Автореферат и диссертация по медицине (14.01.17) на тему:Экспериментально-гистологическое обоснование применения окситоцина для профилактики повреждения печени в комплексном лечении острого панкреатита

/

"05008558

Бобылев Алексей Александрович

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ГИСТОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ОКСИТОЦИНА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ПОВРЕЖДЕНИЯ ПЕЧЕНИ В КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ ОСТРОГО ПАНКРЕАТИТА

14.01.17 - хирургия 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

1 9 Я Н В Ш2

Оренбург-2011

005008558

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научные руководители: заслуженный врач РФ,

доктор медицинских наук, профессор Тарасенко Валерий Семенович;

доктор медицинских наук Стадников Борис Абрамович

Официальные оппоненты: заслуженный врач РФ,

доктор медицинских наук, профессор Абрамзон Олег Моисеевич;

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Соловьев Георгий Сергеевич

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Российский государственный

медико-стоматологический университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «_»__г. в_часов на

заседании диссертационного совета Д 208.066.02 при ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Автореферат разослан «

» •— 2011 г.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Сайфутдинов Р.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Лечение острого панкреатита в настоящее время остается одной из важнейших проблем хирургии. Ежегодный рост числа больных острым панкреатитом, высокая частота осложнений с системными последствиями определяют актуальность данного исследования. Несмотря на то, что в 70-80% наблюдений заболевание характеризуется относительно благоприятной клинической картиной, в 20-30% случаев отмечается тяжелое течение заболевания (Бойко В.В. с соавт., 2002), обусловленное развитием деструктивных форм острого панкреатита (Савельев B.C. с соавт., 2001), при которых летальность достигает 15-40% (Buchler M.W. et al., 2000; Leppaniemi A., 2003).

По имеющимся данным число больных острым панкреатитом варьирует от 200 до 800 пациентов на 1 млн населения (Лебедев Д.С. с соавт., 2005; Шапкин Ю.Г. с соавт., 2007; Beger H.G. et al., 2003; Tao H.-Q. et al., 2004). Рост данной патологии связан с увеличением заболеваемости желчнокаменной болезнью и хроническим алкоголизмом, а также существенным улучшением качества диагностики в последнее десятилетие (Гостищев В.К. с соавт., 2003; Благовестов Д.А. с соавт., 2004; Кузин B.C. с соавт., 2007; Шевченко В.П. с соавт., 2007; Dervenis C.D. et al., 2001).

При остром панкреатите определяют так называемую «триаду смерти», включающую острую печеночную, дыхательную и почечную недостаточности (Савельев B.C. с соавт., 2009). Механизмы повреждения внутренних органов, возникающие при остром панкреатите и ведущие к полиорганной недостаточности, неразрывно связаны между собой, и связь между ними является двусторонней. Однако многие патофизиологические процессы, заложенные в этих механизмах, остаются нераскрытыми. Большинство исследователей считают, что в основе этих механизмов лежит системная воспалительная реакция, возникающая вследствие гиперпродукции провоспалительных цитокинов и интегринов (Mäher Osman О., Steen L.J., 1999).

Известно, что воспалительные реакции неспецифичны, они проявляются при любом повреждении тканей и иммунном конфликте. При этом происходит активация нейтрофилов, макрофагов и комплемента, системы свертывания крови (Souza L. et al., 2007). При воспалении непосредственно в поджелудочной железе увеличивается выработка эндотелием капилляров веществ, поддерживающих адгезию лейкоцитов крови. Считается, что активация эндотелия капилляров обусловливает повышение проницаемости стенки капилляров, образование агрегатов лейкоцитов, выброс факторов хемотаксиса и ускорение фагоцитоза. Повышенный выброс в кровоток провоспалительных цитокинов и других медиаторов способствует генерализации воспалительной реакции, миграции лейкоцитов в органы, отдаленные от поджелудочной железы (Бойко В.В. с соавт., 2002; Zyromski N., Murr М.М., 2003).

Немалую роль в развитии органной недостаточности играет эндогенная интоксикация. При этом массивное и длительное поступление токсических веществ во внутренние среды организма (кровь, лимфу, тканевую жидкость) становится фактором повреждения различных органов и систем. Первым органом-мишенью на пути панкреатогенных токсинов становится печень. Развивающаяся в 18-83,9% случаев функциональная недостаточность печени при деструктивных формах острого панкреатита значительно усугубляет тяжесть течения заболевания и в 40-90% наблюдений заканчивается гибелью больных (Beger H.G. et al., 2000; Heinrich S. et al., 2006; Ii C. et al., 2006; Osmon S. et al., 2007).

К настоящему времени в лечении острого панкреатита достигнуты определенные успехи, однако ряд вопросов профилактики полиорганной, а в частности, печеночной недостаточности, остаются малоизученными (Ко-ноненко С.Н. с соавт., 2006; Кубышкин В.А., 2009; De Waele J.J. et al., 2000; Mayumi Т. et al., 2006).

Вместе с тем остается недостаточно изученным вопрос местного медикаментозного воздействия на паренхиму поджелудочной железы и печени при остром панкреатите с целью профилактики недостаточности печени и предупреждения развития осложнений, стимуляции репаративных процессов тканевых элементов поджелудочной железы. Особенно это касается обоснования использования гипоталамических нонапептидов как биорегуляторов клеточного и тканевого гомеостаза, стимуляторов репаративных гистогенезов (Стадников A.A., 1999,2001; Климушкин A.B., 2003; Николаева О.Я., 2003). Роль указанных нейропептидов в профилактике повреждения печени при остром панкреатите ранее не изучалась.

Важную роль в восстановлении функции пораженных органов играет репаративная регенерация тканей с вовлечением процесса гистогенеза клеток различных дифферонов( Соловьев Г.С. с соавт., 2010).

Исследования последних лет доказали важную патогенетическую роль вторичного инфицирования очагов панкреонекроза условно-патогенными микроорганизмами из просвета желудочно-кишечного тракта, что обусловливает необходимость применения препаратов, способных подавлять жизнедеятельность условно-патогенной микрофлоры (Тарасенко B.C., 2000; Стадников Б.А., 2005).

Применение антибиотиков при остром панкреатите основывается на том факте, что летальность при инфицированном панкреонекрозе выше, чем при стерильном (O'Reilly D.A., Kingsnorth. A.N., 2004). В Кокранов-ском систематическом обзоре рассматриваемой тематики (Bassi С. et al., 2003) было рекомендовано использование антибиотиков широкого спектра, активных в отношении возбудителей интраабдоминальных инфекций (цефуроксим, имипенем или офлоксацин в сочетании с метронидазолом). Применение антибиотиков является стандартом в лечении больных инфицированным панкреонекрозом (Деллинджер Э.П., 2003). Однако в последние годы было установлено, что профилактическое применение антибио-

тиков при остром некротизирующем панкреатите снижало длительность госпитализации и частоту возникновения внепанкреатических инфекций, однако не влияло на уровень смертности, частоту развития инфицированного панкреонекроза и проведения хирургических вмешательств (Nathens А.В. et al., 2004; Hart Р.А. et al., 2008).

Большой интерес представляют сведения о высокой эффективности сочетанного применения окситощша и антибиотиков при различных видах хирургической инфекции, в том числе и при панкреатите (Абрамзон О.М., 2004; Стадников Б.А., 2005). Однако влияние комплекса окситоцина и антибактериальных препаратов на состояние печени при остром панкреатите ранее не изучалось.

Таким образом, изучение вопросов лечебной коррекции печеночной недостаточности при остром панкреатите актуально и перспективно в научном и практическом аспектах.

Цель работы. Экспериментально-гистологическое обоснование целесообразности местного применения окситоцина и комплекса окситоцина с ципрофлоксацином в лечебной коррекции повреждения печени при остром панкреатите.

Задачи исследования

1. Охарактеризовать динамику клинических проявлений экспериментального острого панкреатита при различных видах лечения.

2. Изучить морфологические изменения в печени и поджелудочной железе, характер репаративных процессов в тканях при асептическом и инфицированном экспериментальном остром панкреатите.

3. Определить влияние окситоцина и комплекса окситоцин с ципрофлоксацином на морфофункциональные изменения в печени и поджелудочной железе при остром экспериментальном панкреатите (с инфицированием и без такового).

4. Определить особенности регенераторных свойств и экспрессии про-и антиапоптотических генов гистоструктур печени и поджелудочной железы под влиянием различных препаратов (окситоцин; окситоцин и ципроф-локсацин) при лечении экспериментального острого панкреатита.

Научная новизна исследования. Впервые дана интегральная оценка клиническим проявлениям острого панкреатита при местном лечении оксито-цином и комплексом окситоцина с ципрофлоксацином.

Впервые изучена ультраструктурная реорганизация клеток паренхимы печени и стромы поджелудочной железы при экспериментальном остром панкреатите (ЭОП) в абактериальных и инфицированных (Staphylococcus aureus, Escherichia coli) условиях.

С применением комплексного методического подхода (световая и электронная микроскопия, гистохимия, иммуноцитохимия, морфоме-трия, экспериментально-гистологические исследования in situ) доказана возможность оптимизирующего влияния экзогенно вводимого препарата окситоцина и комплекса окситоцина с ципрофлоксацином на процессы

репаративных гистогенезов паренхимы, стромы печени и поджелудочной железы при ЭОП.

Получены новые факты, обосновывающие современную концепцию об адаптогенной роли нейропептидов как эпигенетических факторов гисто -и органотипической регенерации некротических поражений железистого эпителия и соединительнотканных структур.

Практическая значимость работы. Использование окситоцина и комплекса окситоцина с выбранным антибиотиком в лечении острого панкреатита создает адекватные условия для стимуляции пролиферации панкреа-тоцитов, клеток фибробластического ряда, васкулогенеза, эффективного отграничения очагов панкреонекроза и корригирует измененный клеточный и тканевой гомеостаз поджелудочной железы (в том числе и в инфицированных условиях), что обеспечивает снижение тяжести печеночной недостаточности при ЭОП.

Проведенное исследование открывает новые перспективы для установления механизмов внутриклеточного симбиоза бактериальных агентов в очагах панкреонекроза, для дальнейшего исследования роли S. aureus и Е. coli, что имеет существенное значение для гнойной хирургии и панкреатологаи.

Внедрение результатов исследования. Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедрах: госпитальной хирургии, урологии; хирургии; гистологии, цитологии и эмбриологии Оренбургской государственной медицинской академии.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на VII Всеармейской международной конференции «Актуальные вопросы профилактики, диагностики и терапии хирургической инфекции» (Москва, 2007), на практической конференции, посвященной 90-летию отделенческой клинической больницы на ст. Оренбург (Оренбург, 2009), на региональной конференции дипломированных специалистов «Молодые ученые - медицине» (Самара, 2009), на «Ежегодной региональной конференции молодых ученых и специалистов» (Оренбург, 2010). По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 4 работы в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Ведущими факторами функциональных нарушений при остром панкреатите являются: деструкция эндотелиальных клеток гемокапилляров, кровоизлияния в периваскулярное пространство, нарушение лимфоотгока, поражение гепатоцитов и лимитирование их регенераторных возможностей.

2. Применение окситоцина и окситоцина с ципрофлоксацином корригирует нарушенный клеточный и тканевой гомеостаз печени и поджелудочной железы, стимулирует процессы репаративных гистогенезов стромальных и паренхиматозных элементов печени и поджелудочной железы, создает оптимальные условия для отграничения некротических и некробиотических струюур как в абактериальных, так и инфицированных условиях.

3. Сочетанное использование ципрофлоксацина и окситоцина потенцирует репаративный гомеостаз, лимитирует экспрессию синтеза проапоп-тотического белка р53 и стимулирует синтез антиапоптотического протеина Ьс12, что создает адекватные условия для сохранения жизнеспособности гепатоцитов, реализующих генетически детерминированный путь к пролиферации и клеточной репродукции.

Объем н структура диссертации. Диссертация изложена на 126 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 286 источников, в том числе 182 работы отечественных и 103 - иностранных авторов. Работа иллюстрирована 25 черно-белыми и цветными микрофотографиями гистологических препаратов, электронограммами, 16 таблицами.

Связь работы с научными программами. Диссертационное исследование является составной частью плана НИР Оренбургской государственной медицинской академии (№ государственной регистрации 01.2.00 614193).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Общая характеристика. Работа носит экспериментальный характер. Объектом исследования явились 264 животных - беспородные белые крысы-самцы массой 180 - 230 г.

Сведения о сериях наблюдений в трех группах экспериментов представлены в таблице 1.

В группах было по четыре серии наблюдений, в зависимости от получаемого лечения. Контролем служили первые серии наблюдений, получавшие плацебо.

Во всех сериях опыта на животных осуществляли моделирование ЭОП. В операционной кафедры гистологии Оренбургской государственной медицинской академии, с соблюдением правил асептики, крысам под эфирным наркозом производили верхнесрединную лапаротомию и выделяли поджелудочную железу. Затем в протоковую систему железы вводили 0,5—1,0 мл стерильной желчи (от больных, оперированных по поводу холедохолитиаза) с каплей аутокрови и механическим повреждением ее тканей: дольки органа подвергали травматизации путем сдавления их браншами анатомического пинцета. В брюшную полость, в область поджелудочной железы, экспериментальным животным для дальнейшего введения препарата (в зависимости от серии) ставили тонкий эпидуральный (стерильный) катетер. Рану брюшной полости зашивали наглухо с подшиванием поджелудочной железы к париетальной брюшине и с фиксированием кисетным и Z-образным швами катетера, для введения лекарств, к коже животного (модель Mallet Guy Р et. all., 1961).

Таблица 1 - Распределение экспериментальных животных по 1руппам

№ группы Наименование серии опытов Количество животных Сроки наблюдений

24 часа 3 сутки 7 сутки 14 сутки

I 1) ЭОП + плацебо 12(10) 3 3 3 3

2) ЭОП + окситоцин 12(10) 3 3 3 3

3) ЭОП + ципрофлоксацин 12(10) 3 3 3 3

4) ЭОП + ципрофлоксацин + окситоцин 12(10) 3 3 3 3

II 1) ЭОП + Е. coli (гр -) + плацебо 12(10) 3 3 3 3

2) ЭОП +Е. coli + ципрофлоксацин 12(10) 3 3 3 3

3) ЭОП + Е. coli+ окситоцин 12(10) 3 3 3 3

4) ЭОП + Е. coli + окситоцин + ципрофлоксацин 12(10) 3 3 3 3

III 1) ЭОП + S. aureus (гр +) + плацебо 12(10) 3 3 3 3

2) ЭОП + S. aureus + ципрофлоксацин 12(10) 3 3 3 3

3) ЭОП + S. aureus + окситоцин 12(10) 3 3 3 3

4) ЭОП+S. aureus окситоцин + ципрофлоксацин 12(10) 3 3 3 3

Примечание: в скобках животные, не подвергшиеся эвтаназии.

Во II группе одновременно с желчью в панкреатические протоки вводился инфекционный агент Е. coli (в дозе 3 ■ 10б микробных клеток).

В III группе экспериментальным животным одновременно с желчью в панкреатические протоки вводился инфекционный агент S. aureus штамм Р-450 (в дозе 3 • 106 микробных клеток).

В первой серии (контрольной) каждой группы животные в качестве лечения получали растворитель окситовдша (растворитель окситоцина, Гедеон Рихтер А.О., Венгрия) в дозе 0,2 мл/кг 2 раза в сутки.

Во второй серии опытов оценивалось лечение антибиотиком группы фторхинолонов (ципрофлоксацин, «АБОЛмед», Россия). Антибиотик вводился ежедневно через микроирригатор два раза в сутки в суточной дозе 100 мг/кг (30 мг в сутки).

В третьей серии животные аналогично получали окситоцин фирмы «Гедеон Рихтер» ежедневно в дозе 0,8 мг/сутки в область поджелудочной железы.

В четвертой серии в качестве лечения животным вводилась комбинация ципрофлоксацина с окситоцином в указанных выше дозировках.

Для контроля летальности и клинической оценки проводимого эксперимента в каждой серии опыта было выделено по 10 животных, которые не подвергались эвтаназии (всего 120 крыс).

Экспериментальные исследования проведены с этическими требованиями к работе с лабораторными животными («Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» [приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.77] и Федерального закона «О защите животных от жестокого обращения» от 01.01.1997 г.).

Методики клинических и морфологических исследований. Оценка состояния животных в каждой группе проводилась по критериям двигательной активности, реакции на звуковой раздражитель, реакции на болевой раздражитель, питьевой и пищевой режим (табл. 2, 3, 4, 5).

Таблица 2 — Двигательная активность

Наблюдаемый критерий Оценка в баллах

Не передвигались 0

Передвигались с трудом 1

Передвигались 2

Активное передвижение в клетке 3

Таблица 3 - Реакция на звуковой раздражитель

Наблюдаемый критерий Оценка в баллах

Реакция отсутствовала 0

Слабая реакция 1

Сохраненная реакция 2

Активная реакция 3

Таблица 4 - Реакция на болевой раздражитель

Наблюдаемый критерий Оценка в баллах

Реакция отсутствовала 0

Слабая реакция 1

Сохраненная реакция 2

Активная реакция 3

Таблица 5 - Питьевой и пищевой режим

Наблюдаемый критерий Оценка в баллах

Воду не пили, еду не употребляли 0

Воду пили плохо, пищу не употребляли 1

Воду пили, пищу практически не употребляли 2

Обычный питьевой и пищевой режим 3

Изучение полученного материала (кусочки поджелудочной железы, печени) у экспериментальных животных осуществляли через 24 часа, на 3, 7 и 14 сутки от начала эксперимента на световом и электронно-микроскопическом уровнях. Для забора материала животных забивали под глубоким ингаляционным эфирным наркозом путем декапитации. Материал фиксировали в 10%-ном охлажденном (/ +4 °С) растворе нейтрального формалина, спирт-формоле, Ценкер-формоле, смеси Буэна. Обезвоживание и уплотнение материала производили в этаноле возрастающей крепости и заливали в смесь парафина с воском (1:1). Гистосрезы толщиной 5—6 мкм окрашивали гематоксилином Майера и эозином по Ван-Гизон. Ферменты, маркеры митохондрий (СДГ) и лизосом (КФ) определяли в свежезамороженных криостатных срезах органов в соответствии с методиками КасМаБ М. (1960), Оошогу в. (1963).

Дифференцировку углеводных соединений в тканях поджелудочной железы с необходимыми контролями проводили в соответствии с рекомендациями Пирса Э. (1962). Бгакоген и нейтральные полисахариды выявляли перийодат-ШИК-реакцией. С целью дифференциального анализа гликогена и нейтральных гликопротеидов гистологические срезы обрабатывали амилазой слюны при +37 "С в течение 1 часа.

Гликозаминогликаны определяли в срезах толуидиновым синим (при рН 2,7; 4,0; 7,3) и альциановым синим (при рН 1,0; 2,7) с проведением соответствующих контролей с гиалуронидазами по Хейлу (Пирс Э., 1962).

Нуклеиновые кислоты выявляли метиленовым синим и пиронином Ж по Браше. Контрольные срезы инкубировали в растворе рибонуклеазы - 1 мг/см3 при +37 "С в течение 2 часов. Суммарный белок определяли по Даниэли (Пирс Э., 1962). Морфологические исследования соотношений жизнеспособных и некротизированых зон поджелудочной железы на гистопре-паратах проводили с использованием окулярной вставки (Автавдилов Г.Г., 1990).

Для электронно-микроскопического исследования материал последовательно фиксировали в 2,5%-ном растворе охлажденного (+ 4°С) глютарового альдегида и четырехокиси осмия по МШоши О. (1961). Обезвоживание проводили в ацетоне с нарастающей концентрацией и последующей заливкой кусочков в смолу ЭПОН-812. Ультратонкие срезы приготовили на ультратоме ЬКВ -5. Срезы подвергли двойному контра-

стированию: в 2%-ном водном растворе уранила ацетата при +37 "С в течение 2 часов и цитрате свинца (Reynolds Е., 1963). Изучение объектов и фотографирование их осуществляли с помощью электронного микроскопа ЭВМ 100 АК при увеличениях х 7000 - 48000.

С целью проведения иммуноцитохимического исследования исследуемые объекты фиксировали в 12%-ном растворе нейтрального формалина и заливали в парафин. В последующем на гистосрезах проводили двухэтап-ные реакции по идентификации протеина р53 (маркера апаптоза) и антиа-поптотического белка Ьс12. При этом депарафинированные срезы подвергали инкубации с моноклональными антителами (фирма «Дако», Дания).

Для визуализации позитивного окрашивания клеток использовали стрептавидин - биотиновый дероксидазный метод с последующим докрашиванием ядер гематоксилином Майера. Параллельно определяли внутриядерную фрагментацию ДНК при помощи набора реактивов «Apoptag Plus in Situ Apoptosis Detection Kit» (фирма «Intergen» Канада), докрашивание ядер производили 0,5%-ном раствором метиленового синего на 0ДМ ацетатном буфере. Идентификацию протеина Ьс12 проводили аветин-биотин-пероксидазным методом (по рекомендациям А. А. Жданкиной, 2006).

Методы статистического анализа результатов. Все морфометрические данные были обработаны с помощью ПЭВМ IBM PC Pentium IV (1400 МГц) и программного обеспечения Windows ХР, Word, Exel. При обработке количественных показателей рассчитывали: среднюю арифметическую разряда (М), дисперсию ряда, среднее квадратичное отклонение (d), среднюю ошибку средней величины (т), критерий значимости (t) Стьюден-та-Фишера (Медик В.А. с соавт., 2001; Реброва О.Ю., 2002) для выявления существенных различий между величинами рядов, вероятности значимой разницы (р). Разница сравниваемых величин считалась достоверной при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для количественной оценки состояния животных и эффективности лечения в ходе эксперимента была предложена шкала, основанная на определении выраженности наблюдаемых критериев (двигательная активность, реакция на звуковой и болевой раздражитель, питьевой и пищевой режим) в баллах. Интегральная тяжесть состояния оценивалась суммой баллов по указанным четырем критериям. Шкала основана на методике оценки общего состояния лабораторных животных в условиях хирургического опыта (Липатов В .А., Григорян В.В., 2001). Предложенная методика имеет ряд преимуществ перед существующими методиками. Во-первых, она более проста в количественной оценке состояния животных. Во-вторых, каждый критерий оценивался независимо, вне связи с другими критериями, что

делало оценку более объективной. В-третьих, методика дает интегральный показатель, который позволяет оценить не только состояние животных по всем предложенным критериям, но и эффективность лечения. Таким образом, интегральный показатель тяжести состояния экспериментальных животных первой, второй и третьей групп в сериях без лечения на протяжении всего эксперимента оставался одинаково низким и имел тенденцию к снижению.

В сериях пролеченных окситоцином и ципрофлоксацином данный показатель на третьи сутки снижался незначительно, а на седьмые сутки снижение было значительным. В сериях, где животные получали комбинацию окситоцина с ципрофлоксацином, интегральный показатель тяжести состояния к третьим суткам снижался незначительно, на седьмые сутки снижение интегрального показателя было более чем в 2,5 раза, на 14-е сутки наблюдался подъем. Данные показатели были интегрированы в каждой группе по сериям эксперимента (рис. 1, 2, 3).

Увеличение интегрального показателя при лечении окситоцином с ципрофлоксацином свидетельствует о благоприятном течении заболевания и косвенно указывает на выздоровление экспериментального животного. Если показатель имеет низкие значения или тенденцию к его снижению, то это свидетельствует о неблагоприятном течении экспериментального острого панкреатита, что и наблюдалось в сериях эксперимента без лечения.

2 -1 / •5Й?

1,5 - /

1 - 'С й

0.5 - шт; 1 г

0 - 1 сут. 3 сут. 7 сут. 14 сут.

¡1 контроль 1,4 0,85 0,18 0

□ ципрофлоксацин (ципр.) 1,6 1,48 1,22 0,85

и окситоцин (ОТ) 1,7 1,58 1,07 0,89

ЕЗципр.+ ОТ 1,98 1,95 1,48 1,74

Примечание: здесь и далее ципр. - ципрофлоксацин

Рис. 1 — Диаграмма оценки состояния животных по баллам I группы (без инфицирования)

1 суг. 3 суг. 7 сут.. 14 сут.

В контроль 1,2 0,57 0,15 0

□ ципрофлоксацин (цнпр.) 1,6 1,25 0,17 0

Ш окситоцин (ОТ) 1,55 1 0,5 0,22

Шципр.+ ОТ 1,5 1,43 0,63 0,96

Рис. 2 - Диаграмма оценки состояния животных по баллам II группы (Е. coli)

Рис. 3 - Диаграмма оценки состояния животных по баллам III группы (S. aureus)

В серии опыта ЭОП с использованием комбинации окситонина с ци-профлоксацином наблюдалось значительное снижение летальности по сравнению с изолированным применением ципрофлоксацина и окситоци-на (табл. 6)

Таблица 6 - Летальность животных первой группы в динамике в процентах

№ Наименование серии опытов Серии наблюдений

24 часа 3 сутки 7 сутки 14 сутки

I ЭОП, л= 10 10% 40% 80% 100%

II ЭОП + ципрофлоксацин 0% 20% 50% 60%

III ЭОП+ окситоцин 0% 20% 50% 50%

IV ЭОП + комбинация окситоцина с ципрофлоксацином 0% 10% 30% 30%

Аналогичное снижение летальности при комбинированном использовании окситоцина с ципрофлоксацином наблюдалось в группах, инфицированных штаммами Е. coli и S. aureus (табл. 7, 8)

Таблица 7 - Летальность животных в динамике при инфицированном ЭОП (Е. coli)

№ Наименование серии опытов Серии наблюдений

24 часа 3 сутки 7 сутки 14 сутки

I ЭОП + Е. coli п = 10 20% 60% 100% -

II ЭОП + Е. coli + ципрофлоксацин 10% 50% 80% 100%

III ЭОП + Е. coli + окситоцин 10% 40% 60% 80%

IV ЭОП + Е. coli + окситоцин с ципрофлоксацином 0% 20% 50% 60%

Таблица 8 - Летальность животных при инфицированном ЭОП (S. aureus)

№ Наименование серии опытов Серии наблюдений

24 часа 3 сутки 7 сутки 14 сутки

I ЭОП + S. aureus, л = 10 10% 50% 90% 100%

II ЭОП + S. aureus + ципрофлоксацин 10% 40% 70% 90%

Ш ЭОП + S. aureus + окситоцин 10% 40% 60% 80%

IV ЭОП + S. aureus + комбинация окситоцина с ципрофлоксацином 0% 20% 40% 50%

Анализ полученных экспериментально-гистологических результатов свидетельствует о стимулирующем влиянии окситоцина, особенно оксито-цина с антибиотиком, на процессы репаративных гистогенезов паренхимы и стромы печени и поджелудочной железы как при инфицировании, так и в абактериальных условиях. В этих условиях усиливаются васкулогенез и пролиферация клеток фибробластического дифферона, происходит активизация макрофагических элементов и эффективное отграничение очагов панкреонекроза за счет быстрого разрастания малодифференцированной соединительной ткани, возрастают процессы мукоидизации панкреатоци-тов в паранекротических зонах, где уменьшается число дискомплексиро-ванных ацинусов серозного типа.

Под влиянием окситоцина протяженность зон некроза существенно уменьшалась, особенно при сочетании с ципрофлоксацином. В этих же условиях через 3,7 суток в 2,5 - 3,0 раза уменьшалось количество тромбиро-ванных сосудов гемоциркуляции. Одновременно достоверно повышалась ДНК-синтетическая и митотическая активность эндотелиоцитов, фибро-бластов и адвентициальных клеток. С другой стороны, имунноцитохимиче-ский анализ (по показателям идентификации про- и антиапоптотических генов) показал, что лечебный эффект окситоцина, корригирующий регенеративные процессы в поджелудочной железе и печени, проявлялся отчетливо. Об этом свидетельствовало возрастание количества Ьс12-позишвных панкреатоцитов и гепатоцитов на фоне регрессии их численности, демонстрирующей экспрессию синтезом протеина р53 (табл. 9).

Полученная нами морфологическая картина структурных изменений в печени показала ряд типичных реакций тканей органа, характерных для всех форм острого панкреатита (Владимиров В.Г. с соавт., 1986). При отечной форме панкреатита отмечается полнокровие печени, уменьшение поперечных размеров печёночных балок, расширяются межбалочные капилляры и просвет центральной вены. Отметим, что картина структурных изменений в органе имела гетероморфный характер.

Определялись гепатоциты, особенно центральных зон печеночных долек, с пикнотически изменёнными ядрами и сильно выраженными процессами деструкции в цитоплазме. В цитоплазме таких печёночных клеток отмечалась зернистость, определялись мелкие и крупные вакуоли, которые имели тенденцию к слиянию, липидные капли, разрушающиеся митохондрии, расширенные канальцы эндоплазматической сети и цистерны пластинчатого комплекса Гольджи, аутофагосомы. Количество клеток возрастало к 7-м суткам ЭОП. В некоторых гепатоцитах отмечались процессы разрушения мембран. В печеночных балках, наряду с малоизменёнными в структурно-функциональном отношении гепатоцитами, дающими положительные гистохимические реакции на выявление гликогена, суммарного белка, рибонуклеопротеидов, встречались двуядерные и многоядерные клетки. Часто в таких клетках были видны фигуры митоза. Определялись печёночные клетки с признаками гидропической и баллонной дистрофии.

Таблица 9 — Количественная оценка экспрессии синтеза протеинов bel 2 и р53 у крыс в условиях эксперимента

Сроки наблюдения Структурная ед. Вс12 р53

без лечения 1 серия ципроф-локсацин 2 серия окситоцин 3 серия ОКСИТОЦ.+ ципроф-локсацин 4 сер. без лечения 1 серия ципроф-локсацин 2 серия окситоцин 3 серия окситоцин + ципроф-локсацин 4 сер.

Зсут. панкреа-тоциты 0 0 0,71±0,03 0,81 ±0,01* 1,44 ±0,02 1,62±0,01 1,41+0,01 1,03±0,01*

гепатоци-ты 0,15+0,01 0 0,56 ±0,01 0,61 +0,02* 1,81 ±0,01 1,90 ±0,01 1,60±0,01* 1,01 ±0,01*

7 сут. панкреа-тоциты 0 0 1,22 +0,02 1,31 ±0,01* 3,01 ±0,04 2,97 ±0,01 2,0±0,06* 1,61 ±0,02*

гепатоци-ты 0 0 1,36 ±0,01 1,47 ±0,03* 3,8 ±0,03 3,7 ±0,02 3,10+0,06* 1,57 ±0,04*

14 сут. панкреа-тоциты 0 0 1,77 ±0,01 1,88 ±0,01* 4,31 ±0,07 3,91 ±0,01 3,21±0,03* 2,72 ±0,01*

гепатоци-ты 0 0 1,92±0,03 2,01+0,01* 4,91±0,04 4,81±0,07 4,01±0,04* 3,01+0,06*

* р < 0,05 при сравнении Вс12 4-й серии с 3-й, при сравнении р53 2-й, 3-й, 4-й серий с 1-й.

Примечание: по результатам подсчета не менее 10000 клеток в условных полях зрения микроскопа МБИ — 15 (0,25 ммг, об. 40, ок. 10)

В процессе развитая жировой дистрофии в гепатоцитах определялся жир, который имел пылевидный, мелко- и крупнокапельный вид. Капли липидов оттесняли относительно сохранные органеллы на периферию клетки, которая становилась перстневидной. Жировая инфильтрация охватывала единичные гепатоциты и группы клеток. Некоторые печеночные клетки при жировой инфильтрации погибали, жировые капли сливались и образовывали внеклеточно расположенные жировые кисты, вокруг которых возникала клеточная реакция с начальными признаками разрастания соединительной ткани (7-е сутки ЭОП).

Портальная и внутридольковая строма диффузно инфильтрировалась лимфоцитами и макрофагами, среди которых определялись плазматические клетки, эозинофильные и нейтрофильные лейкоциты. При этом значительно увеличивалось количество ретикулоэндотелиоцитов. Возникшее полнокровие в органе приводило к деструктивным изменениям стенки сосудов микроциркуляторного русла (рис. 4). Отмечались деструктивные изменения эндотелиальных клеток, повышалась проницаемость стенки гемокапилляров, возникали очаги кровоизлияния в периваскулярное пространство. В просвете капилляров появлялось большое количество лейкоцитов.

Отмечались признаки нарушения лимфоотгока, которые выражались в расширении размеров просвета лимфатических сосудов и особенно лимфатических капилляров. Яркая картина поражения печени отмечена нами при развитии явлений пашереонекроза. Уже на ранних стадиях ЭОП определялось резко выраженное полнокровие тканей печени и их отёк, расширение перисинусоидных пространств (Дис-се), слущивание звёздчатых ретику-лоэндотелиальных клеток (клетки Купфера). В гепатоцитах наблюдались активные деструктивные процессы, которые сопровождались нарушением межклеточных контактов.

Нами замечено замедление выведения желчи из печёночных клеток, особенно в центре долек, вокруг центральных вен. Некоторые желчные капилляры были переполнены секреторными продуктами. Встречались очаги кровоизлияний и расширенные лимфатические сосуды. В междольковой

Рис. 4 — Синусоидный гемокапилляр печени крысы:

ЭОП + S. aureus. Стадия: 7 сут. А - эндотелиоцит; Б — эритроцит. Электронограмма. Ув. х27500

■

соединительной ткани вокруг триад прослеживался отек, плазморрагия, выход нейтрофильных лейкоцитов за пределы сосудистых стенок (рис. 5). В отдельных дольках через сутки эксперимента определялись очаговые нарушения кровообращения, печёночные клетки, прилежащие к центральным венам, подвергались процессам дегенерации.

Отмечалась лейкоцитарная инфильтрация очагов гибели клеток, в ге-мокапиллярах встречались лейкоцитарные скопления. Печёночные балки были истонченными, в гепатоцитах развивалась белковая, а позднее и жировая дистрофия. В условиях инфицирования, особенно при введении Е. coli, резко усиливались процессы альтерации тканей печени. В печёночных балках определялось большое количество дегенерирующих клеток. Наблюдалось также расширение перисинусоидальных пространств, в строме железы определялись фибриллярные структуры, лимфоциты, микроорганизмы и реактивно изменённые макрофаги. Необходимо сказать, что в данной серии опытов отмечено быстрое возникновение венозного полнокровия органа с очаговыми лимфостазами и нарушением оттока желчи из

желчных капилляров.

Сосуды микроциркуляторного русла были расширенны, переполнены кровью с большим содержанием лейкоцитов. Отмечены выраженные явления экстравазации плазмы и диапе-деза форменных элементов. В капсуле печени и под ней также определялось большое количество лейкоцитов. Необходимо заметить, что в серии опытов при инфицировании стафилококком структурные изменения в тканях печени носили экссудативнысй и продуктивный характер. Это выражалось дистрофией и некрозом гепатоцитов различных отделов печёночной дольки, активной реакцией ретикулоэн-дотелиальных систем органа. В ходе развития воспаления в строме печени образовывались локальные или разлитые инфильтраты из пролиферирую-щих звёздчатых ретакулоэндотелио-цитов (клеток Купфера), эндотелия, к которым присоединялись гематогенные элементы.

Таким образом, в печени в большинстве случаев наблюдалась картина острого гепатита, причём степень мор-

ж.г.

Рис. 5 - Полиморфоклеточная

инфильтрация между печеночными балками крысы

через 7 сут. эксперимента: ЭОП + Е. соН. Фиксация: спирт -формалин. Окраска: перйодат -Шифф-реакция. Ув. об, 40, ок. 10

фологических изменений в значительной мере зависит от интенсивности патологического процесса в поджелудочной железе.

При воздействии окситоцина и комплекса окситоцина с ципрофлокса-цином в условиях ЭОП отмечалась положительная динамика восстановления в сосудах печени микроциркуляции крови и лимфы, что проявлялось уменьшением экстравазации плазмы и выхода форменных элементов крови в периваскулярное пространство. Улучшение кровоснабжения печёночной дольки, желчевыведения приводило к стабилизации патологических изменений в клетках. В печёночной дольке определялись в структурном отношении малоизменённые клетки, возрастало количество двухъядерных гепато-цитов наряду с уменьшением числа деструктивно изменённых. Отмечался процесс восстановления мембран печёночных клеток и межклеточных контактов. Ядра клеток характеризовались увеличением в них эухроматиновых зон и наличием небольших по размерам ядрышек (рис. 6).

Позитивные изменения в ядрах коснулись структур цитоплазмы. Это выражалось в уменьшении просвета канальцев эндоплазматической сети и цистерн пластинчатого комплекса, размеров и количества вакуолей и липидных капель, аутофагосом, увеличением количества связанных и свободных рибосом, митохондрий. В митохондриях хорошо определялись мембраны, кристы и матрикс, что свойственно для энергированных форм. В гепатоцитах активизируются метаболические процессы (в том числе синтетические), что проявлялось в усилении гистохимических реакций на выявление рибонуклеопротеидов, гликогена, суммарного белка. Отмечалось усиление регенераторных процессов в эндотелиоцитах и звёздчатых клетках. Положительное действие окситоцина с ципрофлоксацином проявлялось также в активизации перемещения лимфоцитов, макрофагов в повреждённые зоны органа и активизации клеток фибробластического ряда.

Таким образом, результаты комплексной оценки морфо-функцио-нального состояния печени животных при экспериментальном остром панкреатите обосновывают целесообразность включения окситоцина с ципрофлоксацином в комплекс лечебных мероприятий при остром панкреатите.

Рис. 6 - Фрагмент гепатоцита:

ЭОП + инфицирование (Е. coli). Стадия 14 суг. (введение окситоцина и антибиотика). Элекгронограмма. Ув.хЗОООО

выводы

1. Использование окситоцина в лечении экспериментального острого панкреатита приводило к улучшению состояния животных в сравнении с контрольной серией, что выражалось в более высоких показателях интегральной оценки состояния, значительным снижением летальности, и более существенный эффект наблюдался при применении окситоцина с ци-профлоксацином.

2. При экспериментальном остром панкреатите печень и поджелудочная железа скоординированно реализуют диапазон своих гистобластиче-ских и органотипических возможностей, что приводит к цитофизиологаче-ской недостаточности гепатоцитов, печеночных сосудов микроциркуляции и особенно перисинусоидальных пространств. При инфицированном процессе (особенно Е. coli) происходит более значимое снижение жизнеспособности гепатоцитов, нарушение сосудов микроциркуляции печени, ультраструктурные повреждения митохондрий, эндотелиоцитов, макрофагов и эндоплазматического ретикулума.

3. При использовании окситоцина и окситоцина в сочетании с ципроф-локсацином при асептическом и инфицированном экспериментальном остром панкреатите в печени наблюдается восстановление микроциркуляции, лимфооттока, желчевыведения, уменьшение экстравазации плазмы и выхода форменных элементов крови в периваскулярное пространство, что в совокупности свидетельствует о гепатопротекторном влиянии.

4. Регенераторная способность гепатоцитов, а также их диапазон цито-дифференцировки при экспериментальном остром панкреатите могут быть достоверно оценены на основе иммуноцитохимического анализа оценки экспрессии синтеза про- и антиапоптических протеинов (р53 и Ьс12). Проведенный имунноцитохимический анализ (по показателям идентификации про- и антиапоптотических генов) показал, что на фоне применения окситоцина и особенно комбинации ципрофлоксацина с окситоцином происходит возрастание количества Ьс12-позитивных панкреатоцитов и гепатоцитов и снижение синтеза протеина р53 в поджелудочной железе и печени, что создает адекватные условия к сохранению жизнеспособности данных элементов, реализующих генетически детерминированный путь к пролиферации и клеточной репродукции.

5. Применение окситоцина для лечебной коррекции экспериментального острого панкреатита, стерильного и инфицированного, нормализует цитофизиологические процессы не только в самой поджелудочной железе, но и в печени, уменьшая провоспалительную активность бактерий, оптимизируя течение фаз регенераторного процесса, что проявляется в 2-3-кратном снижении экспрессии проапоптотического гена р53 и активизации экспрессии панкреатоцитами и гепатоцитами Ьс12 в 1,5 и 1,8 раза соответственно.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные результаты могут быть использованы:

1) для количественной оценки тяжести состояния животных и эффективности лечения экспериментального острого панкреатита предложена шкала, основанная на раздельном определении выраженности критериев в баллах;

2) в экспериментальной морфологии при изучении нейроэндокринной регуляции репаративных процессов паренхимы и стромы печени и поджелудочной железы;

3) для обоснования и разработки эффективных способов стимуляции регенерации ткани печени в клинических условиях с целью предотвращения печеночной недостаточности;

4) в учебном процессе на кафедрах хирургии и гистологии, а также при написании соответствующих разделов учебных пособий.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Динамика биологических свойств Klebsiella pneumonia при лечении экспериментального сепсиса комбинацией окситоцииа и цефотаксима / C.B. Кретинин, С.Б. Фадеев, Н.Б. Перунова, C.B. Явнова, C.B. Андрю-щеико, A.A. Бобылев, О.В. Бухарин // Медицинская наука и образование Урала. - 2008. - № 6. - С. 51 - 53.

2. Количественная оценка тяжести состояния экспериментальных животных / С.Б. Фадеев, B.C. Тарасенко, C.B. Кретинин, Д.Б. Демин, Д. В. Волков, A.A. Бобшев // Сборник научно-практических работ «Актуальные вопросы хирургии: проблемы и пути решения» посвящен 90-летию ОКБ станции Оренбург. - Оренбург, 2009. - С. 216-218.

3. Гистологическая характеристика морфологических изменений печени в условиях экспериментального острого панкреатита при использовании перфто-рана / Д.Б. Демин, Ф.В. Басов, A.A. Стадников, С.Д. Валов, B.C. Тарасенко, H.A. Щетинин, С.А. Корнилов, A.A. Бобшев // Морфологические ведомости. - 2009. - № 3. - С. 279-281.

4. Особенности морфологических изменений печени в условиях экспериментального острого панкреатита / Д.Б. Демин, Ф.В. Басов, С.Д. Валов, B.C. Тарасенко, С.А. Корнилов, H.A. Щетинин, A.A. Бобшев // Сборник научно-практических работ «Актуальные вопросы хирургии: проблемы и пути решения». — Оренбург, 2009. — С. 216-218.

5. Характеристика морфологических изменений печени при экспериментальном остром панкреатите / Ф.В. Басов, Д.Б. Демин, С Д. Валов, B.C. Ткра-сенко, H.A. Щетинин С.А. Корнилов, A.A. Бобшев// Морфология. - 2010. -№4.-С. 27-28.

6. Характеристика морфологических изменений печени в условиях экспериментального острого панкреатита / Ф.В. Басов, H.A. Щетинин, С. А. Корнилов, A.A. Бобылев, C.B. Кретинин // Альманах молодой науки. -Оренбург, 2010. - № 3. - С. 5.

7. Бобылев, A.A. Морфологические изменения печени при экспериментальном остром панкреатите / A.A. Бобылев, Ф.В. Басов // Вестник РГМУ. - 2011. - № 1. - С. 362.

8. Бобылев, АЛ. Морфологические изменения печени при местном лечении окситоцнном в условиях экспериментального острого панкреатита / A.A. Бобылев // Морфология. - 2011. - № 5. - С. 72.

Бобылев Алексей Александрович

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ГИСТОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ОКСИТОЦИНА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ПОВРЕЖДЕНИЯ ПЕЧЕНИ В КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ ОСТРОГО ПАНКРЕАТИТА

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 29.12.11. Формат 60x84/16. Уся. печ.л. 1,0. Печать трафаретная. Бумага офсетная. Заказ № 4274. Тираж 120 экз.

Издательский центр ОГАУ 460014, г. Оренбург, ул. Челюскинцев, 18 Тел.: (3532)77-61-43