Автореферат и диссертация по медицине (14.00.21) на тему:Применение неколлагеновых белков кости в составе материала Гапкол, модифицированного вакуумной обработкой, для оптимизации регенерации челюсти в эксперименте

На правах рукописи

УДК: 616.317-086.844-76

Ожелевская Светлана Анатольевна

Применение неколлагеновых белков кости в составе материала Гапкол, модифицированного вакуумной обработкой, для оптимизации регенерации челюсти в эксперименте

14.00.21 - «Стоматология»

14.00.16 - «Патологическая физиология»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2007

003060804

003060804

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава» и ГОУ ВПО «Ставропольская государственная медицинская академия»

Научные руководители:

Заслуженный деятель науки РФ доктор медицинских наук, профессор Воложин Александр Ильич

доктор медицинских наук Караков Карен Григорьевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Агапов Виталий Сергеевич

доктор биологических наук, профессор Вальцева Инга Алексеевна

Ведущая организация:

ФГУ "Центральный научно-исследовательский институт стоматологии Росздрава"

Защита состоится 2007 года в часов на заседании

диссертационного совета Д 208 041.03 при ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава» по адресу 127006, Москва, ул Долгоруковская д 4. Почтовый адрес 127473, Москва ул. Делегатская, д 20/1 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного медико-стоматологического университета (127206, Москве, ул Вучетича, д 10а)

Автореферат разослан « 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, Кандидат медицинских наук, доцент

Н В Шарагин

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

С целью возмещения костных дефектов в стоматологической и травматологической практике широкое распространение получили материалы, содержащие гидроксиапатит, трикальцийфосфат и коллаген, которые обладают умеренными остеоиндуцирующими свойствами (Воупе Р 1,1999 Щепеткин И А, 1999) Этот эффект обусловлен способностью фиксировать из крови факторы роста, которые стимулируют остеогенез Свойствами факторов роста обладают также некоторые неколлагеновые белки костной ткани (НБК), которые фиксируются в ткани в процессе репаративного остеогенеза (Десятниченко К.С. 1999, 2000) Среди НБК имеются такие белки как трансформирующий фактор роста, факторы роста фибробластов, инсулиноподобные факторы роста и другие (СапаЬэ Е , 1984, Етсе1тап ЯБ, 1992) К настоящему времени выделен в чистом виде ряд этих факторов, которые используются в практической медицине для стимулирования построения костной ткани Каждый из этих факторов выполняет самостоятельную функцию, действуя на процессы хемотаксиса, пролиферации, адгезии, дифференцировки, экспрессию клетками тканеспецифических белков и т д (Мс СаПЬпу Т Ъ, СепйеНа М, 2000) Но их конечный эффект определяется совместным, кооперативным действием Поэтому применение комплекса НБК может оказаться более эффективным, чем использование отдельных факторов В настоящее время эти белки выделены, и они могут быть оценены с точки зрения эффективности для стимулирования регенерации костной ткани При этом важным является условие введения этих белков в костную рану, так как их эффект зависит от сорбции на минеральных и органических компонентах костной ткани Такие компоненты являются основой остеопластических материалов, выпускаемых ЗАО НПО «Полистом», к которым относятся такие материалы как Гапкол, Колапол, Гидроксиапол и другие Поэтому актуальным является изучение

эффективности применения НБК, введенных в состав этих материалов, для усиления построения костной ткани Введение в остеопластический материал белков, инициирующих репаративный потенциал кости в период регенерации ставит перед исследователями и производителями новые задачи Важной задачей является количественная оценка способности нового материала, по сравнению с обычным Гапколом, усиливать репарацию кости Следует также подчеркнуть, что коллаген и гидроксиапатит - содержащие остеопластические материалы обрабатывают формальдегидом для увеличения продолжительности их биорезорбции в тканях Кроме того, с целью получения коллагена из тканей крупного рогатого скота используется уксусная кислота Следовые количества формальдегида и уксусной кислоты, возможно, могут повлиять на активность НБК Поэтому актуальным является изучение, в сравнительном аспекте, содержащего НБК остеопластического материала, который не обрабатывался формальдегидом, и подвергнут вакуумной экстракции для удаления летучих соединений, в первую очередь, уксусной кислоты Качественная и количественная оценка свойств остеопластического материала Гапкол, содержащего НБК и подвергнутого вакуумной обработке является актуальной проблемой стоматологии и патофизиологии стоматологических заболеваний Такой материал в перспективе может быть использован в пародонтологии и челюстно-лицевой хирургии, особенно у пациентов с системными заболеваниями, при которых нередко снижен репаративный потенциал костной ткани Цель Применить в эксперименте неколлагеновые белки кости в составе остеопластического материала Гапкол, модифицированного вакуумной обработкой и без предварительного дубления коллагена формальдегидом для оптимизации репаративной регенерации челюстной кости

Задачи

1. Провести исследование свойств различных вариантов модифицированного введением неколлагеновых белков кости и вакуумной обработкой остеопластического материала Гапкол с помощью декстеровской культуры костного мозга

2. Применить количественный метод оценки репаративной способности модифицированного Гапкола введением неколлагеновых белков кости на модели дефекта теменной кости крысы

3. Оценить в эксперименте состояние тканевых структур в области костной травмы челюсти в динамике после повреждения, выраженность и длительность воспалительных реакций

4. Определить темпы новообразования и дифференциации соединительно-тканного регенерата в костных дефектах

5. Изучить динамику созревания соединительно-тканной компоненты регенерата и удельный вес не костной (хондроидной) компоненты регенерата при использовании модифицированного Гапкола

6. Оценить роль неколлагеновых белков кости и вакуумной обработки остеопластического материала Гапкол в процессе регенерации челюстной кости

Научная новизна

Впервые установлено, что в длительных культурах костного мозга на остеопластическом материале Гапкол с введением НБК происходит развитие стромальных и кроветворных клеток, и идут процессы формирования кроветворного микроокружения, обеспечивающего нормальное кроветворение Материал Гапкол, содержащий НБК более эффективен для остеоиндукции по сравнению с «обычным» Гапколом С помощью вакуумной обработки удаляются остатки уксусной кислоты из коллагена, которая снижает активность морфогенетических белков в составе НБК, участвующих в клеточных реакциях, необходимых для построения костной ткани. Все изученные модификации Гапкола оказывают положительное

действие на заживление костной раны теменной кости, причем наиболее эффективным является материал, содержащий НБК и обработанный вакуумом для удаления уксусной кислоты Таким образом, эффективность НБК в составе остеопластического материала в большей степени проявляется при использовании очищенного коллагена Практическое значение

Результаты проведенного исследования показали, что создание круглого дефекта диаметром 8 мм на теменной кости крыс является адекватной моделью для количественного изучения эффективности остеопластических материалов, применяемых в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии Ускорение репаративного остеогенеза в костных дефектах достигается введением в дефект материала Гапкол, содержащего НБК, не дубленного формальдегидом и обработанного с помощью вакуума При этом наблюдается усиление, как темпов костеобразовательного процесса, так и ремоделирования и созревания новообразованной костной ткани Дубление формальдегидом комплекса Гапкол + НБК, подлежащего введению в костные дефекты, приводит к утрате стимулирующего эффекта остеопластического материала на репаративный остеогенез Необработанный посредством вакуумной экстракции «недубленый» Гапкол в комплексе с НБК оказывает несколько более слабое действие на репаративные процессы в костных дефектах, чем остеопластический материал, обработанный вакуумной экстракцией

Основные положения, выносимые на защиту

1. В длительных культурах костного мозга на остеопластических материалах Гапкол с введением в его состав неколлагеновых белков кости происходит развитие стромальных и кроветворных клеток, и идут процессы формирования кроветворного микроокружения, обеспечивающего нормальное кроветворение Введение неколлагеновых белков кости в состав материала «Гапкол» повышает эффективность развития, в

первую очередь, стромальных клеток костного мозга по сравнению с «обычным» Гапколом

2. Введение неколлагеновых белков кости в состав остеопластического материала Гапкол, с последующей вакуумной обработкой для освобождения от уксусной кислоты оказывает положительное действие на заживление костной раны плоских костей

3. Эффективность применения Гапкола, для стимулирования репаративной регенерации челюстной кости, с помощью введения в его состав неколлагеновых белков кости, повышается, в случае использования остеопластического материала недубленого формальдегидом и при использовании метода вакуумной экстракции для удаления из коллагена остатков уксусной кислоты

Личный вклад автора

Автором лично были выполнены все эксперименты на лабораторных крысах, которые распределены по группам в соответствии с планом работы Лично автором была воспроизведена травма нижней челюсти крыс, и проводились биоклинические исследования в динамике опыта Автор самостоятельно исследовал периферическую кровь животных в динамике эксперимента, провел патоморфологические исследования костной ткани тканей челюсти в процессе репаративного остеогенеза и осуществил анализ полученных результатов исследования Статьи и текст диссертации составлен самостоятельно автором

Внедрение результатов работ

Полученные данные внедрены в дальнейшую научную работу на кафедре терапевтической стоматологии Ставропольской государственной медицинской академии, а также в учебный процесс и научную работу

кафедры патологического физиологии стоматологического факультета ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава

Публикации

По теме диссертации опубликовано 3 работы, в том числе 2 из них в журналах рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ

Апробация работы.

Основные положения и результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на Третьем Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием (Москва, 2004), совместном совещании сотрудников кафедр госпитальной терапевтической стоматологии, госпитальной хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, кафедры патологической физиологии стоматологического факультета и лаборатории биотехнологии минерализованных тканей НИМСИ ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава от 25 октября 2006 года, а также на кафедре терапевтической стоматологии Ставропольской государственной медицинской академии 15 января 2007 года. Объем и структура диссертации

Диссертация написана на 130 страницах машинописного текста, состоит из введения, 5 глав, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, в том числе 130 российских авторов и 66 иностранных В диссертации представлено 4 таблицы и 63 рисунка

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

С целью решения поставленных задач были проведены опыты в 3 этапа На 1-м этапе работы в лабораторных условиях на декстеровских культурах костного мозга изучена биосовместимость и остеостимулирующие свойства модифицированных композиций Гапкола На 2-м этапе в экспериментах на крысах исследовано влияние Гапкола в разных

модификациях на заживление костной раны теменной кости, что позволило количественно оценить эффективность новых композиций остеопластического материала На 3-м этапе, который является основным и завершающим, проведена оценка репаративной регенерации челюсти лабораторных крыс под действием новых остеопластических материалов серии Гапкол без его дубления формальдегидом, содержащих неколлагеновые белки кости (НБК) и подвергнутых очистке с помощью вакуумной обработки в течение Оригинальный и модифицированный Гапкол вакуумировали в эксикаторе в течение 3 часов Методика оценки свойств остеопластического материала с помощью декстеровской культуры костного мозга

Пластинки Гапкола были разделены на 4 группы в зависимости от технологии приготовления

1-я группа - контроль Гапкол без НБК, дубленный формальдегидом без вакуумной обработки,

2-я группа дефект закрывался Гапколом + НБК с дублением формальдегидом без вакуумной обработки,

3-я группа Гапкол +НБК без дубления и без вакуумной обработки;

4-я группа Гапкол +НБК без дубления, с вакуумной обработкой

Эксперименты выполнены с использованием костного мозга мышей

(С57В1/6 х СВА) Н массой 18-24 г, поставляемых питомником РАМН «Столбовая» Длительные культуры костного мозга декстеровского типа вели, как описано ранее (Чертков и др) Костный мозг одной бедренной кости мышей без суспендирования помещали в 10 мл полной среды на основе среды Фишера, обогащенной Ь-глютамином, 14% лошадиной сыворотки, 6% эмбриональной телячьей сыворотки, 10"8 М гидрокортизона и антибиотиками Культуры вели при температуре 33° С в пластиковых флаконах (площадь дна 25 см2) с еженедельной сменой половины культуральной среды

Через 3 недели культивирования, когда на дне флакона образовывался нормально функционирующий стромальный подслой, проводили изучение процессов кроветворения на остеопластическом материале, помещенном в длительные культуры костного мозга Было проведено сравнение материалов четырех вышеуказанных групп

Образцы материала прямоугольной формы размером 20 х 8 мм, массой 0,15 г, толщиной 0,5-1 мм, сначала помещали в чашки Петри диаметром 35 мм, на поверхность полоски наносили костный мозг в концентрации 1,5x106 клеток на мл среды После этого инкубировали в течение 30 минут при температуре 37° С Затем материал переносили в культуральные флаконы, содержащие 3-недельные длительные культуры костного мозга, и помещали в термостат для дальнейшего культивирования Через 7, 14, 21 и 28 суток культивирования из флаконов извлекали образцы и проводили исследование клеточного состава адгезирующего слоя Было взято по 4 полоски Гапкола каждого вида из 4-х видов во все сроки исследования

Для снятия клеток с Гапкола использовали раствор трипсина в концентрации 0,02% в сочетании с 0,02 % раствором ЭДТА С целью изучения морфологического состава костного мозга, снятого с материала, раствор с клетками центрифугировали 10 минут при скорости 1500 оборотов в минуту Затем клетки промывали раствором Хенкса и повторно центрифугировали После центрифугирования сливали надосадочную жидкость и из осажденных на дне пробирки клеток приготавливали мазки-отпечатки, которые окрашивали по методу Паппенгейма, и подсчитывали миелограммы

С целью оценки интенсивности процессов кроветворения на различных по составу исследуемых образцах, перед приготовлением мазков для морфологических исследований, под микроскопом в камере Горяева подсчитывали общее количество клеток костного мозга в суспензии После снятия клеток измеряли размер каждой полоски с точностью до 1 мм, вычисляли площадь поверхности, а затем результаты оценки количества

клеток на мембранах рассчитывали на 1 см2 поверхности мембран Абсолютные значения содержания стромальных и кроветворных клеток на изучаемом материале получали расчетным путем, на основании значений общего количества клеток, снятых с 1 см2 поверхности материала, и процентного содержания стромальных и кроветворных клеток, определенных при подсчете миелограмм

Статистическая обработка цифровых данных

Цифровые данные, полученные в ходе исследований, подвергались статистической обработке с использованием ^критерия Стьюдента для сравнения средних величин, определения погрешности измерений и достоверности различий параметров между исследуемыми группами Различия между группами считали достоверными 1>2 и при р<0,05

Материал и методы количественной оценки репаративной регенерации теменной кости под влиянием остеопластического материала Гапкол в разных модификациях

В теменных костях 48 белых крыс «Вистар» весом 180-220 грамм под гексеналовым наркозом (1 мл 2% раствора на 100 грамм веса) зубоврачебным бором делали отверстия диаметром 8 мм Для этого животное фиксировали спиной вверх к операционному столику для мелких лабораторных животных, острыми ножницами делали полулунный разрез в передней части головы примерно на 1 см выше глазницы Посередине обеих теменных костей, по возможности равно отступя от швов, делали сквозные отверстия до твердой мозговой оболочки Животных разделили на 4 группы

1-я группа - контроль заживление костной раны без Гапкола, под кровяным сгустком,

2- группа дефект закрывался Гапколом + НБК с дублением формальдегидом без вакуумной обработки,

3-я группа Гапкол +НБК без дубления и без вакуумной обработки,

4-я группа Гапкол +НБК без дубления, с вакуумной обработкой

Кожу укладывали на место и накладывали 3 шва Шов находился примерно в 1см от переднего края раны и, по-видимому, существенно не влиял на течение раневого процесса В обеих группах место повреждения закрывали мягкими тканями Крыс выводили из опыта через 15, 30, 60 и 90 суток после операции введением избыточной дозы гексенала

Теменные кости выделяли, очищали от мягких тканей и помещали в холодный 5% раствор гипохлорита натрия для деорганификации После тщательной отмывки в проточной воде полученные образцы обезвоживали в растворах ацетона восходящей концентрации и высушивали из СОг методом перехода критической точки в аппарате Hitachi НСР-2 (Япония) Затем с помощью токопроводящего клея (Watford, Англия) их наклеивали на столики и напыляли медью в атмосфере аргона на приборе Balzers SCD 040 (Лихтенштейн) Все образцы просматривали в сканирующем электронном микроскопе Philips SEM-515 На сканограммах измеряли площадь остающегося отверстия При этом поверхность образца устанавливали перпендикулярно электронному лучу Измерения проводили на фотографиях с помощью прямоугольной сетки с 400 пересечениями Прямое увеличение контролировали путем сравнения маркированных участков на образце и на микрофотографии Усредненные данные с результатами статистической обработки были получены по каждому сроку исследования на основании 6 измерений, (то есть по 2 измерения на правой и левой теменной кости у каждой из трех крыс в группе)

Материал и методы оценки репаративной регенерации челюстной кости под влиянием остеопластического материала Гапкол в разных модификациях

В опытах на 48 крысах Вистар весом 180-200 грамм изучали динамику заживления экспериментально воспроизведенных костных дефектов и оценивали качественные характеристики костной мозоли в области угла нижней челюсти

Животных разделили на 4 группы по 12 крыс в каждой группе

1-я группа - контроль заживление костной раны без Гапкола, под кровяным сгустком,

2- группа дефект закрывался Гапколом + НБК с дублением формальдегидом без вакуумной обработки,

3-я группа Гапкол +НБК без дубления и без вакуумной обработки,

4-я группа Гапкол +НБК без дубления, с вакуумной обработкой

Крыс (по 3 в каждый срок опыта) выводили из опыта через 15, 30 и 60 суток после операции введением избыточной дозы гексенала

Использование гистоморфологического метода позволило оценить темпы, качество и полноценность репаративного остеогенеза в стандартных экспериментально воспроизведенных костных дефектах в зависимости от введенного в костную рану остеопластического материала по нижеследующим критериям

❖ соотношение соединительно-тканной и костной компоненты регенерата в различные сроки после начала опытов,

❖ Степень дифференцировки тканевых компонент регенерата с различные сроки от начала опытов,

♦> «полноценность»- структурная адекватность, костного регенерата, формирующегося в костных дефектах

Основные результаты и обсуждение

1. Свойства остеопластического модифицированного материала Гапкол на модели длительной культуры костного мозга

На основании проведенных экспериментов по изучению изменений числа стромальных и кроветворных клеток, развивающихся на материалах Гапкол в длительных культурах костного мозга в течение 4 недель культивирования, было установлено, что исследованные материалы не вызывали отрицательных реакций и не оказывали ингибирующего влияния на рост клеток костного мозга Наблюдалось постепенное возрастание

общего числа клеток на материалах, отмечалось нормальное кроветворение и образование молодых и зрелых гранулоцитов В табл 1 представлены данные по изменению процентного содержания различных клеточных популяций костного мозга на Гапколе в течение 28 суток культивирования Как видно из таблицы, на Гапколе в разных группах с увеличением времени культивирования происходило постепенное увеличение общего количества клеток за счет стромальных и кроветворных клеток Процентное содержание стромальных клеток через 21-28 суток, по сравнению с 7-ми сутками увеличивалось в основном за счет ретикулярных клеток, а увеличение числа кроветворных клеток происходило за счет молодых и зрелых гранулоцитов Недубленый Гапкол с добавлением НБК (3-я и 4-я группы) был менее устойчивым по сравнению с Гапколом дубленным (2-я группа) и подвергались видимым нарушениям структуры и формы в процессе культивирования в длительных культурах костного мозга

Таблица 1

Изменения общего числа клеток, а также количества стромальных и кроветворных клеток на Гапколе в разных модификациях

Сроки исследован ия Число клеток X 103 на 1 см2 Образцы Гапкола

№1 Гапкол без НБК, с дублением без вакуумной обработки №2 Гапколом + НБК с дублением без вакуумной обработки, №3 Гапкол +НБК без дубления и вакуумной обработки №4 Гапкол + +НБК без дубления, с вакуумной обработкой

7-е сутки Общее число клеток 62,5±4,9 87,5±4,6* 112,5±9,1* 93,5+7,4*

Стромальные 53,4±4,2 73,5±3,9* 93,4+7,6* 79,5+6,3*

Кроветворные 9,1 ±0,7 14,0±0,7* 19,1±1,5* 14,0+1,1

14-е сутки Общее число клеток 92,5±5,9 132,5+6,5* 164,5±11,2* 124,5±6,2*

Стромальные 62,4+3,9 87,5+4,3* 105,3+7,2* 83,4+4,2*

Кроветворные 30,1±2,0 45,0+2,2* 59,2±4,0* 41,1±2,0*

21-е сутки Общее число клеток 159,5±9,8 172,5±10,4 212,5+11,7* 235,5+12,1*

Стромальные 92,5±5,5 94,9+5,7 114,8±6,3* 122,5+6,3*

Кроветворные 67,0±4,3 77,6±4,7 97,7±5,4* 113,0+5,8*

28-е сутки Общее число клеток 142,0±8,4 220,0+10,5* 235,0±11,5* 260,0±12,5*

Стромальные 88,0±5,2 107,8±5,1* 110,5±5,4* 140,4±6,8*

Кроветворные 54,0±3,2 112,2±5,4* 124,5+6,1* 119,6+5,7*

*-достоверно при р<0,05 по сравнению с данными для Гапкола

Как видно из таблицы, с увеличением времени культивирования в течение 28 суток происходило постепенное увеличение общего содержания клеток на этих материалах за счет стромальных и кроветворных клеток, причем на протяжении всего периода исследования величины анализируемых показателей были больше по сравнению с обычным Гапколом Процентное содержание кроветворных клеток через 21-28 суток, по сравнению с 7-ми сутками увеличивалось за счет молодых и зрелых форм гранулоцитов Содержание стромальных клеток на всех модификациях Гапкола постепенно возрастало в период от 7-х до 28-х суток для всех материалов, причем значительно больше стромальных клеток в период с 14 по 28 сутки культивирования отмечалось на Гапколе №2, №3 и №4 по сравнению с обычным Гапколом Вместе с тем, содержание кроветворных клеток на Гапколе во все сроки культивирования было меньше, чем на Гапколе №2, №3 и №4

Через 4 недели культивирования на материалах были выявлены существенные различия содержания фибробластоподобных стромальных клеток, в популяцию которых могут входить и остеогенные клетки Эти данные свидетельствуют о большей способности указанных остеопластических материалов с добавлением НБК обеспечивать как

процессы кроветворения, так, по-видимому, и процессы остеоиндукции и остеоинтеграции

Результаты этих исследований были объяснены на основании данных литературы Известно, что в регуляции гемопоэза важную роль играет кроветворное микроокружение, осуществляющее адгезивную функцию для стволовых кроветворных клеток в костном мозге и регуляцию их пролиферации и дифференцировки (Гольдберг Е Д и др, 2000, Trentm J J ,1976) При этом гемопоэтический эффект достигается созданием «ниш» микроокружения, обеспечивающих прямой межклеточный контакт и интенсивный гуморальный обмен стромы с гемопоэтическими клетками (Lord В1, 1980) Очень важно то, что костномозговое микроокружение необходимо также для нормального протекания процессов развития и перестройки костной ткани (ЩепеткинИ А, 1994), а в условиях применения остеопластического материала адгезирующие на их поверхности клетки, могут оказывать положительное влияние на остеоиндукцию Остеобластогенез и функциональная активность зрелых остеокластов находятся под регуляторным контролем полипептидных факторов роста, продуцируемых кроветворными и стромальными клетками костномозгового микроокружения, а гемопоэтические факторы роста принимают активное участие в остеогенезе (Щепеткин И А ,1994, LeGeros R Z et al, 1993)

Таким образом, материал «Гапкол», содержащий НБК может быть более эффективным для остеоиндукции и остеоинтеграции по сравнению с «обычным» Гапколом

2.Количественная оценка репаративной регенерации костной ткани под влиянием остеопластического материала Гапкол в разных модификациях

Результаты проведенного исследования показали, что воспроизведенный костный дефект на теменной кости заживает и без дополнительного воздействия и к 90-м суткам практически полностью замещается костной тканью Вновь сформированная костная ткань

отличается от нормальной покровной кости черепа тем, что состоит из крупноволокнистой ткани с формирующейся поверхностью Имеются признаки того, что в этой кости имеются зоны резорбции и построения, то есть признаки нормальной перестройки Следует заметить, что процессы заполнения дефекта вновь образованной костной тканью, как правило,

начинаются со стороны внутренней пластинки теменной кости В этом месте нередко сохраняются небольшие фрагменты кости, которые оставались после высверливания отверстия бором Наличие этих частиц кости, возможно, инициировало восстановления костной ткани со стороны эндоста, хотя не исключен и ее более высокий репаративный потенциал по сравнению с периостальной пластинкой

В течение 15 дней после создания дефекта его размер уменьшился в 1-й группе опыта с 50,3 до 11,3 мм2, то есть в 4,45 раза С этого момента до 30 дня опыта уменьшение размера отверстия составило 2,51 раза С 30-го дня до 60-го отверстие уменьшилось в 3 раза, а в период с 60-го до 90 дня отверстие почти закрывается, и расчеты становятся очень неточными Таким образом, наибольшая скорость заживления костной раны на теменной кости происходит в первые 15 дней, затем этот процесс протекает медленнее

Закрытие костного дефекта обычным Гапколом (обработанным формальдегидом и без НБК) несколько ускорило заживление костного дефекта в первые 15 и 30 дней после начала опыта В дальнейшем различие между 1-й и 2-й группами становится несущественным Введение НБК в состав недубленого Гапкола (3-я группа) несколько увеличило скорость заполнения костного дефекта костной тканью на 15-е и 30-е сутки опыта по сравнению с контрольной, в которой использовался обычный традиционный Гапкол, а также с 1-й и 2-й группой Наиболее эффективным было применение недубленого Гапкола, содержащего НБК и подвергнутого вакуумной обработке На рис 1 а,б,в,г показано различие в величине дефекта на кости между группами на 30-е сутки опыта Результаты статистической обработки цифровых данных представлены на табл 2

Рис.1 а. 1-я группа. Контроль, без дубления и бет вакуумной обработки, 30 суток. Отверстие на поверхности теменной кости. СЭМ. У в. 17.9.

. I

'--Л?.»»" 1,7961 евгб'вз иивпав

Рис.] в. 3-я группа. Гапкол +НБК 30 суток. Отверстие на поверхности теменной кости. СЭМ. У в. 17,9.

Рис, 1 б. 2-я группа Гапкол + НБК с дублением

без вакуумной обработки, 30 суток. Отверстие на поверхности теменной кости. СЭМ. У в. I 7,9.

Рис.1 г, 4-я группа. Гапкол +НБК без дубления, с вакуумной обработкой, 30 суток. Отверстие на поверхности теменной кости. СЭМУв.17,9

Таблица 2

Результаты количественной оценки репаративнон регенерации костной ткани под влиянием остеопластического материала Гапкол в разных модификациях (на модели теменной кости крысы), мм2 М ± m

Сроки опыта, сут Группы

1-я Контроль (заживление костной раны без Гапкола, под кровяным сгустком) 2-я дефект закрывался Гапколом + НБК с дублением формальдегидом без вакуумной обработки 3-я Гапкол +НБК без дубления и без вакуумной обработки 4-я Гапкол +НБК без дубления, с вакуумной обработкой

15 11,3 + 1,2 10,53 ±1,9 9,20 ± 0,6 7,13 ±0,8*

30 4,5 ± 0,52 3,90 ± 0,50 3,47 ± 0,47 1,95 ±0,34*

60 1,5 ±0,16 1,31 ± 0,48 1,30 ±0,18 1,04 + 0,12

90 0,05-0,14 0-0,05 0-0,05 0

Обозначение * - различие по сравнению с 1-й группой аналогичного срока статистически достоверно (р 0,05)

Следовательно, все модификации Гапкола оказывают положительное действие на заживление костной ткани теменной кости, но наиболее эффективным можно считать материал, содержащий НБК и обработанный вакуумом для освобождения от остатков уксусной кислоты То есть эффективность НБК проявляется при использовании очищенного коллагена

Можно предположить, что остатки формальдегида и уксусной кислоты либо непосредственно ингибируют морфогенетические протеины костной ткани, либо препятствуют их действию на клетки-предшественники, например, действуя на их рецепторный аппарат Более вероятно, что они действуют на сами белки Это видно из данных литературы о том, что остеопластические материалы, содержащие коллаген и ГАП, дубленые

формальдегидом и не обработанные вакуумом, оказывают выраженный клинический эффект

Основная задача исследования заключалась в обосновании применения оптимальной композиции Гапкола и НБК, которая бы способствовала регенерации челюстной кости Эта задача решалась на 3-м, заключительном этапе работы Гистоморфологическое исследование, проведенное в опыте на крысах с экспериментальным моделированием репаративного процесса в дефектах угла ветви челюсти при введении в них НБК в составе Гапкола, показало следующее

Оптимальное ускорение репаративного остеогенеза в костных дефектах достигалось при инокуляции в дефект материала Гапкол, содержащего НБК, не дубленного формальдегидом и обработанного с помощью вакуумной экстракции При этом наблюдалось усиление, как темпов костеобразовательного процесса, так и ремоделирования новообразованной костной ткани, а также ее созревания В качестве примера на рис 2 а,б,в,г приведены результаты патоморфологического исследования челюсти на 30-е сутки опыта

Установлено, что дубление комплекса Гапкол + НБК, подлежащего введению в костные дефекты приводило к утрате стимулирующего эффекта воздействия остеопластического материала на репаративный остеогенез, о чем свидетельствовало развитие в костных дефектах несовершенной костной субстанции, наблюдавшейся вплоть до 60 суток Необработанный посредством вакуумной экстракции и «недубленый» Гапкол в комплексе с НБК оказывал несколько более слабое действие на репарационные процессы в костных дефектах, чем остеопластический материал, обработанный вакуумной экстракцией

Обобщая результаты исследования в целом, можно сделать заключение о том, что повышение эффективности применения Гапкола для стимулирования репаративного остеогенеза с помощью введения в его состав НБК наблюдается в случае применения остеопластического материала недубленого

'Ш ■ • 1 л - ■■*' " '

* ъ.-л у- 'ГШ*? ■ Ъ : ■ ' •• ■■■;■ ё3 - ■ ' -г1

Щ

/>,-,;■> > ' Гд£

Н ■•..{'-■"■■ ' ■ •"•

: ' • ' ШЯШЯгл

Рис.2 а. Контроль, 30 суток. Новообразованная костная ткань на периферии дефекта кости. Видны участки клеточно-волокнистой соединительной ткани {одинарные стрелки) перемежающейся с новообразованным костным веществом (пунктирные стрелки). Вкрапления хрящевой ткани (с двое иные стрелки). Х100.

■■ ' V? Мг ■

. 1 ■ ч 1 ■ -■ ■■

ШШшШшШШяШ

Рис.2 б.. Группа 2, 15 суток. Компактизированная костная субстанция на периферии костного дефекта с гомогенным слабо структурированным матрмкеом. Видны отдельные мелкие костномозговые пространства. XI00-

Рис.2 г. Группа 3, 30 суток. Костные структуры регенерата характеризуются несовершенством и пестротой строении магрикса трабскул. В нём обнаруживаются включения гомогенного базофильного вещества (стрелки). XI00.

Рис.2 г. Группа 4, 30 суток. Новообразованная костная ткань регенерата по структуре матрикса относится к фиброзному типу. Видны отдельные включения Гапкола в матрикс костных трабекул. Х100.

формальдегидом и при использовании метода вакуумной экстракции для удаления из материала остатков уксусной кислоты

Данная работа выполнена как доклиническое лабораторное и экспериментальное исследование Имеются все основания для заключения о том, что изученные остеопластический материал может быть широко использован в стоматологической практике и травматологии

ВЫВОДЫ:

1 В длительных культурах костного мозга на материалах Гапкол и Гапкол с введением в его состав неколлагеновых белков кости происходит развитие стромальных и кроветворных клеток, и идут процессы нормального формирования кроветворного микроокружения На исследуемых материалах наблюдается постепенное увеличение общего числа клеток, возрастание содержания стромальных и кроветворных клеток

2 С увеличением времени культивирования, в зависимости от состава Гапкола, отмечается разная степень устойчивости структуры материала Более устойчивым в биологической среде является материал Гапкол, дубленный формальдегидом, по сравнению с «недубленым» остеопластическим материалом

3 Создание на теменной кости у крыс круглого дефекта диаметром 8 мм является адекватной моделью для количественного изучения эффективности остеопластических материалов В течение 15 дней после создания дефекта его размер уменьшается в контрольной группе опыта в 4,45 раза В период с 15 до 30 дня опыта размер отверстия уменьшается 2,51 раза, а с 30-го до 60-го дня еще в 3 раза К 90 дню отверстие практически полностью закрывается

4 Закрытие дефекта теменной кости обычным Гапколом (без неколлагеновых белков кости и обработанным формальдегидом) ускорило заживление костной раны в первые 15 и 30 дней после

начала опыта Введение неколлагеновых белков кости в состав недубленного Гапкола несколько ускорило заполнение костного дефекта костной тканью на 15-е и 30-е сутки опыта по сравнению с контрольной группой, в которой использовался обычный Гапкол Наиболее эффективным было применение недубленого Гапкола с неколлагеновыми белками кости и подвергнутого вакуумной обработке

5 Оптимальное ускорение репаративного остеогенеза в дефектах челюстной кости достигалось при использовании содержащего неколлагеновые белки кости материала Гапкол, не дубленного формальдегидом и после вакуумной обработки При этом наблюдалось усиление темпов костеобразовательного процесса, а также ремоделирования и созревания новообразованной костной ткани

6. Дубление формальдегидом комплекса Гапкол + неколлагеновые белки кости, подлежащего введению в костные дефекты челюсти, приводит к утрате стимулирующего эффекта остеопластического материала на регенерацию, о чем свидетельствовало развитие в дефектах несовершенной костной субстанции, сохраняющейся вплоть до 60 суток после нанесения повреждения

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 С целью испытания свойств остеопластического материала Гапкол в различных модификациях рекомендуется изучение в лабораторных условиях клеточных реакций на модели декстеровской культуры костного мозга Регенерация теменной кости после нанесения стандартного круглого дефекта может быть использована для количественной оценки эффективности остеопластического материала Гапкол содержащего неколлагеновые белки кости.

2 Для проявления свойств неколлагеновых белков кости в составе Гапкола, рекомендуется не подвергать его дублению формальдегидом и удалить из него остатки уксусной кислоты путем 3-х часовой вакуумной обработки

3 Остеопластический материал Гапкол, не дубленный формальдегидом и содержащий неколлагеновые белки кости, после вакуумной обработки может быть рекомендован для стимулирования построения костной ткани при заполнении костных дефектов челюстей во время операций на пародонте, после сложного удаления зубов, цистэктомии и других оперативных вмешательствах

Список работ, опубликованных по теме диссертации: 1. А.И. Воложин, И.С. Мальгинова, В.Г. Лебедев, Э.В. Фионова,Г.А. Воложин, С.А. Ожелевская, А.А.Чепель Оценка биосовместимости остеопластических материалов с использованием длительных культур костного мозга // Российский стоматологический журнал, 2005, № 3, С 17-19.

2 С.А Ожелевская Применение неколлагеновых белков кости и хондроитинсульфата для усиления остеопластических свойств остеопластического материала Гапкол // В кн Актуальные проблемы стоматологии Материалы всероссийской научно-практической конференции, посвященной 105-летию со дня рождения профессора ЕЕ Платонова М, 2006, С 123-125

3. Воложин А.И., Бондаренко М.О., Фионова Э. В., Ожелевская С.А. Применение иммуномодулятора Полиоксидония совместно в неколлагеновыми белками кости для ускорения регенерации челюсти при иммунодефицитном состоянии в эксперименте. Патологическая физиология и экспериментальная терапия, 2007, №1, С 27-28.

Заказ №462. Объем 1 пл. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

Актуальность проблемы

С целью возмещения костных дефектов в стоматологической и травматологической практике широкое распространение получили материалы, содержащие гидроксиапатит, трикальцийфосфат и коллаген, которые обладают умеренными остеоиндуцирующими свойствами (Воупе Р.I., 1999. Щепеткин И.А., 1999). Этот эффект обусловлен способностью фиксировать из крови факторы роста, которые стимулируют остеогенез. Свойствами факторов роста обладают также некоторые неколлагеновые белки костной ткани (НБК), которые фиксируются в ткани в процессе репаративного остеогенеза (Десятниченко К.С. 1999, 2000). Среди НБК имеются такие белки как трансформирующий фактор роста, факторы роста фибробластов, инсулиноподобные факторы роста и другие (СапаПэ Е., 1984; Ртсе1тап 11.0., 1992). К настоящему времени выделен в чистом виде ряд этих факторов, которые используются в практической медицине для стимулирования построения костной ткани. Каждый из этих факторов выполняет самостоятельную функцию, действуя на процессы хемотаксиса, пролиферации, адгезии, дифференцировки, экспрессию клетками тканеспецифических белков и т.д. (Мс СагЛпу Т.Ь., Сеп1:ге11а М., 2000). Но их конечный эффект определяется совместным, кооперативным действием. Поэтому применение комплекса НБК может оказаться более эффективным, чем использование отдельных факторов. В настоящее время эти белки выделены, и они могут быть оценены с точки зрения эффективности для стимулирования регенерации костной ткани. При этом важным является условие введения этих белков в костную рану, так как их эффект зависит от сорбции на минеральных и органических компонентах костной ткани. Такие компоненты являются основой остеопластических материалов, выпускаемых ЗАО НПО «Полистом», к которым относятся такие материалы как Гапкол, Колапол, Гидроксиапол и другие. Поэтому актуальным является изучение эффективности применения НБК, введенных в состав этих материалов, для усиления построения костной ткани. Введение в остеопластический материал белков, инициирующих репаративный потенциал кости в период регенерации ставит перед исследователями и производителями новые задачи. Важной задачей является количественная оценка способности нового материала, по сравнению с обычным Гапколом, усиливать репарацию кости. Следует также подчеркнуть, что коллаген и гидроксиапатит - содержащие остеопластические материалы обрабатывают формальдегидом для увеличения продолжительности их биорезорбции в тканях. Кроме того, с целью получения коллагена из тканей крупного рогатого скота используется уксусная кислота. Следовые количества формальдегида и уксусной кислоты, возможно, могут повлиять на активность НБК. Поэтому актуальным является изучение, в сравнительном аспекте, содержащего НБК остеопластического материала, который не обрабатывался формальдегидом, и подвергнут вакуумной экстракции для удаления летучих соединений, в первую очередь, уксусной кислоты. Качественная и количественная оценка свойств остеопластического материала Гапкол, содержащего НБК и подвергнутого вакуумной обработке является актуальной проблемой стоматологии и патофизиологии стоматологических заболеваний. Такой материал в перспективе может быть использован в пародонтологии и челюстно-лицевой хирургии, особенно у пациентов с системными заболеваниями, при которых нередко снижен репаративный потенциал костной ткани.

Цель: Применить в эксперименте неколлагеновые белки кости в составе остеопластического материала Гапкол, модифицированного вакуумной обработкой и без предварительного дубления коллагена формальдегидом для оптимизации репаративной регенерации челюстной кости.

Задачи

1. Провести исследование свойств различных вариантов модифицированного введением НБК и вакуумной обработкой остеопластического материала Гапкол с помощью декстеровской культуры костного мозга.

2. Применить количественный метод оценки репаративной способности модифицированного Гапкола с НБК на модели дефекта теменной кости крысы.

3. Оценить в эксперименте состояние тканевых структур в области костной травмы челюсти в динамике после повреждения, выраженность и длительность воспалительных реакций.

4. Определить темпы новообразования и дифференциации соединительно-тканного регенерата в костных дефектах.

5. Изучить динамику созревания соединительно-тканной компоненты регенерата и удельный вес не костной (хондроидной) компоненты регенерата при использовании модифицированного Гапкола.

6. Оценить роль НБК и вакуумной обработки остеопластического материала Гапкол в процессе регенерации челюстной кости.

Научная новизна

Впервые установлено, что в длительных культурах костного мозга на остеопластическом материале Гапкол с введением НБК происходит развитие стромальных и кроветворных клеток, и идут процессы формирования кроветворного микроокружения, обеспечивающего нормальное кроветворение. Материал Гапкол, содержащий НБК более эффективен для остеоиндукции по сравнению с «обычным» Гапколом. С помощью вакуумной обработки удаляются остатки уксусной кислоты из коллагена, которая снижает активность морфогенетических белков в составе НБК, участвующих в клеточных реакциях, необходимых для построения костной ткани. Все изученные модификации Гапкола оказывают положительное действие на, заживление костной раны теменной кости, причем наиболее эффективным является материал, содержащий НБК и обработанный вакуумом для удаления уксусной кислоты. Таким образом, эффективность НБК в составе остеопластического-материала в большей степени проявляется при использовании очищенного коллагена.

Практическое значение

Результаты проведенного исследования показали, что создание круглого дефекта диаметром 8 мм на теменной кости крыс является адекватной моделью для количественного изучения эффективности остеопластических материалов, применяемых в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии. Ускорение репаративного остеогенеза в костных дефектах достигается введением в дефект материала Гапкол, содержащего НБК, не дубленного формальдегидом и обработанного с помощью вакуума. При этом наблюдается усиление, как темпов костеобразовательного процесса, так и ремоделирования и созревания новообразованной костной ткани. Дубление формальдегидом комплекса Гапкол + НБК, подлежащего введению в костные дефекты, приводит к утрате стимулирующего эффекта остеопластического материала на репаративный остеогенез. Необработанный посредством вакуумной экстракции «недубленый» Гапкол в комплексе с НБК оказывает несколько более слабое действие на репаративные процессы в костных дефектах, " чем остеопластический материал, обработанный вакуумной экстракцией.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В длительных культурах костного мозга на остеопластических материалах Гапкол с введением в его состав НБК происходит развитие стромальных и кроветворных клеток, и идут процессы формирования кроветворного микроокружения, обеспечивающего нормальное кроветворение. Введение НБК в состав материала «Гапкол» повышает эффективность развития, в первую очередь, стромальных клеток костного мозга по сравнению с «обычным» Гапколом.

2. Введение неколлагеновых белков кости в состав остеопластического материала Гапкол, с последующей вакуумной обработкой для освобождения от уксусной кислоты оказывает положительное действие на заживление костной раны плоских костей.

3. Эффективность применения Гапкола для стимулирования репаративной регенерации челюстной кости, с помощью введения в его состав неколлагеновых белков кости, повышается в случае использования остеопластического материала недубленого формальдегидом и при использовании метода вакуумной экстракции для удаления из коллагена остатков уксусной кислоты.

Личный вклад автора

Автором лично были выполнены все эксперименты на лабораторных крысах, которые распределены по группам в соответствии с планом работы. Лично автором была воспроизведена травма нижней челюсти крыс, и проводились биоклинические исследования в динамике опыта. Автор самостоятельно исследовал периферическую кровь животных в динамике эксперимента, провел патоморфологические исследования костной ткани тканей челюсти в процессе репаративного остеогенеза и осуществил анализ полученных результатов исследования. Статьи и текст диссертации составлен самостоятельно автором.

Внедрение результатов работ

Полученные данные внедрены в дальнейшую научную работу на кафедре терапевтической стоматологии Ставропольской государственной медицинской академии, а также в учебный процесс и научную работу кафедры патологического физиологии стоматологического факультета ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава.

Основные положения диссертации опубликованы в работах:

1. А.И. Воложин, И.С. Мальгинова, В.Г. Лебедев, Э.В. Фионова,Г.А. Воложин, С.А. Ожелевская, А.А.Чепель Оценка биосовместимости остеопластических материалов с использованием длительных культур костного мозга // Российский стоматологический журнал, 2005, № 3, С 1719.

2. С.А.Ожелевская Применение неколлагеновых белков кости и хондроитинсульфата для усиления остеопластических свойств остеопластического материала Гапкол // В кн.'.Актуальные проблемы стоматологии Материалы всероссийской научно-практической конференции, посвященной 105-летию со дня рождения профессора Е.Е.Платонова. М., 2006, С 123-125.

3. Воложин А.И., Бондаренко М.О., Фионова Э. В., Ожелевская С.А. Применение иммуномодулятора Полиоксидония совместно в неколлагеновыми белками кости для ускорения регенерации челюсти при иммунодефицитном состоянии в эксперименте. Патологическая физиология и экспериментальная терапия, 2007, №1, С 27-28.

Апробация работы.

Основные положения и результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на: Третьем Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием (Москва, 2004), совместном совещании сотрудников кафедр госпитальной терапевтической стоматологии, госпитальной хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, кафедры патологической физиологии стоматологического факультета и лаборатории биотехнологии минерализованных тканей НИМСИ ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава от 25 октября 2006 года, а также на кафедре терапевтической стоматологии Ставропольской государственной медицинской академии 15 января 2007 года.

Объем и структура диссертации

Диссертация написана на 130 странице машинописного текста, состоит из введения, 5 глав, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, в том числе 130 российских авторов и 66 иностранных. В диссертации представлено 4 таблицы и 63 рисунка.

ВЫВОДЫ

1. В длительных культурах костного мозга на материалах Гапкол и Гапкол с введением в его состав неколлагеновых белков кости происходит развитие стромальных и кроветворных клеток, и идут процессы нормального формирования кроветворного микроокружения. На исследуемых материалах наблюдается постепенное увеличение общего числа клеток, возрастание содержания стромальных и кроветворных клеток.

2. С увеличением времени культивирования, в зависимости от состава Гапкола, отмечается разная степень устойчивости структуры материала. Более устойчивым в биологической среде является материал Гапкол, дубленный формальдегидом, по сравнению с «недубленым» остеопластическим материалом.

3. Создание на теменной кости у крыс круглого дефекта диаметром 8 мм является адекватной моделью для количественного изучения эффективности остеопластических материалов. В течение 15 дней после создания дефекта его размер уменьшается в контрольной группе опыта в 4,45 раза. В период с 15 до 30 дня опыта размер отверстия уменьшается 2,51 раза, а с 30-го до 60-го дня еще в 3 раза. К 90 дню отверстие практически полностью закрывается.

4. Закрытие дефекта теменной кости обычным Гапколом (без неколлагеновых белков кости и обработанным формальдегидом) ускорило заживление костной раны в первые 15 и 30 дней после начала опыта. Введение неколлагеновых белков кости в состав недубленного Гапкола несколько ускорило заполнение костного дефекта костной тканью на 15-е и 30-е сутки опыта по сравнению с контрольной группой, в которой использовался обычный Гапкол. Наиболее эффективным было применение недубленого Гапкола с неколлагеновыми белками кости и подвергнутого вакуумной обработке.

5. Оптимальное ускорение репаративного остеогенеза в дефектах челюстной кости достигалось при использовании содержащего неколлагеновые белки кости материала Гапкол, не дубленного формальдегидом и после вакуумной обработки. При этом наблюдалось усиление темпов костеобразовательного процесса, а также ремоделирования и созревания новообразованной костной ткани.

6. Дубление формальдегидом комплекса Гапкол + неколлагеновые белки кости, подлежащего введению в костные дефекты челюсти, приводит к утрате стимулирующего эффекта остеопластического материала на регенерацию, о чём свидетельствовало развитие в дефектах несовершенной костной субстанции, сохраняющейся вплоть до 60 суток после нанесения повреждения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. С целью испытания свойств остеопластического материала Гапкол в различных модификациях рекомендуется изучение в лабораторных условиях клеточных реакций на модели декстеровской культуры костного мозга. Регенерация теменной кости после нанесения стандартного круглого дефекта может быть использована для количественной оценки эффективности остеопластического материала Гапкол содержащего неколлагеновые белки кости.

2. Для проявления свойств неколлагеновых белков кости в составе Гапкола, рекомендуется не подвергать его дублению формальдегидом и удалить из него остатки уксусной кислоты путем 3-х часовой вакуумной обработки.

3. Остеопластический материал Гапкол, не дубленный формальдегидом и содержащий неколлагеновые белки кости, после вакуумной обработки может быть рекомендован для стимулирования построения костной ткани при заполнении костных дефектов челюстей во время операций на пародонте, после сложного удаления зубов, цистэктомии и других оперативных вмешательствах.

107