Автореферат и диссертация по медицине (14.01.07) на тему:Экспериментальное изучение протеолитической профилактики избыточного рубцевания в хирургии глауком

На правах рукописи

Макарова Анна Сергеевна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ИЗБЫТОЧНОГО РУБЦЕВАНИЯ В ХИРУРГИИ ГЛАУКОМ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

14.01.07 — глазные болезни

Москва - 2013

Т- 4 ^ Г 2013

005535705

Диссертационная работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт глазных болезней» Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Ермолаев Алексей Павлович

Официальные оппоненты:

Алексеев Игорь Борисович, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Министерства здравоохранения РФ, профессор кафедры офтальмологии

Ловпаче Джамиля Нурийдиновна, кандидат медицинских наук, ФГБУ «Московский научно-исследовательский институт глазных болезней им. Гельмгольца» Министерства здравоохранения РФ, научный сотрудник отделения глаукомы

Ведущая организация: Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Московской области «Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского»

Защита состоится «11» ноября 2013 г. в 14.00 на заседании диссертационного совета Д 001.040.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт глазных болезней» Российской академии медицинских наук по адресу: 119021, Москва, ул. Россолимо, д. 11, корп. А, Б.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИГБ» РАМН. Автореферат разослан «_»_2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Иванов М.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

В настоящее время глаукома является одной из наиболее частых причин развития слепоты и слабовидения. Ежегодно вновь заболевает глаукомой 1 из 1000 человек в возрасте старше 40 лет. Около 5,2 миллионов человек в мире страдает этим заболеванием (Либман Е.С., 2000). И до 20% слепых потеряли свое зрение вследствие глаукомы (Нестеров А.П., 2008).

Несмотря на большое разнообразие медикаментозных препаратов и их высокую гипотензивную эффективность, хирургические способы лечения не уступают своих позиций и остаются наиболее результативными и широко распространенными методами лечения глаукомы (Краснов М.М. 1966-1994; Нестеров А.П., 1982-1999; Traverso С.Е. et al. 1987-2000; McHam M.L. et al., 1994; Еричев В.П.,1996-1999; Greve E.L. et al. 1996-2000). Однако с течением времени гипотензивный эффект антиглаукомных операций (АГО) постепенно снижается. Большинство авторов в качестве основной причины этого называют процессы избыточного рубцевания (ИР) тканей глаза в зоне хирургического вмешательства. Рубцовые изменения снижают гипотензивную эффективность хирургически образованных путей оттока и создают условия для повышения офтальмотонуса в послеоперационном периоде. В повторных операциях нуждается до 30% больных.

Определяющую роль в развитии ИР после АГО принадлежит местным трофическим изменениям соединительной ткани дренажной системы глаза и склеры. Эти проявления многообразны. Прежде всего, речь идет о деструкции коллагеновых волокон разной степени выраженности (Шмырева В.Ф., Зиан-гирова Г.Г., 2007). Местные трофические изменения служат основой развития аутоиммунных процессов, что создает предрасположенность к развитию послеоперационного воспаления, активации коллагенеза и, как следствие этого, грубому рубцеванию вновь созданных путей оттока водянистой влаги после АГО. Кроме того, операционная травма с рассечением хорошо кровоснабжае-мых тканей глаза вызывает процесс асептического воспаления с привлечением

в рану макрофагов, которые участвуют в регуляции пролиферативных процессов, активируя деление фибробластов, эпителиальных, эндотелиальных клеток, способствуют ангиогенезу (Шмырева В.Ф., 1988; Лебедев О.И. с соавт., 1989; Ловпаче Д.Н., 2000; Хорошилова-Маслова И.П., Ганковская Л.В., Ери-чев В.П., 2000; Cordero F.et. al., Khaw P.T. et. al., Chang L.et al., 2000). Активный процесс коллагенеза препятствует формированию желаемого исхода АГО — формированию нежного порозного рубца в зоне раневого канала.

Развитие ИР в зоне операции в 15-45% случаев диктует необходимость разработки действенных мер, направленных на предотвращение блокады хирургически созданных путей оттока новообразованной соединительной тканью (Алексеев В.Н., 1983-1986; Нестеров А.П., Егоров Е.А., Бабушкин А.Э., 1990; Лебедев О.И.,1981-2000; Зуев В.К. с соавт, 2000).

Один из способов борьбы с послеоперационным рубцеванием - это использование цитостатиков, что позволяет влиять непосредственно на процесс образования соединительной ткани. В этой области наибольшее применение в клинической практике получили два препарата: 5-фторурацил (5-ФУ) и мито-мицин С. Цитостатики используются, как правило, интраоперационно в виде аппликаций на склеральное ложе, либо в виде субконъюнктивальных инъекций в послеоперационном периоде. Однако, несмотря на успех применения этих препаратов (по данным разных авторов от 65,5 % до 89 %), следует остановиться на побочных действиях антиметаболитов, ограничивающих их широкое распространение в клинической практике (дефекты эпителия и бул-лезная кератопатия — до 69 %, фистула фильтрационной подушки (ФП) — до 36 %, прогрессирование катаракты — до 10%, цилиохориоидальная отслойка — до 14 %, в более редких случаях — синдром мелкой камеры, расхождение краев конъюнктивальной раны, макулопатия) (Mermoud A. et al, 1993; Zacharia P.T. et al, 1993; Krupin Т.Н. et al, 1995; Casson R. et al, 2001; Song A. et al, 2002).

Известны попытки улучшить результаты ATO путем профилактики ИР с помощью применения в послеоперационном периоде различных протеолити-

ческих ферментов (гиалуронидазы, фибринолизина, коллализина, папаина) в виде инсталляций и субконъюнктивальных инъекций. Назначение ферментных препаратов после оперативного формирования путей оттока внутриглазной жидкости (ВГЖ) патогенетически обосновано, так как подавляет естественную воспалительную реакцию в зоне вмешательства и, соответственно, снижает интенсивность репаративных процессов, замедляется процесс формирования новообразованной рубцовой ткани, она «размягчается» и увеличивается ее проницаемость для камерной влаги (Копущинская Р.Ф. и соав., 1978; Старков Г.Л., Савиных В.И., 1979; Киселев Г.А. и соав., 1984; Лебедев О.И., 1989; Полунин Г.С., 1989).

Однако, либо по причине необходимости использования больших объемов дорогостоящих ферментных препаратов, либо из-за небольшого количества экспериментальных и клинических данных, либо по причине нестабильности ферментного препарата при парэнтералыюм его введении и быстрой его инактивации в организме человека, эти предложения не получили широкого распространения.

Учитывая вышеизложенное, а также тот факт, что в настоящее время отсутствует радикальный метод борьбы с ИР в хирургии глауком, актуальным является поиск веществ, обладающих ингибирующим на репаративную регенерацию действием, а также способствующих рассасыванию уже сформировавшейся рубцовой ткани. На сегодняшний день в качестве одного из перспективных медикаментов, который может быть использован с этой целью в хирургии глауком, может рассматриваться отечественный препарат лонгидаза. Данное лекарственное средство не применялось ранее в офтальмологии, однако по известным характеристикам препарата можно предположить о его возможной высокой эффективности в противодействии ИР после АГО. Для того, чтобы можно было перейти к развернутому клиническому изучению данного препарата, особое значение имеет экспериментальная стадия изучения его действия. Только на основании правильно проведенного доклинического испытания лонгидазы, изучения ее возможных пробочных действий, доказанной

эффективности и наличия перспективы получения положительных результатов возможен переход к применению ее в клинике.

Цель исследования: изучить в эксперименте влияние ферментного протеолитического препарата лонгидаза на репаративные процессы в зоне операционной травмы при фильтрующей хирургии, с целью обоснования целесообразности проведения клинических испытаний препарата для уменьшения избыточного рубцевания после антиглаукомных операций.

Задачи исследования:

1. Провести в эксперименте биомикроскопический мониторинг изменений в тканях интактного глаза после субконъюнктивального введения препарата лонгидаза в различных дозах и режимах.

2. Выявить характер гистологических изменений в тканях интактного глаза кролика при субконъюнктивальном введении препарата лонгидаза в различных дозах и режимах.

3. Определить в эксперименте безопасную дозу и схему введения препарата лонгидаза при использовании его в качестве противорубцового средства в послеоперационном периоде после фильтрующих операций.

4. Провести в эксперименте изучение терапевтической эффективности безопасных доз препарата лонгидаза при использовании после фильтрующих операций, сравнить его эффективность и раздражающее воздействие с цито-статическими препаратами.

5. Обосновать целесообразность клинического использования и разработать алгоритм перспективного клинического исследования по применению лонгидазы в послеоперационном периоде после антиглаукомных операций для профилактики избыточного рубцевания в зоне хирургического вмешательства.

Научная новизна. В условиях эксперимента на животных впервые подтверждена безопасность использования и противорубцовая эффективность нового отечественного препарата лонгидаза, при применении его для профилактики и устранения рубцовой блокады вновь созданных путей оттока после б

фильтрующих операций. Полученные данные открывают возможность для проведения клинического исследования, направленного на повышение эффективности антиглаукомных операций и могут быть использованы как базисные для построения дизайна и алгоритма предстоящего клинического исследования.

Практическая значимость. Полученные результаты позволили вплотную приблизиться к проведению клинических исследований лонгидазы в качестве противорубцового препарата в хирургии глаукомы, что имеет большое практическое значение для повышения эффективности оперативного лечения данного заболевания. Полученные результаты позволяют построить концепцию и определить алгоритм для дальнейшего развернутого клинического исследования с расчетом безопасности и эффективности экспериментально обоснованных доз.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Лонгидаза — новый отечественный препарат, экспериментальное изучение которого показало его безопасность по отношению к тканям глаза в исследованных терапевтических дозах.

2. По данным проведенного комплексного исследования, лонгидаза обладает противорубцовой эффективностью, влияя на характер репаративных процессов после антиглаукомных операций.

3. Изучение действия лонгидазы на ткани глаза и ее влияния на течение раневого процесса после фильтрующих операции в эксперименте, дает основание для перехода к обоснованному клиническому исследованию по использованию препарата с целью профилактики избыточного тканевого рубцевания после антиглаукомных операций.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены, доложены и обсуждены на заседании проблемной комиссии ФГБУ «НИИГБ» РАМН (Москва, 2013 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, 3 из них — в журналах, входящих в перечень рецензируемых журналов и изданий, рекомендованных ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 107 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 35 рисунками и 5 таблицами. Список литературы содержит 145 источников (75 отечественных и 70 зарубежных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования

Экспериментальное исследование проводили в два этапа на глазах 40 половозрелых кроликов породы «Шиншилла» (80 глаз) весом от 2,5 до 3 килограммов. В работе были использованы препараты: лонгидаза (представлен в виде лиофилизата для приготовления раствора для внутримышечного и подкожного введения в дозировке 1500 ЕД и 3000 ЕД в стеклянном флаконе), производимый НПО «ПЕТРОВАКС ФАРМ» (Россия), и 5-ФУ (прозрачная жидкость в стеклянных флаконах 250 мг/5 мл), производитель «Верофарм», Россия.

Проведённая работа была разделена на 2 этапа. Целью первого этапа было исследование токсичности препарата лонгидаза при ее субконъюнкти-вальном введении. Эксперимент проводили на глазах 20 кроликов, которые были разделены на 4 группы по 5 животных в каждой. Раствор препарата готовили непосредственно перед инъекцией, растворителем служила вода для инъекций в объеме 0,3 мл. Препарат вводили под конъюнктиву правого глаза на 12 часах. Левый глаз служил в качестве контрольного, под конъюнктиву которого вводили соответствующее количество растворителя (вода для инъекций).

Кроликам I группы вводили по 1500 ЕД препарата в количестве 5 инъекций ежедневно. Кроликам II группы вводили по 1500 ЕД препарата в количестве 5 инъекций через день. Кроликам III группы вводили по 3000 ЕД препарата в количестве 5 инъекций ежедневно. Кроликам IV группы вводили по 3000 ЕД препарата в количестве 5 инъекций через день. 8

Глаза каждого кролика обследовали до начала эксперимента, во время и после его завершения при помощи биомикроскопии. Каждому кролику на протяжении всего периода наблюдения закапывали раствор сульфацил-натрия 20 % в оба глаза. Кролика выводили из эксперимента, а глаза энуклеировали в сроки с 8 до 18 суток для гистологического исследования.

По результатам первого этапа экспериментального исследования определены схемы введения и дозы лонгидазы, обладающие наименьшим токсическим эффектом, которые затем применяли на втором этапе работы.

Во второй части экспериментальной работы планировали оценить влияние препарата лонгидаза на состояние созданных в результате АГО путей оттока ВГЖ при назначении его в послеоперационном периоде в виде подконъ-юнктивальных инъекций. Исследование проводили на глазах 20 кроликов, которые были разделены на 4 группы по 5 животных в каждой. Всем кроликам была произведена АГО (модифицированная синусотрабекулэктомия) на правом глазу.

Схема операции: под инстилляционной анестезией 0,5% раствором проксиметакаина производили разрез конъюнктивы по лимбу в верхненаружном сегменте, а затем конъюнктивальный лоскут отсепаровывали дистально с проведением местного гемостаза. Выкраивали поверхностный склеральный лоскут прямоугольной формы основанием к лимбу, размером 2x3 мм на 1/2 толщины склеры. В основании его формировали микроскопическое отверстие иглой 27С (0,4 мм в диаметре) в дренажной зоне до начала фильтрации ВГЖ, после чего лоскут укладывали обратно. Конъюнктивальный лоскут герметизировали двумя узловыми швами (шелк 8/0). В качестве антибактериальной терапии всем животным после операции в течение всего срока наблюдения инсталлировали раствор сульфацил-натрия 20 % 2-3 раза в сутки.

Кроликам I группы (контрольной) проводили только вышеупомянутую терапию (в течение всего срока наблюдения инсталлировали раствор сульфацил-натрия 20% 2-3 раза в сутки).

Кроликам II группы, начиная с 1-го послеоперационного дня, под конъюнктиву вводили препарат 5-ФУ: от 1 до 5 инъекций в зону, смежную с операционной зоной через день. Для более наглядной оценки зависимости проти-ворубцового эффекта от количества инъекций 5-ФУ, было предложено лабораторным животным делать различное количество инъекций. В соответствии с его порядковым номером: одному животному делали всего одну инъекцию, второму — 2, третьему — 3, четвертому — 4, пятому — 5. Кроликам III и IV группы вводили по 1500 и 3000 ЕД препарата лонгидаза (соответственно) под конъюнктиву рядом с операционной зоной, придерживаясь такой же схемы.

Биомикроскопическую оценку состояния тканей глаза в области операции производили ежедневно. Для гистологического исследования опытные глаза энуклеировали на 5, 11 и 18 сутки. Результаты обследований заносились в индивидуальную карту, заведенную для каждого животного.

Характеристика препарата: лонгидаза является ферментным препаратом, зарегистрированным в России (ЛС - 000764) как лекарственное средство с доказанной эффективностью для профилактики и комплексного лечения гиперплазии соединительной ткани (спаечные, фиброзно-гранулематозные, рубцовые, фиброзные процессы). Препарат обладает ферментативной протео-литической (гиалуронидазной) активностью пролонгированного действия, иммуномодулирующими, хелатирующими, антиоксидантными и противовоспалительными свойствами. Пролонгирование действия фермента достигается ковалентным связыванием фермента с физиологически активным высокомолекулярным носителем (активированным производным 1Ч-оксида поли-1,4-этиленпиперазина, аналогом полиоксидония), обладающим собственной фармакологической активностью: оказывает иммуномодулирующее, детоксика-ционное, антиоксидантное действие. Благодаря указанным свойствам, лонгидаза обладает не только способностью деполимеризовать матрикс соединительной ткани в фиброзных образованиях, но и подавлять реакцию, направленную на синтез компонентов соединительной ткани. Лонгидаза не

обладает антигенными свойствами, митогенной, поликлональной активностью, не оказывает аллергизирующего, мутагенного, эмбриотоксического, тератогенного и канцерогенного действия.

Препарат показан к применению в составе комплексной терапии при заболеваниях, сопровождающихся фиброплазией: в пульмонологии (пневмо-фиброз, туберкулез, альвеолит, туберкулема), гинекологии (спаечный процесс в малом тазу) при развитии воспаления по интерстициальному типу, в ортопедии (контрактуры суставов, артриты, гематомы), хирургии (спаечная болезнь, длительно незаживающие раны), косметологии (келоидные, гипертрофические, втянутые рубцы после пиодермии, травм, ожогов, операций), в дерматовенерологии (ограниченная склеродермия различной локализации), для увеличения биодоступности лекарственных и диагностических препаратов.

Биомикроскопиго производили на щелевой лампе БЬ — 75 (Ор1оп, ФРГ). Обследование всех животных проводили до начала эксперимента и далее ежедневно в течение двух недель.

На первом этапе работы биомикроскопически оценивали: состояние конъюнктивы в месте инъекции: степень гиперемии (0 — отсутствие, 1 - слабая, 2 — умеренная, 3 — выраженная); степень отека (0 — отсутствие, 1 — слабая, 2 — умеренная, 3 — выраженная); состояние роговицы: снижение прозрачности, нарушение целостности эпителиального слоя, наличие инфильтратов, изменение толщины роговицы; состояние прозрачности сред глаза; наличие розового рефлекса с глазного дна.

Во второй части эксперимента с помощью биомикроскопии оценивали состояние фильтрационной подушки (ФП) в глазах животных четырех сформированных групп по следующей схеме:

1. ширина (0 — отсутствие, 1 — маленькая, 2 — средняя, 3 — разлитая);

2. высота (0 — отсутствие, 1 - маленькая, 2 - средняя, 3 - высокая);

3. степень локальной гиперемии (0 - отсутствие, 1 - слабая, 2 - умеренная, 3 — выраженная).

Интенсивность репаративных процессов в зоне хирургического вмешательства оценивали по состоянию ФП. Для более объективной оценки функционального состояния ФП применяли способ, разработанный в ФГБУ «НИИ Глазных болезней» РАМН (программа для ЭВМ «Гиперемия-3», номер государственной регистрации 2010610642, зарегистрирована 18.01.2010).

Полученное числовое значение отражало интенсивность гиперемии интересующего участка в процентном отношении и классифицировано нами соответственно одной из вышеупомянутых степеней, которую наблюдали при биомикроскопии: 0 (гиперемия отсутствует) < 3%, 1 (гиперемия слабая) 4-11%, 2 (гиперемия умеренная) 12-21%, 3 (гиперемия выраженная) >21%.

Для гистологического исследования на первом этапе эксперимента энуклеации проводили в группах I и III - на 8 и 15 сутки, в группах II и IV — на 11 и 18 сутки. На втором этапе работы энуклеации опытных глаз I группы проводили на 5, 11 и 18 сутки, во II, III и IV группах - на 11 сутки. Энуклеиро-ванные глаза фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина в течение 2-3 суток. После промывания в проточной воде вырезали центральную колодку в сагиттальной плоскости, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заливали в парафин. Серийные парафиновые срезы толщиной 5-8 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и заключали в канадский бальзам на предметном стекле. Полученные гистологические препараты исследовали на «Фотомикроскопе III» («Оптон», Германия). Фоторегистрацию изображений осуществляли на цифровую фотовидеокамеру в составе аппаратно-программного комплекса МЕКОС-ФДММ (ЗАО «МЕКОС», Москва).

Статистический анализ и оценка достоверности получаемых результатов проведены с помощью программы Microsoft Excel 2010. Для выявления центральной тенденции распределения рассчитывали Медиану (Me). Статистический анализ результатов проводили с использованием методов непараметрической статистики (U-критерий Манна-Уитни и R коэффициент ранговой корреляции Спирмена).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В настоящей работе проведено изучение противорубцовой эффективности нового отечественного препарата лонгидаза, обладающего ферментативной протеолитической (гиалуронидазной), иммуномодулирующей и противовоспалительной активностью. Экспериментальная работа была произведена в два этапа: I этап — исследование токсического влияния препарата на конъюнктиву и другие структуры глаза; II этап — исследование противорубцовой эффективности безопасных доз препарата.

Результаты первого этапа экспериментального исследования показали, что введение лонгидазы в дозах 1500 и 3000 ЕД субконъюнктивально при обоих режимах введения (ежедневно или через день) сопровождалось только развитием признаков местного воспаления: отмечали появление локального отека и гиперемии конъюнктивы. Ни в одном случае не было отмечено каких-либо изменений в других структурах глазного яблока.

Первая инъекция, независимо от того, была ли это лонгидаза или вода для инъекций, вызывала развитие отека и гиперемии конъюнктивы 2 степени на обоих глазах у всех кроликов. Дальнейшее течение воспалительного процесса имело небольшие различия во всех группах.

Тенденцию к наиболее быстрому снижению отечности и гиперемии конъюнктивы наблюдали во II группе (пятикратное введение 1500 ЕД лонгидазы через день), эти явления к 18 дню практически отсутствовали. В данной группе на протяжении всего периода наблюдения достоверных различий в течении воспалительного процесса в экспериментальных и контрольных глазах отмечено не было. Подобные результаты были отмечены на глазах кроликов IV группы (введение лонгидазы 3000 ЕД через день).

У кроликов I группы (введение 1500 ЕД лонгидазы ежедневно) в течение первой недели наблюдения тенденция к снижению отека и гиперемии конъюнктивы была менее выражена. При этом в экспериментальных глазах случаев полной ликвидации признаков воспаления не наблюдали.

У кроликов III группы (введение 3000 ЕД лонгидазы ежедневно) в течение первой недели отмечали наиболее выраженное развитие воспалительных явлений: отек 2 степени и гиперемию 2-3 степени. К концу наблюдения они также оставались на более высоком уровне по сравнению с глазами из других групп. При этом различия в показателях гиперемии относительно экспериментальных и контрольных глаз были достоверны, начиная со вторых суток наблюдения (р<0,05).

Данные гистологического исследования также подтверждают наличие наименьшей местной воспалительной реакции в конъюнктиве экспериментальных глаз у кроликов II и IV групп. При введении лонгидазы 1500 ЕД в режиме через день явления вазодилятации были выражены незначительно и отмечено более равномерное распределение воспалительных клеток. К концу наблюдения признаки отечности эпителия конъюнктивы практически отсутствовали. Низкая токсичность препарата подтверждается сохранностью бокаловидных клеток в эпителии конъюнктивы и более равномерной плотностью экстрацеллюлярного матрикса ткани конъюнктивы.

В экспериментальных глазах кроликов IV группы при гистологическом исследовании конъюнктива сохраняла свою целостную структуру. Эпителий был отечен, расширение сосудов и перивазальная инфильтрация присутствовали, но в значительно меньшей степени, чем в глазах III группы (ежедневные инъекции). К 18-му дню отмечали расширение лимфатических конъюнкти-вальных сосудов, как возможное свидетельство усиления функции дренажной системы, и незначительные признаки отека эпителия конъюнктивы.

В III группе проведение пяти инъекции препарата в дозе 3000 ЕД ежедневно сопровождалось не только аутоиммунными воспалительными явлениями, но и признаками расслоения конъюнктивы. В строме конъюнктивы была выражена лимфоплазматическая инфильтрация.

Данные гистологического исследования свидетельствуют о том, что инъекция жидкости в субконъюнктивальное пространство глаза воспринимается окружающими тканями в качестве ирритирующего фактора, запускающе-

го механизм иммунного ответа с признаками воспалительной реакции. Введение стерильной воды для инъекций является таким же раздражающим фактором, однако, ответная реакция на воду выражена в меньшей степени, чем на инъекцию исследуемого препарата.

Выявлена четкая зависимость выраженности иммунной реакции от режима инъекций. Введение лонгидазы через день вызывало умеренную воспалительную реакцию без выраженной зависимости от дозировки препарата. К 11 дню интенсивность отека, транссудации и вазодилятации снижалась, а к 18-му дню эти явления были выражены незначительно. Режим ежедневных инъекций не только провоцировал более значительные проявления воспалительной реакции ткани, но и выявил их зависимость от дозы лонгидазы: повышение количества вводимого препарата до 3000 ЕД вызывало расслоение ткани конъюнктивы с образованием сообщающихся полостей.

Согласно литературным данным, репаративный процесс у человека подразделяют на следующие основные фазы: гемостаз (1-е сутки), воспаление (до

6 дней, пик — 2-3 сутки), миграция фибробластов в зону операции (до 7 дней, пик — 3 сутки) и фаза синтеза фибробластами внеклеточного матрикса (до 60 дней, пик — 5 сутки) (Серов В.В., Пауков B.C., 1995). Если у человека необходимые противорубцовые мероприятия принято осуществлять в пределах

7 дней после операции (т.к. после данного срока попытки влияния на процессы рубцевания безрезультатны), то у кроликов данные процессы могут протекать интенсивнее, и к 7 дню уже можно судить о состоянии регенеративного процесса.

В целом, согласно результатам биомикроскопического и гистологического исследования второго этапа экспериментальной работы с целью оценки эффективности хирургически созданных путей оттока ВГЖ в исследуемых группах III и IV с применением в послеоперационном периоде препарата лонгидаза, удалось добиться наименьшей местной реакции тканей конъюнктивы на операционную травму по сравнению с группами I (без проведения какой-либо терапии) и II (с применением 5-ФУ) (рис. 1).

£

12345678 10 Сутки после операции

Рис. 1. Динамика снижения показателей степени гиперемии в зоне хирургического вмешательства. Данные представлены в виде медианы значений степени гиперемии по группам.

Выявлено, что инъекции лонгидазы вызывают менее острую и продолжительную воспалительную реакцию в ткани конъюнктивы, чем инъекции 5-ФУ. 2-3 инъекции лонгидазы по 1500 ЕД не усиливают воспалительную реакцию, а в строме конъюнктивального лоскута после трех инъекций уже проявляются ингибирующие свойства препарата в отношении структур соединительной ткани. При увеличении дозы до 3000 ЕД эти свойства проявляются уже после 2 инъекций, воспалительный процесс купируется в течение 10 дней. При этом необходимо отметить, что у всех кроликов III и IV групп (с применением лонгидазы) проба Зейделя была отрицательной, что свидетельствует о нормальной репарации в зоне хирургического разреза. Цитостатическое влияние 5-ФУ на клеточные структуры соединительной ткани конъюнктивального лоскута в полной мере наблюдалось после 4 инъекций, противовоспалительное действие было очевидно после 2 инъекций.

Исходя из вышеизложенного, можно заключить, что препарат лонгидаза в дозах 1500 и 3000 ЕД обладает не менее выраженным ингибирующим воздействием на структуры соединительной ткани стромы конъюнктивы, чем 5-ФУ, но имеет свои преимущества, так как активно проявляет свои противо-

воспалительные свойства, и 2-3-х инъекций может быть достаточно для подавления пролиферативного процесса при заживлении в зоне операции. При этом наименьшие проявления отека и гиперемии конъюнктивы глаза, наименьшая инфильтрация тканей воспалительными клетками наблюдались при субконъюнктивальных инъекциях препарата лонгидаза в дозе 1500 ЕД № 2-3 и 3000 ЕД № 1-2 в режиме через день.

Уменьшение признаков острой воспалительной реакции в дальнейшем препятствует избыточной пролиферации фибробластов в зоне операции, а следовательно, активному синтезу соединительной ткани, то есть ИР. Также необходимо отметить, что только в случае применения лонгидазы была отмечена активация лимфатического русла (визуализировались расширенные лимфатические сосуды), что свидетельствует об улучшении местной дренажной функции и тканевого обмена. Все это способствует развитию нежного пороз-ного рубца в зоне хирургически созданных путей оттока.

В настоящей работе проведено изучение эффективности противорубцо-вого воздействия нового отечественного препарата лонгидаза, обладающего ферментативной протеолитической (гиалуронидазной), иммуномодулирую-щей и противовоспалительной активностью. Показано, что субконъюнкти-вальное введение препарата лонгидаза является безопасным для тканей глаза, поскольку местный воспалительный процесс в конъюнктиве сравним с реакцией на инъекцию стерильной воды, но имеет более выраженный и устойчивый характер.

Установлено, что ни в одном случае (независимо от дозы препарата и режима введения) не было отмечено признаков патологических изменений со стороны роговицы и нарушения прозрачности сред глаза. Также необходимо отметить отсутствие во всех группах исследования признаков расхождения конъюнктивального шва и наружной фильтрации.

Данные биомикроскопии экспериментальных глаз и морфологического исследования позволили изучить стадии воспалительного процесса и репара-тивной регенерации тканей в зоне антиглаукомной операции. Операционная

травма вызывает развитие воспалительного процесса асептического характера: морфологически это проявляется воспалительной инфильтрацией, расширением макро- и микрососудистого русла, визуально - развитием выраженной локальной гиперемии. По мере стихания воспалительного процесса в зоне вмешательства морфологически обнаруживали увеличение плотности фиб-робластов, свидетельствующее о ходе активного пролиферативного процесса, то есть развития избыточного рубцевания.

Доказано, что в группах с применением в послеоперационном периоде препарата лонгидаза удалось добиться наименьшей местной реакции тканей на операционную травму по сравнению с группами I (без проведения какой-либо терапии) и II (с применением 5-фторурацила). Наилучшие результаты были получены в глазах с введением препарата лонгидаза в концентрации 1500 № 2-3 и 3000 ЕД № 1-2 в режиме через день.

Экспериментальные данные, полученные при изучении препарата лонгидаза, свидетельствуют об эффективности и безопасности его субконьюнк-тивального использования, что делает перспективным дальнейшее развернутое клиническое испытание этого способа введения препарата.

В данной работе экспериментальное исследование проводилось на глазах молодых здоровых кроликов с высокой репаративной активностью, при этом производили дренирующую операцию, которая является всего лишь имитацией антиглаукомной операции (учитывая отсутствие у данной группы животных глаукомы).

При интерпретации полученных в эксперименте результатов необходимо учитывать следующее:

• в норме репаративная и рубцовая активность в тканях глаза кроликов заведомо выше, чем в тканях глаза человека;

• эксперимент проводился на молодых особях кроликов, в то время как популяция людей, у которых возникает необходимость выполнения антиглаукомной операции, в основном относится к группе старшего возраста;

• при экспериментальном моделировании фильтрующей операции у кроликов естественные пути оттока в интактной зоне глаза продолжают функционировать, что уменьшает активность оттока через сформированное отверстие, нагрузку на фильтрационную подушку, и, как следствие, уменьшает противодействие избыточному рубцеванию;

• глаукома, как заболевание дегенеративного характера, вносит свой вклад в ослабление тканевой реакции, в особенности если антиглаукомной операции предшествует длительный срок использования гипотензивных препаратов, влияющих на нормальный тканевой метаболизм.

Эти обстоятельства не позволяют напрямую экстраполировать полученные результаты на клиническую практику, однако существует убедительная основа для проведения в дальнейшем развернутого клинического исследования с высокими шансами получения успешных результатов. Таким образом, перспективу проведения клинических испытаний препарата лонгидаза можно рассматривать как обоснованную и важную для развития антиглаукомной микрохирургии.

ВЫВОДЫ

1. Впервые в эксперименте доказано дозозависимое влияние субконъ-юнктивальных инъекций раствора протеолитического фермента лонгидаза на ткани глаза. При биомикроскопическом мониторинге после применения препарата в дозе 1500 и 3000 ЕД на интактном глазу, местная реакция со стороны конъюнктивы по степени гиперемии и отека (оценивали по предложенной шкале в баллах) практически не отличалась при сравнении с контрольной группой (стерильная вода для инъекций), что позволяет говорить об отсутствии у лонгидазы явных токсических и раздражающих свойств, то есть о безопасности ее применения. Выявлено, что минимальный раздражающий эффект при 5-кратном субконъюнктивалыюм введении раствора лонгидазы наблюдается при применении препарата через день, независимо от использованной дозы.

2. По данным гистологического исследования, введение в субконъюнк-тивальное пространство на интактном глазу раствора лонгидазы (так же как и воды для инъекций) действует как слабый раздражающий фактор, запускающий механизм иммунного ответа с признаками локального асептического воспаления (расширение сосудов, отек конъюнктивы, дилатация лимфатических сосудов, умеренный периваскулярный воспалительный инфильтрат, активация пролиферации фибробластов). Выявлена четкая зависимость выраженности воспалительной реакции от продолжительности временного интервала между инъекциями, что дает основание рекомендовать использование препарата через день, и согласуется с данными биомикроскопического мониторинга.

3. Экспериментально определено, что введение раствора протеолити-ческого препарата лонгидаза под конъюнктиву глаза в зоне проведенной фильтрующей операции в дозировках как 1500 ЕД, так и 3000 ЕД в количестве до 5 инъекции через день является безопасным, что позволяет рекомендовать данный режим использования препарата для предстоящих клинических испытаний.

4. При биомикроскопическом исследовании состояния конъюнктивы в области фильтрационной подушки, а также при анализе данных гистологического изучения биоптатов, взятых из зоны проведенной фильтрующей операции, в эксперименте выявлено, что при сравнении результатов в группах животных III и IV (введение 1500 ЕД и 3000 ЕД лонгидазы), с I (контрольной) и II группами (введение 5-фторурацила), отмечаются меньшие проявления местной воспалительной реакции. Минимально выраженной была реакция при концентрации лонгидазы 1500 ЕД — при использовании 2-3-х инъекций через день, а при концентрации 3000 ЕД — до 2-х инъекций через день. Применение в аналогичном режиме, эффективной противорубцовой дозы 5-фторурацила в эксперименте вызывало более выраженную ирритацию, сопровождалось отеком и мацерацией эпителия, что подтверждено морфологически.

5. Полученные данные позволяют рекомендовать лонгидазу как эффективный и безопасный препарат для профилактики избыточного рубцевания в послеоперационном периоде после фильтрующих операций, что дает основания для проведения дальнейших клинических испытаний с использованием лонгидазы в раннем послеоперационном периоде после антиглаукомных операций. Наиболее перспективным предполагается применение препарата у пациентов с наличием факторов риска развития рубцовой блокады вновь созданных путей оттока внутриглазной жидкости. Рекомендуемой зоной субконъюнктивального введения протеолитического препарата лонгидаза является область, смежная с зоной формирования фильтрационной подушки. Оптимальная и безопасная доза препарата для однократного введения — 1500 ЕД или 3000 ЕД. Режим дозирования препарата — 2-3 инъекции через день.

Практические рекомендации

В ходе экспериментальной работы получены новые сведения о протео-литическом препарате лонгидаза, как эффективном средстве для профилактики избыточного рубцевания в зоне хирургически сформированных путей оттока внутриглазной жидкости. Результаты биомикроскопического мониторинга и гистологических исследований позволяют рассматривать проведение в будущем развернутых клинических испытаний препарата как безопасное и перспективное. В качестве рабочего алгоритма проведения клинических исследований может быть использована схема проведения вышеописанного эксперимента. По предварительным данным, применение протеолитического препарата лонгидаза позволяет ожидать увеличение эффективности проводимых антиглаукомных операций за счёт более продолжительного гипотензивного эффекта, достигаемого в результате супрессии избыточного рубцевания в зоне формирования фильтрационной подушки.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Шмырева В.Ф., Петров С.Ю., Макарова A.C. Причины снижения отдаленной гипотензивной эффективности антиглаукомных операций и возможности ее повышения // Глаукома. - 2010. - № 2. - С. 43-49.

2. Шмырева В.Ф., Иванова A.C., Федоров A.A., Петров С.Ю., Макарова A.C. Медико-биологическое исследование лонгидазы. Часть 1 // Глаукома. -

2011.-№4.-С. 3-7.

3. Шмырева В.Ф., Иванова A.C., Федоров A.A., Петров С.Ю., Макарова A.C. Медико-биологическое исследование лонгидазы. Часть 2 // Глаукома. —

2012. - № 1. - С. 3-7.

4. Шмырева В.Ф., Иванова A.C., Федоров A.A., Петров С.Ю., Макарова A.C. Возможности ферментной профилактики избыточного рубцевания после хирургии глаукомы. Экспериментальное исследование // Российская глауком-ная школа. Конференция «Глаукома: теориря и практика». Сборник научных трудов конференции Санкт-Петербург. - 2012. - С. 226 - 233.

5. Шмырева В.Ф., Иванова A.C., Федоров A.A., Петров С.Ю., Макарова A.C. Экспериментальное исследование ферментного препарата лонгидаза как средства профилактики избыточного рубцевания после антиглаукомных операций // 11 Всероссийская школа офтальмолога. Сборник научных трудов. Москва. - 2012. - С. 274 - 281.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГО — антиглаукомная операция;

ВГЖ — внутриглазная жидкость;

ВГД — внутриглазное давление;

ИР — избыточное рубцевание;

ПОУГ — первичная открытоугольная глаукома;

ФП — фильтрационная подушка;

5-ФУ — 5-фторурацил.

Подписано в печать 07.10.2013 г. Печать лазерная цифровая Тираж 100 экз.

Типография Aegis-Print 115230, Москва, Варшавское шоссе, д. 42 Тел.: 8 (495) 785-00-38 www.autoref.ae-print.ru