медицинских наук, профессор
Борисова Татьяна Константиновна Семенков Виктор Фадеевич
Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Смоленская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития России.
Защита состоится «15» декабря 2011г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., д. 5а.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН (Москва, Малый Казенный пер., д. 5а).
Автореферат разослан » ноября 2011г.
Ученый секретарь диссертационного совета
кандидат биологических наук
И.В. Яковлева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования
В настоящее время герпесвирусные инфекции входят в число наиболее распространенных заболеваний. По данным литературы свыше 90% людей инфицировано одним или несколькими вирусами герпеса человека [Кицак В.Я., 2005; Исаков В.А., 2006; Харламова Ф.С., 2006; Сухих Г.Т., 2010].
Особое значение активная форма герпесвирусной инфекции приобретает у беременных. Первичное заражение будущей матери, например, вирусом простого герпеса 2 типа (ВПГ-2), цитомегаловирусом (ЦМВ) или реактивация латентного вируса во время беременности, может привести к внутриутробному инфицированию плода, невынашиванию, возникновению генерализованной инфекции у новорожденного, гибели плода и др. [Краснопольский В.И., 2006; Макаров О.В., 2007; Anzivino Е.,2009; Corey L.,2009].
Известно, что первой линией защиты организма от инфекционных агентов является система врожденного иммунитета [Clark R., 2005; Ганковская O.A., 2010; Ярилин A.A., 2011]. На фоне физиологического изменения баланса между системами врожденного и адаптивного иммунитета во время беременности факторы врожденного иммунитета приобретают особое значение в защите от патогенов [Gonzalez J., 2007; Сухих Г.Т., 2010].
Клетки системы врожденного иммунитета способны распознавать консервативные структуры, представленные у различных микроорганизмов. Среди распознающих структур, активирующих клеточное звено врожденного иммунитета, ключевая роль отводится То11-подобным рецепторам (TLRs) [Takeda К., 2005; Ковальчук JI.B., 2006; Семенов Б.Ф., 2009]. Активация TLRs приводит к выработке эффекторных молекул (ИФНа/ß, ФНОа, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12 и др.), необходимых для защиты организма от инфекционных агентов, в том числе вирусов [Sandor F., 2005; Parker L„ 2007; Gribar S., 2008].
Экспрессия TLRs показана на клетках врожденного иммунитета (макрофагах, дендритных клетках и др.), а также на эпителиальных клетках слизистых оболочек
дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта, репродуктивной системы и т.д. [Sandor F., 2005; Aflatoonian R., 2008; Chang Z., 2010]. В клетках слизистой оболочки женского репродуктивного тракта выявлена экспрессия TLR1-10 [Fazeli А., 2005; Sonnex С., 2010]. Установлено, что при герпесвирусной инфекции особое значение имеет эндосомальный TLR9, который распознает неметилированные повторы CpG ДНК [Andersen J., 2006; Bowie А., 2007; Gill N„ 2008]. Взаимодействие TLR9 с лигандом запускает сигнальный путь рецептора, что приводит к активации важнейшего транскрипционного фактора клетки - NF-кВ, инициирующего процесс транскрипции генов провоспалительных цитокинов, хемокинов, молекул адгезии и некоторых других факторов системы врожденного иммунного ответа [Sandor F., 2005; Martin T., 2005; Семенов Б.Ф., 2009; Chang Z„ 2010].
В последние годы в научной литературе стали все чаще появляться работы, указывающие на непосредственное участие иммунных механизмов в развитии различных осложнений беременности [Abrahams, 2006; Макаров О.В., 2007; Ганковская O.A., 2008]. Однако остается неисследованным ТЫ19-опосредоваш1ЫЙ сигнальный путь при герпесвирусной инфекции у беременных женщин. Изучение системы TLR-опосредованных сигнальных путей при активации факторов врожденного иммунитета у беременных с герпесвирусной патологией позволит на молекулярном уровне изучить патогенетические особенности развития инфекционного процесса, вызванного ВПГ-2, оценить степень участия иммунных механизмов в развитии осложнений беременности.
Цель: изучение ТЪК9-опосредованного сигнального пути при моделировании герпесвирусной инфекции in vitro и в клетках слизистой оболочки цервикального канала беременных с герпесвирусной урогенитальной инфекцией. Задачи:
1) Разработать на основе полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) системы для количественного определения уровней экспрессии генов TLR9, NF-кВ и ФНОа.
2) Изучить динамику экспрессии генов TLR9, NF-кВ и ФНОа в клетках HeLa, инфицированных ВПГ-2 in vitro.
3) Исследовать ТЫ19-опосредованный сигнальный путь при блокировании >1Р-кВ специфическим ингибитором (изохеленином) в культуре клеток Не1а, инфицированных ВПГ-2.
4) Определить уровни экспрессии генов ТЫ19, ОТ-кВ и ФНОа в клетках слизистой цервикального канала беременных женщин с герпесвирусной патологией (ВПГ-2, ЦМВ).
5) Выявить корреляционную зависимость между уровнями экспрессии генов ТЬЯ9, ЫР-кВ и ФНОа в клетках слизистой цервикального канала беременных женщин.
6) Провести сравнительный анализ экспрессии гена ФНОа в клетках слизистой цервикального канала и продукции ФНОа в сыворотке крови у женщин с нормально протекающей беременностью и беременностью на фоне герпесвирусной урогенитальной инфекции.
Научная новизна
Разработан подход к оценке ТЫ19-опосредованпого сигнального пути, основанный на определении экспрессии генов рецептора ТЫ19, транскрипционного фактора №-кВ и эффекторной молекулы - ФНОа.
Впервые показана активация ТЫ19-опосредованного сигнального пути в культуре клеток НеЬа, инфицированных ВПГ-2.
Впервые, используя специфический ингибитор №-кВ (изохеленин), доказано, что ВПГ-2-индуцированное повышение экспрессии гена ФНОа в клетках цервикального канала является следствием активации ТЬК9-опосредованного сигнального пути.
Впервые определено увеличение экспрессии генов ТЫ19, МР-кВ и ФНОа в клетках слизистой цервикального канала беременных с герпесвирусной урогенитальной инфекцией (УГИ).
Впервые установлено наличие статистически значимой положительной корреляции между уровнями экспрессии генов ТЫ19, ЫР-кВ и ФНОа в клетках слизистой цервикального канала беременных.
Впервые показано, что увеличение экспрессии гена ФНОа в клетках слизистой цервикального канала сопровождается гиперпродукцией данного цитокина в сыворотке крови у беременных с герпесвирусной инфекцией.
Практическая значимость работы
На основе ПЦР в режиме реального времени разработаны лабораторные варианты систем, предназначенные для количественного определения экспрессии генов TLR9, NF-кВ и ФНОа, позволяющие оценивать экспрессию генов компонентов ТЬЯ9-опосредованного сигнального пути.
На основе культуры клеток HeLa создана модель герпесвирусной инфекции in vitro, с помощью которой возможна оценка факторов врожденного иммунитета в клетках цервикального канала.
Положения, выносимые на защиту
1. Доказана ВПГ-2-индуцированная активация ТЬЯ9-опосредованного сигнального пути, приводящая к повышенной экспрессии гена ФНОа, в клетках цервикального канала in vitro.
2. Герпесвирусная урогенитальная инфекция вызывает повышение уровней экспрессии генов TLR9, NF-кВ и ФНОа в клетках слизистой цервикального канала беременных. Между показателями экспрессии исследуемых генов установлены положительные, статистически значимые корреляционные связи.
3. Активация ТЬ119-опосредованного сигнального пути в слизистой оболочке цервикального канала беременных с герпесвирусной патологией сопровождается локальным увеличением экспрессии гена ФНОа и гиперпродукцией данного цитокина в сыворотке крови.
Внедрение результатов работы в практику
Материалы диссертации в 2010-11 гг. использовались в педагогическом процессе (лекциях и семинарских занятиях) кафедры вирусологии ГБОУ ДПО
«Российская медицинская академия последипломного образования» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.
Апробация работы
Материалы диссертационной работы представлены на XIV Всероссийском научном форуме с международным участием им. академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2011г.), Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2007, 2010гг.), XVI Российском Национальном Конгрессе «Человек и Лекарство» (Москва, 2010г.), 29-th Congress of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology (Великобритания, Лондон, 2010г.), IV Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008г.), III Международной Пироговской студенческой научной конференции (Москва, 2008г.), Международной конференции «Генетика в России и в мире» (Москва, 2006г.).
Апробация диссертации состоялась 14 июня 2011 года на научной конференции отдела вирусологии им. О.Г. Анджапаридзе НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.
Публикации результатов исследования
По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 5 глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 135 источников, из которых 32 отечественных и 103 зарубежных. Работа выполнена на 120 страницах машинописного текста и иллюстрирована 6 таблицами и 17 рисунками.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Характеристика клинических групп. Работа была проведена при сотрудничестве с кафедрой иммунологии РГМУ (зав. кафедрой, д.м.н., проф. Ковальчук Л. В., д.м.н., проф. Ганковская Л.В., к.м.н. Карташов Д.Д.) и кафедрой акушерства и гинекологии лечебного факультета РГМУ (зав. кафедрой, д.м.н., проф. Макаров О.В., д.м.н. Бахарева И.В., к.м.н. Романовская В.В., к.м.н. Кузнецов П.А., к.м.н. Гришук А.Ю.).
Общее количество обследуемых беременных женщин составило 173 человека, среди них 119 беременных с урогенитальной инфекцией различного генеза и 54 беременных с физиологически протекающей беременностью и срочными родами, которые составили контрольную группу. Возраст обследуемых женщин составлял 24-34 лет, срок беременности - 27-33 недели гестации. Критериями отбора в контрольную группу служили следующие показатели: отсутствие воспалительных и инфекционных заболеваний, аутоиммунной и эндокринной патологии, гестоза.
Беременные с УГИ были разделены на 4 группы в зависимости от этиологии урогенитальной инфекции:
группа беременных с герпесвирусной УГИ составили 99 женщины, у которых обнаружили ВПГ-2 (ЦМВ);
группа беременных с бактериальной УГИ составили 7 женщин с положительным анализом на Ureaplasma urealyticum и/или Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium;
группу беременных с грибковой УГИ составили 8 женщин с Candida albicans',
группа беременных со смешанной УГИ составили 5 женщин, у которых выявили бактериальную, вирусную и/или грибковую УГИ.
В качестве клинического материала в работе использовали клетки слизистой цервикального канала и сыворотку крови здоровых беременных и беременных с УГИ различного геиеза.
Обследуемые женщины являлись пациентами родильного отделения ГБ №8 (главный врач - Дуленков А.Б.) и женской консультации при роддоме №10 (главный врач - Озимковская Е.П.) г. Москвы. В данных медицинских учреждениях проводились комплексное клинико-лабораторное обследование женщин, анализы на наличие инфекций, забор клинического материала (клетки слизистой цервикального канала, сыворотка крови) и сбор данных анамнеза пациентов.
Материалы и методы исследования
Материалы. В работе использовали культуру клеток HeLa, которая представляет собой эпителиальные клетки, полученные из аденокарциномы цервикального канала человека. Культура клеток HeLa была любезно предоставлена сотрудником ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии Н.Ф. Гамалеи, к.б.н. Парфеновой Т.М.
В проводимых экспериментах для заражения клеток использовали ВПГ-2 штамм MS (Национальная коллекция вирусов, Великобритания).
Для блокирования ТЬК.9-опосредованного сигнального пути в экспериментах in vitro применяли специфический ингибитор транскрипционного фактора NF-kB -изохеленин (Calbiochem, Германия).
Методы.
Ведение культуры клеток HeLa, Клетки HeLa поддерживали в среде DMEM (ПанЭко, Россия), содержащую 80мМ гентамицина (Ферейн, ПанЭко, Россия), 0,6М L-глутамина (ПанЭко, Россия) и 10% эмбриональную сыворотку телят (HyClone, Великобритания). Клетки инкубировали при температуре 37°С в атмосфере 5% С02. Пересев культуры проводили через каждые 3-4 суток.
Заражение культуры клеток HeLa. 48-и часовой монослой культуры клеток HeLa заражали ВПГ-2 в дозе 2,5 или 3,5 ТЦЦ50/0,1 мл и инкубировали в культуральной среде при температуре 37 °С в атмосфере 5% СОг в течение 1, 3, 6, 12 и 24 часов. Через указанные интервалы времени клетки лизировали, и затем из них выделяли РНК для последующего проведения реакций обратной транскрипции
и ПЦР в режиме реального времени с целью определения уровней экспрессии исследуемых генов.
Для ингибирования NF-кВ в клетках культуры HeLa в лунки с монослоем клеток добавляли 20цМ или ЗОцМ изохеленина (Calbiochem, Германия) и культивировали в атмосфере 5% С02 при температуре 37°С в течение 30 мин.
Выделение РНК из клеток слизистой цервикального канала проводили с помощью метода кисло-фенольной экстракции [Херринггон С., 1999]. РНК из клеток HeLa выделяли методом сорбции на силикагеле с использованием набора "Рибо-сорб" (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, АмплиСенс, Россия) согласно инструкции производителя. Выделенные образцы РНК хранили при температуре минус 70°С.
Реакцию обратной транскрипции проводили согласно стандартным протоколам [Херрингтон С., 1999] с использованием Random праймеров (Синтол, Россия), 25 мМ дНТФ (Сибэнзим, Россия), 10-кратного SE-буфера для обратной транскриптазы M-MulV (Сибэнзим, Россия) и 5 е.а. M-MulV Обратной транскриптазы (Сибэнзим, Россия). Праймеры для обратной транскрипции были подобраны с помощью программы Vector NTI 8.0 и синтезированы фирмой Синтол (Россия). Полученные образцы кДНК хранили при температуре минус 70°С.
Для определения количества копий кДНК исследуемых генов проводили полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени. Для приготовления реакционной смеси использовали компоненты "Набора реактивов для проведения ПЦР-РВ в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I (Буфер Б)" (Синтол, Россия), а также Hot Start Taq ДНК-полимераза (СибЭнзим, Россия). Реакционную смесь готовили согласно инструкции фирмы-производителя. ПЦР-РВ проводили в амплификаторах АНК-16 и АНК-32 (Институт Аналитического Приборостроения РАН, Россия), используя следующую программу. 50°С - 2 минуты; [60 - 64°С - 50 секунд; 95°С - 20 секунд] - 40 циклов. Результаты реакции рассчитывали с помощью программного обеспечения приборов. Подсчет копий кДНК исследуемого гена проводили относительно 106 копий гена ß-актина. Количество копий гена ß-актина определяли в ходе ПЦР в режиме реального
времени с использованием «Набора реактивов для обнаружения и определения кДНК р-актина человека» (Синтол, Россия). Используемые в ПЦР-РВ TaqMan зонды и праймеры были сконструированы с помощью программы Vector NTI 8.0 и синтезированы фирмой Синтол (Россия).
Иммуноферментный анализ (ИФА). Концентрацию ФНОа в сыворотке крови беременных женщин определяли методом твердофазного ИФА с помощью диагностической тест-системы (BioSource, Бельгия, 0-1000 пг/мл). Анализ проводили согласно инструкции фирмы-производителя. Оптическую плотность измеряли при 450 нм с помощью анализатора иммуноферментных реакций (Пикон, Россия).
Статистическую обработку результатов проводили в рамках непараметрической базовой статистики с использованием критерия Манна-Уитни для сравнения двух выборок. Данные представлены в виде «среднее значение ± стандартное отклонение от среднего». Различия в группах рассматривались как значимые при р<0,05. Наличие статистически достоверной корреляции между уровнями экспрессии исследуемых генов оценивали по коэффициенту ранговой корреляции Спирмена [Гланц С., 1999].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Разработка систем для количественного определения экспрессии генов TLR9, NF-кВ и ФНОа методом ПЦР в режиме реального времени
На первоначальном этапе исследования были разработаны лабораторные системы на основе ПЦР в режиме реального времени для количественного определения уровней экспрессии генов TLR9, NF-кВ и ФНОа. Для этого были подобраны праймеры и зонды, определены оптимальные условия проведения реакций, построены калибровочные графики для стандартизации и количественной обработки полученных результатов. Данные системы использовались для определения динамики экспрессии исследуемых генов в модели герпесвирусной инфекции in vitro. Также с помощью разработанных систем были определены
уровни экспрессии генов ТЫ19, №-кВ и ФНОа в клинических образцах клеток цервикального канала беременных женщин. В таблице 1 представлены экспериментально установленные данные по разработанным системам.
Таблица 1
Экспериментальные условия проведения ПЦР в режиме реального времени для определения экспрессии исследуемых генов
Система Температура отжига праймеров, °С Концентрация прямого праймера, пкмоль/мкл Концентрация обратного праймера, пкмоль/мкл Концентрация зонда, пкмоль/мкл Концентрация MgCh, мМ
TLR9 64 4,04 5,16 3,39 25
NF-kB 64 4,08 4,36 3,09 50
ФНОа 60 5,32 4,41 3,80 50
Экспрессия генов TLR9, NF-кВ и ФНОа под действием ВПГ-2 в культуре клеток HeLa
Уровни экспрессии генов TLR9, NF-кВ и ФНОа эпителиальными клетками цервикального канала под действием ВПГ-2 оценивали in vitro в модели культуры клеток HeLa, инфицированной различными дозами ВПГ-2 (2,5 и 3,5 ТЦД5о/0,1мл). В качестве контроля использовали неинфицированную культуру клеток HeLa. Относительные значения количества копий мРНК TLR9, NF-кВ и ФНОа в неинфицированных клетках в динамике не имели статистически значимых различий по сравнению с данными показателями в "нулевой точке" эксперимента. Проведенные эксперименты показали, что под действием ВПГ-2 в клетках культуры HeLa значительно увеличивались уровни экспрессии генов TLR9, NF-кВ и ФНОа с первых часов после заражения (рис. 1).
6000000
3000000 2000000 1000000 -о
0ч
12ч 24ч
700000 600000 500000 -400000 -300000 200000 -100000 о
Оч
1ч
Зч
6ч
12ч 24ч
♦ контроль —— ВПГ-2 (3,5 ТЦД50/0.1МЛ) ВПГ-2 (2,5 ТЦД50/0,1мл)
Рис. 1. Динамика экспрессии генов Т1Л*9 (А), №-кВ (Б) и ФНОа (В) в культуре клеток НеЬа под действием ВПГ-2.
По оси абсцисс - время после инфицирования клеток ВПГ-2.
По оси ординат - относительное значение числа копий мРНК ТЬЯ9 (А), ЫР-кВ (Б) и ФНОа (В). Различия между количеством копий мРНК в инфицированных клетках и в контроле достоверны на уровне значимости р<0,05 (*) или р<0,01 (**).
Максимальные значения экспрессии генов ТЫ19 и №-кВ наблюдались через 3 часа после заражения клеток ВПГ-2. К 12-му часу эксперимента экспрессия генов ТЬЯ9 и ОТ-кВ снижалась, но оставалась значительно выше по сравнению с данными показателями в контрольных клетках. Через 24 часа после заражения было
зафиксировано повторное повышение экспрессии гена nf-кВ и TLR9 в клетках HeLa. Подобная динамика снижения экспрессии гена nf-кВ с 6-й по 24-й час эксперимента, видимо, связана с тем, что в данный промежуток времени под действием ВПГ-2 увеличивается синтез ингибирующей субъединицы 1кВ, что было показано в исследованиях, проводимых на культуре клеток НСЕ [Li Н., 2009]. Эти данные позволяют предположить, что повышение продукции ингибирующей субъединицы 1кВ в клетках подавляет процесс транскрипции и, соответственно, образования мРНК nf-кВ. Вероятно, повышение продукции ингибирующей субъединицы 1кВ и снижение синтеза nf-кВ под действием ВПГ-2 необходимо для предотвращения гиперпродукции провоспалительных цитокинов, поскольку связывание субъединицы 1кВ с nf-кВ блокирует транскрипционный фактор и, как следствие, транскрипцию большого числа генов (провоспалительных цитокинов, хемокинов и др.).
Максимальная экспрессия гена ФНОа была определена на 6-й час после инфицирования клеток. После достижения максимальных значений уровни экспрессии гена ФНОа снижались.
Обобщая полученные результаты, можно отметить, что ВПГ-2 способствовал значительному увеличению экспрессии генов TLR9, NF-кВ и ФНОа клетками цервикального канала с первых часов после инфицирования в модели in vitro. Кроме того, проведенные эксперименты показали, что в дальнейшем культура клеток HeLa может быть использована для изучения системы TLRs и сигнальных путей рецепторов на уровне клеток цервикального канала.
Динамика экспрессии генов TLR9 и ФНОа под действием ВПГ-2 в культуре клеток HeLa при ингибировании NF-kB
На следующем этапе для установления взаимосвязи между экспрессией генов TLR9, NF-кВ и ФНОа был проведен ряд экспериментов по определению ВПГ-2-индуцированной экспрессии исследуемых генов в клетках HeLa при блокировании Т1^9-опосредованного сигнального пути специфическим ингибитором NF-kB (изохеленином). Проведенные эксперименты показали, что в присутствии
изохеленина динамика экспрессии генов ТЬЯ9 и ФНОа под действием ВПГ-2 в клетках НеЬа менялась (рис. 2).
16000000 14000000 12000000 10000000 8000000 6000000 4000000 2000000 о
А
4000000 3500000 3000000 2500000 2000000 1500000 1000000 500000
ф контроль —■—ВПГ-2 —ВПГ-2+изохеленин 20цМ - - ВПГ-2+изохеленин ЗОцМ
Рис. 2. Динамика экспрессии гена TLR9 (А) и ФНОа (Б) в культуре клеток Ilel.a под действием ВПГ-2 в присутствии специфического ингибитора NF-кВ (изохеленина).
По оси абсцисс - время после инфицирования клеток ВПГ-2. По оси ординат - относительное значение числа копий мРНК TLR9 (А) и ФНОа (Б). Различия между количеством копий мРНК в инфицированных клетках, обработанных изохеленином, по сравнению с необработанными, достоверны на уровне значимости р<0,01 (**) и р<0,05 (*).
При иигибировании №-кВ уровни экспрессии гена ФНОа в клетках, зараженных ВПГ-2, достоверно снижались по сравнению с аналогичными показателями в инфицированных клетках, в которые не добавляли изохеленин. Кроме того, при воздействии большей дозы изохеленина максимальная экспрессия ФНОа наблюдалась на 6 часов позже (через 12 часов после заражения). Таким образом, блокирование ТЬЯ9-опосредованного сигнального пути за счет ингибитора №-кВ (изохеленина) подавляет продукцию ФНОа в клетках, зараженных ВПГ-2. Снижение ВПГ-2-индуцированной экспрессии гена ФНОа при блокировании транскрипционного фактора свидетельствует о том, что синтез данного провоспалительного цитокина в инфицированных клетках цервикального канала является ЫР-кВ-зависимым. При блокировании ЫИ-кВ максимальная экспрессия гена ТЦ19 также наблюдалась на 6-й час после инфицирования клеток (т.е. на 3 часа позже по сравнению с контрольными клетками). Однако уровень экспрессии гена ТЬ119 при этом был достоверно выше, чем в инфицированных клетках, не обработанных изохеленином, что позволяет предположить наличие так называемой обратной связи, как механизма регуляции экспрессии ТЬЯб.
Установленная взаимосвязь между экспрессией исследуемых генов подтверждает предположение о том, что ВПГ-2 в клетках цервикального канала активирует ТЫ19-опосредованный сигнальный путь, а также увеличивает синтез ФНОа, непосредственно оказывающего цитопатическое действие на инфицированные клетки.
Экспрессия генов ТЬЯ9, №-кВ и ФНОа в клетках слизистой цервикального канала беременных женщин
Следующей задачей настоящего исследования было оценить экспрессию компонентов ТЫ19-опосредованного сигнального пути на локальном уровне при герпесвирусной урогенитальной инфекции беременных. Для этого были определены уровни экспрессии генов ТЪЯ9, ОТ-кВ и ФНОа в клетках слизистой цервикального канала здоровых беременных и беременных с герпесвирусной инфекцией. В качестве групп сравнения использовали группы здоровых беременных и
беременных с бактериальной, грибковой и смешанной УГИ.
В группе беременных с герпесвирусной инфекцией статистически достоверно увеличивались уровни экспрессии генов ТЬЯ9, ОТ-кВ и ФНОа, в 5,7; 4,4 и 3 раза, соответственно, по сравнению с контрольной группой (рис. 3). Достоверного повышения уровня экспрессии гена ТЬЯ9 в группах сравнения не было выявлено. Установленное в ходе исследования увеличение экспрессии генов №-кВ и ФНОа у беременных с бактериальной, грибковой и смешанной УГИ, вероятно, объясняется активацией №-кВ за счет распознавания бактериальных и грибковых компонентов поверхностными ТЬЯб.
□ здоровые беременные
□ беременные с бактериальной УГИ
□ беременные со смешанной УГИ
□ беременные с грибковой УГИ
I беременные с герпесвируной инфекцией
Рис. 3. Экспрессия генов II.К9 (А), 1ЧТ-кВ (Б) и ФНОа (В) в клетках слизистой цервикального канала беременных женщин.
По оси ординат - относительное значение числа копий мРНК ТЬЯ9 (А), №-кВ (Б) и ФНОа (В). По оси ординат - клинические группы.
Различия между количеством копий мРНК достоверны на уровне значимости р<0,05 (*).
Анализ показал наличие статистически значимой положительной корреляции между показателями экспрессии исследуемых генов, что свидетельствует о взаимосвязи между экспрессией генов ТЬЯ9, №-кВ и ФНОа в клетках слизистой цервикального канала при герпесвирусной УГИ. Значения коэффициентов корреляции между уровнями экспрессии генов ТЫ19,
№-кВ и ФНОа в клетках слизистой цервикального канала беременных представлены в таблице 2.
Таблица 2
Коэффициенты корреляции между уровнями экспрессии генов ТЬЫ9, №-кВ и ФНОа в клетках слизистой цервикального канала
Анализируемые показатели экспрессии генов Коэффициент корреляции г
0,77 *(р < 0,05)
№-кВ ФНОа 0,64 *(р < 0,05)
1X1*9 ФНОа 0,67 *(р < 0,05)
* - коэффициент корреляции г статистически достоверно отличается от нуля на
уровне значимости р<0,05
Обобщая полученные данные, можно сделать вывод, что при инфицировании ВПГ-2 происходит активация ТЫ19-опосредованного сигнального пути на уровне слизистой цервикального канала во время беременности.
Герпесвирусная инфекция у беременных не только вызывает увеличение экспрессии гена ФНОа в клетках слизистой цервикального канала, но и повышает концентрацию цитокина на системном уровне. Проведенные исследования показали, что в группе беременных с герпесвирусной инфекцией концентрация ФНОа в сыворотке крови составила 125,2 ± 20,5 пкг/мл, тогда как в группе здоровых беременных ФНОа практически не определялся (6,2 ± 1,3 пкг/мл) (рис.4).
140
т
100
120
40
20
80
60
0
здоровые беременные беременные с
герпесвирусной инфекцией
Рис. 4. Концентрация ФНОа в сыворотке крови здоровых беременных и беременных с герпесвирусной инфекцией.
По оси ординат- концентрация ФНОа, пкг/мл. По оси абсцисс - клинические группы.
Различия в группах статистически достоверны на уровне значимости р<0,05 (*).
Анализ данных по клиническим группам показал, что у беременных с герпесвирусной УГИ по сравнению с контрольной группой частота развития преждевременных родов была достоверно выше и составляла 53% (в России частота преждевременных родов составляет 7-10% от общего числа родов [Сидельникова В. М., 2005]). Вероятно, одним из механизмов развития преждевременных родов у беременных с герпесвирусной инфекций является ВПГ-2-индуцированное повышение выработки ФНОа.
С учетом полученных результатов и данных литературы была составлена возможная схема участия механизмов врожденного иммунитета в патогенезе преждевременных родов у беременных с герпесвирусной инфекцией (рис. 5).
Согласно данной схеме, при действии инфекционного агента (ВПГ-2, ЦМВ) происходит активация факторов врожденного иммунитета через систему ТЬЯв, за счет распознавания белков оболочки вирионов и вирусной ДНК, соответственно, рецепторами ТЬЯ2 и ТЬ119. Активация факторов врожденного иммунитета заключается в повышенной продукции провоспалительных цитокинов и индукции воспалительных процессов в женском репродуктивном тракте. Острый
воспалительный процесс в тканях сопровождается изменением протеинов внеклеточного матрикса, активацией протеаз и увеличением синтеза простагландинов, способствующих преждевременному развитию родовой деятельности. Таким образом, под действием инфекционного агента запускается каскад воспалительных реакций, приводящий к активации миометрия, раскрытия шейки матки и преждевременному разрыву плодных оболочек, что в свою очередь, может стать причиной развития преждевременных родов [Макаров О.В.,2007; 2009; Koga К., 2010; Noguchi Т., 2010; Riley J., 2010; Thaxton J., 2010].
Воздействие инфекционного агента
(вирусная ДНК, белки оболочки ВПГ)
Г
Рис. 5. Схема развития преждевременных родов при герпеевирусной урогенитальной инфекции у беременных женщин. Схема составлена на основе полученных результатов и данных литературы [Макаров 0.в.,2007; Lyttle В., 2009; Patni S., 2009; Koga К., 2010; Noguchi Т., 2010; Riley J., 2010; Thaxton J., 2010].
Выявленные изменения в экспрессии генов TLR9, NF-кВ и ФНОа в клетках
слизистой цервикального канала и повышенная продукция ФНОа в сыворотке крови
у беременных с герпесвирусной инфекцией, вероятно, в комплексе могут служить
прогностическими критериями течения беременности.
Выводы
1) На основе ПЦР в режиме реального времени разработаны лабораторные варианты систем для количественного определения уровней экспрессии генов ТоП-подобного рецептора 9, транскрипционного фактора NF-кВ и провоспалительного цитокина ФНОа.
2) Установлено, что под действием ВПГ-2 увеличивается экспрессия генов TLR9, NF-кВ и ФНОа в клетках Не La, и максимальные значения экспрессии генов TLR9 и NF-кВ достигаются на 3-ий час, гена ФНОа - на 6-ой час после инфицирования клеток.
3) Доказано, что повышение экспрессии гена ФНОа под действием ВПГ-2 является следствием активации ТЬК9-опосредованного сигнального пути в клетках HeLa.
4) Определено, что в клетках слизистой цервикального канала беременных с герпесвирусной урогенитальной инфекцией уровни экспрессии генов TLR-9, NF-кВ и ФНОа увеличены в 5,6; 4,4 и 3,0 раза, соответственно. Между показателями экспрессии исследуемых генов установлены положительные, статистически значимые корреляционные связи.
5) Установлено, что в группе беременных с герпесвирусной урогенитальной инфекцией повышение экспрессии гена ФНОа в клетках слизистой цервикального канала, сопровождалось значительным увеличением концентрации данного цитокина в сыворотке крови (до 125,2 ± 20,5 пкг/мл, относительно 6,2 ±1,3 пкг/мл в сыворотке крови здоровых беременных).
6) Показано, что ВПГ-2-индуцированная активация ТЬК9-опосредованного сигнального пути в эпителиальных клетках цервикального канала коррелирует с повышенной частотой развития преждевременных родов.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:
1) Ганковская O.A. Экспрессия То11-подобных рецепторов у беременных женщин больных генитальным герпесом / Романовская В.В., Сомова О.Ю.* // Тезисы докладов Международной конференции «Генетика в России и в мире». - Москва -2006.-С.43.
2) Карташов Д.Д. Экспрессия генов а-дефенсина 1 и ß-дефенсина 1 у беременных женщин с урогенитальной инфекцией / Кузнецов П.А. Сомова О.Ю.*, Ганковская O.A., Ганковская Л.В. // Сборник тезисов 11-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». - 2007. -С.250.
3) Ганковская O.A. Анализ уровней экспрессии генов ТЫ19-сигнального пути при герпесвирусной инфекции во время беременности / Сомова О.Ю.*, Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., Лавров В.Ф. // Российский иммунологический журнал. -2008. - т.2(11). - №2-3. - С.286.
4) Сомова О.Ю.* Изучение экспрессии генов сигнального пути То11-подобного рецептора 9 при герпесвирусной инфекции // Вестник РГМУ. Материалы III Международной Пироговской студенческой научной конференции. - 2008. - С.335.
5) Ганковская O.A. Исследование экспрессии генов TLR9, NF-kB, ФНОа в клетках слизистой цервикального канала беременных с герпесвирусной инфекцией / Бахарева И.В., Ганковская Л.В., Сомова О.Ю.*, Зверев В.В. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2009. - 2. - С.61-65.
6) Ганковская O.A. То11-подобные рецепторы, распознающие лиганды вируса герпеса / Ганковская Л.В., Сомова О.Ю.*, Зверев В.В. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2009. - 2. - С.108-111.
7) Сомова О.Ю.* Изучение экспрессии генов ТЫ19-опосредованного сигнального пути в клетках слизистой цервикального канала при герпесвирусной инфекции / Ганковская O.A. // Сборник тезисов 14-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». - 2010. - С.312.
8) Сомова О.Ю.* Динамика экспрессии молекул ТЫ19-оносредованиого сигнального пути эпителиальными клетками цервикального канала под действием вируса простого герпеса 2 типа in vitro / Ганковская O.A., Лавров В.Ф., Ганковская Л.В., Зверев В.В. // Российский иммунологический журнал. - 2011. - т.5(14). - №2. -С.129-134.
* - Сомова О.Ю. = Григорьева О.Ю.
Заказ № 306-1/11/2011 Подписано в печать 03.11.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1
ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-maii.info@cfr.ru
Оглавление диссертации Григорьева, Оксана Юрьевна :: 2011 :: Москва
Список сокращений.
Введение.
Глава 1. Обзор литературы.
1.1 Основные понятия системы врожденного иммунитета.
1.2 Рецепторный аппарат системы врожденного иммунитета.
1.3 Генитальный герпес.
1.4 Иммунные механизмы при герпесвирусной инфекции.
Собственные исследования.
Глава 2. Материалы и методы.
2.1 Характеристика клинических групп.
2.2 Материалы.
2.3 Методы.
2.3.1 Ведение клеточных культур.
2.3.2 Определение жизнеспособности клеток.
2.3.3 Выделение РЖ.
2.3.4 Реакция обратной транскрипции.
2.3.5 Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени.
2.3.6 Гель-электрофорез.
2.3.7 Иммуноферментный анализ.
2.3.8 Статистический анализ.
Глава 3. Результаты и обсуждение.
3.1 Разработка систем для количественного определения уровней экспрессии генов ТЬЯ9, МР-кВ и ФНОа методом ПЦР в режиме реального времени в присутствии интеркалирующего красителя 8уЬгСгееп I и TaqMan зондов.
3.2 Динамика экспрессии генов ТЫ19, ИР-кВ и ФНОа в культуре клеток НеЬа, инфицированных ВПГ-2.
3.3 Динамика экспрессии генов ТЬЯ9 и ФНОа в культуре клеток НеЬа под действием ВПГ-2 в присутствии специфического ингибитора М^-кВ (изохеленина).
3.4 Экспрессия генов ТЫ19, ИР-кВ и ФНОа в эпителиальных клетках слизистой оболочки цервикального канала беременных с урогенитальной инфекцией различной этиологии и женщин с физиологически протекающей беременностью.
3.5 Анализ показателей ФНОа на локальном и системном уровнях при герпесвирусной урогенитальной инфекции у беременных женщин.
Введение диссертации по теме "Клиническая иммунология, аллергология", Григорьева, Оксана Юрьевна, автореферат
Актуальность темы
В настоящее время герпесвирусные инфекции. входят в' число наиболее распространенных заболеваний. По данным, литературы свыше 90% людей инфицировано одним или несколькими вирусами герпеса человека [9; 10, 27]:
Особое значение активная форма- герпесвирусной инфекции приобретает у беременных, поскольку первичное заражение будущей матери, например, вирусом простого герпеса 2 типа (ВПГ-2), цитомегаловирусомі (ЦМВ) или реактивация латентного вируса во время беременности, может привести, к внутриутробному инфицированию плода, невынашиванию, возникновению генерализованной инфекции у новорожденного, гибели плода [10, 16, 40, 47].
Известно, что первой линией защиты организма от инфекционных агентов является система врожденного иммунитета [15, 17, 32,' 45, 111]. На фоне физиологического изменения баланса между системами врожденного' и адаптивного иммунитета во время беременности-факторы врожденного иммунитета приобретают особое значение в защите от патогенов [27, 56].
Клетки системы врожденного иммунитета способны распознавать консервативные структуры, представленные у различных микроорганизмов. Среди распознающих структур, активирующих клеточное звено врожденного? иммунитета, ключевая роль отводится То11-подобным рецепторам (ТЬЯб) [64, 65, 103]. Активация ТЬЯб приводит к выработке эффекторных молекул (ИФНа/р, ФНОа, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12 и др.), необходимых для защиты организма от инфекционных агентов, в том числе вирусов [88, 110, 111].
Экспрессия ТЫ^я показана на клетках врожденного- иммунитета (макрофагах, дендритных клетках и др.), а также, на эпителиальных клетках слизистых оболочек дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта, репродуктивной- системы и т.д. [52, 57, 97, 108]. В клетках слизистой оболочки женского? репродуктивного тракта выявлена: экспрессия ТЪК1-10 [52, 108].
Установлено, что при- заболевании генитальным герпесом особое значение имеет эндосомальный То11-нодобный рецеп тор 9, распознающий неметилированные повторы- СрО вирусной- ДНК [39, 42, 55]. Взаимодействие Т1Л9' с лигандом вызывает активацию: важнейшего транскрипционного: фактора клетки- - Мг-кВ- инициирующего* процесс транскрипции генов;, провоспалительных цитокинов,. хемокинов, молекул адгезии! и некоторых других- факторов? системы; врожденного иммунного ответа'[44]^
В последние годы■ в научной литературе стали, все чаще появляться работы; указывающие:на< непосредственное участие иммунных механизмов» в развитии различных осложнений беременности, связанных с сопутствующей инфекционной: патологией [33, 34, 35]. Было высказано предположение, что? гиперактивация факторов иммунной7 защиты, под воздействием инфекционных агентов? через систему ТЬИб может приводить к невынашиванию беременности' и преждевременным родам: [17,114].
Несмотря» на очевидную значимость указанных процессов, в настоящее время роль, ТЪК9 и ключевых молекул сигнального пути рецептора на уровне слизистой цервикального канала беременных женщин. в норме и при инфекционной патологии практически: не изучена.
Исследование системы ТЪЯ-опосредованных сигнальных путей при активации факторов врожденного иммунитета у беременных с герпесвирусной, патологией позволит на молекулярном уровне изучить патогенетические особенности развития вызванного ВПГ-2 инфекционного процесса, оценить степень участия иммунных механизмов в развитии осложнений, беременности и, вероятно, даст возможность создать принципиально новые подходы в прогнозировании и лечении инфекционного процесса.
Цель: изучение ТЬК9-опосредованного сигнального пути при моделировании герпесвирусной инфекции in vitro и в-клетках слизистой оболочки цервикального канала беременных с герпесвирусной урогенитальной инфекцией.
Задачи:
1) Разработать на основе полимеразной цепной реакции в режиме реального« времени (ПЦР-РВ) системы, для количественного определения уровней экспрессии генов TLR9, NF-кВ и ФНОа.
2) Изучить динамику экспрессии генов TLR9, NF-кВ и ФНОа в клетках HeLa, инфицированных ВПГ-2 in vitro.
3) Исследовать ТЬЯ9-опосредованный сигнальный путь при блокировании
NF-кВ специфическим ингибитором (изохеленином) в культуре клеток HeLa, инфицированных BITF-2.
4) Определить уровни экспрессии генов TLR9, NF-кВ и ФНОа в эпителиальных клетках слизистой оболочки цервикального канала беременных женщин с герпесвирусной патологией (ВПГ-2, ЦМВ).
5) Выявить корреляционную зависимость между уровнями экспрессии генов TLR9, NF-кВ и ФНОа в клетках слизистой цервикального канала беременных-женщин.
6) Провести сравнительный анализ экспрессии гена ФНОа в клетках слизистой цервикального канала и продукции ФНОа в сыворотке крови у женщин с нормально, протекающей беременностью и беременностью на фоне герпесвирусной урогенитальной инфекции.
Научная новизна
Разработан подход к. оценке ТЬБ19-опосредованного сигнального пути, основанный- на определении экспрессии генов рецептора- ТЫ19, транскрипционного фактора ИР-кВ и эффекторной молекулы - ФНОа.
Впервые показана активация ТЫ19-опосредованного сигнального пути в культуре клеток НеЬа, инфицированных ВПГ-2.
Впервые, используя специфический* ингибитор КБ-кВ (изохеленин), доказано, что ВПГ-2-индуцированное повышение экспрессии гена ФНОа в клетках цервикального канала является следствием, активации ТЬЯ9-опосредованного сигнального пути.
Впервые определено-увеличение экспрессии генов ТЬЯ9, №-кВ и ФНОа в клетках слизистой цервикального- канала беременных с герпесвирусной урогенитальной инфекцией (УТИ).
Впервые установлено наличие статистически значимой положительной корреляции' между уровнями экспрессии генов ТЫ19, кВ и ФНОа в,клетках слизистой цервикального^канала беременных.
Впервые показано, что увеличение экспрессии гена ФНОа в клетках слизистой цервикального канала- сопровождается гиперпродукцией данного цитокина в сыворотке крови у беременных с герпесвирусной инфекцией.
Практическая значимость работы
Разработаны системы на основе ПНР в режиме реального времени для количественного определения экспрессии генов Т1Л19, >1Р-кВ и ФНОа, позволяющие оценивать экспрессию генов компонентов ТЫ19опосредованного сигнального пути в клинических и биологических образцах. .
На основе, перевиваемой культуры клеток HeLa создана модель герпесвирусной инфекции in vitro, позволяющая оценивать: факторы врожденного иммунитета на уровне клеток цервикального канала.
Установлено, что специфический ингибитор транскрипционного фактора NF-кВ (изохеленин) может быть, использован, для исследования TLR-опосредованных сигнальных путей.
Положения, выносимые на защиту
1. Доказана; ВПГ-2-индуцированная активация; ТЬК9-опосредованного сигнального пути, приводящая к, повышенной . экспрессии; гена ФНОа, в клетках цервикального канала ш vitro.
2. Герпесвирусная урогенитальная инфекция вызывает повышение уровней экспрессии генов TLR9, NF-кВ и ФНОа в клетках слизистой цервикального канала беременных: Между показателями экспрессии исследуемых генов; установлены положительные; статистически значимые корреляционные связи;
3. Активация ТЫФ-опосредованного сигнального пути в слизистой оболочке цервикального канала беременных с герпесвирусной патологией сопровождается локальным увеличением экспрессии; гена ФНОа и гиперпродукцией данного цигокина в сыворотке крови.
Внедрение результатов работы в практику
Материалы диссертации в 2010-11 гг. использовались в педагогическом процессе'(лекциях и семинарских занятиях) кафедры' вирусологии ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.
Публикации результатов исследования
По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации
Заключение диссертационного исследования на тему "Экспрессия генов и функциональная активность молекул TLR9-опосредованного сигнального пути при герпесвирусной инфекции у беременных женщин"
Выводы
1) На основе ПЦР в режиме реального времени разработаны лабораторные варианты систем для количественного определения уровней экспрессии генов То11-подобного рецептора 9, транскрипционного фактора КР-кВ и провоспалительного цитокина ФНОа.
2) Установлено, что под действием ВПГ-2 увеличивается экспрессия генов ТЬЫ9, ОТ-кВ и ФНОа в клетках НеЬаь и максимальные значения экспрессии генов ТЪК9 и ТЧБ-кВ достигаются на 3-ий час, гена ФНОа - на 6-ой час после инфицирования клеток.
3) Доказано, что повышение экспрессии гена ФНОа под действием ВПГ-2 является следствием активации ТЬК9-опосредованного сигнального пути в клетках НеЬа.
4) Определено, что в клетках слизистой цервикального канала беременных с герпесвирусной урогенитальной инфекцией уровни экспрессии генов 1X11-9, №-кВ и ФНОа увеличены в 5,6; 4,4 и 3,0 раза, соответственно. Между показателями экспрессии исследуемых генов установлены положительные, статистически значимые корреляционные связи.
5) Установлено, что в группе беременных с герпесвирусной урогенитальной инфекцией повышение экспрессии гена ФНОа в клетках слизистой цервикального канала, сопровождалось I значительным увеличением концентрации данного цитокина в сыворотке крови (до 125,2 ± 20,5 пкг/мл, относительно 6,2 ± 1,3 пкг/мл в сыворотке крови здоровых беременных).
Показано, что ВПГ-2-индуцированная активация ТЬК9-опосредованного сигнального пути в эпителиальных клетках цервикального канала коррелирует с повышенной частотой развития преждевременных родов.
Заключение
На данный момент серьезную медицинскую проблему представляет генитальный" герпес, что обусловлено высокой распространенностью заболевания, ростом частоты заболеваемости, влиянием на репродуктивное здоровье населения и др. [27]. Наличие герпесвирусной урогенитальной инфекции у беременных значительно? повышает риск развития преждевременных, родов и других осложнений- беременности. Исследование факторов- врожденного иммунитета беременных представляется: особенно важным, поскольку, многие авторы отмечают физиологическое угнетение некоторых специфических иммунных реакций-во? время . гестационного процесса; что компенсируется; усилением факторов врожденного иммунитета [17].
На первом этапе исследования были разработаны лабораторные варианты систем- на основе ПЦР в режиме* реального времени- для количественного определения' уровней! экспрессии; генов ТЫ19, Ш1-кШ и ФНОа: Для этого были подобраны; праймеры- и зонды, определены оптимальные; условия? проведения, реакций, построены калибровочные графики для стандартизации и количественной обработки полученных данных.
Изначально уровни экспрессии генов ТЬЯ9, ЫЕ-кВ" ш ФНОа эпителиальными клетками цервикального канала под действием ВПГ-2 оценивали в модели: т уЫго. Для этого использовали: культуру клеток НеЬа, которую инфицировали различными^ дозами ВПГ-2. Проведенные эксперименты показали, что под действием ВПГ-2 в клетках культуры НеЬа значительно увеличивались уровни экспрессии генов ТЬЯ9, ИР-кВ и ФНОа с первых часов после заражения. Максимальные значения экспрессии генов ТЬЯ9. и КР-кВ набшодались на 3-й час после добавления в клетки ВПГ-2. К 24-му часу эксперимента экспрессия генов ТЕЯ9 и
ЫБ-кВ снижалась, но оставалась значительно выше по сравнению с данными показателями в контрольных клетках. Максимальная экспрессия гена ФНОа была определена на 6-й час после инфицирования клеток. Воздействие на клетки ВПГ-2 в большей дозе вызывало наиболее значительное увеличение экспрессии исследуемых генов.
На основании полученных результатов1 и данных литературы было высказано предположение о том, что в клетках культуры НеЬа увеличение экспрессии генов ТЫ19, №"-кВ и ФНОа обусловлено активацией ТЪК9-опосредованного сигнального пути в ответ на инфекцию, вызванную-ВПГ-2. Для того чтобы подтвердить данное предположение, на следующем этапе работы определяли. ВПГ-2-индуцированную экспрессию исследуемых генов в клетках НеЬа при блокировании ТЬЯ9-опосредованного сигнального пути специфическим ингибитором1 1МТ-кВ (изохеленином).
Проведенные эксперименты- показали, что в присутствии^ изохеленина динамика экспрессии генов1 ТЬЯ9 и ФНОа под действием ВПГ-2 в клетках НеЬа менялась. При* ингибировании МмсВ уровни-экспрессии гена ФНОа- в клетках, зараженных ВПГ-2, достоверно^ снижались« по сравнению с аналогичными показателями- в инфицированных клетках, в которые не добавляли изохеленин. Кроме-того; при воздействии- изохеленином в большей дозе максимальная экспрессия ФНОа была снижена и происходила на 6 часов позже. Таким образом; блокирование Т1Л9-опосредованного сигнального пути за счет ингибитора №-кВ (изохеленина) подавляет продукцию ФНОа в клетках, зараженных ВПГ-2. Снижение ВПГ-2-индуцированной экспрессии гена ФНОа при блокировании транскрипционного' фактора свидетельствует о том, что1 синтез данного- провоспалительного цитокина в инфицированных клетках цервикального канала является ЫГ-кВ-зависимым.
При блокировании ЫИ-кВ максимальная экспрессия гена Т1Л*9 также наблюдалась на 6-й час после инфицирования клеток (т.е. на 3 часа позже по сравнению с контрольными клетками). Однако уровень экспрессии гена ТЬИ9 при этом был достоверно выше, чем в инфицированных клетках, не обработанных изохеленином, что позволяет предположить наличие; так называемой, "обратной связи" как механизма регуляции экспрессии
Установленная взаимосвязь между экспрессией?исследуемых генов с большой вероятностью^, подтверждает предположение: 6ітом, что- ВПГ-2 в-клетках цервикального> канала активирует ТЬК9-опосредованный сигнальный; путь, а также, увеличивает синтез ФНОа, непосредственно оказывающего? цитопатическос действие на инфицированные клетки. Кроме того,, увеличение: экспрессии ЫГ-кВ . в инфицированных клетках культуры НеЬа, вероятно, свидетельствует о том, что при: запуске ТЬК9-опосредованного сигнального пути происходит не- только:- активация; КР-кВ за счет деградации его ингибирующей субъединицы ІкВ; но и увеличение экспрессии гена этого транскрипционного фактора.
В работе впервые была показана ВІ ІГ-2-индуцированная активация сигнального пути рецептора ТЫ19 в клетках. НеЬа на уровне самого рецептора, транскрипционного фактора №'-кВ и эффекторной молекулы ФІІОа. Полученные данные относительно динамики экспрессии генов ТЬИ.9; ЫР-кВ и ФНОа в клетках шшжНеЬа помогают на молекулярном-уровне выявить патогенетические особенности течения инфекции, вызванной ВПГ-2.
Следующей задачей- настоящего исследования было оценить экспрессию компонентов ТЕК9-опосредованного сигнального пути на локальном уровне при герпесвирусной урогенитальной инфекции беременных. Для этого были.: определены уровни экспрессии генов ТЫ19, ИР-кВ- и ФНОа в клетках слизистой цервикального канала здоровых беременных и беременных с герпесвирусной инфекцией. Для того чтобы оценить насколько специфичны изменения экспрессии исследуемых генов под действием ВПГ-2, дополнительно были определены данные показатели в группах беременных с инфекцией невирусного генеза. В качестве групп сравнения выступали группы беременных женщин с бактериальной, грибковой1 и смешанной УГИ.
В группах беременных с УГИ невирусного генеза не было определено достоверного повышения уровня экспрессии гена ТЬЯ9, однако было отмечено статистически достоверное повышение уровней экспрессии генов ФНОа и ИР-кВ. Ранее были получены данные о том, что у беременных с урогенитальной инфекцией бактериального генеза по сравнению с женщинами, у которых беременность протекала без осложнений, многократно возрастала экспрессия генов ТЬЯ1 и ТЫ12 в • клетках слизистой цервикального канала. Эти показатели прямо коррелировали с увеличением уровня продукции ряда провоспалительных цитокинов (ФНОа и др.) [3, 5]. Кроме того, было установлено, что гомодимер ТЬК2/ТЫ12 и гетеродимер ТЬК2/ТЪБ16, экспрессированные на поверхности вагинальных и цервикальных эпителиальных клетках, распознают мембранные пептиды бактерий и активируют 1МР-кВ-зависимый сигнальный путь [85]. Учитывая данные литературы, можно заключить, что повышение экспрессии генов МР-кВ и ФНОа в группе беременных с бактериальной УГИ обусловлено запуском КР-кВ-зависимого сигнального пути за счет активации поверхностных рецепторов — ТЬЮ, ТЫ12, ТЫ16.
Что касается группы беременных с грибковой урогенитальной инфекцией, статистически достоверное повышение экспрессии гена ФНОа, вероятно, объясняется активацией сигнальных путей поверхностных ТЬИ-Б (ТЫ12 и ТЫМ), имеющих большое значение в распознавании молекулярных структур грибов [50, 109].
Таким образом, показанное в нашей работе увеличение экспрессии генов NF-кВ и ФНОа в группах беременных с УГИ не вирусного reHe3á, вероятно, объясняется активацией NF-кВ за счет распознавания бактериальных и грибковых компонентов (ЛПС, гликопротеины, зимозан, флагеллин и др.) поверхностными TLRs (TLR1, TLR2, TI,R4, TLR5, TLR6) [3, 5].
В ходе проведенного исследования было показано, что в группе беременных с герпесвирусной инфекцией статистически, достоверно увеличивались» уровни экспрессии генов TLR9, NF-кВ и ФНОа, соответственно, в 5,7; 4,4 и 3 раза по сравнению с контрольной группой. Корреляционный анализ полученных данных показал наличие статистически значимой положительной; корреляции между исследуемыми показателями, что свидетельствует от взаимосвязи , между экспрессией генов TLR9, NF-кВ и ФНОа в клетках слизистой цервикального канала при герпесвирусной: УГИ: Обобщая; полученные результаты и данные, полученные in vivo; можно * сделать вывод, что при инфицировании ВПГ-2 происходит активация Т1Л9-опосредо*ванного сигнального пути на уровне слизистой цервикального канала во время беременности. '
Герпесвирусная иифекция у беременных не только вызывает увеличение экспрессии гена ФНОа. в клетках слизистой цервикального: канала, но и повышает концентрацию данного цигокина на системном уровне. Проведенные исследования показали, что в группе беременных с герпесвирусной: инфекцией концентрация ФНОа в сыворотке крови; составила 125,2 ± 20,5 пкг/мл, тогда как в группе здоровых беременных ФНОа практически не определялся (6,2 ± 1,3 пкг/мл).
Ранее было отмечено, что у женщин1 с урогенитальной инфекцией в 70% случаев беременность завершалась преждевременными родами [3, 5]. Анализ данных по клиническим группам показал, что у беременных с герпесвирусной УГИ по сравнению с контрольной группой частота развития преждевременных родов была достоверно выше и составляла 53% (в России частота преждевременных родов составляет 7-10% от общего числа родов) [21]. Вероятно, одним из механизмов развития преждевременных родов у беременных с герпесвирусной инфекций является ВПГ-2-индуцированное повышение выработки ФНОа, поскольку ранее было показано, что у женщин с преждевременными родами увеличивалась продукция- провоспалительных цитокинов (ФНОа, ИФНу, ИЛ-1(3, ИЛ-6) [21]. Кроме того, уровни» ФНОа в сыворотке крови значительно повышались в случае реализации внутриутробного-инфицирования [6, 17].
Обобщая полученные нами и другими8 авторами данные относительно* факторов врожденного» иммунитета у беременных с урогенитальной инфекцией, можно, предположить, что избыточная экспрессия генов ТЬЯ9 клетками слизистой цервикального« канала при герпесвирусной инфекции и увеличение продукции: ФНОа на локальном уровне и. в сыворотке крови, с большой' вероятностью оказывает негативное влияние на течение* беременности. Таким образом, гиперактивацию клеточных факторов врожденного иммунитета за счет ТЬК9-опосредованного ответа на- инфекцию, вызванную ВПГ-2, и, как следствие, чрезмерную выработку провоспалительных цитокинов (в частности, ФНОа) можно рассматривать как один из механизмов развития преждевременных родов и других осложнений беременности.
С учетом полученных результатов и данных литературы была составлена возможная схема участия механизмов врожденного иммунитета в. патогенезе преждевременных родов у беременных с герпесвирусной! инфекцией (рис. 17).
Согласно данной схеме, при действии инфекционного агента (в частности, герпесвирусов) происходит активация факторов врожденного иммунитета через систему ТЫ^з, за счет распознавания белков оболочки вирионов и вирусной ДНК рецепторами ТЪЫ2 и Т1Л9, соответственно. Активация факторов врожденного иммунитета заключается в повышенной продукции провоспалительных цитокинов и индукции воспалительных процессов в женском репродуктивном тракте. Острый воспалительный процесс в тканях сопровождается изменением протеинов внеклеточного матрикса, активацией протеаз и увеличением синтеза простагландинов, способствующих преждевременному развитию родовой деятельности. Таким образом, под действием инфекционного агента запускается каскад воспалительных реакций, приводящий к активации миометрия, раскрытию шейки матки и преждевременному разрыву плодных оболочек, что в свою очередь, может стать причиной развития преждевременных родов [17, 70, 80, 92, 99, 101, 114]. Воздействие инфекционного агента ( (вирусная ДНК, белки оболочки ВПГ) У
Активации специфических рецепторов
Секреция провоспалительных цитокинов (ФНОа, МЛ-1,6,8 и др.) Активация воспалительных процессов на I уровне женского репродуктивного тракта
Преждевременный разрыв плодных оболочек
Простаглаидинов
Активация миометрия
Раскрытие шейки матки
Л^ІГ и» 1. ш щ
Рис. 17. Схема развития преждевременных родов при герпесвнрусной урогенитальной инфекции у беременных женщин.
Схема составлена на основе полученных результаюв и данных литературы [17, 70, 80, 92, 99, 101, 114].
Обобщая полученные результаты и данные литературы, можно сделать вывод о том, что механизмы иммунной системы, в том числе и на уровне врожденного иммунитета, вносят существенный вклад в патогенез осложнений гестационного процесса и развития преждевременных родов, вызванных инфекционными агентами, в частности ВПГ-2.
Выявленные изменения в экспрессии генов ТЬЯ9,1\ПР-кВ и ФНОа в клетках слизистой цервикального канала и повышенная продукция ФНОа в сыворотке крови у беременных с герпесвирусной инфекцией, вероятно, в комплексе могут служить прогностическими критериями повышенного риска развития преждевременных родов.
Список использованной литературы по медицине, диссертация 2011 года, Григорьева, Оксана Юрьевна
1. Адаскевич В.П. Инфекции, передаваемые половым путём. Руководство для врачей. — Н. Новгород, Изд-во НГМА, 1999, 415с.
2. Анохин В.А., Хаертынов Х.С., Хасанова F.P. Внутриутробная инфекция (Клиника, диагностика и профилактика) — М., Медицина, 1999,95 с. \ . •
3. Ганковская Л.В., Романовская В.В., Фензелева В.А. Увеличение уровня экспрессии TLR2 у беременных женщин при урогенитальной инфекции. Аллергология и иммунология в педиатрии 2006, №2-3(9): 66
4. Ганковская O.A., Зверев В.В. Взаимодействие вирусов и Т611-подобных рецепторов. Журнал: микробиологии,, эпидемиологии, и иммунобиологии.-2010.— 2. —С. 101-5.
5. Гриноу А., Осборн Д., Сазерленд III. Врождённые, перинатальные и неонатальные инфекции. — ■ М., Медицина, 2000:287.
6. Долгушина Н.В., Макацария А.Д. Вирусные инфекции' у беременных. М:, Триада-Х, 2004.8. . Исаков В.А., Борисова В.В;, Исаков Д.В. Герпес: патогенез илабораторная диагностика. Руководство для врачей. СПб. Лань, 1999. -192 с. ч
7. Исаков В.А., Рыбалкин С.Б. , Романцов М.Г. Герпесвирусная инфекция: Рекомендации для врачей. — СПб., 2006. — 96 с. Кицак В.Я. Вирусные инфекции беременных: патология плода и новорожденных. Кольцово, Вектор-Бест, 2005.
8. Ковальчук JI.B., Ганковская Л:В., Баркевич O.A., Лавров В.Ф. Естественный иммунитет и герпетическая инфекция. Вопросы вирусологии. 2006;3:4-9.
9. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Рубакова Э.И. Система цитокинов. М., Янус-К, 2001.
10. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Хорева М.В. и др., Система цитокинов, современные методы иммунного анализа// М:, 2001. Козлова В.И., Пухнер А.Ф. Вирусные, хламидийные имикоплазменные заболевания, гениталий: Руководство для врачей.
11. Изд.б-е, обновл. и доп. М., Триада-Х, 2003: 440.
12. Кокряков В.Н. Очерки о врождённом иммунитете. СПб, «Наука», 2006:261.
13. Краснопольский В.И., Тареева Т.Г., Малиновская В.В., Шугинин И.О., Микаелян A.B., Никольская И.Г., Федотова A.B., Ефанов A.A. -Мониторинг беременных с вирусными инфекциями семейства герпеса. М., Ферон, 2006.
14. Макаров О.В., Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Ганковская O.A. Невынашивание беременности, инфекция,врожденный иммунитет. М., ГЭОТАР-Медиа, 2007.
15. Маниатис Т. и др., Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М., Мир, 1984.
16. Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю., Семенов П.А., Савилова A.M., Кофиади И.А., Абрамов Д.Д. ПЦР в "реальномвремени". Изд.2-ое, испр. М. БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009: 224 с.
17. Сидорова И.С., Кулаков В.И., Макаров И.О.Руководство по акушерству. М. Медицина, 2006. - 1033 с.
18. Симбирцев A.C. Цитокины — новая система регуляции защитных реакций организма. Цитокины и воспаление, 2002; 1(1): 9—16. Сметник В.П., Тумилович Л.Г. Неоперативная гинекология: Руководство для врачей. Изд.2-е, перераб. — СПб. Сотис, 1995. 224 с.
19. Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С., Кудряшова A.B.,I
20. Иммунологическая загадка беременности. Иваново, изд. МИК, 2005: 276.
21. Стентон Гланц.Медико-биологическая статистика. М., Практика, 1999.
22. Сухих Г.Т., Ванько Л.В. Генитальный герпес: иммунологические аспекты. М., Миклош, 2010.
23. Федосеева В.Н., Порядин Г.В., Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н., Коган В.Ю. Руководство по иммунологическим и аллергологическим методам в гигиенических исследованиях. М., Промедэк, 1993. — 320 с.
24. Хаитов P.M. Физиология иммунной системы//М., 2001, 188 с.30.. Харламова Ф.С., Егорова Н.Ю., Гусева JI.H., Гусева Н.А., Новосад Е.В., Чернова Е.В., Учайкин В.Ф. Вирусы семейства герпеса и иммунитет. Детские инфекции 2006;5(3):3-10.
25. Херрингтон С., Макги Дж., Молекулярная клиническая диагностика. Методы//М. изд. «Мир», 1999.
26. Ярилин А.А. Основы иммунологии. М., Медицина, 1999.
27. Abrahams VM, Bole-Aldo Р, Kim YM, Straszewski-Chavez SL, Chaiworapongsa T, Romero R; Мог G. Divergent trophoblast responses to bacterial products mediated by TLRs. J Immunol. 2004 Oct 1; 173(7):4286-96.
28. Abrahams VM, Schaefer TM, Fahey JV, Visintin I, Wright JA, Aldo PB, Romero R, Wira CR, Мог G. Expression and secretion of antiviral factors by trophoblast cells following stimulation by the TLR-3 agonist, Poly(I : C).Hum Reprod^ 2006 Sep; 21(9):2432-9.
29. Abrahams VM, Visintin I, Aldo PB, Guller S, Romero R, Мог G. A, role for TLRs in the regulation of immune cell migration by first trimester trophoblast cells.J Immunol: 2005 Dec 15; 175(12):8096-104.
30. Aflatoonian R, Fazelr A. Toll-like receptors in female reproductive tract and their menstrual cycle dependent expression. J Reprod Immunol. 2008 Jan; 77(1):7-13.
31. Akhtar J, Shukla D. Viral entry mechanisms: cellular and viral mediators of herpes simplex virus entry. FEBS J. 2009 Dec; 276(24):7228-36. Epub 2009 Nov 15.
32. Albiger B, Dahlberg S, Henriques-Normark B, Normark S. Role of the innate immune system in host defence against bacterial infections: focus on the Toll-like receptors.J Intern Med. 2007 Jun;261(6):511-28. Epub 2007 May 5.
33. Andersen JM, Al-Khairy D, Ingalls RR. Innate immunity at the mucosal surface: role of toll-like receptor 3 and toll-like receptor 9 in cervical epithelial cell responses to microbial pathogens. Biol Reprod. 2006 May; 74(5):824-31.
34. Anzivino E, Fioriti D, Mischitelli M, Bellizzi A, Barucca V, Chiarini F, Pietropaolo V. Herpes simplex virus infection in pregnancy and in neonate: status of art of epidemiology, diagnosis, therapy and prevention. Virol J. 2009 Apr 6; 6:40.
35. Beauman JG.Genital herpes: a review.Am Fam Physician. 2005 Oct 15;N72(8): 1527-34.
36. Bowie AG. Translational mini-review series on Toll-like receptors: recent advances in understanding the role of Toll-like receptors in anti-viral immunity. Clin Exp Immunol. 2007 Feb; 147(2):217-26. Epub 2007 Jan 15.
37. Clark R, Kupper T. Old meets new: the interaction between innate and adaptive immunity.J' Invest Dermatol 2005 Oct; 125(4):629-37. Epub 2005 Oct 1.
38. Coll RC, O'Neill LA. New insights into the regulation of signalling by toll-like receptors and nod-like receptors. J Innate Immun. 2010; 2(5):406-21.
39. Corey L, Wald A. Maternal and neonatal herpes simplex virus infections. N Engl J Med. 2009 Oct 1; 361(14):1376-85.
40. Dasgupta G, Chentoufi AA, Nesburn AB, Wechsler SL, BenMohamed L. New concepts in herpes simplex virus vaccine development: notes from the battlefield: Expert Rev Vaccines. 2009 Aug; 8(8): 1023-35: Epub 2009 Aug 1.
41. Dennehy KM, Brown GD. The role of the beta-glucan receptor Dectin-1 in control of fungal infection. J Leukoc Biol. 2007 Aug; 82(2):253-8. Epub 2007 Aug. 15.
42. Gonzalez JM, Xu H, Ofori E, Elovitz MA. Toll-like receptors in the uterus, cervix, and placenta: is pregnancy an immunosuppressed state? Am J Obstet Gynecol. 2007 Sep; 197(3):296.el-6.
43. Hart KM, Murphy. AJ, Barrett KT, Wira CR, Guyre PM, Pioli PA. Functional expression of pattern recognitions receptors in tissues of the human female reproductive tract. J Reprod Immunol. 2009 Jun; 80 (1 -2):33-40. '
44. Hopkins PA, Sriskandan S.Mammalian Toll-like receptors: to immunityand beyond.Clin Exp Immunol. 2005 Jun; 140(3):395-407.
45. Janssens S, Beyaert R.Role of Toll-like receptors in pathogenrecognitibn-eiin MicrobiollRev. 2003'Oct; 16(4):637-46:
46. Kawai; T, Akira SI The role of pattern-recognition receptors in innate:immunity: update on Toll-like receptors. Nat Immunol; 2010 May;11(5):373-84: \
47. Kawaii T, Akira; SiTER signalings, Gelli Death Differ:: 2006s May; 13(5):816-25.
48. Kelly RW, King AE, Critchley HO. Cytokine control in human endometrium. Reproduction. 2001 Jan; 121(1):3-19.
49. Kurt-Jones EA, Chan M, Zhou S, Wang J; Reed G, Bronson R, Arnold
50. MM, Knipe DM, Einberg RW. Herpes simplex virus 1 interaction with113
51. Toll-like receptor 2 contributes to lethal encephalitis. Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Feb 3; 101(5):1315-20.
52. Lee MS, Kim YJ. Pattern-recognition receptor signaling initiated from extracellular, membrane, and cytoplasmic space.Mol Cells. 2007 Feb 28; 23(1):1-10.
53. Leroy MJ, Dallot E, Czerkiewicz I, Schmitz T, Breuiller-Fouche M. Inflammation of choriodecidua induces tumor necrosis factor alphamediated apoptosis of human myometrial cells.Biol Reprod. 2007 May;V76(5):769-76.
54. Li H, Li X, Wei Y, Tan Y, Liu X, Wu X. HSV-2 induces TLRs and NF-kappaB-dependent cytokines in cervical epithelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 2009 Feb 13; 379(3):686-90.
55. Liang Y, Zhou Y, Shen P. NF-кВ and Its Regulation on the Immune System. Cell Mol Immunol. 2004 Oct; l(5):343-50.
56. Lin Z, Xu J, Jin X, Zhang X, Ge F. Modulation of expression of Toll-like receptors in the human endometrium. Am J Reprod Immunol. 2009 May; 61(5):338-45.
57. Liu G, Zhao Y. Toll-like receptors and immune regulation: their directand indirect modulation on regulatory CD4+ CD25+ T cells.i1.munology. 2007 Oct; 122(2): 149-56.
58. Lyttle B, Chai J, Gonzalez JM, Xu H, Sammel M, Elovitz MA. The negative regulators of the host immune response: an unexplored pathway in preterm birth. Am J Obstet Gynecol. 2009 Sep; 201(3):284.el-7.
59. Manicassamy S, Pulendran B. Modulation of adaptive immunity with Toll-like receptors. Semin Immunol. 2009 Aug; 21(4): 185-93. Epub 2009 Jun 6.
60. Martin TR, Frevert CW. Innate immunity in the lungs.Proc Am Thorac Soc. 2005;2(5):403-ll.
61. McGowin CL, Ma L, Martin DPI, Pylés RB. Mycoplasma genitalium-encoded MG309 activates NF-kappaB via Toll-like receptors 2 and 6 to elicit proinflammatory cytokine secretion from human genital epithelial cells. Infect Immun. 2009 Mar; 77(3): 1175-81,
62. McGowin GL, Pyles RB. Mucosal treatments for herpes simplex virus: insights on targeted immunoprophylaxis and' therapy. Future Microbiol; 2010 Jan; 5(1): 15-22.
63. Montero Vega MT,. de: Andrés Martín. A; The: significance: of toll-like receptors: in«human diseases. Allergoli Immunopathol (Madr); 2009' Sep-Oct; 37(5):252-63. ^ '
64. Mukhopadhyay S, Fierre J,. Brown GD, Gordon S. The potential for Tolllike receptors to collaborate with: other innate immune receptors: Immunology. 2004 Aug; 112(4):521-30
65. Nasu K,. Itoh H, Yuge A, Nishida M, Narahara H. Human¡ oviductáf epithelial cells express Toll-like receptor 3 and respond to double-stranded RNA: Fallopian tube-specific mucosal immunity against, viral infection. Hum Reprod. 2007 Feb; 22(2):356-61.
66. Nasu K, Narahara Hi Pattern recognition via the toll-like receptor system in the human female genital tract. Mediators Inflamm. 2010. Epub 2010 April1.
67. Netea MG, Sutmuller R, Hermann C, Van der Graaf CA, Van der Meer
68. JW, van Krieken JH, Hartung T, Adema G, Kullberg BJ. Toll-like115receptor 2 suppresses immunity against Candida albicans through induction of IL-10 and regulatory T cells. J Immunol. 2004 Mar 15; 172(6):3712-8.
69. Novak N, Peng WM. Dancing with the enemy: the interplay of herpes simplex virus with dendritic cells. Clin Exp Immunol. 2005 Dec; 142(3):405-10.
70. Ozato K, Tailor P, Kubota T.The interferon regulatory factor family in host defense: mechanism of action.J Biol Chem. 2007 Jul 13; 282(28):20065-9.
71. Parker LC, Prince LR, Sabroe I.Translational mini-review series on Tolllike receptors: networks regulated by Toll-like receptors mediate innate and adaptive immunity.Clin Exp Immunol. 2007 Feb; 147(2): 199-207. Epub 2007 Feb.
72. Patni S, Flynn P, Wynen LP, Seager AL, Morgan G, White JO, Thornton CA. An introduction to Toll-like receptors and their possible role in theinitiation of labour. BJOG. 2007 Nov; 114(11): 1326-34. Epub 2007 Sep 27.
73. Patni S, Wynen LP, Seager AL, Morgan G, White JO, Thornton CA. Expression and activity of Toll-like receptors 1-9 in the human term placenta and changes associated with labor at term. Biol Reprod. 2009 Feb;80(2):243-8. Epub 2008 Sep 24.
74. Rahman MM, McFadden G. Modulation of tumor necrosis factor bymicrobial pathogens.PLoS Pathog. 2006 Feb;2(2):e4.
75. Riley JK, Nelson DM. Toll-like receptors in pregnancy disorders and placental dysfunction. Clin Rev Allergy Immunol. 2010 Dec; 39(3): 18593.
76. Sandor F, Buc M.Toll-like receptors. I. Structure, function and their ligands.Folia Biol (Praha). 2005; 51(5): 148-57.
77. Sandor F, Buc M.Toll-like receptors. II. Distribution, and pathways involved in TLR signalling.Folia Biol (Praha). 2005; 51(6): 188-97. Epub 2005.
78. Sentman CL, Wira CR, Eriksson M'. NK cell function in the human'female reproductive tract. Am J Reprod Immunol. 2007 Feb; 57(2): 108«15.
79. Shimizu T, Kida Y, Kuwano K. Ureaplasma parvum lipoproteins,including MB antigen, activate NF-kappaB through TLR1, TLR2 and TLR6. Microbiology. 2008 May; 154(Pt 5):1318-25.
80. Song J, Abraham SN. Innate and adaptive immune responses in the urinary tract. Eur J Clin Invest. 2008 Oct; 38 Suppl 2:21-8. Epub 2008 Aug 15.
81. Song J, Abraham SN. TLR-mediated immune responses in the urinary tract. Curr Opin Microbiol. 2008 Feb;l l(l):66-73. Epub 2008 Feb 1.
82. Takeda K, Akira S. Toll-like receptors: Curr/Protoc Immunol. 2007 May; Chapter 14: Unit 14.12.
83. Trinchieri G, Sher A. Cooperation! of Toll-like receptor, signals in innate immune defence. Nat Rev Immunol. 2007 Mar; 7(3):179-90.
84. Tsan MF, Gao B. Endogenous ligands of Toll-like r receptors. J Leukoc Biol. 2004 Sep; 76(3):514-9.
85. Tse K, Horner AA. Update on toll-like receptor-directed therapies for human disease. Ann Rheum Dis. 2007 Nov; 66 Suppl 3: 77-80.
86. Uematsu S, Akira S. Toll-like receptors and Type I interferons. J Biol Chem. 2007 May 25; 282(21):15319-23.
87. Varner MW, Esplin MS. Current understanding of genetic factors in preterm birth. BJOG. 2005 Mar; 112 Suppl 1:28-31.
88. Vider-Shalit T, Fishbain V, Raffaeli S, Louzoun Y. Phase-dependent immune evasion of herpesviruses. J Virol. 2007 Sep;81(17):9536-45.
89. Wang J, Hu Y, Deng WW, Sun B. Negative regulation of Toll-like receptor signaling pathway. Microbes Infect. 2009 Mar; ll(3):321-7. Epub 2009 Jan 3.
90. Wang Y, Zhang P, Liu Y, Cheng- G. TRAF-mediated regulation of immune and inflammatory responses. Sci China Life Sci. 2010* Feb; 53(2): 159-68. Epub 2010 Mar 7.
91. Watts C, West MA, Zaru R. TLR signalling regulated antigen*presentation in dendritic cells. Curr Opin Immunol. 2010 Feb; 22(l):124-30. Epub 2010 Jan 18.
92. Wells JM, Rossi O, Meijerink M, van Baarlen P. Epithelial! crosstalk at the microbiota-mucosal interface. Proc Natl AcadfSci U S A. 2011 Mar 15; 108 Suppl 1:4607-14. Epub 2010 Sep 8.
93. Werling D, Jann OC, Offord V, Glass EJ, Coffey TJ. Variation matters: TLR structure and species-specific pathogen recognition. Trends Immunol. 2009 Mar; 30(3):124-30. Epub 2009 Feb 9.
94. Willment JA, Brown GD. C-type lectin receptors in antifungal immunity. Trends Microbiol. 2008 Jan;16(l):27-32. Epub 2007 Dec 21.
95. Yao XD, Rosenthal KL. Herpes simplex virus type 2 virion host shutoff protein suppresses innate dsRNA antiviral pathways in human vaginal epithelial cells. J Gen Virol. 2011 Sep; 92(Pt 9): 1981-93. Epub 2011 Jun 1.
96. Yu L, Wang L, Chen S. Endogenous toll-like receptor ligands and their biological significance. J Cell Mol Med. 2010 Nov; 14(11):2592-603.
97. Zeytun A, Chaudhary A, Pardington P, Cary R, Gupta G. Induction of cytokines and chemokines by Toll-like receptor signaling: strategies for control of inflammation. CritRev Immunol. 2010; 30(l):53-67.
98. Zhu J, Mohan C. Toll-like receptor signaling pathways—therapeutic opportunities. Mediators Inflamm. 2010; 2010:781235. Epub 2010 Oct 17.