Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Экспериментальное изучение эстроген-зависимых изменений функции мозговой системы "награды" и подкрепляющего эффекта кокаина

На правах рукописи

00340000-

ГАЛАНКИН Тимофей Леонидович

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЭСТРОГЕН-ЗАВИСИМЫХ ИЗМЕНЕНИЙ ФУНКЦИИ МОЗГОВОЙ СИСТЕМЫ «НАГРАДЫ» И ПОДКРЕПЛЯЮЩЕГО ЭФФЕКТА КОКАИНА

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

? /, 200В

Санкт-Петербург 2008

003458389

Работа выполнена в отделе психофармакологии Института фармакологии им. A.B. Вальдмана ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Федерального Агентства по здравоохранению и социальному развитию.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Звартау Эдвин Эдуардович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Андреев Борис Владимирович

доктор медицинских наук, профессор Крауз Владислав Алексеевич

Ведущее учреждение:

НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург

/Х^

Защита диссертации состоится 16 января 2009 года в/ -^ часов на заседании диссертационного совета Д 208.090.03 при Санкт-Петербургском государственном медицинском университете им. акад. И.П. Павлова (Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, 6/8).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова.

Автореферат разослан " /Г- А (З-еЗ 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

профессор Владимир Филиппович

Общая характеристика работы

За последнее десятилетие накоплен большой экспериментальный и клинический материал, свидетельствующий о существовании половых различий в эффектах психоактивных веществ (ПАВ), в частности психостимуляторов. Показано, что женщины реагируют на эффекты психостимуляторов иначе, чем мужчины и оказываются более восприимчивыми к наркогенному потенциалу этих веществ (Van Etten, Anthony, 1999). Согласно эпидемиологическим оценкам в США, зависимость к кокаину у женщин в течение первых 24 месяцев после первого употребления наркотика вырабатывается с вероятностью, большей в 3-4 раза по сравнению с мужчинами (O'Brien, Anthony, 2005), несмотря на то, что общее количество ежедневно потребляемого наркотика не различается между полами (Kosten et al., 1996). У женщин с зависимостью от кокаина в большей степени по сравнению с мужчинами выражено поведение поиска наркотика при предъявлении стимулов, ассоциированных с употреблением кокаина (Robbins et al. 1999).

Показано, что выраженность поведенческих эффектов ПАВ зависит от стадии полового цикла, а также изменяется при введении женских половых гормонов. В ряде исследований показано, что субъективные эффекты кокаина более выражены у женщин в фолликулярную стадию цикла по сравнению с пютеальной, что коррелирует с уровнем эндогенного эстрадиола (Evans et al., 2002; Lukas et al., 1996; Sofuoglu et al., 1999). Поэтому ведущая роль в возникновении наблюдаемых половых различий отводится половым гормонам, в основном эстрадиоду (Becker, Hu, 2008; Lynch, 2007).

В экспериментальных исследованиях на животных также продемонстрировано влияние половых гормонов на поведенческие эффекты психостимуляторов. В ряде работ отмечается, что именно эстрадиол оказывает наибольшее влияние на выраженность этих эффектов. Так, эстрадиол увеличивает чувствительность овариоэктомированных самок крыс к кокаину в экспериментах по внутривенному самовведению наркотика (Lynch 2007) и способствует развитию поведенческой сенситизации к эффектам психостимуляторов (Ни, Becker, 2003).

Показано, что наблюдаемые гормональные влияния на поведенческие эффекты кокаина не мотуг быть объяснены возможным изменением его фармакокинетики под действием стероидных гормонов (Bowman et al., 1999).

Основным субстратом действия ПАВ является система «награды» головного мозга (ГМ) (Wise, 2002). Усиление эффектов кокаина при введении эстрадиола,. вероятно, происходит на уровне дофаминергических проекций «системы награды» ГМ, о чем свидетельствует способность эстрадиола изменять активность дофаминергических нейронов (Becker, Hu, 2008). Однако до сих это предположение так и не получило подтверждение в экспериментах по реакции электрической самостимуляции мозга, позволяющей непосредственно оценивать поведенческие эффекты исследуемых веществ на систему «награды». Более того, в недавних работах, проведенных в этой области, некоторыми авторами опровергалась возможность индукции эстрадиолом поведенчески-значимых изменений в системе «награды» ГМ (Stratmann, Craft 1997; Bless et al., 1997).

Механизмы, которые лежат в основе влияния эстрадиола на поведенческие эффекты психостимуляторов, до сих пор остаются невыясненными. Вместе с тем, понимание причин, ведущих к возникновению половых различий в эффектах ПАВ, важно для оптимизации стратегии профилактики и лечения аддиктивных расстройств. В данной работе был проведен экспериментальный анализ влияния эстрадиола на поведенческие эффекты кокаина с применением различных методических подходов.

Настоящая работа выполнена в рамках отраслевой научно-исследовательской программы «Разработка эффективных методов и средств профилактики, диагностики и лечения наркологических заболеваний на основе медико-биологических, клинических и медико-социальных исследований» (тема: «Изыскание и изучение средств фармакотерапии наркотоксикоманий и алкоголизма в ряду веществ, влияющих на ионные каналы и нейрональные рецепторы»).

Цель исследования.

Экспериментальное изучение эстроген-зависимых изменений функции мозговой системы «награды» и подкрепляющего эффекта кокаина.

Основные задачи исследования.

1. Оценить функцию системы «награды» по показателям реакции электрической самостимуляции мозга (РЭСМ) в разные периоды эстрального цикла, а также после введения эстрадиола овариэктомированным (ОВЭ) самкам крыс.

2. Исследовать различные виды двигательной активности, обладающие и не обладающие собственными подкрепляющими свойствами, в разные периоды эстрального цикла, а также после введения эстрадиола ОВЭ самкам крыс.

3. Изучить влияние эстрадиола на подкрепляющий эффект кокаина на модели инициации внутривенного самовведения (ВВС) данного ПАВ у ОВЭ самок мышей.

4. Сравнить роль эстрогеновых рецепторов аир подтипов (а-ЭР и Р-ЭР) в модулирующем влиянии эстрадиола на поведенческие эффекты кокаина.

5. Оценить влияние эстрадиола на экспрессию мРНК а-ЭР и Р-ЭР, дофаминового транспортера (ДАТ) и серотонинового транспортера (СЕРТ) в тромбоцитах периферической крови.

Научная новизна.

В работе впервые показано, что:

1. У ОВЭ самок крыс эстрадиол (5 мкг/животное, подкожно, 2 дня введения) вызывает медленно развивающееся повышение чувствительности системы «награды» со снижением порогов РЭСМ через двое суток после введения эстрадиола с максимумом на 4-ый день.

2. На' фоне сенситизации системы «награды» эстрадиолом кокаин (5 мг/кг, внутрибрюшинно) вызывает быстро развивающееся дальнейшее снижение порога РЭСМ, причем взаимодействие двух веществ носит аддитивный характер.

3. Эстрадиол повышает специфическую двигательную активность, обладающую собственными подкрепляющими свойствами (модель «бег в колесе»), но не

оказывает влияния на двигательную активность лишенную собственных подкрепляющих эффектов (перемещения в актометре).

4. Положительно-подкрепляющий эффект кокаина у ОВЭ самок мышей усиливается после предварительного введения эстрадиола, а также селективного агониста (3-ЭР БРИ.

5. Предложена гипотеза о том, что пермиссивное влияние эстрогенов на подкрепляющий эффект кокаина реализуется на уровне системы «награды» ГМ преимущественно через (3-ЭР посредством геномных механизмов.

Научно-практическое значение работы.

Результаты данной работы служат основой для понимания и дальнейшего углубленного изучения механизмов, лежащих в основе формирования полового диморфизма в поведенческих эффектах психостимуляторов и других ПАВ. Изучение влияния гормональных факторов на развитие эффектов психоактивных веществ в конечном итоге может играть существенную роль в оптимизации медикаментозных стратегий, применяемых для лечения зависимости в клинической практике. На основе полученных данных о разделении функциональной роли а-ЭР и Р-ЭР в реализации подкрепляющего действия кокаина определено новое направление изыскания потенциальных терапевтических средств для лечения наркотоксикоманий. Кроме того, как показывают результаты данного исследования, половой. диморфизм в эффектах ПАВ, а также зависимость эффектов ПАВ от полового цикла, является существенными факторами, которые должны учитываться при планировании как клинических, так и экспериментальных исследований.

Положения, выносимые на защиту.

1. Эстрогены сенсибилизируют систему «награды» мозга и усиливают «гедонический» эффект' кокаина на модели электрической самостимуляции головного мозга.

2. Эстрогены усиливают первично-подкрепляющие свойства фармакологических (кокаин) и нефармакологических (двигательная активность, обладающая собственным подкрепляющим эффектом, «награждающие» свойства электрической стимуляции вентральной покрышки мозга) стимулов.

3. Усиление первично-подкрепляющих свойств кокаина эстрадиолом опосредуется Р-эстрогеновыми рецепторами.

4. Пермиссивный эффект эстрадиола в отношении поведения, подкрепляемого фармакологическими и нефармакологическими стимулами, является отсроченным (на 48-72 часа) и не коррелирует с максимумом концентрации эстрадиола в плазме, что косвенно свидетельствует о геномной природе данного эффекта.

5. Эстроген-зависимость подкрепляющих и «гедонических» эффектов психоактивных веществ (на примере кокаина) является важной составляющей факторов риска аддиктивных расстройств, ассоциированных с полом.

Реализация результатов исследования.

Результаты исследования внедрены в практику учебной и исследовательской работы кафедры фармакологии и НИЦ СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на международной ежегодной конференции Европейского Общества Нейропсихофармакологии (Ницца, Франция, 2008), на П-м Международном Молодежном Медицинском Конгрессе "Санкт-Петербургские научные чтения" (Санкт-Петербург, Россия, 2008), на NIDA International Forum 2008 (Пуэрто-Рико, Сан Хуан, 2008).

По результатам исследования опубликовано 5 работ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 132 страницах и состоит из введения, обзора литературных источников, описания материалов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа проиллюстрирована 17 таблицами и 19 рисунками. Литературный указатель содержит ссылки на 222 научных публикаций.

Содержание работы

Работа выполнена на 263 самках крыс линии Wistar, массой 180-200 г, и 394 самках мышей линии DBA, массой 20-25 г (питомник РАН «Рапполово», Ленинградская область).

В работе использовали следующие вещества: 17р-эстрадиола бензоат (ICN Biomedicals, USA), кокаина гидрохлорвд (Центральная городская аптечная база, С-Петербург, Россия), РРТ (пропилпиразол триол, Cayman chemicals, USA), DPN (2,3-бис-(4-гидроксифенил)-пропионитршх, Cayman chemicals, USA).

Эстрадиол растворяли в кунжутном масле (ICN Biomedicals, USA) в концентрации 50 мкг/мл. Полученный раствор вводили подкожно в объеме 0.1 мл/животное. Контрольным группам вводили кунжутное масло в том же объеме. Кокаин, растворяли в изотоническом растворе хлорида натрия в концентрации 5 мг/мл. Полученный раствор вводили внутрибрюшинно в объеме 1 мл/кг. Контрольным группам вводили растворитель в том же объеме. DPN и РРТ растворяли в 100% растворе DMSO, в концентрации 10 мг/мл. Полученный раствор разводили в 10 раз кунжутным маслом и ставили на 10 минут в ультразвуковую ванну до получения эмульсии. Полученную эмульсию вводили подкожно в объеме 0.1 мл/животное.

Стадию астрального цикла определяли по клеточному составу влагалищных мазков. Овариэктомию самок крыс осуществляли под галотановым наркозом. Самок мышей для проведения овариэктомии наркотизировали путем внутрибрюшинного введения кетамина (2,5% раствор, 0,1 мл ча животное) и ксилозина (0,5% раствор, , 0,05 мл на животное).

Результаты экспериментов обрабатьвали с помощью пакета статистических программ SPSS (SPSS 14.0, SPSS lie., США). Статистическую достоверность действия веществ и ее дозозависимость оценивали с помощью одно- и двухфакторного дисперсионного анализа, адаптированного для ситуаций с повторными измерениями и с разним размером групп. Межгрупповые сравнения (тесты/критерии Тьюки, Манн-Уитни, Вшшжсона) проводили при условии, что

достоверный эффект был выявлен процедурой дисперсионного анализа. Достоверность результатов при альтернативном учете оценивали с помощью точного метода Фишера.

Зависимость порога РЭСМ от стадии цикла выявляли с помощью статистического пакета анализа временных рядов «Гусеница» (CaterpillarSSA 3.30, GistaT Group, Россия).

1. Изменение порогов реакции самостимуляции мозга самками крыс в разные фазы эстрального цикла, а также под влиянием эстрадиола и его сочетания с

кокаином

Для исследования порогов реакции электрической самостимуляции мозга (РЭСМ) крысам вживляли биполярный электрод в область вентральной покрышки среднего мозга (координаты относительно брегмы: саггитальная ось -4.8 мм, горизонтальная ось 0.8 мм справа или слева от саггитального шва, вертикальная ось 8.2 мм вглубь от поверхности черепа).

Определение «порогов» РЭСМ проводили с помощью процедуры дискретных «проб», не зависящей от моторной функции животного. Каждая проба начиналась с предъявления животному «независимого» 0.5 секундного электрического стимула. Инструментальная реакция животного (выглядывание в отверстие) подкреплялась одним «зависимым» стимулом, идентичным по всем параметрам независимому, после чего проба засчитывалась как «позитивно» оконченная. Если животное не производило инструментальной реакции, то, по истечении 7.5 сек, попытка засчитывалась как «негативно» оконченная.

Сила тока электрических стимулов менялась в десяти восходящих и нисходящих сериях. Шаг изменения силы тока высчитывался по десятичной логарифмической шкале. На каждый шаг животному предоставлялось 5 попыток самостимуляции. Если 3 и более попытки из пяти оканчивались «позитивно», сила тока понижалась на один шаг. Если 3 и более попытки оканчивались «негативно», сила тока повышалась. «Порог» самостимуляции высчитывался как среднее арифметическое полученных минимальных значений тока в каждой из десяти серий.

По окончании эксперимента животных умерщвляли, извлекали у них головной мозг и фиксировали в парафине. Точность локализации электрода в вентральной покрышке определяли путем исследования срезов, полученных на микротоме

1.1. Пороги самостимуляции в разные фазы эстрального цикла

При анализе ковариационных матриц методом «Гусеница» у 4-х из 19-ти интактных самок крыс были обнаружены эпизоды колебаний порога РЭСМ с цикличностью в 4 дня (что соответствует нормальному эстральному циклу). Минимальный порог РЭСМ наблюдали во время стадии проэструса (рис. 1), характеризующейся максимальным содержанием эстрадиола в плазме крови (Butcher et ai, 1974). Небольшой процентный выход животных можно связать с недостаточной чувствительностью методики определения порога к эффектам

' Гистологические исследования головного мозга крыс проводили в лаборатории патологической морфологии отдела патологии НИЦ СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова под руководством д.м.н., профессора Томсона В.В.

эндогенного эстрадиола, или же с антагонистическим влиянием прогестерона, присутствующим в крови интактных самок.

Дни от напала тестирований

Рис. 1. Зависимость порога самостимуляции от стадии эстрального цикла, репрезентативное животное.

Эпизоды циклических четырехдневных колебаний порога самостимуляции были выявлены у четырех животных. * - достоверное отличие порога самостимуляции в стадию проэструса (ПЭ) от стадий эструса (Э), метеструса (МЕ) и диэструса (ДЭ) (Р<0,01, парные сравнения по Бонферрони).

1.2. Изменение порога реакции самостимуляции под влиянием эстрадиола Поскольку у нескольких животных была выявлена зависимость порогов самостимуляции от уровня половых гормонов, следующим шагом в работе стало изучение влияния эстрадиола на РЭСМ у овариоэктомированных (ОВЭ) самок крыс. Введение эстрадиола (5 мкг/животное, 2 дня введения, подкожно) снижало пороги самостимуляции в течение 6-ти дней спустя 48 часов после первой инъекции (рис. 2). Ежедневный порог РЭСМ высчитывали в процентных единицах, как отношение к базовому порогу, который представлял собой среднее арифметическое порогов самостимуляции, полученных за пять дней до определения контрольного порога (рис. 2, КП).

Последовательность ежедневных тестов Рис. 2. Порог самостимуляции у ОВЭ самок крыс после введения эстрадиола. Данные представлены в процентном отношении тестовых порогов к базовому, М ± т, N=8. * - Р<0,05; достоверное отличие от контрольного порога, КП (критерий Вилхоксона).

1.3. Влияние кокаина на реакцию самостимуляции у овариоэктомированных крыс после введения эстрадиола.

Опыты проводили на 8 ОВЭ самках крыс. На каждом животном было протестировано 4 комбинации веществ и их растворителей (растворитель эстрадиола, 0,1 мл/животное, и растворитель кокаина, 1 мл/кг; растворитель эстрадиола и кокаин, 5 мг/кг; эстрадиол, 5 мкг/животное, и растворитель кокаина; эстрадиол и кокаин) в псевдослучайной последовательности. Перерыв между тестированием каждой комбинации составлял 10 дней. Первый день тестирования служил контрольной точкой (КТ1, рис. 3). В этот день животные не получали инъекции препаратов или их растворителей. На второй и третий день крысы получали, в зависимости от тестируемой комбинации, инъекции эстрадиола или его растворителя, подкожно, за 2 часа до экспериментальной сессии, и инъекции кокаина или его растворителя, внутрибрюшинно, за 15 минут до экспериментальной сессии. На четвертый, пятый и шестой дни животные получали инъекции только кокаина или его растворителя. Седьмой день также служил контрольной точкой (КТ2, рис. 3), и животные не получали никаких инъекций.

Как и в предыдущем эксперименте эстрадиол вызывал постепенное снижение порога РЭСМ. Кокаин вызывал одинаковое по выраженности снижение порога во все дни его введения, без развития эффектов сенситизации или толерантности. После отмены кокаина, порог возвращался к исходному уровню (КТ2, рис. 3). Эффект комбинации кокаина и эстрадиола был выше, чем у каждого вещества по отдельности и значимо отличался от эффектов только эстрадиола во всех точках, и от эффектов только кокаина на 3-ий, 4-ый и 5-ый дни после начала введения. Когда введение кокаина прекращалось, порог возвращался к уровню, полученному при введении эстрадиола (КТ2, рис. 3).

Таким образом, на основании полученных данных можно сделать заключение, что эффекты эстрадиола и кокаина на порог РЭСМ суммировались.

Какаин или Физ. р-р 15 дней]

КТ1 | | КТ2

Э страдиол или масло 12 дня]

Рис. 3. Влияние комбинации эстрадиола и кокаина на РЭСМ у ОВЭ самок крыс. Данные представлены как процентное отношение к базовому порогу, который для каждого теста высчитывался как среднее арифметическое порогов самостимуляции, полученных за 5 дней до теста. Парные post-hoc сравнения по Бонферрони, Р<0,05:

# - различия между комбинациями, включающими растворитель эстрадиола (масло), оп

& - различия между комбинациями, включающими кокаин,

§ - различия между комбинациями, включающими растворитель кокаина (физ. р-Р). ов

* - различия между комбинациями, включающими эстрадиол,

2. Влияние астрального цикла и эстрадиола на двигательную активность, обладающую и не обладающую собственными подкрепляющими свойствами, у

самок крыс.

В качестве двигательной активности, обладающей собственными подкрепляющими свойствами, был изучен бег самок крыс в колесе. Существует большое количество работ, доказывающих, что бег в колесе обладает собственным подкрепляющим действием (ЗЬегтоп, 1998). Обучение бегу происходит спонтанно, при этом животные продолжают наращивать суточное количество оборотов в течение нескольких недель, до тех пор, пока не выйдут на стадию плато, что явно говорит о наличии собственных подкрепляющих свойств у этого вида активности, в отличие от двигательной активности, наблюдаемой у животных в актометре (рис. 4).

Бег в колесе обладает свойствами, подкрепления в экспериментах по инструментальному обучению наравне с едой, водой и электростимуляцией. Кроме того, бег в колесе может использоваться для обусловливания предпочтения места (Ъе«е1а1.2001).

Рис. 4. Пример изменения активности животных.

А - спонтанное увеличение двигательной активности в беговом колесе у необученных крыс. Б, В -ежедневное снижение горизонтальной и вертикальной двигательных активностей в актометре.

2.1. Влияние астрального цикла на двигательную активность, обладающую собственными подкрепляющими свойствами (бег в колесе). В данной серии опытов 20 интактных необученных самок помещали в экспериментальные камеры на 3 недели, где они в течение 24 часов имели свободный доступ к колесу. У 7 из 20-ти животных (35%) выявлена зависимость двигательной активности в колесе от стадии цикла. Как видно из графика (рис. 5), в стадию проэструса на фоне максимального содержания эстрадиола в плазме крови (Butcher et al., 1974) наблюдалась максимальная активность в беговом колесе.

5 12000

X

5.

и 10000

го

т

а

О 8000

h-

О

а

о 6000

ю

о

о

ш 4000

13

tu

т S 2000

с:

о

ЭГ 0

э me

О 4 8 12 16 20 Дни

Рис. 5. Зависимость двигательной активности в беговом колесе от стадии эстрального цикла. На графике представлены данные как среднее количество оборотов колеса за 24 ч (М±ш), N=7. * -отличие стадии проэструса, ПЭ, от стадий эструса, Э, метеструса, МЕ, и дизструса, ДЭ ( Р<0,05, тест Бонферрони).

2.2. Влияние овариоэктомии на обучение бегу в колесе. Сравнение суточной активности ранее не обученных бегу в колесе ОВЭ и циклирующих самок крыс выявило, что овариоэктомия делает менее эффективным обучение бегу в колесе. На графике показано, что активность циклирующих крыс постепенно нарастает к 14-му дню, тогда как активность ОВЭ животных остается на прежнем уровне (рис. 6). Стадию цикла в этом эксперименте не учитывали.

S 3500

SC

В 3000

га

(*!

09 2500

о

1-

о а. 2000

о

ю

о 1500

о

m

1-и 1000

ш

У

500

Ч

О

ае 0

■ Ложнооперированные самки ' Овариэкгомированные самки

12

11

Дни

Рис. 6. Влияние овариэктомии на обучение крыс бегу в колесе.

Данные предстазлены как среднее количество оборотов колеса за 24 ч (М±т). В клетки с беговым колесом помещали на 2 недели ранее не обученных циклирующих или ОВЭ самок. Суточную активность измеряли ежедневно в течение 14 дней. Стадию цикла не учитывали. * - Р<0,001 (post hoc t-тест) - достоверные отличия группы циклирующих от ОВЭ самок, N=8.

2.3. Влияние овариоэктомии на активность самок, обучившихся бегу в колесе. Овариоэктомия значимо снижала активность животных в беговом колесе (рис.-7)

—о— Те же самки после овариэктомии Рис. 7. Влияние овариэктомии на активность крыс в беговом колесе.

Данные представлены как среднее количество оборотов колеса за 24 ч (М±т), N=8. Цитирующих крыс помещали в клетки с беговым колесом на 2 недели, затем животных овариэктомировали, измерение активности продолжали через 2 недели после овариэктомиии в течение 14 дней.

Следует отметить, что сам факт хирургического вмешательства не влиял на активность животных, так как сравнение активности интактных и ложнооперированных крыс в беговом колесе не выявило различий в активности животных (данные не приведены).

2.4 Влияние эстрадиола на активность овариэктомированных самок крыс в беговом

колесе.

Интактных самок помещали в экспериментальные камеры на три недели, где они в течение 24 часов имели свободный доступ к колесу. После периода обучения самок овариэктомировали. В течение трехнедельного восстановительного периода животных содержали в изолированных домашних клетках. Во время тестирования ОВЭ самок ежедневно помещали в экспериментальные камеры на 1 час. После четырех дней габитуации самок разделяли на 2 группы по 10 животных в каждой, с таким условием, чтобы средняя беговая активность за предыдущие 4 дня в группах была одинаковой. На 5-й и 6-й дни тестирования одна группа самок получала инъекцию эстрадиола (подкожно, 5 мкг/животное в объеме 0,1 мл), вторая (контрольная) - растворитель эстрадиола кунжутное масло (подкожно, в объеме 0,1 мл) за два часа до тестирования. Одночасовую активность животных в беговом колесе продолжали анализировать в течение 10 дней после первой инъекции эстрадиола.

Эстрадиол оказал значимое влияние на активность животных, причем активность увеличивалась, начиная с четвертого дня после первой инъекции эстрадиола (рис.

I

a о vo о о ш

Ö

a>

У

s §

700 600 500 400 300 200 100

0 12 3 4

t t

Введение эстрадиола или растворителя (2 дня)

9 10 Дни

Рис. 8. Влияние эстрадиола на активность ОВЭ самок крыс в беговом колесе. Данные представлены как среднее количество оборотов колеса за 1 ч (М±т), N=8. Животные получали две последовательные (день 1 и день 2) инъекции эстрадиола (5 мкг на животное; 0,1 мл) или его растворителя (0,1 мл) за два часа до теста. Активность измеряли ежедневно в течение 10 дней. * - Р<0,05 (post hoc t-тест) - достоверные отличия группы, получившей инъекции эстрадиола от группы, получившей инъекции растворителя.

2.5 Влияние астрального цикла крыс на двигательную активность в актометре. Двигательная активность в актометре не обладает собственными подкрепляющими свойствами. При изучении данного вида поведения не было обнаружено его зависимости от стадии астрального цикла (рис. 9).

О

X s 120

Р

га 100

сС

X

■с 80

х

X

Ol У 60

01

0J 40

a

a>

с 20

о

a

Ч 0

О

2С

Вертикальная активность

Горизонтальная активность

пэ

дэ

Рис. 9. Двигательная активность в локомоторных боксах у интактных самок крыс. Данные представлены в виде среднего количества пересечений животными инфракрасных датчиков, М ± т. Стадии эстрального цикла: ПЭ - проэструс (N=9), Э - эструс (N=5), МЭ -метэструс (N=8), ДЭ - диэструс (N=9).

2.6 Влияние эстрадиола на двигательную активность овариэктомированных крыс в

актометре.

В эксперименте использовали 14 ОВЭ животных для группы эстрадиола и 16 для группы растворителя. Животных приучали к экспериментальным боксам в течение 5-ти дней. По исходному уровню активности крыс разделяли на 2 группы. Инъекции эстрадиола или его растворителя за 2 часа до экспериментальной сессии. Эстрадиол не влиял на двигательную активность ОВЭ животных в актометре (рис. 10)

S 100 х

2 80 х

¥ 60

Вертикальная активность

— Растворитель

— Эстрадиол

Горизонтальная активность

3 250

Е

■ Растворитель

■ Эстрадиол

б Дни

6 Дни

Эстрадиол или Растворитель [2 Дня]

Эстрадиол или Растворитель [2 дня]

Рис. 10. Влияние эстрадиола на двигательную активность ОВЭ крыс.

Данные представлены в виде среднего количества пересечений жиеотными инфракрасных датчиков, М ± т.

3. Влияние овариэктомии и эстрадиола на первично-подкрепляющий эффект

кокаина.

Влияние овариоэктомии и эстрадиола на первично-подкрепляющий эффект кокаина проводили с помощью методики внутривенного самовведения (Кузьмин, Звартау, 1991) у необученных самок мышей линии БВА/2.

Протокол опыта с инициацией внутривенного самовведения фармакологических веществ предусматривает предварительный отбор и формирование пар животных на основе исходного уровня их ориентировочно-исследовательской активности (количества выглядываний в отверстие). Тестирование проводили в соответствии со сформированными парами. Во время теста одна из мышей («активная» - АМ) получала в/в инъекции кокаина в ответ на собственные выглядывания. Другая («пассивная» - ПМ) получала инъекции в ритме выглядывания АМ, без связи с собственными выглядываниями. Исходя из соотношения количества выглядываний АМ и ПМ, рассчитывали Я-критерий самовведения по формуле: К=1^(А2/П2)-Ь§(А1/П1), где А1 и А2 - количество выглядываний у АМ в контрольном периоде и периоде самовведения соответственно, а П1 и П2-те же показатели для ПМ.

3.1 Влияние эстрадиола на инициацию внутривенного самовведения кокаина у

овариэктомированных мышей. Необходимые концентрации кокаина получали разведением препарата в изотоническом растворе №С1. Каждая экспериментальная группа состояла из 7-10

животных. В эксперименте использовали 6 групп ОВЭ мышей, получавших инъекции масла и 6 групп, получавших иньекции эстрадиола: по одной контрольной группе с самовведением растворителя (изотонического раствора ЫаС1), и по 5 групп животных с самовведением разных концентраций кокаина (0,25; 0,5; 0,75, 1,0 и 1,25 мг/мл раствора).

Эстрадиол (5 мкг/мышь, 0.1 мл) или его растворитель (кунжутное масло, 0.1 мл/мышь) вводили подкожно в область холки в течение двух дней до теста. Такая схема введения была достаточна для индукции эструса на день теста. Было обнаружено, что эстрадиол усиливал аддиктивные свойства кокаина, что отражалось в сдвиге дозозависимой кривой'самовведения кокаина влево у мышей, получавших

0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 Доза кокаина, мкг/инф

Рис. 11. Изменение кривой «доза - эффект» под влиянием эстрадиола у ОВЭ мышей (модель инициации внутривенного самовведения кокаина).

+, * - достоверное отличие от контрольной группы (доза кокаина «О») для мышей, получавших соответственно растворитель эстрадиола или эстрадиол, Р<0,05 (Тест множественных сравнений Тьюки-Крамера)

# - достоверное отличие мевду группами, получавшими масло или эстрадиол, Р=0,0012 (двухфакторный дисперсионный анализ, парное сравнение по Бонферони)

3.2 Влияние селективных агонистов а- и р- эстрогеновых рецепторов на внутривенное самовведение кокаина v мышей. Исследования селективных агонистов проводили в полной аналогии с предыдущим экспериментом. Агонист а-ЭР, РРТ, или (3-ЭР, DPN, вводили подкожно в область холки в течение двух дней до теста в дозе 0,1 мг/животное. Такая схема введения была подобрана на основании работы J. Frasor (2003), согласно которой РРТ в дозе 0,1 мг/мышь вызывал увеличение матки сравнимое с введением эстрадиола в дозе 5 мкг/мышь, a DPN в дозе 0,1 мг/мышь обладал модулирующими эффектами на андрогеновые и прогестероновые рецепторы в матке при совместном введении с РРТ.

Было выявлено, что агонист Р-ЭР, DPN, смещал дозозависимую кривую самовведения кокаина влево аналогично эстрадиолу. Кривая самовведения для агониста а-ЭР, РРТ, не отличалась от таковой для растворителя эстрадиола (рис. 12).

-О— РРТ

0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 Доза кокаина, мкг/инф

Рис. 12. Влияние селективных агонистов а- и р-ЭР на значение R-критерия самовведения кокаина у ОВЭ мышей.

Примечания: график растворителя (кунжутное масло) взят из предыдущего эксперимента.

+, * - достоверное отличие от контрольной группы (доза кокаина «0») для мышей получавших

соотвественно РРТ и DPN, Р<0,05 (Тест множественных сравнений Тьюки-Крамера)

# - достоверное отличие между группами, получавшими масло или эстрадиол, Р<0,05

(двухфакторный дисперсионный анализ, парное сравнение по Бонферони)

4. Измерение концентраций эстрадиола в плазме крови у самок крыс

Целью данного раздела работы было сопоставить концентрации эстрадиола в крови у интактных крыс с уровнем эстрадиола в крови после его введения в форме фармакологического препарата ОВЭ самкам крыс. Содержание эстрадиола в сыворотке крови определяли с помощью гормональных тест-наборов для твердофазного иммуноферментного анализа in vitro у человека (Хема-Медика, Италия-Россия).

Результаты показали, что через 2 часа после подкожного введения 5 мкг эстрадиола его концентрация в плазме крови сопоставима с уровнем эндогенного эстрадиола у интактых самок крыс в стадию проэструса. Концентрация эстрадиола в стадию проэструса у интактных самок (N=6) крыс в среднем составила 90,7 ±13,6 (М ± т), что статистически не отличалось от уровня эстрадиола у ОВЭ крыс через 2 часа после первого введения (Р=0,457; критерий Стъюдента), но отличалось от концентрации эстрадиола у ОВЭ животных в контрольной точке (Р<0,01; критерий Стьюдента).

Повышенные концентрации эстрадиола продолжают наблюдаться у ОВЭ самок после 2-х дней его введения на протяжении еще 4-х дней (рис. 13).

Рис. 13. Уровень эстрадиола в плазме крови ОВЭ самок крыс после двух дней введения. Данные представлены в виде средней концентрации эстрадиола в плазме, выраженой в пкг/мл (М ± т) по 14-ти животным. Данные за 8-ой день представлены только по 6-ти животным. ** -Р<0,01; * - Р<0,05, критерий Вилкоксона, парные сравнения с контрольной точкой.

5. Исследование экспрессии генов альфа и бета эстрогеновых рецепторов, а также серотонинового и дофаминового транспортеров2

Материалом для исследования служили тромбоциты периферической крови животных, получаемой путем отрезания кончика хвоста. Нуклеиновые кислоты выделяли с помощью сорбентного метода, с применением набора реагентов «Рибосорб» производства фирмы «Амплисенс». Обратную транскрипцию РНК проводилась с помощью коммерческого набора «Реверта L-ЮО» производства фирмы «Интерлабсервис» (Москва). Экспрессию генов определяли по содержанию копий кДНК с помощью геноспецифической ПЦР. Полуколичественный анализ специфических ПЦР-сигналов проводили с помощью программы Gel-Pro. Показатели экспрессии целевых генов определяли как отношение степени абсорбции изучаемого гена и абсорбции гена глицеральдегиддегидрогеназы (GAPDH), принимаемой за 1,0.

При анализе результатов учитывался тот факт, что мРНК в тромбоцитах отражает изменения в экспрессии генов с запаздыванием в два дня (транзитный период безъядерных тромбоцитов с момента их образования из мегакариоцитов до появления в крови).

2 Данный раздел работы выполнялся совместно с лабораторией молекулярной диагностики Научно-методического центра по молекулярной медицине М3 РФ на базе СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова под руководством д.м.н. Чухловина А.Б.

Было обнаружено снижение количества интактных животных, у которых выявлялась экспрессия Р-ЭР в стадии проэструса и эструса (таб. 1), и аналогичное снижение числа ОВЭ самок крыс, у которых выявлялась экспрессия Р-ЭР на 4-ый день после введения экзогенного эстрадиола (2 дня введения, 5 мкг/животное; таб. 2). Эти данные могут отражать реакцию р-ЭР на «нагрузку» эстрадиолом. Изменения экспрессии а-ЭР выявлены не были, вероятно, в силу недостаточной выраженности их экспрессии в тромбоцитах.

Экспрессия дофаминового транспортера не зависела ни от стадии эстрального цикла, ни от введения экзогенного эстрадиола. Выраженность экспрессии серотонинового транспортера повышалась в стадии проэструса и эструса у интактных животных (таб. 3), но не зависела от введения экзогенного эстрадиола.

Таблица 1. Экспрессия гена Р-ЭР у интактных самок крыс в стадии проэструса и эструса (ПЭ/Э) и метэструса и диэструса (МЭ/ДЭ).__

Стадии цикла (на момент нахождения тромбоцитов в костном мозгу) Количество наблюдений Выраженность экспрессии в относительных единицах свечения (М±м)

С экспрессией Без экспрессии Всего

ПЭ/Э 3* 9 12 0,41±0,18

МЭУДЭ 10 2 12 0,15±0,05

* - достоверное отличие между стадиями цикла ПЭ/Э и МЭ/ДЭ (Р<0,05, точный критерий Фишера)

Таблица 2. Экспрессия гена Р-ЭР у овариэктомированных крыс после двух инъекций эстрадиола

День забора пробы День нахождения тромбоцитов в костном мозгу Группа Количество наблюдений Выраженность экспрессии в относительных единицах свечения (М±м)

С экспрессией Без экспрессии Всего

3 1 Эстрадиол 6 9 15 0,16±0,04

3 1 Растворитель 4 9 13 0,22±0,07

б 4 Эстрадиол 1* 14 15 0,07+-

6 4 Растворитель 6 б 12 0,17±0,05

* - достоверное отличие между группами, получавшими эстрадиол и растворитель на 6-ой день после первой инъекции эстрадиола (Р<0,05, точный критерий Фишера)

Таблица 3. Экспрессия гена СЕРТ у интактных самок крыс

Стадии цикла (на момент нахождения тромбоцитов в костном мозгу) Количество наблюдений Выраженность экспрессии в относительных единицах свечения (М+м)

С экспрессией Без экспрессии Всего

ПЭ/Э 6 6 12 0,62±0,12*

МЭ/ДЭ 5 7 12 0,15±0,05

* - Достоверное различие между стадиями ПЭ/Э и МЭ/ДЭ (Р<0,05, критерий Стьюдента для связанных выборок)

Заключение

Проведенное исследование показало, что эстрадиол усиливает первично-подкрепляющие свойства фармакологических (кокаин) и нефармакологических

(двигательная активность, обладающая собственным подкрепляющим эффектом, «награждающие» свойства электрической стимуляции вентральной покрышки мозга) стимулов. При этом он не оказывает влияние на поведение животных в условиях нейтральной контекстной обстановки (двигательная активность в актометре). Эстроген-зависимость подкрепляющих («гедонических») эффектов ПАВ на. примере кокаина, может являться важной составляющей факторов риска аддиктивных расстройств, ассоциированных с полом, достаточно широко освещенных в клинических исследованиях за последние двадцать лет.

Общей характеристикой наблюдаемых эффектов эстрадиола у ОВЭ животных явилась отсроченность их возникновения во времени от момента введения гормона. При измерении концентрации эстрадиола у ОВЭ самок нами было показано, что максимальная его концентрация в крови наблюдается уже спустя 2 часа после его подкожного введения. Снижение порогов самостимуляции, однако, наблюдалось нами только спустя 48 часов после первой инъекции, а увеличение двигательной активности в колесе - спустя 4 дня. Кроме того, в экспериментах по выявлению экспрессии генов ЭР в тромбоцитах периферической крови, возникновение ответа на эстрадиоловую «нагрузку» (снижение экспрессии генов р-ЭР) наблюдалось на 4-ый день после первой инъекции эстрадиола в режиме двухдневного его введения (таб. 4). Быстрые (негеномные) эффекты эстрадиола, развивающиеся в течение нескольких часов после его введения, нами не наблюдались ни в одном из проведенных экспериментов на ОВЭ крысах.

Таблица 4. Соотношение времени развития поведенческих и фармакологических эффектов после введения эстрадиола овариэктомированным самкам крыс и динамики концентрации эстрадиола в плазме _ _ _ _ ___

2 часа ! 24 часа | 48 часов | 72 часа | 4 дня | 6 дней | 8 дней | 12 дней

Увеличение концентрации эстрадиола в плазме крови после его введения:

++ 1 ++ I ++ t ++ 1 н.д. I + I 0 | н.д.

Снижение порогов самостимуляции вентральной покрышки ГМ:

0 1 0' | + | + | н.д. | ++ | + | 0

Увеличение двигательной активности в беговом колесе:

0 | 0 | 0 1 0 | + | ++ | ++ | +

Развитие ответа гена ß-ЭР на нагрузку эстрадиолом:

И.Д. 1 Н.Д. 1 н.д. 1 0 1 + I н.д. 1 Н.Д. I н.д.

Изменение двигательной активности в актометре:

0 | 0 | 0 ! 0 | 0 | 0 | 0 | н.д.

О - отсутствие эффекта; ++, + - наличие эффекта разной степени выраженности. Н.д. - нет данных.

Активация системы «награды» головного мозга эстрадиолом через ß-ЭР может реализовываться посредством изменения синаптической передачи в дофаминергических проекциях этой системы. Нами не было обнаружено изменения экспрессии гена дофаминового транспортера при введении эстрадиола, однако, существуют данные, свидетельствующие о том, что эффект эстрадиола может Также реализовываться посредством увеличения синаптического выброса дофамина (Becker & Hu 2008), или изменения плотности и чувствительности дофаминовых

рецепторов (Le Saux et al. 2006; Hruska et al. 1980). Возможные механизмы развития активирующего эффекта эстрадиола в системе «награды» еще предстоит изучить.

Выводы

1. Эстрадиол (5 мкг/животное, 2 дня введения) у овариэктомированных самок крыс

вызывает медленно развивающееся и длительное повышение чувствительности системы «награды», что доказывается снижением порогов реакции самостимуляции через 48 часов после введения эстрадиола и продолжающимся 6 дней.

2. На фоне сенситизации системы «награды» эстрадиолом кокаин (5 мг/кг,

внутрибрюшинно) вызывает быстро развивающееся дальнейшее снижение порога реакции самостимуляции, причем взаимодействие двух веществ носит аддитивный характер.

3. Двигательная активность, обладающая собственными подкрепляющими

свойствами (модель «бег в колесе») является эстроген-зависимой, что доказывается максимальной активностью в период проэструса, формированием данной поведенческой реакции в течение 2 недель у циклирующих, но не овариэктомированных крыс, подавлением реакции у обученных животных после овариэктомии, и восстановлением у обученных овариэктомированных крыс после введения эстрадиола.

4. Чувствительность к положительно-подкрепляющему эффекту кокаина (модель

инициации внутривенного самовведения у мышей) возрастает под влиянием эстрадиола, что доказывается сдвигом кривой «доза-эффект» влево при самовведении кокаина в группе овариэктомированных мышей, получивших предварительную нагрузку эстрадиолом.

5. Пермиссивное влияние эстрогенов на подкрепляющий эффект кокаина

реализуется через (3-ЭР, о чем свидетельствуют эксперименты с высокоселективными лигандами а-эстрогеновых (пропилпиразол триол, РРТ) и Р-эстрогеновых (2,3-бис-(4-гидроксифенил)-пропионитрил, DPN) рецепторов, выявившие смещение кривой самовведения кокаина влево под действием только DPN - ашниста р-ЭР.

Научно-практические рекомендации

Рекомендуется продолжить изучение лигандов Р-ЭР с целью изыскания потенциальных фармакотерапевтических средств преимущественно центрального действия для лечения предменструального синдрома и аддиктивных расстройств у женщин.

При доклиническом исследовании психоактивных веществ у самок целесообразно регистрировать и указывать фазы астрального цикла, в период которых проводится исследование, и учитывать возможность влияния женских половых гормонов на психофармакологические эффекты.

Список научных трудов, опубликованных по теме диссертации

1. Галанкин T.JI. Влияние эстрадиола на порог самостимуляции у интактных и овариоэктомированных крыс // Ученые записки СПбГМУ. - 2008. - №4 - т. 15 - с. 71-722. Т. Л. Галанкин, Н.А. Паткина, Э.Э. Звартау. Влияние эстрадиола на подкрепляющий эффект кокаина у овариоэктомированных мышей // Вопросы наркологии. - 2008. - JSTsl - с. 55-60

3. Галанкин Т.Л., Шекунова Е.В., Звартау Э.Э. Роль половых гормонов в аддиктивном эффекте психостимуляторов // Вопросы наркологии. - 2008. - №2 - с. 66-73

4. Т. Galankin, I.V. Belozertseva, E.V. Shekunova and E.E. Zvartau. P.2.17. Estradiol decreases ventral tegmental area self-stimulation threshold and increases cocaine rewarding properties in rats // European Neuropsychopharmacology. - 2008. - Vol.18. -Suppl. l.-s50-s51

5. T. Galankin, Zvartau E. Estradiol decreases ventral tegmental area self-stimulation threshold and increases cocaine rewarding properties in rats // NIDA International Forum "Globally Improving Evidence-Based Interventions for Addictions", San Juan, Puerto Rico, June 13-17,2008. Abstract Book-P.91-92

Подписано в печать 12.12.2008. Формат 60x84/16 Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ЗАО «КопиСервис». Печать ризографическая. Заказ № 1/1212. П. л. 1.25. Уч.-изд. л. 1.25. Тираж 100 экз.

ЗАО «КопиСервис» Адрес: 197376, Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, д. 3. тел.: (812) 327 5098