Автореферат и диссертация по медицине (14.01.17) на тему:Экспериментально-морфологическое обоснование эффективности антиоксидантных препаратов при лечении синдрома энтеральной недостаточности

На правах рукописи

ЧУКИНА Ольга Вячеславовна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ АНТИОКСИДАНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ ПРИ ЛЕЧЕНИИ СИНДРОМА ЭНТЕРАЛЬНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ

14.01.17 Хирургия 03.03.04 Клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

5 ДЕК 2013

Оренбург 2013

00554217и

005542170

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научные руководители; доктор медицинских наук, профессор,

заведующий кафедрой госпитальной хирургии, урологии

Тарасенко Валерий Семенович;

доктор медицинских наук Стадников Борис Абрамович;

доктор биологических наук, з.д.н. РФ, профессор, заведующий кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии Стадников Александр Абрамович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

кафедры общей хирургии Оренбургской государственной медицинской академии Абрамзон Олег Моисеевич; кандидат медицинских наук, доцент ГБУЗ «Оренбургская ЦРБ» Кривонос Владимир Андреевич

Ведущая организация Государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «¿/<?» 2013 г. в /0-0-& часов на заседании

диссертационного совета Д 2u8.066.02 при ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: г. Оренбург, Парковый проспект, 7, с авторефератом - на сайтах Ьйр/Лулулу.о^та.ги и vak.ed.gov.ru.

Автореферат разослан «¡/-3 » СсО&Л^^ 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор РМ. Сайфутдинов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Многочисленные научные изыскания последних лет доказали лидерство синдрома энтеральной недостаточности (СЭН) среди непосредственных причин эндогенной интоксикации и неудовлетворительных результатов лечения у больных с распространенным перитонитом (Лабер-ко J1.A. с соавт., 2004; Алешин Д.А., 2009; Сергиенко В.И. с соавт., 2012). Интерес современной медицинской науки к проблеме СЭН обусловлен отсутствием общепризнанных схем его профилактики и комплексного лечения.

Ведущую патогенетическую роль в развитии СЭН занимает активация липопероксидации, возникающая при нарушении микроциркуляции и ишемии кишечной стенки (Ефименко H.A. с соавт., 2003; Sullins К.Е. et al., 2004; Ozguner I.F. et al., 2006). Повышение уровня активных форм кислорода при острых хирургических заболеваниях ведет к быстрому истощению факторов антиоксидантной системы, что обусловливает необходимость применения препаратов, обладающих антиоксидантными свойствами, в лечении энтеральной недостаточности (Юдакова О.В. с соавт., 2004; Аксенова A.A., 2008).

Одним из главных ферментов антиоксидантной защиты в организме человека является супероксиддисмутаза (СОД), поэтому в настоящее время большой интерес представляют препараты на его основе. Этот фермент эффективно снижает уровень супероксиданион-радикала и уменьшает образование других, более опасных для организма метаболитов кислорода (Alscher R.G. et al., 2002). В ФГУП «Государственный НИИ особо чистых биопрепаратов» Федерального медико-биологического агентства РФ (г. Санкт-Петербург) разработан ферментный лекарственный препарат Рексод®, обладающий антиоксидантным, антицитолитическим и противовоспалительным действием, основным веществом которого является рекомбинантная СОД человека (РСОД), получаемая по генноинженерной технологии.

Активация липопероксидации при разлитом перитоните ведёт к быстрому истощению факторов антиоксидантной системы, прежде всего аскорбиновой кислоты - ключевого антиоксиданта плазмы крови (Илларионов М.Ю., 2004; Musil F. et al., 2005). Аскорбиновая кислота является одним из наиболее изученных и часто применяемых в медицине гидрофильных антиоксидантов.

Сегодня представляется особо значимым изучение состояния гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы (ГГНС), участие которой в регуляции тканевого и клеточного гомеостаза у экспериментальных животных детально проанализировано в ряде фундаментальных исследований (Поленов А.Л., 1994; Акмаев И.Г., 1997; Стадников A.A., 2001; Стадников A.A. с соавт., 2012).

Вопрос лечебной коррекции СЭН и в настоящий момент является актуальным, особенно в аспекте нейроэндокринной регуляции. Практическая значимость подобных исследований продиктована необходимостью рас-

шифровки патогенетических механизмов СЭН и поиска универсального перспективного решения этой проблемы. Все вышеизложенное послужило обоснованием проведения настоящего исследования.

Цель исследования —экспериментально-морфологическое обоснование эффективности антиоксидантных препаратов при СЭН, в аспекте регулятор-ных влияний гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы (ГГНС) на репаративные процессы в тонкой кишке, печени.

Задачи исследования:

1. Выявить морфологические изменения со стороны тонкой кишки, печени при СЭН в условиях моделирования калового перитонита у морских свинок-самцов.

2. Определить характер репаративных процессов в тонком отделе кишечника и печени исследуемых животных при традиционной терапии и при использовании РСОД, аскорбиновой кислоты и их комбинации.

3. Оценить в эксперименте роль ГГНС в регуляции репаративных процессов при применении антиоксидантных препаратов (РСОД, аскорбиновая кислота) в условиях СЭН.

Научная новизна.

Впервые установлена светооптическая и ультраструктурная реорганизация гистологических структур тонкого отдела кишечника и печени при СЭН в условиях лечебной коррекции препаратом РСОД и высокими дозами аскорбиновой кислоты.

При использовании комплексного методического подхода (световая и электронная микроскопия, морфометрия, иммуноцитохимия) доказана возможность оптимизирующего воздействия экзогенно вводимых РСОД и аскорбиновой кислоты и особенно их комбинации на процессы репаративных гистогенезов, восстановления микроциркуляции в стенке тонкой кишки при СЭН.

Получены новые данные о диапазоне цитологической реорганизации крупноклеточных ядер гипоталамуса при СЭН и ее роли в реализации репаративных процессов в условиях применения антиоксидантных препаратов (РСОД, аскорбиновая кислота).

Теоретическая и практическая значимость работы.

Использование РСОД, высоких доз аскорбиновой кислоты и их сочетания в лечении СЭН создает адекватные условия для стимуляции пролиферации энтероцитов, клеток фибробластического ряда, что обеспечивает адекватную коррекцию измененного клеточного и тканевого гомеостаза тонкого отдела кишечника и существенно углубляет учение о биологии ткани в аспекте нейроэндокринной регуляции репаративных гистогенезов.

Проведенное исследование открывает перспективы для клинического применения РСОД и аскорбиновой кислоты с целью лечебной коррекции СЭН, начиная с ранних сроков заболевания, это позволит изменить даль-

нейшее течение патологического процесса, что имеет большое значение для абдоминальной хирургии.

Внедрение результатов исследования в практику. Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедрах госпитальной хирургии, урологии; гистологии, цитологии и эмбриологии ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Минздрава России.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на IX всероссийской научно-практической конференции врачей Приволжско-Уральского военного округа (Оренбург, 2008 г.); IV Международной (XIII Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2009 г.); конференции «Актуальные вопросы хирургии: проблемы и пути решения», посвященной 90-летию ОКБ станции Оренбург (Оренбург, 2009 г.); Всероссийском форуме «Пироговская хирургическая неделя» (Санкт-Петербург, 2010 г.); XI съезде хирургов Российской Федерации «Новые идеи и технологии в хирургии» (Волгоград, 2011 г.); III Эмбриологическом симпозиуме «ЮГРА-ЭМБРИО-2011. Закономерности эмбрио-фетальных морфогенезов у человека и позвоночных животных» (Ханты-Мансийск, 2011 г.); XI межобластной научно-практической конференции хирургов «Актуальные вопросы хирургии» (Бугуруслан, 2012 г.); XIX международном конгрессе хирургов-гепатологов России и стран СНГ «Актуальные проблемы хирургической гепатологии» (Иркутск, 2012 г.); II Всероссийской конференции студентов и молодых ученых в рамках «Дней молодежной науки ОрГМА», посвященной памяти чл.-кор. АМН СССР профессора Ф.М. Лазаренко (Оренбург, 2013 г.); Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы морфологии, адаптогенеза и репаративных гистогенезов», посвященной памяти чл.-кор. АМН СССР профессора Ф.М. Лазаренко (Оренбург, 2013 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, из них 8 работ в изданиях, рекомендованных ВАК при Минобрнауки РФ для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 333 источника, в том числе 235 работ на русском и 98 - на иностранных языках. Работа иллюстрирована 35 рисунками, в том числе 30 черно-белыми И цветными микрофотографиями гистологических препаратов и электронограмм и 19 таблицами.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная

медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации согласно плану НИР (№ государственной регистрации 01201156940).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

Течение экспериментального калового перитонита сопровождается развитием СЭН. Течение и исход заболевания, объем деструктивных процессов в тонкой кишке и печени во многом определяются рассинхронизацией этапов гипоталамической нейросекреции, нарушением микроциркуляции в стенке кишки с развитием ишемии последней.

Применение РСОД и высоких доз аскорбиновой кислоты корригирует характер гипоталамической нейросекреции при СЭН, нарушенный клеточный и тканевой гомеостаз в стенке тонкого отдела кишечника и печени, стимулирует процессы репаративных гистогенезов элементов слизистой оболочки и создает оптимальные условия для отграничения некротических и некробиотических структур, улучшает структурную организацию гепато-цитов и клеток кровеносных сосудов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Исследования по изучению морфологических изменений в тонкой кишке, печени, гипоталамусе и гипофизе в условиях экспериментального моделирования синдрома энтеральной недостаточности (СЭН), а также при лечении антиоксидантными препаратами (РСОД, высокие дозы аскорбиновой кислоты) были выполнены на 150 половозрелых морских свинках-самцах массой 560—710 г.

Моделирование экспериментального калового перитонита осуществлялось на базе кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии Оренбургской государственной медицинской академии (заведующий кафедрой - заслуженный деятель науки РФ, профессор A.A. Стадников).

Для создания деструктивного процесса с целью «сенсибилизации» организма животного, согласно способу, разработанному Баклыковой Н.М. (1976), в асептических условиях под эфирным наркозом морским свинкам производилось подкожное введение 5,0 мл 10%-ного раствора хлорида кальция (Баклыкова Н.М. с соавт., 1976; Струков А.И. с соавт., 1987; Шалимов С.А. с соавт., 1989; Будашеев В.П. с соавт., 2007; Шуркалин Б.К. с соавт., 2010).

Через 7 суток после предварительных контрольных исследований животным под эфирным наркозом пункционным методом в брюшную полость была введена 30%-ная аутокаловая взвесь из расчета 0,5 мл на 1 кг массы тела (Попова Т.С. с соавт., 1991). Спустя 24 часа под эфирным наркозом выполнялась среднесрединная лапаротомия, ревизия, санация брюшной полости путем промывания последней физиологическим раствором хлорида натрия. Затем следовало ушивание брюшной стенки наглухо.

Экспериментальные животные были разделены на пять групп по 30 особей в каждой. В первую группу вошли 30 животных с СЭН на фоне экспериментального калового перитонита, не получавшие терапию. Во вторую группу вошли 30 экспериментальных животных, которым внутривенно вводился (в подкожную вену внутренней поверхности бедра) 0,85%-ный раствор хлорида натрия в расчете 6 мл/кг через два часа от начала эксперимента и затем ежедневно (группы сравнения). Третья группа включала 30 животных, которым внутривенно вводился РСОД через два часа от начала эксперимента и затем ежедневно в разовой дозе 0,2 мг/кг. Четвертую группу составили 30 животных с внутривенным введением через два часа от начала эксперимента и затем ежедневно раствора аскорбиновой кислоты в дозе 300 мг/кг. Пятая группа включала 30 животных, которым вводились аскорбиновая кислота и РСОД по вышеназванной методике.

Общие сведения об объеме и структуре исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Распределение экспериментальных животных по группам и срокам наблюдения

. № группы Наименование серии опытов Кол-во животных Срок наблюдения

1 сут 2 сут 3 сут

I СЭН без применения каких-либо лекарственных средств 30 10 10 10

П СЭН + 0,85%-ный раствор хлорида натрия в качестве лечения через два часа от начала эксперимента и затем ежедневно в дозе 6 мл/кг 30 10 10 10

ІП СЭН + внутривенное введение в качестве лечения раствора РСОД через два часа от начала эксперимента и затем ежедневно в дозе 0,2 мг/кг 30 10 10 10

IV СЭН + внутривенное введение в качестве лечения аскорбиновой кислоты через два часа от начала эксперимента и затем ежедневно в дозе 300 мг/кг 30 10 10 10

V СЭН + внутривенное введение в качестве лечения комбинации препаратов РСОД и аскорбиновой кислоты вышеописанным способом 30 10 10 10

ВСЕГО 150 50 50 50

Контрольную группу составили пять здоровых морских свинок, у которых был забран материал для морфологических сравнительных исследований и получены нормальные морфометрические данные.

Для количественной оценки клинического состояния животных в ходе эксперимента была использована шкала, основанная на методике оценки общего состояния лабораторных животных в условиях хирургического опыта (Липатов В.А., Григорян В.В., 2001; Фадеев С.Б., Волков Д.В., 2002; Кретинин C.B., 2008), сущность которой заключается в выражении наблюдаемых критериев (движение, болевой и звуковой раздражитель, пищевое поведение) в баллах. Интегральная тяжесть состояния оценивалась путем вычисления среднего арифметического баллов по четырем критериям.

Сроки наблюдения животных всех групп - 1, 2 и 3 сутки. Животные выводились из опыта путем декапитации под глубоким ингаляционным эфирным наркозом. Экспериментальные исследования проводились в соответствии с Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 г.) и после получения письменного согласия на проведение исследований Этического комитета ГОУ ВПО ОрГМА Минздрава России.

Выполнялось макроскопическое исследование кишечника: производился замер наружного диаметра дистальных участков подвздошной кишки и подсчет количества структурных дефектов слизистой оболочки на протяжении 5 см от илеоцекального перехода с последующим расчетом индекса Паулса (Pauls F. et al., 1947; Махакова Г.Ч. с соавт., 2001; Аберясев Н.В., 2007).

Степень изъязвления определялась как среднее арифметическое для каждой группы животных по следующей шкале: 0 — отсутствие видимых повреждений; 1 - наличие отека слизистой; 2 - точечные кровоизлияния; 3 - эрозии; 4 — язвы; 5 — язва с перфорацией стенки кишки. (Добряков Ю.И., 1978; Яковлева JI.B. с соавт., 2001; Родина О.П. с соавт., 2007). Противоязвенную активность (ПА) исследуемых препаратов определяли как отношение индекса Паулса в контрольной группе к индексу Паулса в опытной группе (Зуева Е.П. и др., 2009).

Производился забор дистального участка подвздошной кишки, печени, гипоталамуса и гипофиза для морфологических исследований. Материал от экспериментальных и контрольных животных подвергали однотипной гистологической обработке. Для светооптических и иммуноцитохимических исследований материал фиксировали в 10%-ном водном растворе нейтрального формалина, спирт-формоле или жидкости Буэна. Обезвоживание и уплотнение материала производили в этаноле возрастающей крепости и заливали в смесь парафина с воском (1:1). Гистосрезы толщиной 5-6 мкм окрашивали гематоксилином Майера и эозином.

Для идентификации клеток с признаками апоптоза применяли следующие иммуноцитохимические реакции: на определение экспрессии проапоптотиче-ского белка р53 и на выявление интернуклеосомальной фрагментации ДНК.

Материал фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине, обезвоживали и заливали в парафин. Исследование проводили на серийных парафиновых срезах толщиной 5-6 мкм. Срезы инкубировали с моноклональными антителами к р53 (Дако, Дания) в рабочем разведении 1:50.

Для выявления иммунного окрашивания использовали стрептавидин-биотиновый пероксидазный метод (ДакоЬБАВ-кй, Дания), затем осуществляли докрашивание ядер водным раствором гематоксилина. С целью определения внутриядерной фрагментации ДНК использовали набор реактивов «Apoptag Plus in Situ Apoptosis Detection Kit» (Intergen, Канада), докрашивание ядер производили 0,5%-ным раствором метиленового зелёного на 0,1М ацетатном буфере. При постановке Apoptag-тестэ ядерный хроматин клеток, вступивших в апоптоз, приобретал коричневое окрашивание. Во всех случаях подсчитывали процент окрашенных клеток на 1000 клеток в случайно выбранных полях зрения.

С целью определения экспрессии протеина Ki-67 использовался набор иммуноцитохимических реактивов (Intergen, Канада), докрашивание ядер производили 0,5%-ным раствором метиленового зелёного на 0,1М ацетатном буфере. Во всех случаях подсчитывали процент окрашенных клеток на 1000 клеток в случайно выбранных полях зрения. Все манипуляции с антителами осуществляли согласно протоколам фирм-производителей, а также рекомендациям по иммуногистохимии (Киясов А.П., 1998; Райхли-на Н.Т. с соавт., 2004).

Для оценки пролиферативной активности тканей проводилось изучение показателей митотической активности: производился подсчет клеток, находящихся на разных стадиях фаз митоза в нескольких полях зрения, с последующим расчетом суммы клеток, претерпевающих митоз.

Для электронно-микроскопического исследования материал (печень, гипоталамус, гипофиз) последовательно фиксировали в 2,5%-ном охлаждённом растворе (+4 °С) глютарового альдегида и четырехокиси осмия по Millonig G. (1961). Обезвоживание проводили в ацетоне с нарастающей концентрацией и последующей заливкой кусочков в смолу ЭПОН-812. После изготовления полутонких объектов (1 мкм) ультратонкие срезы приготавливали на ультратоме LKB-5 (Bromma, Sweden). В дальнейшем срезы подвергли двойному контрастированию: в 2%-ном водном растворе уранила ацетата при +37 °С в течение двух часов и цитрате свинца (Reynolds Е., 1963). Изучение объектов и фотографирование их осуществляли с помощью электронного микроскопа ЭВМ 100 АК (Россия) при увеличениях ><7000-48000.

Статистическая обработка полученных результатов исследования проводилась с помощью программного комплекса Excel (Windows) и Statistica. Полученные количественные данные подвергались статистической обработке с определением стандартной ошибки среднего (Зайцев В.М. с соавт., 2003).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ полученных нами результатов и сопоставление с данными литературы позволили обосновать ряд положений, касающихся закономерностей структурно-функциональных изменений в тонком отделе кишечника и печени при СЭН, в том числе в условиях антиоксидантной терапии.

При анализе результатов клинической оценки тяжести состояния экспериментальных животных было выявлено, что в первые сутки исследования данные практически не различались по группам. Начиная со вторых суток нами наблюдалась достоверная разница между животными, не получавшими лечения или получавшими физиологический раствор, и животными, в качестве лечения получавшими РСОД, аскорбиновую кислоту или их комбинацию (табл. 2).

Таблица 2 - Динамика тяжести клинического состояния экспериментальных животных, М±т, баллы

1 сутки 2 сутки 3 сутки

I группа 2,55±0,15 1,13±0,13 0,63±0,13

Пгруппа 2,63±0,06 1,44±0,06 0,75±0,25

Шгруппа 2,69±0,06 2,29±0,09и 2,00±0,14и

IV группа 2,66±0,08 2,29±0,08и 1,95±0,17и

V группа 2,61±0,08 2,22±0,071,2 2,06±0,21и

1 Разница достоверна по сравнению с I группой (р < 0,05);

2 Разница достоверна по сравнению со II группой (р < 0,05).

_ Выявление патоморфологических элементов в тонкой кишке и последующий расчет индекса Паулса и ПА показали достоверное уменьшение структурных нарушений (степень изъязвления) к 3 суткам эксперимента в группах III, IV и V по сравнению с контрольными группами. Наряду с этим индекс Паулса и ПА уже с первых суток эксперимента свидетельствовал о прекращении прогрессирования деструктивных процессов в тканевых структурах стенки тонкого отдела кишечника, выявляя тем самым энтеро-протекторный эффект терапии СЭН, включающей РСОД и аскорбиновую кислоту. Эта разница становится более выраженной с увеличением сроков наблюдения, достигая максимума к 3 суткам (рис. 1).

Обращает на себя внимание изменение диаметра дистального участка подвздошной кишки по суткам в зависимости от способа лечебной коррекции. Так через 24 часа в I и П группах этот показатель достоверно превышал норму, в V группе диаметр кишки был достоверно меньше, чем у животных

без лечения. Данная тенденция прослежена во все сроки наблюдения, что, очевидно, указывает на меньшую степень выраженности пареза кишечника и постепенное нивелирование проявлений СЭН у животных, получавших РСОД и аскорбиновую кислоту (табл. 3).

3 сут

2 сут

1 сут

И V группа 0 IV группа Е2 III группа И П группа ^ I группа

О 0,5 1 1,5 2 2,5 3

Рисунок 1 - Индекс Паулса по сериям эксперимента

Таблица 3 - Диаметр дистального участка подвздошной кишки, М ± т, см

Срок наблюдения Группа экспериментальных животных

I группа II группа ІП группа IV группа V группа

1 сутки 0,82±0,02 0,78±0,02 0,75±0,03 0,74±0,03 0,73*0,03'

2 сутки 0,89±0,02 0,86±0,02 0,85±0,02 0,83±0,02 0,82±0,02'

3 сутки 0,91±0,02 0,89±0,02 0,80±0,0212 0,81±0,02'-2 0,78±0,02и

1 Разница достоверна по сравнению с I группой (р < 0,05);

2 Разница достоверна по сравнению со II группой (р < 0,05);

Жирный шрифт - разница достоверна по сравнению с нормой (0,66 см) (р < 0,05).

Летальность животных в эксперименте постепенно нарастала с увеличением сроков наблюдения во всех сериях, но общая летальность за весь эксперимент в группах животных, получавших антиоксидантную терапию, была в два раза ниже аналогичных показателей контрольных групп (табл. 4).

Анализ гистологических препаратов выявил морфофункциональные изменения в тонком отделе кишечника, которые в своей совокупности можно трактовать как острый энтерит катарально-фибринозного характера с явлениями ангиита.

Таблица 4 - Летальность животных по группам за весь эксперимент

Наименование серии опытов Срок наблюдения

1 сут 2 сут 3 сут

кол-во животных из них выжили летальность, % кол-во животных из них выжили летальность, % кол-во животных из них выжили летальность, %

I группа 10 5 50 10 2 80 10 2 80

II группа 10 6 40 10 4 60 10 2 80

III груша 10 9 10 10 7 30 10 5 50

IV группа 10 8 20 10 6 40 10 5 50

V группа 10 9 10 10 8 20 10 4 60

Всего 50 37 26 50 27 46 50 18 64

У животных из I и II групп через 48 и 72 часа отмечалась чрезвычайная гетероморфность структуры ворсинок тонкой кишки. Местами ворсинки были деформированы. Эпителий, покрывающий ворсинки, уплощен, имел базофильную цитоплазму и высокое содержание рибонуклеопротеидов. Покровный эпителий был значительно инфильтрирован лимфоцитами. Количество бокаловидных клеток увеличивалось, особенно на дне крипт. Большинство эпителиальных клеток имело признаки дистрофических изменений (кариопикноз, кариолизис, везикуляция цитоплазмы). Отек тканей сопровождался локальным слущиванием эпителиоцитов (рис. 2).

В некоторых местах возникали некротические изменения тканевых структур слизистой оболочки кишки, иногда проникающие до подслизистой основы и серозной оболочки.

Собственная пластинка слизистой оболочки была резко отечна и также обильно инфильтрирована лимфоцитами и плазматическими клетками. Среди лимфоцитов встречались клетки с признаками бластной трансформации (клетки имели крупные ядра с деконденсированным хроматином, слабо развитыми мембранными ультраструктурами и большим содержанием свободных рибосом). Данные клетки давали позитивную реакцию с имму-ноцитохимическим маркером Кл-67.

В серозной оболочке кишки отмечались гиперемия, набухание и отек мезотелия, частичная его десквамация, мелкие кровоизлияния в стромальных компонентах. Нарастали дистрофические и деструктивные изменения эндотелия кровеносных сосудов микроциркуляции. При этом субэндотелиально наблюдалось скопление фибрина.

При этом кровеносные сосуды микроциркуляторного русла были резко расширены, полнокровны с признаками диапедеза форменных элементов крови. Эти признаки можно расценить как проявления ангиита. Значительный отек стромальных элементов сочетался со сладжированием и стазом гемокапилляров, тромбозом мелких кровеносных сосудов (рис. 3).

Рисунок 2 — Слизистая оболочка тонкой кишки. Стадия: 2 сут. II группа; фиксация: 10%-ный раствор нейтрального формалина; окраска: гематоксилин Майера и эозин; увеличение: об. 40, ок. 10; а — отек собственной пластинки слизистой оболочки

шш

/ м * ■ '

, *■■ »«Ж,, * гі- .

«.. «V. і . ** . »* ,

■.і" * • •• :

Рисунок 3 - Расширенная затромбированная вена (а) в подслизистой основе тонкой кишки. Стадия: 2 сут. I группа; фиксация: 10%-ный раствор нейтрального формалина; окраска: перйодат-Шифф-реакция; увеличение: об. 40, ок. 10

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что в моделируемых условиях в ранние сроки (1-2 сутки наблюдения) наступают нарушения микроциркуляции на фоне интенсификации воспаления, что приводит к усугублению дистрофических и некробиотических поражений эпителиоцитов. Вместе с тем описанные процессы протекают на фоне гиперсекреции слизи, что согласуется с ранее высказанным Ю.М. Гальпериным (1975) предположением о том, что решающим фактором развития синдрома энтеральной недостаточности является выраженное преобладание слизистой секреции над всасыванием, неизбежно приводящее к скоплению в просвете кишечника его содержимого (воды, электролитов, основных питательных веществ).

У экспериментальных животных контрольных групп наблюдалось токсическое повреждение интрамуральных нервных ганглиев (подслизистой основы и Ауэрбаховского межмышечного сплетения). Это проявилось в некробиотических изменениях нейронов, их деструкции и нервных волокон. Тела отдельных нейронов деформировались. Отмечены маргинации гетерохроматина и кариорексис (рис. 4).

Рисунок 4 - Межмышечные нервные сплетения Ауэрбаха в кишке. Стадия: 2 сут. II группа; фиксация: 10%-ный раствор нейтрального формалина; окраска: гематоксилин Майера - эозин, увеличение: об. 40, ок. 10; а - гладкие миоциты с признаками пересокращения

Проводя гистологическую оценку состояния печени в моделируемых условиях, мы исходили из того, что данный орган являет собой чрезвычайно важный барьер между пищеварительным трактом и другими висцеральными системами организма и может служить маркером развития эндотоксикоза и следующей за этим полиорганной недостаточности.

Наши исследования продемонстрировали, что морфологическая картина структурных изменений в печени показала ряд типичных реакций тканей органов, характерных для гнойно-воспалительных патологических процессов в брюшной полости. Уже в 1-2 сутки моделирования СЭН у животных из I и II групп определялось резко выраженное полнокровие тканей печени и их отёк, расширение перисинусоидных пространств Диссе, слущивание звёздчатых ретикулоэндотелиальных клеток (клетки Купфера). В гепатоцитах наблюдались активные деструктивные процессы, которые сопровождались нарушением межклеточных контактов. Было отмечено замедление выведения желчи из печёночных клеток, особенно в центре долек, вокруг центральных вен. Некоторые желчные капилляры были переполнены секреторными продуктами. Встречались очаги кровоизлияний и расширенные лимфатические сосуды.

Внутри печеночных долек полиморфноклеточные инфильтраты располагались по ходу синусоидных капилляров возле некротизированных гепатоцитов, а также вокруг холангиол. Инфильтраты включали в себя лимфоциты, гистиоциты, плазмоциты, нейтрофилы, эозинофилы. Печёночные балки были истончены, межбалочные капилляры и просвет центральной вены расширены, в гепатоцитах развивалась белковая, а позднее и жировая дистрофия.

Наблюдались пятнистые (Серов В.В., Пауков B.C., 1995) некрозы гепатоцитов, развивающиеся в результате их чрезмерной гидропии (так называемые цитолитические некрозы). Вместе с тем встречались ацидофильные некрозы (гепатоциты с резко выраженной цитоплазмой и пикнотическим ядром). Данные клетки давали позитивную окраску на апоптоз по показателям экспрессии синтеза протеинов р53 и каспаза-3. Распад подобных клеток завершается формированием дискретных апоптозных телец, фагоцитируемых макрофагами.

В своей совокупности полученные нами результаты позволили сделать заключение о том, что структурно-функциональные изменения в печени укладываются в морфологическую картину гепатита, складывающуюся из повреждения, воспалительной инфильтрации и трансформации клеток. При этом степень морфологических изменений в значительной мере коррелирует с интенсивностью патологического процесса в стенке тонкой кишки.

Исследуя фрагменты тонкой кишки экспериментальных животных, у которых с целью лечебной коррекции применяли РСОД и высокие дозы аскорбиновой кислоты, мы получили существенные морфологические от-

личия в развитии репаративных гистогенезов по сравнению с контрольными сериями, они были наиболее выражены в V группе.

Было установлено, что введение экспериментальным животным РСОД или аскорбиновой кислоты существенно корригирует нарушенный клеточный и тканевой гомеостаз тонкого отдела кишечника. Так, несмотря на сохраняющийся мозаичный характер деструктивных изменений энтероци-тов и собственной пластинки слизистой оболочки, отмечено уменьшение их выраженности (особенно на 3 сутки наблюдений). Уменьшаются образование и размеры субэпителиальных пространств Грюнхагена, которые формируются вследствие отслойки эпителиального пласта от базальной мембраны. Снижается число ворсин с признаками десквамации энтероци-тов. В соединительной ткани собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистой основы уменьшается степень дезинтегративных процессов (кровоизлияния, эрозии).

В криптах появляются митотически делящиеся клетки, которые перемещаются по направлению к вершине ворсинок, заменяя десквамированные участки эпителия. Здесь же регистрируются эпителиоциты и соединительнотканные клетки, экспрессирующие синтез протеина Кл-67, как маркера активизации гена пролиферации.

Через 72 часа эксперимента морфометрические показатели и качественное состояние кишечной стенки свидетельствовали о постепенном возвращении к норме (табл. 5).

Таблица 5 — Морфометрические показатели структур тонкой кишки экспериментальных животных. Сетка Г.Г. Авантадилова, микроскоп МБИ-15, аб. 20, ок. 10, М± т

Морфометри-ческий показатель (%) Группа экспериментальных животных

1 сутки 3 сутки

I II Ш IV V I П П1 IV V

Субэпителиальные пространства на верхушке ворсин 6,5± 1,3 6,1± 1,6 5,2± 1,3 5,7± 1,1 4,9± 2,1 9,7± 2,2 9,9± 5,3± 1,6 5,0± 1Д 4,3± 0,9

Десквамация эпителия 20,9± 3,6 21,6± 4,1 20,9± 3,3 20,4± 2,2 19,3± 2,5 33,2± 2,6 29,6± 3,9 16,7± 2,6 17,6± 2,1 15,6± 3,1

Эрозии ворсин 32,1± 2,4 30,7± 3,6 28,1± 4,1 29,2± 3,1 28,7± 1,9 41,7± 3,9 39,9± 3,3 27,6± 2,8 26,1± 2,7 22,7± 3,7

Сосуды венулярного звена не имели признаков агрегации эритроцитов. Их размеры колебались от 31,2 до 32,8 мкм. Следует заметить, что данные сосуды у экспериментальных животных, не получавших лечения,

имели размеры от 33,1 до 34,8 мкм. Также на восстановление проницаемости микроциркуляторного русла указывало значительное уменьшение межуточного отека и периваскулярной клеточной инфильтрации. При этом эпителиальный покров ворсинок был непрерывным.

Можно также полагать, что уменьшение отека в мышечной оболочке, явлений деструкции гладких мышечных клеток приводит к коррекции моторики исследованной кишки.

Таким образом, можно сделать заключение о том, что применение РСОД, аскорбиновой кислоты и особенно их сочетание нивелирует глубокие нарушения микроциркуляции, касающиеся тромбоза, дистрофически-дегенеративных изменений в стенках сосудов. Также уменьшаются зоны повреждения эпителия ворсинок и крипт, эрозий на фоне восстановительных регенераторных процессов. Применение 0,85%-ного раствора ИаС1 не приводит к значимым изменениям динамики изучаемых процессов.

Гистологические исследования печени экспериментальных животных позволили получить данные об оптимизирующем влиянии РСОД и аскорбиновой кислоты на репаративные процессы гепатоцитов. Прежде всего это выразилось в повышении митотической активности печеночных клеток (табл. 6).

Таблица 6 - Митотическая активность гепатоцитов экспериментальных животных, М±т, промилле

Серия экспериментов Срок наблюдения

1 сутки 3 сутки

I группа 1,2±0,02 1,0*0,01

II группа 1,2±0,01 1,1±0,01

П1группа 3,3±0,01 4,1 ±0,02

IV группа 2,9±0,01 3,5±0,01

V группа 5,5±0,03 6,1±0,02

Восстановление микрососудов крово- и лимфотока проявлялось уменьшением экстравазации плазмы и выхода форменных элементов крови в периваскулярное пространство. Улучшение кровоснабжения печёночной дольки, желчевыведения приводило к стабилизации реактивных изменений в клетках. В печёночной дольке определялись в структурном отношении малоизменённые клетки, возрастало количество двуядерных гепатоцитов наряду с уменьшением числа деструктивно изменённых (табл. 7).

Таблица 7 — Морфометрические показатели гепатоцитов экспериментальных животных (деструктивно измененных [А] и двуядерных [Б] гепатоцитов). Сетка Г.Г. Авантадилова, микроскоп МБИ-15, аб. 40, ок. 10, М± т, %

Серия экспериментов Срок наблюдения

1 сутки 3 сутки

А Б А Б

I группа 16,3±1,8 2,3±0,9 24,1±2,9 2,9±0,8

П группа 15,6±1,1 2,2±0,3 22,7±2,3 3,8±1,1

III группа 14,2±2,4 3,9±1,1 18,4±2,1 5,0±0,9

IV группа 16,8±2,6 4,1±0,8 17,6±3,1 6,2±1,4

V группа 13,2±1,6 4,8±1,4 11,6±1,7 7,7±1,3

Происходила нормализация ультраструктуры гепатоцитов: восстановление мембранных компартментов, митохондрий, включений гликогена. Ядра клеток характеризовались возрастанием в них эухроматина. В цитоплазме уменьшалось число липосом, аутофагосом, ламеллярных телец на фоне увеличения количества свободных рибосом и полисом.

Нам представлялось значимым изучение состояния гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы (ГТНС), участие которой в регуляции тканевого и клеточного гомеостаза у экспериментальных животных детально проанализировано в ряде фундаментальных исследований (Поленов А.Л., 1994; Акмаев И.Г., 1997; Стадников A.A., 2001; Стадников A.A., Бухарин О.В., 2012).

В своей совокупности полученные результаты свидетельствуют об интенсивном функционировании нейросекреторных клеток (НСК) в условиях СЭН. Это проявлялось в гипертрофии ядер, ядрышек, перикарионов, шероховатого эндоплазматического ретикулума.

При морфометрическом анализе аксонов НСК обнаруживалось нарастание числа терминалей, переполненных секреторными гранулами и признаками деструкции органелл. Подобная картина дает возможность предположения либо о блокаде высвобождения нейросекреторного материала, либо о существенном повышении уровня их продукции над экструзией (высвобождением) на уровне аксовазальных комплексов нейрогипофиза.

Оценивая морфофункциональное состояние супраоптических и пара-вентрикулярных ядер гипоталамуса экспериментальных животных, нейрогипофиза в условиях лечебной коррекции, мы также отметили усиление функционирования ГГНС. Состояние «повышенной активности» большинства «светлых» НСК проявилось в усилении выведения нейросекрета из перикарионов и терминалей аксонов (рис. 5).

Рисунок 5 - Терминали аксонов НСК в нейрогипофизе.

Стадия: 3 сут. III группа; электронограмма; увеличение: ><22500

При этом НСК увеличивались в размерах. Рыхлые ядрышки имели при-кариолеммное расположение. Полученные факты могут свидетельствовать, что в таких клетках синтез нейросекрета уравновешен его высвобождением в гемокапилляры. Тем не менее до 30% НСК имели расширенные канальцы эндоплазматического ретикулума (до 800 нм), набухшие митохондрии с признаками повреждения крипт.

Эти наблюдения мы сочли важными, поскольку они указывают на то, что лечебная коррекция экспериментального перитонита приводит к активизации ГГНС как в части синтеза гормонов, так и относительно их выведения в гемоциркуляцию.

В связи с этим мы нашими данными еще раз подтвердили ранее сформулированное (Стадников A.A., 2001) положение о том, что при чрезвычайном напряжении ГГНС имеет место рассинхронизация процессов секреции нонапептидных нейрогормонов и их высвобождения в общую гемоциркуляцию, что существенно снижает компенсаторно-приспособительные реакции клеток и тканей.

В своей совокупности полученные в экспериментах результаты говорят об эффективности исследуемых препаратов, что обосновывает целесообразность включения РСОД и высоких доз аскорбиновой кислоты в стартовый комплекс лечебных мероприятий при СЭН и открывает перспективу для дальнейших клинических исследований.

выводы

Клинические проявления синдрома энтеральной недостаточности у экспериментальных животных уже в ранние сроки сопровождаются нарушениями микроциркуляции в стенке тонкой кишки на фоне интенсификации воспаления, что приводит к усугублению дистрофических и некробиотических поражений эпителиоцитов.

Развитие энтеральной недостаточности при экспериментальном каловом перитоните сопряжено с формированием значительных морфофункциональ-ных расстройств тонкого отдела кишечника, коррелирующих со степенью морфологических изменений в печени и протекающих на фоне рассинхро-низации фаз гипоталамической нейросекреции.

Использование в лечении синдрома энтеральной недостаточности у экспериментальных животных рекомбинантной супероксиддисмутазы и высоких доз аскорбиновой кислоты способствует устранению глубоких нарушений микроциркуляции, сладжирования форменных элементов крови и дистрофически-дегенеративных изменений в стенках сосудов, что сопровождается уменьшением зон повреждения эпителия ворсинок и крипт на фоне восстановительных регенераторных процессов.

Позитивный эффект сочетанного применения рекомбинантной супероксиддисмутазы и высоких доз аскорбиновой кислоты проявляется в уменьшении отека и деструкции мышечной оболочки, в снижении токсического повреждения интрамуралышх нервных ганглиев тонкого отдела кишечника, что в свою очередь приводит к восстановлению пропульсивной функции тонкой кишки.

Лечебная коррекция синдрома энтеральной недостаточности с использованием антиоксидантных препаратов сопровождается структурно-функциональной реорганизацией гипоталамо-гипофизарной нейросекре-торной системы, что проявляется в сбалансированном нарастании синтеза и высвобождения нейросекреторного материала.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Можно рекомендовать использование комбинации РСОД с высокими дозами аскорбиновой кислоты в комплексном лечении СЭН, как патогенетически обоснованной схемы, начиная с ранних сроков заболевания, что позволит в ряде случаев добиться обрыва патологического процесса и улучшить результаты лечения.

Результаты работы рекомендуется использовать в учебном процессе на кафедрах хирургии и гистологии, а также при написании соответствующих разделов учебных пособий.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Значение хемшпоминесценции при диагностике энтеральной недостаточности у больных с кишечной непроходимостью / Д.В. Волков, B.C. Та-расенко, Н.В. Шарапова, A.B. Бастрыкина, О.В. Захарова, О.В. Чукина // Информационный архив. - 2008. - Т. 2, № 4. - С. 60-62.

2. Чукина, О.В. Применение хемилюминесценции в диагностике энтеральной недостаточности у больных с кишечной непроходимостью / О.В. Чукина, A.B. Ронжин // Вестник РГМУ. - 2009. - № 3. - С. 52.

3. Хемилюминесценции в диагностике энтеральной недостаточности у больных с кишечной непроходимостью / Д.В. Волков, B.C. Тарасенко, С.И. Красиков, Н.В. Шарапова, О.В. Чукина// Сборник научно-практических работ конференции «Актуальные вопросы хирургии: проблемы и пути решения», посвященной 90-летию ОКБ станции Оренбург. - Оренбург, 2009. - С. 148-150.

4. Профилактика синдрома энтеральной недостаточности у больных с кишечной непроходимостью / Д.В. Волков, B.C. Тарасенко, С.И. Красиков, Н.В. Шарапова, О.В. Чукина // Хирург. - 2009. - № 6. - С. 17-21.

5. Применение рексода при лечении кишечной непроходимости / Д.В. Волков, B.C. Тарасенко, С.И. Красиков, Н.В. Шарапова, О.В. Чукина, М.А. Богатов // Информационный архив. - 2010. - Т. 4, № 3-4. - С. 29-31.

6. Применение антиоксидантов у больных кишечной непроходимостью с целью профилактики энтеральной недостаточности / Д.В. Волков, B.C. Тарасенко, С.И. Красиков, Н.В. Шарапова, О.В. Чукина, М.А. Богатов // Материалы всероссийского форума «Пироговская хирургическая неделя». - СПб., 2010. - С. 377-378.

7. Современные аспекты коррекции синдрома энтеральной недостаточности (обзор литературы) / B.C. Тарасенко, О.В. Чукина, Б.А. Стад-ников, Д.В. Волков // Хирург. - 2011. - № 3. - С. 47-56.

8. Значение лабораторных методов исследования при прогнозировании тяжести энтеральной недостаточности у больных кишечной непроходимостью / Д.В. Волков, B.C. Тарасенко, С.И. Красиков, Н.В. Шарапова, О.В. Чукина, М.А. Богатов, Е.А. Сысоев // Хирург. -2011. - № 9. - С. 19-23.

9. Влияние антиоксидантной терапии на течение послеоперационного периода у больных с кишечной непроходимостью / Д.В. Волков, B.C. Тарасенко, С.И. Красиков, Н.В. Шарапова, О.В. Чукина, М.А. Богатов // Материалы XI съезда хирургов РФ «Новые идеи и технологии в хирургии». - Волгоград, 2011. - С. 78-79.

10. Экспериментально-гистологическое исследование структурно-функциональной реорганизации печени при синдроме энтеральной

недостаточности / O.B. Чукина, H.A. Щетинин, Б.А. Стадников, B.C. Та-расенко, Д.В. Волков // Морфология. - 2011. - Т. 140, № 5. - С. 126.

11. Экспериметально-гистологическое исследование морфогенеза печени в условиях энтеральной недостаточности / О.В. Чукина, H.A. Щетинин,

A.A. Стадников, B.C. Тарасенко, Д.В. Волков // Материалы XIX международного конгресса хирургов-гепатологов России и стран СНГ «Актуальные проблемы хирургической гепатологии». - Иркутск, 2012. - С. 213-214.

12. Влияние процессов липопероксидации на течение энтеральной недостаточности и их коррекция при экспериментальном перитоните / Д.В. Волков, B.C. Тарасенко, О.В. Чукина, С.И. Красиков, Н.В. Шарапова, А.Р. Ильясов Н Медицинский вестник Башкортостана. — 2012. — Т. 7, № 6. - С. 80- 83.

13. Чукина, О.В. Морфофункциональное обоснование применения препарата «Рексод» при синдроме энтеральной недостаточности в условиях экспериментального калового перитонита / О.В. Чукина // Материалы П Всероссийской конференции студентов и молодых ученых в рамках «Дней молодежной науки ОрГМА». - Оренбург, 2013. - С. 248.

14. Современные аспекты синдрома энтеральной недостаточности /

B.C. Тарасенко, О.В. Чукина, Д.В. Волков, A.A. Стадников // Хирург. -2013. - № 7. - С. 74-84.

15. Коррекция синдрома энтеральной недостаточности у больных с кишечной непроходимостью / Д.В. Волков, B.C. Тарасенко, С.И. Красиков, Н.В. Шарапова, О.В. Чукина, С.А. Корнилов // Астраханский медицинский журнал. - 2013. - Т. 8, № 1. - С. 53-56.

16. Влияние рекомбинантной супероксиддисмутазы на морфофункциональное состояние слизистой оболочки тонкой кишки при моделировании синдрома энтеральной недостаточности / О.В. Чукина, Б.А. Стадников, Д.В. Волков, B.C. Тарасенко // Морфология. - 2013. -Т. 144, № 5. - С. 130.

Чукина Ольга Вячеславовна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ АНТИОКСИДАНТНИХ ПРЕПАРАТОВ ПРИ ЛЕЧЕНИИ СИНДРОМА ЭНТЕРАЛЬНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 20.11.2013. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,0. Печать трафаретная. Бумага офсетная. Заказ № 6771. Тираж 130 экз.

Издательский центр ОГАУ 460014, г. Оренбург, ул. Челюскинцев, 18 Тел.: (3532) 77-61-43