Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Экспериментальное обоснование использования супероксиддисмутазы и флер-энзима при неспецифических вульвовагинитах

На правах рукописи

— —■ "

КАРТАШЕВСКАЯ Рита Асатуровна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СУПЕ РОКС И ДД И С МУ Т АЗ Ы И ФЛЕР-ЭНЗИМА ПРИ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ВУЛЬВОВАГИНИТАХ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Старая Купавна 2003

Работа выполнена в Краснодарском научном центре Российской академии медицинских наук и администрации Краснодарского кра и Кубанской государственной медицинской академии

Научный руководитель - член-корреспондент РАМН, доктор

медицинских наук, профессор Галенко-Ярошевский Павел Александрович

заслуженный деятель народного образования Украины, доктор медицинских наук, профессор Дроговоз

Светлана Мефодиевна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Ковалева Виолетта Леонидовна

доктор медицинских наук, профессор Духанин Александр Сергеевич

Ведущая организация - ГУ НИИ фармакологии

им. В.В.Закусова РАМН

Защита состоится «_»_2003 г. в __часо]

на заседании диссертационного совета Д 217.004.01 при Всерос сийском научном центре по безопасности биологически активны веществ (ВНЦ БАВ) по адресу: 142450, Московская обл., п. Стара Купавна, ул. Кирова, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНЦ БАВ.

Автореферат разослан «_»_2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

профессор Корольченко Л.В

Научный консультант -

Л

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Широко распространёнными заболеваниями в гинекологии являются неспецифические вульвовагиниты, которые по своей сущности являются полиэтиологическими и полипатогенетическими заболеваниями и имеют тенденцию к хронизации процесса. Так, у амбулаторных гинекологических больных вульвовагиниты занимают одно из первых мест по частоте заболеваний женских половых органов. Современными исследованиями доказано (Н.И.Агаджанов и соавт., 1989; Е.Л.Левицкий, Ю.И.Губский, 1994; В.В.Абрамченко и соавт., 1995), что, несмотря на многообразие этиологических факторов, в патогенезе большинства гинекологических заболеваний ведущая роль принадлежит активации процессов свободнорадикального окисления (СРО). При избыточной генерации активных форм кислорода процесс СРО принимает каскадный характер, что приводит к липид-липидным и белок-липидным нарушениям биомембран с последующим освобождением из лизосом протеолитических ферментов, которые обладают про-оксидантным действием, разобщению процессов окислительного фос-форилирования и нарушению сопряженного с ним тканевого дыхания и, как результат, к тяжелому дисбалансу клеточного метаболизма (М.В. Биленко, 1991; В.В.Абрамченко и соавт., 1995; Е.В.Омельянюк, С.Э. Покровский, 1997; В.З.Ланкин и соавт., 2001; Fantone, Ward, 1982). В свою очередь метаболиты СРО интенсифицируют каскад преобразований арахидоновой кислоты, способствуют накоплению в очаге воспаления полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЯЛ), активация которых также сопровождается образованием свободных радикалов (В.В.Абрамченко и соавт., 1995; Е.В.Омельянюк, С.Э.Покровский, 1997; Brune Kay, 1983; Fantone, Ward, 1982). Таким образом, при вульвовагинитах возникает замкнутый круг, способствующий поддержанию незатухающего воспалительного процесса.

Согласно литературным данным, применение в комплексном лечении гинекологических заболеваний антиоксидантов (а-токоферола ацетата, кверцетина, аскорбиновой кислоты и др.) способствует более бы-

строму их купированию, нормализует антиокислительный гомеостаз, уменьшает интенсивность процессов перекисного окисления липидов, улучшает метаболические процессы в организме (В.И.Грищенко и со-авт., 1993; С.Б. Матвеев, 1994; В.В.Абрамченко и соавт., 1995; К.А.Походун,1995). Этот факт открывает перспективы использования препаратов с антиокислительным действием, в частности супероксид-дисмутазы (СОД) и флер-энзима, для местного и системного применения в гинекологической практике.

Известно, что эндогенная СОД является одним из компонентов антиокислительной системы организма и действует на начальных стадиях СРО, препятствуя деструктивному действию 0{ (Т.А.Девяткина, 1990; М.В.Биленко, 1991; Ю.И.Губский и соавт., 1994; В.В.Абрамченко и соавт., 1995; Н.ГГурин, 1997; В.З.Ланкин и соавт., 2001).

Исходя из вышеизложенного, изучение эффективности антиокислительной терапии с применением СОД и препаратов, ее содержащих, например флер-энзима, в лечении вульвовагинитов представляется актуальным.

Целью настоящего исследования явилось экспериментальное обоснование возможности применения супероксиддисмутазы и флер-энзима при лечении неспецифических вульвовагинитов.

Для достижения поставленной цели необходимо было выполнить следующие задачи:

1. Изучить лечебное, профилактическое и лечебно-профилактическое действие СОД и флер-энзима при экспериментальном феноловом вульвовагините.

2. Изучить лечебное, профилактическое и лечебно-профилактическое действие СОД и флер-энзима при экспериментальном "механическом" вульвовагините.

3. Исследовать иммуномодулирующую активность СОД при феноловом и "механическом" вульвовагинитах.

4. Исследовать противомикробную активность СОД.

Новизна исследования состоит в обосновании возможности при-

менения антиоксидантов СОД и флер-энзима (в условиях местного и системного действия) при вульвовагинитах.

Разработаны модели экспериментальных фенолового и "механического" вульвовагинитов у крыс.

Показано, что СОД и флер-энзим проявляют более выраженное лечебное, профилактическое и лечебно-профилактическое действие в условиях фенолового и "механического" вульвовагинитов, чем а-токо-ферола ацетат и облепиховое масло, взятые для сравнения.

Показано, что изучаемые антиоксидантные препараты повышают общий иммунный статус: при феноловом вульвовагините снижают общий уровень комплемента (СОД - в 1,3, флер-энзим - в 1,2 раза) и уровень низкомолекулярных циркулирующих иммунных комплексов (СОД -в 1,8, флер-энзим - в 1,4 раза), при "механическом" вульвовагините уменьшают общий уровень комплемента (СОД - в 1,2 раза, флер-энзим - 1,1 раза) и уровень низко- и высокомолекулярных циркулирующих иммунных комплексов (СОД - в 1,7 и 1,8 раза, флер-энзим - в 1,4 и 1,5 раза соответственно).

Научно-практическая значимость работы. Результаты исследований антиоксидантных и антицитолитических свойств СОД и флер-энзима обосновывают целесообразность их дальнейшего доклинического изучения с целью представления в Фармакологический комитет МЗ РФ для получения разрешения на клинические испытания в качестве препаратов, используемых при лечении неспецифических вульвовагинитов.

Данные об антиоксидантных и антицитолитических свойствах СОД и флер-энзима включены в программу обучения студентов на кафедрах фармакологии Кубанской государственной медицинской академии (КГМА) и Ростовского государственного медицинского университета.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. СОД и флер-энзим при экспериментальных феноловом и "механическом" вульвовагинитах обладают выраженными антиоксидантны-ми и антицитолитическими свойствами, превосходя в этом отношении

а-токоферола ацетат и облепиховое масло, взятые для сравнения.

2. СОД и флер-энзим проявляют выраженное иммуномодулирую-щее действие, повышая общий иммунный статус экспериментальных животных.

Апробация работы. Материалы и положения диссертации доложены и обсуждены на конференции "Медицина будущего" (г. Сочи, 2002 г.) и на расширенных заседаниях (16.05.2002 г., 18.09.2002 г. и 22.10.2003 г.) Краснодарского краевого отделения Российского научного общества фармакологов с приглашением представителей отдела экспериментальной фармакологии Краснодарского научного центра РАМН и администрации Краснодарского края (КНЦ РАМН и АКК), кафедр фармакологии, клинической фармакологии, госпитальной терапии, поликлинической терапии, акушерства и гинекологии факультета усовершенствования врачей, хирургии педиатрического и стоматологического факультетов, патологической физиологии, пропедевтики внутренних болезней КГМА, Российского научного центра функциональной хирургической гастроэнтерологии (г. Краснодар).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах компьютерного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследований, 2 главы собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, научно-практические рекомендации, список литературы и приложения.

Работа иллюстрирована 16 рисунками и 30 таблицами. Библиография включает 178 источников литературы, из которых 142 отечественных и 30 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ I. Материалы и методы исследований

Опыты выполнены на 262 белых крысах-самках массой 180 - 220 г.

Исследовались препараты: СОД (Си-2п-супероксиддисмутаза) и крем флер-энзим на основе Си-7п-С0Д, полученные в Санкт-Петербургском НИИ особо чистых биопрепаратов концерна "Росбиопром" из эритроцитов человека, а также а-токоферола ацетат (витамин Е) и об-лепиховое масло, взятые для сравнения.

СОД, флер-энзим и препараты сравнения вводили в лечебном, профилактическом и лечебно-профилактическом режимах (табл. 1).

Таблица 1

Дозы и режим введения СОД-содержащих и референс препаратов при изучении их эффективности на моделях вульвовагинитов у крыс

Режим введения Дни эксперимента Вводимая доза

лечебный 1-5 формирование патологии 6-9 введение препаратов 10 забой СОД -в/м 0,02 мг/кг Флер-энзим - 0,1 г во влагалище а-токоферола ацетат-в/м 10мг/кг Облепиховое масло - 0,1 г во влагалище

профилактический 1-4 введение препаратов 5-9 формирование патологии 10 забой СОД - в/м 0,02 мг/кг Флер-энзим - 0,1 г во влагалище а-токоферола ацетат - в/м 10 мг/кг Облепиховое масло - 0,1 г во влагалище

лечебно-профилактический введение препаратов в течение 5 суток за 1 час и через 2 часа после вызывания потологии 6 забой СОД - в/м 0,02 мг/кг Флер-энзим - 0,1 г во влагалище а-токоферола ацетат - в/м 10 мг/кг Облепиховое масло - 0,1 г во влагалище

Экспериментальные вульвовагиниты (феноловый и "механический") моделировали по разработанным нами методам. Феноловый вульвовагинит вызывали по следующей схеме: в утренние часы в вагину через металлический зонд вводили 5% раствор фенола из расчета 0,1 мл на 100 г массы животного в течение 5 суток 4 раза. Первое и второе, а также третье и четвертое введения осуществляли с интервалом 24 часа, между вторым и третьим введением интервал составил 48 часов. Механический вульвовагинит вызывали в течение 5 суток следующим образом: скарификатор вводили в вагину на глубину 3-5 мм, проворачивали там 5 раз и извлекали.

Действие препаратов оценивали по следующим показателям: площадь некроза слизистой оболочки влагалища, состояние слизистой обо-

лочки (отёк, гиперемия, эрозия, количество точечных кровоизлияний). Перед исследованием и в конце его у крыс измеряли температуру тела (в прямой кишке), определяли количество лейкоцитов и скорость оседания эритроцитов (СОЭ). Состояние слизистой оболочки влагалища оценивали в баллах, которые присваивали в зависимости от выраженности признаков: "—" признак отсутствует, "+" признак выражен незначительно, "++" признак выражен умеренно, "+++" признак выражен сильно. Затем определяли сумму баллов по указанным выше параметрам. При этом точечные кровоизлияния подсчитывали с помощью лупы (увеличение в 7 раз). Площадь некроза слизистой влагалища рассчитывали на основе данных, измеряемых с помощью штангенциркуля.

Показатели цитолиза — аспартатаминотрансферазу (АсАТ) и кислую фосфатазу (КФ) - определяли по А.М.Алексеевой (1956) и В.С.Камышникову (2000).

Интенсивность процессов липопироксидации оценивали по уровню малонового диальдегида (МДА) (Т.Н.Фёдорова и соав., 1983); антиоксидантного гомеостаза - по уровню каталазы, СОД, глутатион-Б-трансферазы (Г-Б-ТР) и глутатионпероксидазы (ГПР) по методам , описанным С.Чебарис и соавт. (1985) и В.С.Гуревич и соавт. (1990).

Изучение влияния СОД и флер-энзима на показатели иммунно-реактивности (циркулирующие иммунные комплексы - ЦИК и Е-розеткообразование - Е-РОК) и неспецифической резистентности (активность фагоцитоза, общего комплемента) у крыс при модельных вульвовагинитах проводили по методам, описанным И.В.Нестеровой и соавт., 1996).

Исследование антимикробной активности СОД проводили1 методом "колодцев", т.е. диффузии в агаре. Об активности препарата судили по зоне роста тест-культуры (в мм). Для определения антимикробной активности использовали эталонные штаммы ВОЗ и музейные

' Исследования выполнены в Харьковском национальном фармацевтическом университете на кафедре микробиологии (зав. кафедрой - доктор медицинских наук, профессор И.Л.Дикой) совместно с профессором И.Л.Диким, за что выражаем ему благодарность.

культуры грамотрицательных микроорганизмов: Egcherichia coli (АТСС 25922), Pseudomonas aeruginosa (АТСС 27853), Proteus vulgaris (АТСС 4636), Staphylococcus aureus (АТСС 14990), Streptococcus faecium, Bacillus subtilis, Clostridium perfringens A 28 (BK 6K), а также дрожжевые грибы Candida albicans и плесневые Penicillium crustaceum и Aspergillus fumigatus. При этом использовали суспензии микроорганизмов в физиологическом растворе, конечная стандартная плотность для которых составляла 2-10 КОЕ /мл фазы. Для аэробных микроорганизмов использовали односуточные культуры, для анаэробных - двухсуточные, для грибов - односуточные.

Результаты исследований обрабатывали методом вариационной статистики с учетом t - критерия Стьюдента (M.JI.Беленький, 1963; Л.Н.Сернов, В.В.Гацура, 2000) с использованием разработанных на кафедре фармакологии КГМА программ для ЭВМ IBM PC XT.

II. Результаты исследований и их обсуждение

Феноловый и "механический" вульвовагиниты, моделированные нами у крыс, сопровождались симптоматикой, характерной для клиники неспецифических вульвовагинитов у женщин (табл. 2).

Таблица 2

Признаки, характеризующие неспецифические вульвовагиниты у женщин и экспериментальные феноловый и "механический" у крыс

Женщины с Животные

Показатель вульвоваги- с вульвовагинитами

нитом феноловым "механическим"

1 2 3 4

Болевой синдром + ? 7

Выделения из влагалища ++ + +

Эрозии, геморрагии + ++ ++

Лейкоцитоз + + +

Повышение СОЭ + + +

Гипертермия ++ + +

Окончание таблицы 2

1 2 3 4

Активация СРО + + +

Активация цитолиза + -н- +

Воспаление + + +

Снижение активности + + +

антиокислительных сис-

тем

"+" признак выражен умеренно;"++" признак выражен достаточно сильно;"?" наличие признака проверить не удается.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что у экспериментальных животных с феноловым вульвовагинитом наблюдаются множественные эрозии, геморрагии, язвы; отмечается выраженный лейкоцитоз, увеличение СОЭ и гипертермия. Это может быть обусловлено тем, что фенол оказывает как местное повреждающее действие на слизистые оболочки (за счет денатурации белка), так и резор-бтивное. Так, площадь поражения вульвы у крыс по сравнению с ин-тактными животными составляла 57%, количество точечных кровоизлияний 60%. Температура тела повышалась в 1,2 раза, количество лейкоцитов увеличилось на 43,6%, СОЭ - на 45,7%. Имела место активизация СРО, что подтверждалось увеличением уровня МДА в 1,4 раза, а каталазы - в 1,8 раза. Наблюдалось повышение общего комплемента на 50%.

Как известно, при взаимодействии с белками фенол не образует с ними прочной связи, поэтому одна молекула фенола может реагировать со многими молекулами белка. Очевидно, эта реакция происходит и при взаимодействии фенола с ферментами-антиоксидантами: СОД, Г-Б-ТР, ГПР, каталазой и др. Результаты проведенных опытов свидетельствуют о том, что при феноловом вульвовагините активность этих ферментов понижается в среднем на 30 - 50%. Так как в функционировании ферментативного звена антиоксидантной системы тиоловые соединения играют важную роль (дегидрогеназы пентозомонофосфатного и трикарбонового циклов - Г-Б-ТР; ГПР и каталаза являются тиолами), то 8

взаимодействие с ними фенола приводит к активации процессов СРО на 45%. Очевидно, это обусловлено несколькими причинами. Во-первых, фенол, обладая высокой липофильностью, приводит к активации процессов СРО. Взаимодействуя с фосфолипидами биомембран, фенол вызывает цитотоксические эффекты, о чем свидетельствует наблюдавшееся нами при феноловом вульвовагините повышение уровней АсАТ и КФ (маркеров цитолиза) на 98 и 16%. Кроме того, гипертран-саминаземия является косвенным свидетельством развившегося при вульвовагините энергодефицита, т.к. АсАТ является важной составляющей функционирования цикла Кребса.

Нами установлено, что при феноловом вульвовагините активность эндогенных СОД, Г-Б-ТР и ГПР снижается, а активность каталазы несколько увеличивается. Это может быть обусловлено тем, что СОД, Г-Б-ТР и ГПР оказались более чувствительными к повреждающему действию фенола, чем каталаза, которой "пришлось" взять на себя антиокислительные функции других эндогенных ферментов. Известно, что каталаза обладает способностью высвобождать НАДФ-Н, когда клетки находятся в условиях окислительного стресса (П.А. Галенко-Ярошевс-кий и соавт., 2001). Это способствует активации глутатион-редуктазы и стимулирует функционирование глутатион-пероксидазы по утилизации Н202. ГПР катализирует разложение не только Н202, но и гидроперекисей липидов, перекисей холестерина и стероидов.

Использование изучаемых нами антиоксидантов для лечения и профилактики фенолового вульвовагинита дало положительный эффект, реализуемый по разным механизмам. Анализ суммарного показателя ("общее количество баллов") местного действия изучаемых антиоксидантов показал, что наибольшее цитопротекторное действие на слизистую влагалища в лечебном, профилактическом и лечебно-профилактическом режимах оказывает флер-энзим. Аналогичная закономерность прослеживалась и при сравнении протекторного действия изучаемых антиоксидантов на площадь поражения вульвы и влагалища. Наибольший эффект (42,1, 12,7 и 58,6%) наблюдался при всех режи-

мах введения флер-энзима. Однако наиболее значимым этот показатель был при лечебно-профилактическом введении флер-энзима (58,6%).

Флер-энзим и СОД ингибировали процесс СРО путем дисмутации 02*. Это способствовало обрыву цепей окисления и, следовательно, ин-гибированию процессов перекисного окисления липидов. Так, уровень МДА под влиянием СОД в лечебном режиме введения был на 20,2%, а флер-энзима на 17,2% меньше, чем в контрольной группе животных. Действие флер-энзима и СОД в лечебно-профилактическом режиме введения на уровень МДА было примерно одинаковым и составляло 27,2 и 28,2% соответственно. Антиоксидантное действие препаратов в лечебно-профилактическом режиме было значительно выше, чем в профилактическом (табл. 3).

Таблица 3

Сравнительная протекторная активность (при лечебном, профилактическом и лечебно-профилактическом режимах) СОД, флер-энзима, а-токоферола ацетата и облепихового масла в условиях фенолового вульвовагинита у крыс

Условия опыта Общее количество баллов1 Площадь поражения в мм2 МДА, мМ/л АсАТ, мМ/л

1 2 3 4 5

Режимы введения: - лечебный

Интактные животные 0 0 7,1 ± 0,3 0,89 ± 0,06

Нелеченные животные (контроль) 9,1 ±0,1 5,7 ± 0,4 9,9 ± 0,9* 1,79 ±0,7*

сод 6,1 ± 0,2** 4,6 ±0,3** [19,3] 7,9 ± 0,9** [20,2] 1,46 ±0,5** [18,4]

Продолжение таблицы 3

1 2 3 4 5

Флер-энзим 5,4 ± 0,2** 3,3 ± 0,4** [42,5] 8,2 ± 0,7** [17,2] 1,50 ±0,3 [16,2]

а-токоферола ацетат 6,8 ± 0,2** 4,9 ± 0,5 [14Д] 8,0 ±0,5** [19,2] 1,56 ±0,4 [12,8]

Облепиховое масло 3,9 ±0,1** 3,6 ± 0,4** [36,8] 8,5 ±0,6** [14,2] 1,60 ±0,7 [10,6]

- профилактический

Интактные животные 0 0 7,1 ±0,3 0,89 + 0,06

Нелеченные животные (контроль) 5,9 ±1,4 7,1 ±0,1 10,0 ±0,5* 1,80 ±0,7*

сод 5,2 ± 1,3** 6,7 ± 0,2** [5,6] 8,9 ± 0,9** [11,0] 1,59 ±0,5** [П,7]

Флер-энзим 4,3 ± 0,9** 6,2 ± 0,2** [12,7] 9,2 + 0,7 [8,0] 1,70 ±0,3 [5,6]

а-токоферола ацетат 5,4 ±1,5 6,9 ± 0,2 [2,8] 9,3 ±0,5 [7,0] 1,76 ±0,4 [2,2]

Облепиховое масло 5,6 ±1,1 6,8 ±0,1 [4,2] 9,5 ±0,6 [5,0] 1,73 ±0,6 [3,9]

- лечебно-профилактический

Интактные животные 0 0 7,0 ± 0,3 0,89 ± 0,06

Нелеченные животные (контроль) 7,9 + 0,1 5,8 + 1,4 10,3 ± 1,0* 1,80 ±0,6*

сод 3,8 + 0,2** 3,1 +0,2** [46,6] 7,4 ±0,9** [28,2] 1,40 ±0,6** [22,2]

Окончание таблицы 3

1 2 3 4 5

Флер-энзим 2,5 ±0,1** 2,4 ±0,1** 7,5 ± 0,8** 1,46 ±0,7**

[58,6] [27,2] [18,9]

а-токоферола 4,3 ± 0,2** 3,8 ± 0,4** 8,2 ±0,6** 1,51+0,3**

ацетат [34,5] [20,4] [16,1]

Облепиховое 4,5 ± 0,3** 3,8 ±0,5** 8,3 ±0,5** 1,53 ±0,6**

масло [34,5] [19,4] [15,0]

'Отражает характер поражения вагины при визуальном осмотре (наличие отека, гиперемии, эрозии и количество точечных кровоизлияний). * -р< 0,05 по отношению к интактным животным. ** -р< 0,05 по отношению к нелеченным животным.

Примечание. В квадратных скобках - показатели, выраженные в %.

Препараты СОД, используемые при феноловом вульвовагините, защищали другие ферменты-антиокислители от повреждения, что обеспечивало стационарность протекания процессов СРО и, кроме того, определенный мембранопротекторный эффект. При этом местная лекарственная форма СОД - флер-энзим - действовала аналогично внутримышечному введению СОД, что, по-видимому, обусловлено фармако-кинетическими параметрами крема.

Ингибирование цитолитических процессов как в лечебном, так и в лечебно-профилактическом режимах было выше под влиянием СОД (на 18,4 и 22,2 %), чем при местном использовании флер-энзима (на 16,2 и 18,9 %) (табл. 3).

Таким образом, устранение возникшего при вульвовагините "дефицита" эндогенной СОД приводит к "восполнению" и её действия.

а-токоферола ацетат также ингибировал процессы СРО и защищал ферменты-антиокислители от повреждения. Однако этот препарат действует на более поздних стадиях СРО, когда уже произошло нарушение интимных структур клеток активными формами кислорода и их метаболитами. Мембранопротекторные свойства а-токоферола ацетата обу-12

словлены его способностью встраиваться в мембрану с образованием комплексов между метальными группами боковой цепи токоферола и двойными связями полиненасыщенных жирных кислот. Наиболее выраженное мембранопротекторное действие а-токоферола ацетат оказал при лечебно-профилактическом режиме введения, наименьший - при профилактическом. Аналогичная тенденция наблюдалась и по антиокислительному эффекту а-токоферола ацетата: наиболее выражено он действовал при лечебно-профилактическом режиме введения (16,1 %).

Эффективность местного применения при феноловом вульвоваги-ните облепихового масла была ниже, чем у всех исследованных нами антиокислительных препаратов. Это может быть обусловлено невысокой всасываемостью облепихового масла со слизистой вагины и, как следствие этого, низкой выраженностью резорбтивного участия его в биохимических процессах (табл. 3).

Низкая эффективность местного применения облепихового масла подтверждена последующими исследованиями показателей иммунного ответа при феноловом вульвовагините под влиянием антиоксидантов.

Феноловый вульвовагинит у крыс сопровождался изменениями клинических показателей крови - анемией, лейкоцитозом, увеличением СОЭ. Это связано как с непосредственным токсическим действием фенола на мембранные структуры эритроцитов, так и его токсическим действием на органы кроветворения.

Как известно из данных литературы (Н.В.Адрианов, В.Ю.Уваров, 1988) и полученных нами результатов исследований, фенол способствует гемолизу эритроцитов. Нами установлено, что использование антиоксидантов способствует уменьшению токсических проявлений фенолового вульвовагинита, о чем свидетельствует уменьшение лейкоцитоза и СОЭ. Следует отметить, что эффективность действия актиокси-дантов выражена по-разному. Наибольшее действие наблюдается при применении СОД: уровень лейкоцитов уменьшался в 1,2 раза, а СОЭ -в 1,3 раза (р < 0,05). Близкие к этим результаты имели место при введении флер-энзима. Что же касается а-токоферола ацетата и облепихово-

го масла, то они лишь вызывали тенденцию к уменьшению изучаемых показателей. В целом эффективность препаратов по этим показателям менялась следующим образом: СОД > флер-энзим > а-токоферола ацетат > облепиховое масло.

Нами установлено, что экспериментальный феноловый вульвова-гинит сопровождается значительными нарушениями иммунной системы (рис. 1 и 2). Так, в сравнении с интактными животными уровень общего комплемента увеличивался в 1,7 раза, активность фагоцитоза возрастала в 1,6 раза, количество Е-РОК уменьшалось в 1,6 раза, уровни низко- и высокомолекулярных ЦИК возрастали соответственно в 3,3 и 6,0 раза. Образовавшиеся ЦИК активируют систему комплемента с последующим повреждением мембран эритроцитов и их гемолизом. Одной из причин увеличения уровня ЦИК при феноловом вульвоваги-ните, по-видимому, является усиленное образование и поступление экзо- и эндоантигенов и снижение их катаболизма вследствие развивающегося

Общий комплемент,

усл. гем. ЕД

Рис. 1. Влияние супероксидцисмутазы (СОД), а-токоферола ацетата (а-ТК), флер-энзима (ФЭ) и облепихового масла (ОМ) на общий комплемент при феноловом вульвовагините у крыс.

Здесь и на рис. 2-4: * - достоверно по отношению к ингактным животным (р < 0,05) ** - достоверно по отношению к контрольным животным (р < 0,05). И - интактные животные, К - нелеченные животные (контроль).

60 мин

Активность фагоцитоза, %

а-ТФ ОМ а-ТФ ОМ

Рис. 2. Влияние супероксидцисмутазы (СОД), а-токоферола ацетата (а-ТК), флер-энзима (ФЭ) и облепихового масла (ОМ) на активность фагоцитоза при феноловом вульвовагините у крыс через 30 и 60 мин.

на фоне феноловой интоксикации реактивного гепатита. Увеличение уровня общего комплемента при феноловом вульвовагините обусловлено активацией ЦИК. При этом иммунный компонент развития фенолового вульвовагинита, по-видимому, является вторичным и усугубляет цитотоксический компонент поражения.

Оба эти механизма повреждения связаны с образованием 02", поэтому применение препаратов СОД представляется патогенетически оправданным, что находит подтверждение в результатах наших исследований, свидетельствующих о более выраженном снижении под влиянием внутримышечного введения СОД и местного применения флер-энзима уровня ЦИК и общего комплемента. По степени снижения комплемента при феноловом вульвовагините в сравнении с нелеченными животными активность препаратов уменьшалась следующим образом: СОД > а-токоферола ацетат > флер-энзим > облепиховое масло. Аналогично показателям общего комплемента изменялась и активность фагоцитоза: наибольшее нормализующее влияние было у СОД-содержащих препаратов, наименьшее - у облепихового масла (табл. 4).

Таблица 4

Динамика протекторного действия СОД и флер-энзима при феноловом вульвовагините у крыс

Режим введения препарата Активность Динамика Активность в баллах

вид степень

Лечебный М + СОД > флер-энзим > а-токоферола ацетат > облепиховое масло 2

А/о ++ СОД > флер-энзим > а-токоферола ацетат > облепиховое масло

А/ц + СОД > флер-энзим > а-токоферола ацетат > облепиховое масло

Профилактический М + флер-энзим > СОД > а-токоферола ацетат > облепиховое масло 1

А/о + флер-энзим > СОД > а-токоферола ацетат > облепиховое масло

А/ц + СОД > флер-энзим > облепиховое масло > а-токоферола ацетат

Лечебно-профи-лактиче-ский М +++ флер-энзим > СОД > а-токоферола ацетат > облепиховое масло 3

А/о ++ СОД > флер-энзим > а-токоферола ацетат > облепиховое масло

А/ц + СОД > флер-энзим > а-токоферола ацетат > облепиховое масло

"+" активность 15 - 30%: 1 - наименьшее количество баллов; М - местное протекторное действие; "++" активность 30 - 40%: 2 - среднее количество баллов; А/о - антиоксидантное действие; "+++" активность больше 40%: 3 - наибольшее количество баллов; А/ц - антицитолитическое действие.

При изучении влияния СОД и флер-энзима на показатели иммуно-реактивности была выявлена подобная зависимость и для показателей иммунорезистентности.

Местное применение облепихового масла существенного влияния на нарушенные показатели иммунного статуса при феноловом вульвовагините не оказывало, что, очевидно, связано с низкой резорбтивной его активностью.

Таким образом, по степени суммарной эффективности изучаемые антиоксидантные препараты при феноловом вульвовагините можно расположить в определенной последовательности (табл. 4).

Анализ результатов проведенных исследований показал, что наиболее эффективным при феноловом вульвовагините является лечебно-профилактический режим введения, наименее эффективным - профилактический.

Эффективность применения при феноловом вульвовагините СОД и флер-энзима позволяет предположить целесообразность их использования и при других повреждениях вульвы и вагины.

Исследование действия этих препаратов при "механическом" вуль-вовагините показало, что вне зависимости от этиологического фактора механизмы реализации протекторного действия препаратов остались те же: дисмутация О2", защита антиоксидантной системы от повреждения, мембранопротекция.

При "механическом" вульвовагините протекторный эффект изучаемых СОД-содержащих препаратов был несколько выше. Очевидно, это обусловлено различной тяжестью патологии. При феноловом вульвовагините наблюдались более существенные поражения ферментативных систем, а при "механическом" - ведущим являлось воспаление, связанное с микротравмой.

При "механическом" вульвовагините степень поражения вульвы и вагины остается значительной, однако это не сопровождается тяжелыми нарушениями иммунной системы и выраженной цитолитической реакцией, как при феноловом вульвовагините.

Барьерная функция мембран обеспечивает компартментализацию клеток и гомеостаз. Поэтому механическое нарушение их сопровождается активацией протеолитических процессов и развитием цитолиза. Однако повышение уровня АсАТ, наблюдавшееся при "механическом" вульвовагините, не столь выражено, как при феноловом. В аналогичной степени происходит и активация свободнорадикальных процессов. Так, при феноловом вульвовагините имело место увеличение уровня МДА на 40%, а при "механическом" - на 35%. Это еще раз доказывает важность активации процессов СРО клеточных мембран слизистой оболочки влагалища при моделированной патологии (табл. 5).

Очевидно, при микротравмах вульвы и вагины ведущим показателем является площадь поражения. Мембранные изменения могут иметь как локальный, так и диссеминированный характер. Локальные повреждения обусловлены гибелью мембранных структур лишь части орга-нелл или части клеток, которая может компенсироваться усилением ре-паративных процессов в неповрежденных структурах. Поэтому при слабо выраженном (по данным биохимических и иммунологических ис-

Таблица 5

Сравнительная протекторная активность (при лечебном, профилактическом и лечебно-профилактическом режимах) СОД, флер-энзима, а-токоферола ацетата и облепихового масла в условиях "механического" вульвовагинита у крыс

Условия опыта Общее количество баллов1 Площадь поражения в мм2 МДА, мМ/л АсАТ, мМ/л

1 2 3 4 5

Режимы введения:

- лечебный

Интактные животные 0 0 7,1 ± 0,2 0,88 ±0,06

Нелеченные

животные 7,0 ± 0,1 5,9 + 0,4 9,6 ± 0,4* 1,60 ±0,3*

(контроль)

сод 4,9 ± 0,2** 4,3 ± 0,2** 7,6 + 0,3** 1,30 ±0,2**

[27,1] [20,8] [18,8]

Флер-энзим 3,3+0,2** 2,4 ± 0,5** 8,1 ±0,5** 1,50 ±0,3

[59,5] [15,6] [6,3]

а-токоферола 6,1 ± 0,2 4,5 ±0,3** 8,0 ±0,2** 1,42 ±0,4

ацетат [23,7] [16,7] [11,3]

Облепиховое 5,5 ± 0,2 3,6 ±0,2** 8,4 ± 0,2** 1,50 ±0,5

масло [39,0] [12,5] [6,3]

- профилактический

Интактные животные 0 0 7,14 ±0,2 0,890 ± 0,06

Нелеченные

животные 5,8 ± 1,2 6,9± 0,1 10,1 ±0,4* 1,60 ±0,1*

(контроль)

Окончание таблицы 5

1 1 2 3 4 5

сод 5,2 ± 09 6,4 ± 0,3 [7,2] 8,6 ±0,5** [14,9] 1,50 ±0,05** [6,3]

Флер-энзим 4,1 ±0,4** 6,2 ± 0,4** [10,1] 9,1 ±0,2 [9,9] 1,47 ±0,1 [8Д]

а-токоферола ацетат 5,1 ± 1,2 6,5 ± 0,3 [5,8] 9,3 ± 0,2 [7,9] 1,50 ±0,1 [6,3]

Облепиховое масло 5,5 ± 1,4** 6,1 ±0,4** [11,6] 9,5 ±0,3 [5,9] 1,52 ±0,1 [5,0]

- лечебно-профилактический

Интактные животные 0 0 7,0 ± 0,3 0,89 ± 0,06

Нелеченные животные (контроль) 8,0 ± 0,4 5,9 ±0,4 11,2± 0,5* 1,92 ±0,01*

сод 3,7 ±0,4** 3,4 ± 0,2** [42,4] 7,8 ± 0,2** [30,4] 1,54 ±0,02** [19,8]

Флер-энзим 2,7 ±0,3** 2,4 ± 0,4** [59,3] 7,9 ±0,3** [29,5] 1,52 ±0,07** [18,9]

а-токоферола ацетат 4,2 ±0,5** 3,7 ±0,4** [37,3] 8,8 ± 0,4** [21,4] 1,61 ±0,1** [16,1]

Облепиховое масло 5,1 ±0,9** 3,9 ± 0,4** [33,9] 8,9 ± 0,5** [20,5] 1,65 ±0,08** [1514,1]

'Отражает характер поражения вагины при визуальном осмотре (наличие отека, гиперемии, эрозии и количество точечных кровоизлияний). * -р< 0,05 по отношению к интактным животным. ** -р< 0,05 по отношению к нелеченным животным. Примечание. В квадратных скобках - показатели, выраженные в %.

следований) повреждении вульвы и вагины более целесообразно представляется использование местных лекарственных форм (рис. 3 - 4).

Общий комплемент, усл. гем. ЕД

67,2*

СОД а„ТФ

Рис. 3. Влияние супероксидцисмутазы (СОД), а-токоферола ацетата (а-ТК), флер-энзима (ФЭ) и облепихового масла (ОМ) на общий комплемент при "механическом" вульвовагините у крыс.

30 мин 60 мин

И К СОД ФЭ И К СОД ФЭ

а-ТФ ОМ а-ТФ ОМ

Рис. 4. Влияние супероксидцисмутазы (СОД), а-токоферола ацетата (а-ТК), флер-энзима (ФЭ) и облепихового масла (ОМ) на активность фагоцитоза при "механическом" вульвовагините у крыс через 30 и 60 мин.

Так как ведущим компонентом в патогенезе "механического" вуль-вовагинита является воспалительный, то применение препаратов СОД патогенетически оправдано.

Результаты проведенных нами опытов свидетельствуют (табл. 5), что а-токоферола ацетат и облепиховое масло оказывают менее выраженный протекторный эффект, чем СОД и флер-энзим, а-токоферола ацетат и облепиховое масло действуют на более поздних стадиях воспаления, когда каскад свободнорадикальных превращений уже запущен 0{, и показывают соответственно менее эффективные результаты.

Сравнительное исследование при "механическом" вульвовагините трех режимов использования изучаемых антиоксидантов - лечебного, профилактического и лечебно-профилактического - показало, что наиболее эффективными являются первый и третий (табл. 5).

Как видно из таблицы 6, флер-энзим при местном применении в

Таблица 6

Динамика протекторного действия СОД и флер-энзима при "механическом" вульвовагините у крыс

Режим введения препарата Активность Динамика Активность в баллах

вид степень

Лечебный м +++ флер-энзим > облепиховое масло > СОД > а-токо-ферола ацетат 2

А/о ++ СОД = а-токоферола ацетат > флер-энзим > облепиховое масло

А/ц + СОД > флер-энзим > а-токоферола ацетат > облепиховое масло

Профилактический м + Облепиховое масло =флер-энзим > СОД > а-токо-ферола ацетат 1

А/о + СОД > флер-энзим > а-токоферола ацетат > облепиховое масло

А/ц + флер-энзим > СОД = а-токоферола ацетат >облепиховое масло

Лечебно-профи-лактиче-ский М ++ флер-энзим > СОД > а-токоферола ацетат > облепиховое масло 3

А/о +++ СОД > флер-энзим > а-токоферола ацетат > облепиховое масло

А/ц ++ + СОД > флер-энзим > а-токоферола ацетат > облепиховое масло

"+" активность 15 - 30%: 1 - наименьшее количество баллов, М - местное протекторное действие; "++" активность 30 - 40%: 2 - среднее количество баллов, А/о - антиок-сидантное действие; "+++" активность больше 40%: 3 - наибольшее количество баллов, А/ц- антицитолитическое действие.

лечебном и лечебно-профилактическом режимах введения был эффективнее всех сравниваемых препаратов по влиянию на площадь поражения вульвы. Вместе с тем в данных режимах введения он уступал СОД по антиоксидантному и антицитолитическому действию, но при этом был эффективнее облепихового масла и а-токоферола ацетата. В профилактическом режиме введения по устранению механических повреждений вульвы наиболее эффективным было облепиховое масло, по антиоксидантному действию - СОД, по антицитолитическому - флер-энзим.

Таким образом, наиболее эффективными антиоксидантами при феноловом и "механическом" вульвовагинитах оказались СОД и флер-энзим.

В связи с тем, что вульвовагиниты в большинстве случаев индуцируются неспецифической микрофлорой (М.М.Васильев и соавт., 1998; В.КДурягин, 1999; Ленинджер, 1985), представляло интерес исследовать противомикробную и противогрибковую активность СОД.

Установлено, что СОД не оказывает сколько-нибудь значимого влияния на рост микробных и грибковых тест-культур.

ВЫВОДЫ

1. Препарат СОД (Си-гп-супероксидцисмутаза) при внутримышечном введении крысам в условиях экспериментальных фенолового и "механического" вульвовагинитов оказывает выраженное лечебно-профилактическое, лечебное и менее значимое профилактическое действие, превосходя а-токоферола ацетат при всех режимах введения.

2. Флер-энзим (на основе Си-2п-супероксидцисмутазы) при местном применении (в виде крема) у крыс в условиях экспериментальных фенолового и "механического" вульвовагинитов проявляет выраженное лечебно-профилактическое, лечебное и менее значимое профилактическое действие, превосходя облепиховое масло при всех режимах введения.

3. Одним из основных механизмов протекторных свойств препаратов СОД и флер-энзима в условиях экспериментальных фенолового и "механического" вульвовагинитов у крыс могут быть их антиоксидант-ное, антицитолитическое и иммуномодулирующее действие.

4. Препарат СОД не оказывает существенного антимикробного действия на аэробные и анаэробные бактерии, а также патогенные дрожжевые грибы.

5. Разработанные экспериментальные феноловый и "механический" вульвовагиниты у крыс могут быть использованы в качестве моделей при поиске и создании новых лекарственных средств для лечения вульвовагинитов.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Препарат СОД и флер-энзим рекомендуются для более углубленного доклинического изучения (хронической токсичности) с последующим представлением их в Фармакологический комитет МЗ РФ с целью получения разрешения на клинические испытания в качестве лекарственных средств для лечения неспецифических вульвовагинитов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Использование антиоксиданта супероксиддисмутазы в гинекологии. (Р.А.Карташевская, С.М.Дроговоз, П.А.Галенко-Ярошевский) //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2002. - Приложение 2. - С. 73 - 75.

2. Иммунологические аспекты использования веществ, содержащих СОД, при вульвовагините. (Р.А.Карташевская, С.М.Дроговоз, П.А.Галенко-Ярошевский) //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2002. - Приложение 2. - С. 93 - 95.

3. Использование иммунокорректирующих свойств СОД-содержащих веществ при модельном вульвовагините. (Р.А.Карташевская, С.М.Дроговоз, П.А.Галенко-Ярошевский) //Сборник материа-

лов научно-практической конференции "Медицина будущего", - Краснодар - Сочи, 2002. - С. 108.

4. Фармакологическое изучение кардиопротекторных и иммуномо-дулирующих свойств супероксидцисмутазы. (Р.А.Карташевская, С.М. Дроговоз, П.А.Галенко-Ярошевский) //Сборник материалов научно-практической конференции "Медицина будущего", - Краснодар - Сочи, 2002.-С. 108.

5. Сравнительная характеристика эффективности использования антиоксиданта супероксиддисмутазы в гинекологии. (Р.А.Карта-шевская, С.М.Дроговоз, П.А.Галенко-Ярошевский) //Сборник материалов научно-практической конференции "Медицина будущего", - Краснодар - Сочи, 2002. - С. 109.