Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Экспериментальная терапия паркинсонического синдрома липосомальными формами L-3,4 - дигидроксифенилаланина и дофамина

Р Г Б ОД О 1 ИЮН 1997

На нравах рукописи

ЮРАСОВ Василий Викторович

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ ПАРКИНСОНИЧЕСКОГО СИНДРОМА ЛИПОСОМАЛЬНЫМИ ФОРМАМИ Ь-З. 4-ДИГИДРОКСИФЕИИЛАЛАНШ1АИ

ДОФАМИНА

14.00.1 б. - Патологическая физиология 03.00.04. - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Москва - 1997

Работа выполнена в лаборатории общей патологии нервной системы Научно-исследовательского интститута общей патологии и патофизиологии Российской АМН и на кафедре биотехнологии Московской Государственной Академии Тонкой Химической Технологии имени М.В. Ломоносова.

Научные руководители: доктор медицинских наук,

профессор, академик РАМН Г.Н. Крыжановский,

доктор медицинских наук Е.В. Никушкин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Р.Н. Глебов,

доктор биологических наук А.Н. Ерин

Ведущее учреждение: Научный Центр психического здоровья

Российской АМН

Защита диссертации состоится " -¿Х" ^¿¿¿¿гХ- 1997 ГОда в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д.001.03.01 при Научно-исследовательском институте общей патологии и патофизиологии Российской АМН (125315, Москва, Балтийская ул., д.8.).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан диклм? 1997 года,

Учёный секретарь Диссертационного Совета кандидат медицинских наук

Л.Н. Скуратовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последнее десятилетие одновременно с ростом средней продолжительности жизни населения и сосудистых заболеваний мозга, отмечается значительное увеличение числа больных дрожательным параличём и синдромом Пар-кинсона (Маньковский и др., 1988; Каменецкий, 1995). Эти заболевания встречаются у 1% населения до 60 лет и до 5% у лиц старшего возраста, что соответствует 60-180 случаям на 100000 населения (Mamila, 1987; Stern, Koller, 1992). Рост заболеваемости и наблюдаемое "омоложение" паркинсонизма (Ходос, Кондакова, 1982) выдвигают данную патологию в ряд актуальных медико-социальных проблем.

Основным подходом в лечении паркинсонизма остаётся заместительная терапия сравнительно легко проникающим в мозг предшественником дофамина (ДА) - L-3,4-дигидроксифенилаланином (L-DOPA) (Wolters et al., 1994). Однако клиническая нестабильность по типу "wearing-off и "on-of' феноменов, периферические и центральные побочные эффекты, обусловленные колебаниями концентрации L-DOPA в крови и мозге, интенсивным периферическим декарбоксилированием препарата и развитием денер-вационной гиперчувствительности ДА-рецептороа стриатума, значительно затрудняют корректировку дозы и ритма введения L-DOPA (Quinn, 1990; Wooten, 1990; Obeso, Linazasoro, 1994). Для решения этих проблем предпринимались различные методические подходы к заместительной терапии паркинсонизма: применение L-DOPA с ингибитором периферических декарбоксилаз - карбидопой (Nutt, 1987); заключение L-DOPA в полимерные матрицы, обеспечивающие контролируемое его высвобождение (LeWitt, 1993); внутривенные (Quinn, 1990) и интрацеребровентрикулярные инфузии L-DOPA (Hood et al., 1988); применение гидрофобных предшественников ДА (Murata et al., 1990) и, наконец, трансплантация эмбриональных нигральных клеток в мозг (Backlund, 1985). Однако, несмотря на достигнутые успехи, разработка новых подходов к заместительной терапии паркинсонизма, направленных на увеличение ее эффективности, сохраняет свою актуальность.

Одним из способов защиты лекарственных веществ от периферической биотрансформации, увеличения времени циркуляции в кровотоке и снижения дозы, является их заключение в липосомы (Gregoriadis, 1995). Липосомы лишены ограничений по химическому и структурному диапазону переносимых веществ (Fendler, 1980), а их ли-пидные компоненты подвержены полной биодеградации (Poste, 1980). Липосомы способны улучшать доступ лекарственного вещества в области, нуждающиеся в лечении (Марголис, 1987). Успешное применение липосом было продемонстрировано ранее для ряда противосудорожных препаратов, которые не способны самостоятельно преодолевать гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) (Loeb et al., 1982; Yokoyama et al., 1992; Morí et al., 1992). Показана возможность длительной коррекции двигательных нарушений

при экспериментальном гемипаркинсонизме у крыс на фоне интрастриатной имплантации липосом с ДА (During et al., 1992). Однако попыток к системному применению ли-посомалькых форм L-DOPA и ДА для терапии экспериментального паркинсонического синдрома (ПС) до настоящего времени не предпринималось. Изучение влияния "пустых" липосом на развитие Г1С имеет самостоятельную ценность, так как известно, что липосомы восстанавливали нарушения метаболизма липидов и оказывали ан-тиоксидантное и общее терапевтическое действие при различных патологических состояниях у животных (Skinner et al., 1989; Стефанов и др.,1990; Лескова, Удовиченко, 1991), стимулировали секрецию ДА в мозге мышей (Bigon et al., 1979) и увеличивали афинность ацетилхолиновых (Gelbmann, Muller, 1991) и NMDA-рецепторов (Cohen, Muller, 1992) в мозге старых крыс.

В связи с вышеизложенным, идеи, предполагающие системное использование липосом с L-DOPA и ДА для заместительной терапии паркинсонизма и изучение влияния "пустых" липосом на развитие ПС, не лишены оснований. Экспериментальной проверке этих предположений и посвящена данная диссертация.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в выяснении эффективности системного применения L-DOPA и ДА, заключённых в липосомы, для терапии экспериментального 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (МФТП) -индуцированного паркинсонического синдрома (Г1С).

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1. Осуществить подбор оптимального липидного состава и технологических условий для приготовления дисперсии липосом с L-DOPA и ДА. Охарактеризовать физико-химические свойства липосом с L-DOPA и ДА (размеры, процент включения моноаминов, стабильность липосом, кинетику окисления моноаминов в липосомах, влияние моноаминов на пространственную упаковку липидов в липосомах и на кинетику перекисного окисления липосомальных липидов).

2. Подобрать схему и способ введения липосомальных лекарственных форм и изучить их влияние на параметры двигательной активности животных как в условиях нормы, так и при экспериметальном ПС.

3. Исследовать влияние липосомальных лекарственных форм на нейрохимические параметры обмена катехоламинов в стриатуме животных с экспериментальным ПС и в норме.

4. Изучить влияние липосомальных лекарственных форм на уровень конечных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в стриатуме и плазме крови, а также исследовать их влияние на фосфолипидный состав стриатума при экспериментальном ПС и в норме.

5. Оценить количественые и кинетические параметры проникновения липосомальных форм катехоламинов в стриатум.

Научная новизна работы. Впервые предпринято системное применение малых одноламеллярных липосом (МОЛ) из яичного фосфатидилхолина (яФХ) и холестерина (Хол), нагруженных Ь-ООРА и ДА для проведения экспериментальной заместительной терапии МФТП-индуцнрованного ПС у мышей С57В1./6. Установлено, что степень включения ЮОРА и ДА в 5% дисперсию липосом с размерами 60 нм крайне мала, ограничена внутренним объемом везикул и не превышает 12-15%, а регресс паркинсо-нической симптоматики у животных, наступает только на фоне длительного внутри-брюшинного (в/б) введения Ь-ИОРА и ДА, заключённых в МОЛ. Впервые обнаружено, что заключение ЮОРА и ДА в МОЛ позволяет пролонгировать антипаркинсониче-ский эффект до 5 ч, в отличие от 10-кратно больших доз свободного ЮОРА, действующего в течение I ч, и полностью неэффективного ДА. Показано, что антипаркин-соническая эффективность липосомальных форм Ь-ООРА и ДА коррелирует с частичной компенсацией дефицита уровня ДА и его метаболитов в стриатуме. В связи с этим, полученные результаты, являются доказательством способности липосом эффективно транспортировать малые дозы моноаминов в мозг и принимать непосредственное участие в проникновении ЮОРА и ДА через ГЭБ. Впервые проведенная количественная оценка проникновения липосомальных форм катехоламинов в стриатум показала, что МОЛ ускоряют этот процесс в 100 раз.

Выявлено умеренное антипаркинсоническое действие самих МОЛ при их длительном в/б введении животным, сопровождающееся модуляцией обмена фосфолипи-дов, снижением содержания конечных продуктов ПОЛ и увеличением уровня показателя секреций ДА - гомованилиновой кислоты (ГВК) в стриатуме. Свойство МОЛ модулировать обмен фосфолипидов и ДА в стриатуме проявляется не только при ПС, но и в норме.

Показано, что Ь-ВОРА и ДА, инкапсулированные в липосомы, окисляются медленнее, чем их свободные формы и ингибируют ПОЛ в липосомах.

Теоретическая значимость. Полученные результаты углубляют представления об альтернативных путях преодоления ГЭБ для нейромедиаторов и их предшественников. Обнаружение у "пустых" липосом умеренных антииммобилизационных свойств, ан-тиоксидантной активности и способности стимулировать обмен фосфолипидов и ДА в стриатуме представляет интерес для изучения роли обмена липидов в механизмах компенсации дофаминергической передачи при ПС.

Практическая ценность. Обнаруженное антипаркиисоническое действие заключённых в МОЛ ЮОРА и ДА может быть полезно как для дальнейшего совершенствования принципов заместительной липосомо-Ь-ООРА- или ДА- терапии в эксперименте,

так и для изучения возможностей применения данного методического подхода к заместительной терапии болезни Паркинсона у человека. Умеренная антипаркинсоническая эффективность самих МОЛ увеличивает терапевтическую ценность липосомальных форм L-DOPA и ДА и позволяет рассматривать "пустые" МОЛ как дополнительное средство в комплексной патогенетической терапии болезни Паркинсона.

Положения, выносимые на защиту.

1. В 5% дисперсию МОЛ из яФХ и Хол включается около 12-15% L-DOPA и ДА, которые не нарушая ламеллярной упаковки липидов МОЛ, эффективно удерживаются внутри везикул и более устойчивы к окислению, чем их свободные формы. Инкапсулированные в МОЛ L-DOPA и ДА ингибируют перекисное окисление липидов МОЛ.

2. Малые дозы L-DOPA и ДА, заключённые в МОЛ, при их системном (в/б) введении оказывают выраженное и пролонгированное подавление характерных паркинсо-нических симптомов у мышей C57BL/6, которое коррелирует с частичной компенсацией дефицита уровня ДА и его метаболитов: ГВК и диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) и усилением интенсивности обмена ДА в стриатуме.

3. Липосомы обеспечивают эффективную транспортировку малых количеств L-DOPA и ДА в стриатум и облегчают их проникновение через ГЭБ. Скорость проникновения липосомальной формы катехоламинов в стриатум (на примере их абиогенного аналога - диоксибепзиламипа) в 100 раз превышает таковую для свободной.

4. Липосомальный носитель потенцирует антипаркинсоническое действие заключённых в него L-DOPA и ДА, оказывая модулирующее влияние на обмен фосфоли-пидов в стриатуме, которое сопровождается снижением уровня конечных продуктов ПОЛ и увеличением концентрации ГВК - показателя секреции ДА. В условиях нормы "пустые" МОЛ не вызывают отклонений в двигательной активности мышей и не провоцируют токсических реакций и гибели животных, но как и при ПС оказывают модулирующее влияние на обмен фосфолипидов и вызывают увеличение ГВК в стриатуме.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на VI-м Российско-СНГ симпозиуме по биохимии липидов (Санкт-Петербург, 1994), IV-м Всемирном IBRO-конгрессе по нейронаукам (Киото, Япония, 1995), 1-м Европейском конгрессе по фармакологии (Милан, Италия, 1995), Ш-ем международном симпозиуме "Восстановительная неврология" (Иркутск, 1995), IV-ой международной конференции "Liposome Research Days Conference" (Фрайбург, ФРГ, 1995), III-м Всероссийском Национальном конгрессе 'Человек и лекарство" (Москва, 1996), VI-м международном EBPS-симпозиуме по поведенческой фармакологии (Кальяри, Италия, 1996), 1-м Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 1996), V-ой международной конференции "Liposome Research Days Conference" (Шизока, Япония, 1996) и III-ей между народ-

ной конференции "Liposome Advances: Progress in Drug and Vaccine Delivery" (Лондон, Великобритания, 1996).

Структура и оfii,ем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием методов исследования и 5 глав, посвященных изложению результатов экспериментальных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 167 страницах, содержит 39 рисунков и 14 таблиц. Список литературы включает 245 источников, из которых 51 опубликован в отечественных и 194 в зарубежных изданиях.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты были выполнены на 5-месячных мышах-самцах линии C57BL/6 массой 23-25 г. ПС моделировали путём внутрибрюшинного (в/б) введения МФТП в дозе 20 мг/кг 2 раза в день с интервалом 12 ч в течение 7 дней и 21 дня (Крыжанозский и др., 1995). "Пустые" МОЛ, МОЛ с L-DOPA или ДА и свободные формы L-DOPA или ДА вводили в/б через 1 ч после инъекции МФТП однократно на 7 день введения МФТП и многократно с 7 по 21 день введения МФТП по 2 раза в сутки с интервалом 12 ч. Отдельным группам мышей без ПС (контроль) и с ПС вместо лекарственных форм вводили 0,9% NaCl. L-DOPA в МОЛ вводили в дозе 5 мг/кг, а ДА - 3,5 мг/кг. Свободный L-DOPA вводили в дозах 5 мг/кг (только однокр.) и 50 мг/кг, а ДА - в дозе 50 мг/кг. Доза липидов МОЛ была равна 500 мг липидов/кг массы мыши. Отдельной группе мышей без ПС по той же схеме в течение 14 дней вводили "пустые" МОЛ.

Двигательную активность (выраженность олигокинезии) у животных оценивали в ¡-ьш день (до начала введения МФТП), на 7-ой, ¡4-ый и 21-ый дни введения МФТП в автоматизированном аналоге теста "открытое поле" (Opto-Varimex-3, "Columbus instruments", США), регистрируя в течение 3 мин пройденный путь, в см; время передвижения животных, в с; время, когда животные оставались без движения (время "отдыха"), в с; число мелких (груминг. умывание, обнюхиваиие) и число вертикальных движений (стоек). На 7-ой, 14-ый и 21-ый дни введения МФТП двигательную активность оценивали через 1, 3 и 5 ч после введения лекарственных форм. Ригидность мышц туловища оценивали по выраженности симптома "горбатости" в баллах (Крыжановский и др., 1993).

Животных декаиитировали на 7-ой день через 1 ч после однократного введения препаратов и по окончании длительного введения препаратов - на 22-ой день. В последнем случае, в день забоя фармакологические воздействия не отменялись. Стриатум (20-25 мг) выделяли согласно методу (Glowinski, Iversen, 1966) и хранили при -70°С до проведения биохимических исследований. Из крови получали плазму.

Экстракты из стриатумов для количественного определения катехоламинов готовили, как описано в работе (Шеманов и др., 1988). Содержание ДА, ДОФУК и ГВК определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе LC-304T (BAS, West Lafayette. США) с электрохимическим детектором (Bruntlett, 1980) в модификации (Kontur et al., 1984) и выражали в иг на 1 мг ткани.

Фосфолипиды из стриатума экстрагировали по методу (Folch et al., 1957) и разделяли на фракции методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) (Кейтс, 1975). Количественное определение фосфата во фракциях проводили, по методике (Zilversmit et al., 1950) и выражали в мкмоль липидного фосфора на 1 мг ткани.

Концентрацию продуктов ПОЛ, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБКП), определяли в дисперсии липосом по методике (Владимиров, Арчаков, 1972), а в плазме крови и гомогенатах стриатума - согласно её модификации (Гаврилов и др., 1987). Концентрацию ТБКП в дисперсии липосом выражали в мкМ, а в биоматериале в нмолях иа 1 мг белка. Белок определяли по методу (Lowry et al., 1951).

МОЛ готовили из яФХ (0,053 М) и Хол (0,024 М), взятых в мольном соотношении - 7:3 и общей концентрацией липидов 50 мг/мл, методом ультразвуковой дезинтеграции (22 кГц 20 раз по 30 с релаксацией в 1 мин) липидной пленки, предварительно диспергированной в 0,0127 M L-DOPA, ДА гидрохлорида или 3,4-диоксибензиламина гидробромида (ДОБА) в 0,9% NaCl (Papahadjopoulos, VVatkins, 1967). МОЛ с моноаминами и невключившиеся препараты для экспериментов in vitro разделяли гель-фильтрацией на сефадексе G-100, а для использования in vivo - методом равновесного диализа. Включение моноаминов в МОЛ и отделение МОЛ от невключившихся препаратов качественно подтверждали методом ТСХ на пластинах "Silufol" в системе Хлф:Ме0Н:Н20=65:25:4 (по объему), используя для обнаружения яФХ и моноаминов реакции с фосфорномолибденовой кислотой и нингидрином, соответственно (Dawson et al., 1991). Для вычисления процента включения моноаминов в МОЛ и определения степени их окисленности к дисперсии МОЛ добавляли дезоксихолат натрия (ДХН) из расчета ДХН:яФХ=1:4 (мольно) и проводили спектрофотометрическое измерение проб при 280 нм и 436 нм, соответственно. Кинетику удержания препаратов в МОЛ изучали, проводя через определенные интервалы времени повторную гель-фильтрацию МОЛ с L-DOPA и ДА, ранее очищенных от невключившегося вещества.

Размеры МОЛ определяли методами измерения спектра мутности (Трофимов, Нисневич, 1990), лазерной корреляционной спектроскопии (ЛКС) (Лебедев и др., 1987) на спектрометре ИНТОКС (ИЯФ РАН, Россия) и электронной микроскопии (ЭМ) (Papahadjopoulos et al.. 1974). Пространственную организацию липидов в липосомах изучали методом 31Р-ЯМР (Ghosh, 1988) на спектрометре MSL-200 (Bruker, ФРГ).

Оценку количественых и кинетических параметров проникновения липосомаль-ных форм катехоламинов в стриатум, проводили после однократного введения мышам липосомальной и свободной форм абиогенного структурного аналога ДА - 3,4-диоксибензиламина (ДОБА), определяя динамику изменения его уровня в стриатуме методом ВЭЖХ ex vivo. Содержание ДОБА в стриатуме выражали в пг на 1 мг белка и в % от введенной дозы. Скорость проникновения ДОБА в стриатум вычисляли согласно (Davson, 1955; Renkin. 1959).

В работе были использованы реактивы фирм "Serva" (ФРГ), "Sigma" (США). "Merck" (Австрия) и "Boehringer Mannheim" (ФРГ).

Данные представлены в виде средних арифметических+стандартная ошибка (М±ш). Достоверность установленных различий определяли, используя компьютерный статистический пакет "Statgraphics" (США), согласно t-крнтерию Фишера-Стьюдента и однофакторному дисперсионному анализу (ANOVA) с пост-хок тестом Ньюмена-Кулза. Различия считали достоверными при Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. ЛИПОСОМЫ С L-DOPA И ДОФАМИНОМ - ОСНОВНЫЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ И СВОЙСТВА

Исследование дисперсии липосом с L-DOPA и ДА методом 31Р-ЯМР показало, что L-DOPA и ДА не нарушали ламеллярной упаковки липидоз в липосомах и не вызывали грубых структурных изменений бислоя, так как формы линий их спектров, совпадая с таковыми для "пустых" липосом, были характерны для водных дисперсий фос-фатидилхолина с бислойной фазой и анизотропным движением молекул фосфолипидов в пределах мембраны (Cullis, 1983; Ghosh, 1988).

Измерение спектра мутности дисперсии липосом, установило, что размер везикул не превышал 100 нм. По данным ЛКС средний размер около 90% липосом был равен 55-65 нм. По результатам ЭМ около 85-90% липосом, с учетом их деформации в "плоские диски" (Oldfield et al.. 1978) и "полусферы" (Drechsler et al., 1995) в процессе подготовки образцов, имели размеры 56-69 нм. ЭМ-исследование позволило визуализировать преобладание именно липосом с одним фосфолипидным бнслоем. Полученные результаты согласуются с данными других авторов (Huang, 1969; Rahman, 1980; Kimelberg, 1980) и подтверждают возможность получения высокооднородной по размерам дисперсии однослойных липосом, определяемых как "малые" (Марголис, Бергельсон, 1986).

Процент включения (Puo) L-DOPA и ДА в МОЛ с размерами 60-80 нм. который характеризует степень связывания веществ с липосомами, оказался невысоким и

100 96 90 85 80

А О 1 2 3 24 180 336

0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00

Б

20 16 12 8 4 0

В

Рис. 1. Физико-химические свойства дисперсии МОЛ из яФХ и Хол (7:3 моль/мояь) в 0,9% N10, нагруженных ЮОРА и ДА. Концентрация моноаминов - 0,0127 М, липидов - 50 мг/мл, рН=7,4. Размер МОЛ - 60 нм. Дисперсию МОЛ хранили при температуре +-ГС в условиях темноты. А.) Кинетика удержания ЫЭОРА (1) и ДА (2) в МОЛ. По оси абсцисс: время, ч. По оси ординат: содержание моноаминов в МОЛ в % от начального уровня, принятого за 100%. Достоверность различий согласно (-критерию Стьюден-та: * - р<0,05 по сравнению с содержанием моноаминов в МОЛ на 0 ч. Б.) Кинетика окисления воздухом ЮОРА (2) и ДА (4) в р-ре 0,9% №С1 (концентрации такие же как и в МОЛ) и ЮОРА (1) и ДА (3), инкапсулированных в МОЛ. По оси абсцисс: время (I), суг. По оси ординат: оптическая плотность А,.Ао при дайне волны 436 нм. В.) Кинетика накогиения ТБКП в "пустых" МОЛ (1), МОЛ с Ь-ООРА (2) и в МОЛ с ДА (3). По оси абсцисс: время (О, сут. По оси ординат: концентрация (С) ТБКП в мкМ. к» - константы скорости накопления ТБКП как для реакции нулевого порядка, мкмольхЮ^хл-'хчг1 (к.,= (С-Со)Л).

у

0 И 1—1 г-

0123456789

составлял 15,41±0,37 для L-DOPA и 12.1+0,5 для ДА. При этом доля внутреннего водного объёма МОЛ от общего объёма их водной дисперсии, практически совпадала с Р„а для моноаминов и была равна 10-15%. L-DOPA и ДА, обладая низкой гидрофобностью (Dawson et al., 1991), как и другие подобные им вещества должны целиком располагаться во внутреннем водном пространстве везикул и иметь Рна, зависящий только от объема этого пространства (Fendler, 1980). Не смотря на низкие значения Рма и ограниченность внутреннего объема везикул, который определяется размерами липосом и концентрацией липидов (Марголис, Бергельсон. 1986), выбор МОЛ был оправдан тем, что в отличие от больших липосом, МОЛ значительно медленнее поглощаются макрофагами печени, дольше циркулируют в кровотоке (Gregoriadis, 1995), проникают в системный кровоток при в/б введении (Kimelberg, 1980) и не приводят к гибели животных от эмболии сосудов легких и почек (Gregoriadis, 1980). Содержание по отношению к яФХ в моль/моль для L-DOPA составило 0,045+0,0021, а для ДА - 0,028+0,0019.

Изучение кинетики удержания моноаминов в МОЛ показало, что оно достаточно эффективно для использования МОЛ с L-DOPA и ДА in vivo, несмотря на то, что ДА полностью оставался внутри МОЛ не 14 суток, как L-DOPA, а только 3 суток (рис. 1А). Стабильность МОЛ с L-DOPA и ДА могла быть обусловлена высоким содержанием Хол в МОЛ, увеличивающим эффективность удержания вещества в везикулах (Gregoriadis, 1980), и низкой гидрофобностью L-DOPA и ДА (Dawson et al., 1991), препятствовавшей их значимому проникновению через бислой.

Изучение кинетики окисления L-DOPA и ДА, которые в водных растворах легко окисляются кислородом воздуха в дигидроиндолхиноновые производные (аминохромы) (Young, 1983) показало, что моноамины, инкапсулированные в МОЛ, в процессе хранения окислялись значительно медленнее, чем их свободные формы (рис. 1Б). Более интенсивное окисление ДА, чем L-DOPA в аминохромы (рис. 1Б) могло быть обусловлено отсутствием в структуре ДА a-карбоксильной группы, ослабляющей элек-тронодонорные свойства a-аминогруппы при атаке ею хинонового кольца (Bindoli et all, 1992).

Изучение кинетики окисления ДА в ускоренном режиме (рН=8,9 + барботирова-ние воздухом) показало, что при сохранении везикулами целостности окисление ДА протекало очень медленно, в то время как после разрушения липосом ДХН, и высвобождения ДА во внешнее водное пространство скорость окисления ДА возрастала в 4 раза. По всей видимости, липидный бислой МОЛ выполняет роль барьера, уменьшающего доступность моноаминов для растворенного в воде кислорода.

Для кагехоламинов и катехольных аминокислот, способных к окислению, в зависимости от природы субстрата и окислителя, их концентраций и окислительных свойств продуктов, образующихся в процессе реакции, описано как антиоксидантное

(Graham, 1979; Liu et all., 1992; Бурлакова и др., 1992), так и прооксидантное действи< (Sotomatsu et all, 1990; Болдырев, 1995). Изучение кинетики накопления ТБКП в МОЛ с L-DOPA и ДА с конкретными количественными параметрам показало, что в первые í суток образование ТБКП в МОЛ с L-DOPA и ДА, по сравнению с "пустыми" МОЛ, замедлялось в 3 и 5 раз, соответственно, а с 9-е по 14-е сутки - в 20 и 35 раз (рис. 1В). Таким образом, присутствие L-DOPA и ДА в МОЛ приводило к значительному торможению образования ТБКП в липосомах в процессе их хранения. Стоит заметить, что эффективное удержание моноамшюв в МОЛ, могло быть обусловлено ингибированием окисления липидов МОЛ, так как увеличение проницаемости липосомальных мембран -коррелирует.«} степенью окисленное™ липидов (Rahman, 1980). Учитывая, что торможение образования ТБКП было более выражено в присутствии быстрее окисляемого ДА, то нельзя исключить, что антиоксидангное действие моноаминов связано с продуктами их окисления - аминохромами, которые являются мощными ингибиторами ПОЛ (Graham, 1979, Bindoli et all, 1992),.

В целом, изучение и анализ количественных физико-химических параметров МОЛ с моноаминами позволили установить, что одномоментно приготовленные МОЛ пригодны для использования in vivo в течение 3-х дней.

II. ВЛИЯНИЕ ЛИПОСОМАЛЬНЫХ ФОРМ НА ДВИГАТЕЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ЖИВОТНЫХ В НОРМЕ И ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО МФТП-ИНДУЦИРОВАННОГО ПАРКИНСОНИЧЕСКОГО СИНДРОМА

. Введение "пустых" МОЛ из яФХ и Хол мышам без индукции ПС в течение 2-х недель в дозе 500 мг липидов на 1 кг массы не вызывало отклонений в двигательной активности и не провоцировало токсических реакций. Ранее было показано, что внутривенное введение крысам липосом из яФХ и Хол в течение месяца в дозах 300-1000 мг/кг не изменяло поведения животных, не приводило к острым или отсроченным проявлениям токсичности и не влияло на гистологию легких, сердца, печени, мозга и селезенки (Gregoriadis, 1980; Rahman, 1980).

Введение МФТП в течение 7-и дней вызывало выраженное снижение двигательной активности у мышей, что хорошо согласуется с результатами других авторов (Крьшановский и др., 1995). Величина пройденного пути (рис. 2) уменьшалась в 2 раза по сравнению с контролем. Время передвижения сокращалось в 2,3 раза, а время "отдыха" возрастало в 1,6 раза. Число стоек снижалось в 7,7 раз. У всех животных, которым вводили МФТП развивалась мышечная ригидность. На 14-й день введения МФТП наблюдали дальнейшее развитие пнркинсонической симптоматики, а на 21 день - двигательные нарушения были выражены максимально (рис. 2).

Однократное введение животным с Г1С "пустых" МОЛ, МОЛ с L-DOPA (5 мг/кг), МОЛ с ДА (3,5 мг/кг) и свободного L-DOPA в дозе эквивалентной липосомаль-

гЬ X

+ +

+ 1?;

•Л #

«Ш *

ш$

/

II!

IV

□ i Шг Из И 4 ЦП 5

Рис. 2. Влияние 2-х недельного (с 7 по 21 день) в/б введения липосомальных форм на двигательную активность у мышей C57BL/6 с экспериментальным МФТП-индуцированным ПС. По оси ординат: пуп. пройденный животным за 3 мин, в см. По оси абсцисс, время наблюдения, I - до начала введения МФТП; П - на 7-ой день от начала введения МФТП; Ш - V - на 21 день от начала введения МФТП (Iii спустя I ч, IV спустя 3 я и V спустя 5 ч после последнего введения препаратов). Группы животных (А, Б): I -NaCl/NaCl (контроль), 2 - МФТП/NaCI, 3 - МФТПГпусше" МОЛ; (А): 4 - МФТП/МОЛ с L-DOPA (5 мг/кг), S - МФТП/L-DOPA (50 мг/кг); (Б): i - МФТП/МОЛ с ДА (3,5 мг/кг), 5 - МФТП/ДА (50 мг/кг). Достоверность различий согласно ANO VA с посг-хок тестом Ньюмена-Кулза: * - Р<0,01, * • Р<0,001 -по сравнению с группой 1; + - Р<0,05, ++ - Р<0,01 - по сравнению с группой - 2; х - Р<0,05, хх - Р<0,01 по сравнению с группой 3. В группах по 12-1.5 животных.

ной (5 мг/кг) не улучшало показателей двигательной активности и не уменьшало мышечной ригидности.

В/б введение МОЛ с L-DOPA и МОЛ с ДА в течение 7 дней (14-й день введения МФТП) частично компенсировало двигательные нарушения у животных с ПС. Так, уже через 1 ч после последнего введения препаратов отмечались тенденции (Р>0,05) к увеличению пройденного пути и времени передвижения животных, а также к сокращению времени "отдыха". Через 3 ч наблюдали достоверное, но достаточно .умеренное улучшение всех параметров двигательной активности. ,

На 14 день через ! ч после последнего введения МОЛ с L-DOPA,(21 день введения МФТП) наблюдали увеличение пройденного пути (рис. 2А) в 2 раза и времени передвижения в 4 раза. Время "отдыха" сокращалось па 30%. Спустя 3 и 5 ч наблюдался устойчивый и ярко выраженный антипаркинсонический эффект. Так, пройденный путь увеличивался (рис. 2А) в 5 раз, а время передвижения в 7 раз. Время "отдыха" сокращалось в 2,3 раза. Число стоек, абсолютно нехарактерных для ПС, возрастало в 22 раза.

На 14 день введения МОЛ с ДА (21 день введения МФТП), уже через 1 ч после их последней инъекции наблюдали максимально выраженный антипаркинсонический эффект, сохранявшийся через 3 и 5 ч на том же уровне. Пройденный путь (рис. 2Б) увеличивался в 3 раза, а время передвижения в 5 раз. Время "отдыха" сокращалось в 1,5 раза. Число стоек возрастало в 12 раз.

Введение мышам с ПС "пустых" МОЛ сопровождалось достоверно значительно меньшим, чем под влиянием МОЛ с L-DOPA и МОЛ с ДА антипаркинсоническим эффектом на любом из этапов эксперимента. Так. на 7-ой день их введения наблюдалась лишь тенденция к улучшению параметров двигательной активности. На 14-й день введения через 1 ч после последней инъекции их действие совпадало с таковым для МОЛ с L-DOPA, но не для МОЛ с ДА (рис. 2). Через 3 и 5 ч эффект был максимальным, но достаточно умеренным.

Однократное, 7-и и 14-и дневное системное введение свободного L-DOPA в дозе 10-кратно превышающей таковую в МОЛ, способствовало значительному улучшению параметров двигательной активности только спустя 1 час после введения препарата, а через 3 ч двигательная активность у животных данной группы соответствовала таковой у животных с ПС, которым вводили 0,9% NaCl (рис. 2А).

Введение свободного ДА (50 мг/кг) не оказывало антипаркинсонического эффекта ни на одном из этапов эксперимента (рис. 2Б).

Выраженность мышечной ригидности у животных с ПС на 7 день введения "пустых" МОЛ, свободного L-DOPA, МОЛ с L-DOPA и МОЛ с ДА снижалась на 30%, 37%, 60% и 50%, а на 14 день введения - на 50%, 50%, 75% и 75%, соответственно.

Таким образом, согласно полученным результатам, крайне малые дозы L-DOPA

и ДА, заключение в МОЛ, оказывали хотя и отсроченный, но выраженный и пролонгированный антипаркинсонический эффект. Учитывая, что степень выраженности эффекта не уступала таковой при введении, 10-кратно превышающей дозы свободного L-DOPA, можно с большой долей уверенности утверждать, что в процессе, транспортировки моноаминов в мозг бислой МОЛ предотвращал перераспределение L-DOPA и ДА из везикул в общий объем кровотока, снижая объем распределения препаратов в организме и защищая L-DOPA и ДА от периферической биотрансформации. Антипар-кинсоническое действие крайне малой дозы ДА, заключенного а МОЛ, в отличие от полностью неэффективной 13-кратно большей дозы свободного ДА, указывает на то, что липосомы обеспечивали проникновение в мозг ДА, который самостоятельно не проникает через ГЭБ (Bradbury, 1979). Отсроченность и пролонгирование действия L-DOPA и ДА, заключенных в МОЛу могло быть обусловлено особенностями фармако-кинетики самих МОЛ, так как умеренный антипаркинсонический эффект последних наблюдался с той же динамикой во времени, что и при применении МОЛ с моноаминами (рис. 2). Отсроченность действия липосомальных форм моноаминов могла быть связана с увеличением уровня препаратов в кровотоке при каждом последующем их введении, так как процесс поглощения везикул печенью и селезенкой носит насыщаемый характер (Wisse, Gregoriadis, 1975; Maruyama et al„ 1995). Пролонгирование эффекта, по всей видимости, могло быть обусловлено свойством МОЛ - длительно циркулировать в кровотоке (10-12 ч) (Woodle, 1992; Марголис. 1987; Gregoriadis, 1995).",

Следует также отметить, что "пустые" МОЛ и МОЛ с L-DOPA или с ДА одинаково увеличивали выживаемость животных с ПС до уровня контроля-!! предотвращали снижение у них массы тела. У мышей, которым вводили свободные формы L-DOPA и ДА в дозах 50 мг/кг, выживаемость соответствовала 58% от контроля, а масса снижалась на 15% от изначальной (Р<0,05). При этом, указанные параметры, совпадали с таковыми, у мышей с ПС, которым вводили 0,9% NaCl. Таким образом, полученные результаты позволяют связать увеличение выживаемости и предотвращение снижения массы тела у мышей с ПС с непосредственным действием липидов МОЛ, но не с L-DOPA или ДА. Не исключено, что липиды МОЛ использовались в качестве субстратов для энергообеспечения процессов, происходящих в клетках (Степанов и др., 1991).

III. ВЛИЯНИЕ ЛИПОСОМАЛЬНЫХ ФОРМ НА ОБМЕН ДОФАМИНА В СТРИАТУМЕ У ЖИВОТНЫХ В НОРМЕ И С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ МФТП-ИНДУЦИРОВАННЫМ ПАРКИНСОНИЧЕСКИМ СИНДРОМОМ

Введение в течение 7 дней МФТП,- сопровождалось снижением уровня ДА, ДОФУК и ГВК в стриатуме на 80%, 70% и 60%, соответственно. Содержание ДА на 21 день введения МФТП снижалось до 90% от уровня конроля (рис. ЗА,1). Уровень экстра-

Рнс. 3. Влияние 2-х недельного в/б введения липосомальных форм на нейрохимические параметры обмена дофамина в стриатуме мышей с экспериментальным МФТП-индуцировэнным ПС. По оси ординат, в нг на 1 мг ткани: I - ДА, II -ДОФУК, III - ГВК; в усл. ед.: IV - ДОФУК/ДА, V -ГВК/ДА. Группы животных (А, Б): 1 - NaCl/NaCI (ко1ггроль), 2 - МФТП/NaCl, 3 - МФТПЛпустые" МОЛ; А: 4 - МФТГ1/МОЛ с L-DOPA (5 мг/кг), 5 -МФТП/L-DOPA (50 мг/кг); Б: 4 - МФТП/МОЛ с ДА (3,5 мг/кг), S - МФТП/ДА (50 мг/кг). Достоверность рашичий согласно ANOVA с пост-хок тестом Ньюмена-Кулза: * - Р<0,05 - по сравнению с группой 1; + - Р<0,05 - по сравнению с группой - 2; х - Р<0,05 по сравнегапо с qiynnoü 3; # - Р<0,05 по сравнению с группой - 5. В группах по 12-15 животных.________________

I Уважаемые читатели, в ctdvktvdv осадка 3 вгаалась досалная опечатка. Фгагмент

клеточного и преимущественно постсекреторпого метаболита ДА - ГВК (Zetterstrom et al,. 1985; Kaakkola et al., 1992) снижался на 80% (рис. ЗА, 111)., а уровень внутринейро-налыгого метаболита ДА - ДОФУК (Zetterstrom et al,. 1983) только до 77% (рис. ЗА, II). Интенсивность внеклеточного метаболизма ДА - ГВК/ДА на 7-ой день введения МФТП, как считают компенсаторно (Wooten, 1987), возрастала в большей степени (в 2,5 раза), чем внутриклеточного - ДОФУК/ДА (на 60%), но на 21-й день введения МФТП преобладало усиление внутриклеточного метаболизма ДА (в 2 раза) (рис. ЗА, IV) по сравнению с внеклеточным (на 50%) (рис. ЗА. V). Полученные данные свидетельствуют не только о значительном снижении способности нейронов синтезировать и высвобождать ДА (Бархатова, 1988; Девойно, Ильюченок, 1993), но и являются нейрохимическими коррелятами выраженной олигокинезии и ригидности, имевшими место у мышей при введении МФТП (см. II). Сходные изменения в обмене ДА наблюдали и ранее при введении МФТП обезьянам (Burns et all, 1983) и мышам (Heikkila et all, 1984).

Однократное введение L-DOPA в МОЛ, в отличие от 10-кратно большей дозы свободного L-DOPA. не приводило к увеличению абсолютного содержания ДА, ДОФУК и ГВК в стриатуме мышей с МФТП-индуцированным ПС, но аналогично свободному L-DOPA (50 мг/кг) в 2 раза повышало интенсивность метаболизма ДА до ДОФУК (ДОФУК/ДА) и ГВК (ГВК/ДА). Свободный L-DOPA в дозе эквивалентной липосомальной и "пустые" МОЛ после их однократного введения не влияли на изменение нейрохимических параметров обмена ДА. По всей видимости, модулирующее влияние МОЛ с L-DOPA на оборот ДА в стриатуме было связано именно с доставкой препарата в мозг, но этих биохимических изменений, в отличие от имевших место при однократном введении 10-кратно большей дозы свободного L-DOPA, было недостаточно для коррекции нарушений двигательной активности у мышей с ПС (см. И).'

Введение МОЛ с L-DOPA (5 мг/кг) и свободного L-DOPA (50 мг/кг) в течение 14 дней мышам с ПС приводило к одинаковому повышению абсолютного содержания ДА - в 1,8-2 раза (рис. ЗА. I). По всей вероятности, большая часть L-DOPA; вводимого в растворе, подвергалась естественной биотрансформации под действием периферической DOPA-декарбоксилазы, и в мозг проникало не более 20% от введенной дозы (Owmen, Rosengren, 1967; Melamed, 1987). Уровень ДОФУК - внутриклеточного метаболита ДА - после введения свободного L-DOPA повышался в 5,7 раза, а после введения МОЛ с L-DOPA - в 2,3 раза (рис. ЗА, 11). Интенсивности внутринейронального метаболизма ДА (ДОФУК/ДА) (рис. ЗА, IV) после введения свободного и липосомально-го L-DOPA возрастали одинаково в 2,5-3 раза. Уровень экстраклеточного метаболита ДА - ГВК (рис. ЗА, III) и интенсивность его образования (ГВК/ДА) (рис. ЗА, V) также увеличивались одинаково - в 3 и в 2 раза, соответственно. В целом, количественные изменения нейрохимических параметров обмена ДА в стриатуме после введения сво-

бодного L-DOPA, хорошо согласуются с данными других авторов (Wooten, 1990; Ogawa et al., 1994).

Введение МОЛ с ДА (3,5 мг/кг) в течение 14 дней мышам с ПС приводило к повышению содержания ДА в стриатуме на 35% (рис. ЗБ, I). Уровень ДОФУК (рис. ЗБ, II) и оборот ДА - ДОФУЮДА (рис. ЗБ, IV) увеличивались в 2,7 раза. Содержание ГВК возрастало на 73% (рис. ЗБ, III), а оборот ДА - ГВК7ДА - в 2 раза (рис. ЗБ, V).

При 14-дневном введении мышам с ПС свободного ДА (50 мг/кг) нейрохимические параметры обмена ДА совпадали с таковыми у мышей с ПС, которым вводили 0,9% NaCl (рис. ЗБ).

Длительное (14 суток) введение МОЛ мышам без индукции ПС сопровождалось увеличением в стриатуме абсолютного содержания ГВК на 20% и оборота ДА -ГВК/ДА на 46%. На уровень ДА и ДОФУК "пустые" МОЛ влияния не оказывали. Ранее было показано, что введение МОЛ из липидов бычьего мозга увеличивало высвобождение кагехоламинов в мозге крыс (Bruni et al., 1976; Bigon et al., 1978) и дозозависимо увеличивало активность ДА-чувствительной аденилатциклазы в мозге мышей (Leon et al., 1978). Учитывая, что ГВК рассматривают как маркер секреции ДА (Roth et al., 1987; Kaakkola et al., 1992), можно предположить, что МОЛ способствовали увеличению высвобождения ДА из нейрональных терминален в стриатуме. Последнее могло быть связано со способностью липидов или их метаболитов влиять на липидное окружение и активность мембраносвязанных белков, ферментов и рецепторов, принимающих участие в процессах секреции, синтеза и обмена катехоламинов (Горкин, 1981; Srivastava, 1981; Raskovsky, 1989; Белоконева, Зайцев. 1993).

Длительное введение "пустых" МОЛ животным с ПС сопровождалось, как и в условиях нормы аналогичной направленностью, но большей выраженностью изменений нейрохимических параметров секреции ДА - более значимым увеличением уровня ГВК и величины ГВК/ДА (рис. 3, III, V). В связи с этим, количественно сходное по сравнению со свободным L-DOPA увеличение уровней ДА и ГВК, но значительно меньшее - ДОФУК после введения МОЛ с L-DOPA и с ДА могло быть обусловлено действием липидов МОЛ, которые модулируя высвобождение ДА из поврежденных токсином нейронов, уменьшали тем самым его внутринейрональный метаболизм.

Таким образом, полученные результаты в целом следует рассматривать как нейрохимическое подтверждение антипаркинсони ческой эффективности крайне малых доз L-DOPA и ДА, заключенных в МОЛ. Кроме того, из полученных данных следует, что доза L-DOPA, необходимая для частичной компенсации дефицита ДА и его метаболитов при МФТП-индуцированном ПС у мышей, может быть снижена в 10 раз, именно благодаря инкапсуляции препарата в МОЛ. Изменения в обмене ДА после введения мышам с ПС МОЛ с ДА следует рассматривать как основное биохимическое доказа-

тельство способности липосом обеспечивать проникновение ДА в мозг на уровне стриатума. Изменения в обмене ДА, имевшие место после введения "пустых" МОЛ как в условиях нормы, так и при IIC могут в определенной степени объяснить их умеренную антипаркинсоническую эффективность.

IV. ВЛИЯНИЕ ЛИПОСОМАЛЬНЫХ ФОРМ НА ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ В КРОВИ И СТРИАТУМЕ И НА ОБМЕН ФОСФОЛИПИДОВ В СТРИАТУМЕ В НОРМЕ И ПРИ МФТП-ИНДУЦИРОВАННОМ ПАРКИНСОНИЧЕСКОМ СИНДРОМЕ

Одним из звеньев патогенеза паркинсонизма (в т.ч. МФТП-индуцированного) является нарушение регуляции процесса ПОЛ в стриатуме (Ciuffi et а!., 1988; Кучеряну и др. 1989; Ргуог, 1994; Sandler, 1994). В связи с тем, что применение препаратов, обладающих антиоксидантпой активностью, позволяет снизить нейротоксичность МФТП и предотвратить снижение ДА в стриатуме животных с ПС (Albino-Teixeira et ai., 1991; Przedborski et al., 1992; Oishi et al., 1992; Yoshikawa, 1993). а простые липосомы из яФХ способны оказывать выраженное аитиоксидантное действие при различных патологических состояниях (Бородин, 1987; Стефанов и др., 1У90; Середенко и др., 1993) было изучено влияние 14-дневного в/б введения липосомальных форм, на состояние ПОЛ при МФТП-индуцированном ПС у мышей в плазме кропи и в очаге осноеных биохимических нарушений - в стриатуме,

21-дневное введение МФТП приводило к увеличению продуктов ПОЛ -ТБКП в стриатуме на 30% и в плазме крови на 20% (табл. 1).

Таблица 1. Содержание ТБКП в плазме крови и в стриатуме мышей С57ВЬ/6 с ПС при 21 дневном введении МФТП и в норме после длительного (с 7 по 21 день) в/б введения липосомальных форм (М-Ьт). __

Условия опыта Плазма крови, нмольх 10'2/мг белка Стриатум, нмоль/мг белка

NaCl/NaCl (контроль) - 1 5,84+0,46 2,42+0,085

NaCi/''пустые" МОЛ - 2 6,20+0,15 2,4310,083

МФТП/NaCI - 3 7,23+0,17' 3,15+0,058'

МФТП/"пустые" МОЛ - 4 6,1210,14" 2,19+0,033 '•"

МФТП/МОЛ с L-DOPA - 5 6,17+0,29* 2,03+0,025'-

МФТП/L-DOPA - 6 7,32+0,12' 2,83+0,121'■х

МФТП/МОЛ с ДА -7 6,05+0,17* 1,91±0,092*,,+

МФТП/ДА - 8 6,9410,18" 2,94+0,124*

Примечание. Достоверность различий согласно АМОУА с пост-хок тестом Ныомена-Кулза - Р<0,05: * - по сравнению с группой-1, х - по сравнению с группой - 3, + - по сравнению с группой - А. Число животных в группах 10-12.

14-дневное введение в условиях ПС как "пустых" МОЛ, так н МОЛ с L-DOPA или ДА сопровождалось однонаправленностью и практически одинаковой выраженностью снижения уровня ТБКП: в плазме крови - до уровня контроля, а в стриатуме на 30-40% (табл. 1). Достоверно более выраженное на 10%, по сравнению с действием "пустых" МОЛ, снижение ТБКП в стриатуме после введения МОЛ с моноаминами, ско-. рее всего, могло быть связано с тем, что липосомальные липиды, будучи сами субстратом ПОЛ, в момент введения в форме МОЛ с моноаминами были в меньшей степени окислены, чем липиды "пустых" МОЛ (см. I). Длительное же введение животным с ПС свободного L-DOPA, но не ДА, в дозе, 10-кратно превышающей таковую в МОЛ, вызывало недостоверное снижение ТБКП в стриатуме на 10% (Р<0,08) (табл. 1).

Между липосомами, клетками и липопротеидами как in vitro, так и в кровотоке происходит перенос мембранных компонентов и обменная диффузия липидами (Poste, 1980; Марголис, 1987; Gregoriadis, 1995). В связи с этим, нельзя исключить, что на фоне длительного введения МОЛ происходило обновление липидного состава потенциальных субстратов ПОЛ - липопротеидов крови и мембранных структур стриатума. Возможно это способствовало интенсивному обороту липидов, и как следствие, элиминации их окисленных форм из крови и поврежденных структур стриатума.

Для того чтобы установить, возможно ли принципиально, влияние липидов МОЛ на обмен фосфолипидов (ФЛ) в стриатуме в норме и при ПС, проводили количественное исследование спектра ФЛ в стриатуме после введения липосомальных форм.

Показано, что общее содержание ФЛ не изменялось при любых условиях экспериментов. Введение МФТП сопровождалось увеличением только фосфатидилинозитов (ФИ) и фосфатидных кислот (ФК). С непосредственным влиянием липидов МОЛ. как в условиях нормы, так и при ПС, было связано достоверное снижение уровня ФИ (при ПС до уровня нормы), фосфатидилхолинов (ФХ), фосфатидилэганоламинов (ФЭА) и сфингомиелинов (СМ), также увеличение содержания ФК в стриатуме. Обнаруженные изменения в содержании отдельных ФЛ, к в особенности количественно разнонаправленные изменения в содержании ФХ и ФК, могли быть косвенным свидетельством в пользу модулирующего влияния липидов МОЛ на обновление и обмен мембранных ФЛ стриатума (Флеров, Толстухина, 1992; Robinson et al., 1992). Собственно с действием L-DOPA (50 мг/кг) при ПС было связано небольшое увеличение ФИ и ФК. которое на фоне введения липосомальной формы L-DOPA (5 мг/кг). маскировалось более выраженным влиянием на эти параметры липосомальных липидов.

Свойства липосом оказывать терапевтическое действие при патологических состояниях, модифицировать дипидный состав клеточных мембран и изменять функциональную активность клеток были продемонстрированы в ряде исследований (Sandra et

al., 1981; Бородин и др., 1985; Thal et al., 19X6; Иванова и др. 1990; Крсйнес и др., 1990; Aurelli et а!., 1990; Лескова, Удопиченко, 1991; Slack et al., 1992).

Изменения в содержании ФЛ в стриатуме, обнаруженные под влиянием МОЛ можно рассматривать как универсальные, так как они не связаны с развитием патологического процесса а нигростриатной системе. Известно, что ФЛ и их метаболиты способны оказывать локальную регуляцию фазового состояния и микровязкости аннуляр-ного липидного окружения рецепторов, каналов и мембраносвязанных ферментов (Сергеев, Шимановский, 1987; Cohen, Muller, 1992; Белоконева, Зайцев, 1993), а также модулировать изменение активности клеток в целом (Радченко, 1991; Авдонин, Ткачук 1994). В связи с этим, нельзя исключить, что обнаруженное свойство "пустых" МОЛ модулировать увеличение уровня ГВК в стриатуме, как в норме, так и при ПС (см. III) могло быть результатом этих влияний. Уменьшение ТБКП под влиянием МОЛ при ПС, но не в условиях нормы (табл. 1), могло быть одним из следствий обновления мембранных структур стриатума именно на чюне усиления свободнорадикальных процессов и функциональной недостаточности антиоксидантных систем, наблюдаемых при введении МФТП (Cleeter et al., 1992; Oishi et al., 1993; Гуляева, Ерин, ¡995). В целом, высказываемые предположения не противоречат логике, однако для точного выяснения последовательности биохимических изменений и соответствующих им молекулярных событий, лежащих в основе терапевтической эффективности "пустых" МОЛ при ПС (см. II) требуются дополнительные исследования.

V. КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА РОЛИ ЛИПОСОМ В ПРОНИКНОВЕНИИ КАТЕХОЛAM 1111 OB В МОЗГ

Антипаркинсоническая эффективность ДА, заключенного в МОЛ, и его способность частично компенсировать дефицит ДА, ДОФУК и ГВК в стриатуме (см. II и III) -убедительные биологические доказательства способности липосом обеспечивать проникновение ДА в мозг, который самостоятельно в физиологически значимых количествах (не более 0,5% от введенной дозЫ) через ГЭБ не проникает (Oldendorf, 1971). Однако эти результаты не позволяют количественно оценить участие липосом в процессе проникновения катехоламинов в мозг. В связи с этим, было проведено исследова- , ,• ние динамики проникновения в стриатум в/б введенной липосомальной (5,6 мг в 500 мг липидов/кг) и свободной (37,5 мг/кг) форм 3,4-диоксибензиламина (ДОБА). Использование ДОБА в качестве альтернативного маркера проникновения катехоламинов в мозг не противоречит логике, так как он, будучи структурным аналогом ДА, не образуется в процессе метаболизма катехоламинов, не метаболизируется в тканях мозга (Arakawa et al, 1983) и легко обнаруживается методом ЮЖХ (Bruntlett, 1980). Количественные параметры МОЛ с ДОБА были близки к таковым для МОЛ с ДА.

■ 1 □ 2 3 -0-4

Ряс. 4. Динамика изменения содержания ДОБА в стриатуме мышей С57В1./6 после его однократного в/б введения в свободной (37,5 мг/кг) и липосомальной форме (5,6 мг/кг). Размер МОЛ из яФХ и Ход - 60 нм. По оси абсцисс: время, ч. По левой оси ординат: уровень ДОБА в процентах от введенной дозы (столбики)- По правой оси ординат: уровень ДОБА в иг на 1 мг белка (лшшм). Форма введения ДОБА: 1, 3 - в растворе; 2,4 - в МОЛ.

Таблица 2. Кинетические параметры, характеризующие проникновение в стриатум свободного и заключенного в МОЛ ДОБА.

Кинетические параметры МОЛсДОБА Раствор ДОБА

кк, мин' 4x10"4 4,1x10-«

К«,, мл хмг'1 хмин' 2,97x10-' 2,88x10-»

МЛ ХМКМ'2ХМ1Ш~' 5,94x10-'4 5,76x10-'-8

*Км-т, число МОЛ хмг' хмин' 6x107 6,5x10«

*Км..ч, число МОЛхмкм'3 хмин' 12 1,3

*Км-эид, число МОЛ на 1 эндотелиоцит хмин' 1177 131

*Рзшд, % от площади поверхности эндотелия, занятый МОЛ хмин'1 3,33 0,37

К», пмольДОБА хг'хмин1 48,97 5,45

Примечание. * - кинетические параметры, характеризующие проникновение в стриатум свободного ДОБА, рассчитаны как МОЛ-эквивалент.

Как видно из рис. 4, проникновение в стриатум лнпосомальной формы ДОБА значительно более эффективно, по сравнению с 7-кратно большей дозой свободного ДОБА. Максимальное содержание ДОБА после его введения в МОД наблюдалось уже через 15 мин (2,75%) и, сохраняясь на этом уровне до 1,5 ч, было в 55 раз выше в % от введенной дозы и в 30 раз - в нг/мг белка, чем после введения свободного ДОБА. Содержание ДОБА, вводимого в растворе, со следовых количеств возрастало до 0,25% только через 3 ч.

Вычисление кинетических параметров, характеризующих скорость проникновения ДОБА в стриатум показало, что доля общего объема внутрисосудистой жидкости, которая обменивается ДОБА с внесосудистым пространством мозга (квх);объем крови, обменивающийся ДОБА с 1 мг ткани мозга (К„) и с I мкм3 внутренней поверхности капилляров (КоЧ-ь), при заключении препарата в МОЛ, превышают таковые для свободного ДОБА в 100 раз (табл. 2). Вычисление кинетических параметров, которые, справедливы только для применявшихся в данном эксперименте доз ДОБА, обнаружило 10-кратное количественное преимущество проникновения ДОБА в стриатум для его лнпосомальной формы (К„) и позволило наглядно показать, сколько липосом проникало в стриатум в перерасчете на массу ткани (Кк-щ), на площадь поверхности капилляров (К^.ь) и на 1 клетку эндотелия (Км-з>и) в 1 мин (табл. 2).

В целом, полученные результаты позволили количественно оценить преимущества динамики проникновения липосомальных форм катехоламинов в мозг и вклад липосом в кинетику их проникновения через ГЭЬ.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что выраженное подавление характерных паркинсонических симптомов у мышей С57ВЬ/6 при системном (внутрибрюшинном) применении малых доз ЮОРА (5 мг/кг) и дофамина (3,5 мг/кг), инкапсулированных в липосомы, происходит только при их длительном введении (7-14 сут), но в отличие от 10-кратно больших доз свободного ЮОРА, действующего в течение 1 часа, и полностью неэффективного дофамина, применение заключенных в липосомы моиоаминов позволяет пролонгировать антипаркинсонический эффект до 5 часов.

2. Показано, что антипаркинсоническая эффективность длительно вводимых липосомальных форм 1_-ООРА и дофамина коррелирует с частичной компенсацией дефицита уровня дофамина (ДА), его внеклеточного метаболита - гомованилиновой кислоты (ГВК) и внутриклеточного - диокслфенилуксусной кислоты (ДОФУК), а также сопровождается увеличением интенсивности внутринейронального (ДОФУК/ДА) и постсекреторного (ГВК/ДА) метаболизма дофамина в стриатуме.

3. Обнаружено, что биохимические изменения в обмене катехоламинов в стриа-туме мышей с паркинсоническим синдромом - увеличение содержания ДОФУК и ГВК относительно ДА, наблюдаются уже при однократном введении малой дозы заключенного в липосомы ЮОРА, но выраженность этих изменений недостаточна для коррекции экстрапирамидпых нарушений двигательной активности.

4. Выраженное антипаркинсоническое действие и возможность частичной компенсации дефицита ДА и его метаболитов в стриатуме, наблюдаемые при применении малых доз Ь-БОРА и ДА, заключенных в липосомы, доказывают способность липосом эффективно удерживать ЮОРА и ДА в процессе их транспортировки в мозг и обеспечивать проникновение моноаминов через ГЭБ. Установлено, что скорость проникновения липосомальной формы катехоламинов в стриатум (на примере их абиогенного аналога - диоксибензиламина) в 100 раз превышает таковую для свободной.

5. Обнаружено, что сама транспортная липосомальная форма способна потенцировать антипаркинсоническое действие заключенных в везикулы ЮОРА и ДА: частично компенсировать дефицит двигательной активности, оказывая модулирующее влияние на обмен фосфолипмдов в стриатуме, которое сопровождается снижением уровня конечных продуктов ПОЛ и увеличением концентрации ГВК - показателя секреции ДА. Показано, что увеличение выживаемости и предотвращение снижения массы тела у животных с МФТП-индуцированным паркинсоническим синдромом связано с непосредственным действием транспортной липосомальной формы, но не с Ь-ООРА и ДА.

6. Установлено, что в условиях физиологической нормы "пустые" МОЛ не вызывают отклонений в двигательной активности мышей и не провоцируют токсических реакций и гибели животных, но как и при паркинсоническом синдроме способны оказывать модулирующее влияние на обмен фосфолипидов и увеличивать содержание ГВК в стриатуме.

7. Исследование свойств 5% дисперсии липосом из яичного фосфатидилхолина и холестерина (7:3, мольно) с размерами 60 нм позволило установить, что степень включения в них ЮОРА и дофамина ограничена внутренним объемом везикул и не превышает 12-15%, но при этом моноамины не нарушают ламеллярной упаковки липидов в липосомах и как минимум 3 суток удерживаются внутри везикул. Обнаружено, что в процессе хранения ЮОРА и дофамин, инкапсулированные в липосомы, окисляются медленнее, чем их свободные формы и ингибируют перекисное окисление липосомаль-ных липидов.

CmiCOK PAEOT, OnyBJIHKOBAHIIWX no TEME/1HCCEPTALIIIH ,

1. Liposomes containing L-DOPA in experimental parkinsonian syndrome // Abstr. of the 4th IBRO World Congress of Neuroscience Kyoto, Japan. - 1995. - P. 530. (Co-authors. V.G. Kucheryanu, G.N. Kryzhanovsky, E.V. Nikushkin, A.P. Kaplun, V.I. Shvetz).

2. Effect of liposomes containing L-DOPA on mice behavioural in experimental parkinsonian sindrome II Pharmacological Research. - 1995. - Vol.31, Suppl.- P. 106. (Coauthors. V.G. Kucheryanu, G.N. Kryzhanovsky, E.V. Nikushkin, A.P. Kaplun, V.I. Shvetz).

3. Effect of liposomes containing L-DOPA on striatum dopamine metabolism in experimental parkinsonian sindrome // Ibid. - P. 109. (Co-authors. V.S. Kudrin, V.G. Kucheryanu, G.N. Kryzhanovsky, E.V. Nikushkin, A.P. Kaplun, V.i. Shvetz., N.V. Borisova).

4. The comparative effect of liposome-encapsulated L-DOPA and non-encapsulated L-DOPA on experimental parkinsonian syndrome //Abstr. of the 4-th Liposome Research Days Conference, Freiburg, Germany. - 1995. - P. 9. (Co-authors. V.G. Kucheryanu, E.V. Nikushkin, Yu.G. Sandalov, M.M. Borduikov, A.P.Kaplun, V.I. Shvets, G.N. Kryzhanovsky).

5. The influence of liposome-encapsulated L-DOPA on striatum dopamine metabolism in mice with experimental parkinsonian syndrome // Ibid. - P. 10. (Co-authors. V.S. Kudrin, V.G. Kucheryanu, E.V. Nikushkin, A.P. Kaplun, G.N. Podgorniy, V.I. Shvets, G.N. Kryzhanovsky).

6. Behavioral abnormalities and dopamine-serotonin interactions in parkinsonian syndrome treated with L-DOPA encapsulated in liposomes II Behavioural Pharmacology - 1996. -Vol. 7, Suppl. - P. 124. (Co-authors. V.G. Kucheryanu, E.V. Nikushkin, G.N. Kryzhanovsky. Yu.G. Sandalov, A.P. Kaplun).

7. Do liposomes protect L-DOPA from peripheral decarboxylation in parkinsonian mice? // In: Progress in drug delivery systems, ed. by F. Hirota & al., Biomedical Recearch Foundation, Tokyo. - 1996. - Vol. 5, October 1. - P. 171-174. (Co-authors. V.G. Kucheryanu, G.N. Kryzhanovsky, V.S. Kudrin, J.V. Zhigaltsev, E.V. Nikushkin, A.P. Kaplun, Y.G. Sandalov).

8. Application of liposome-encapsulation of dopamine to the correction of extrapyramidal disorders in parkinsonian mice// Ibid. - P. 179-182. (Co-authors. V.G. Kucheryanu, G.N. Kryzhanovsky, I.V. Zhigaltsev, E.V. Nikushkin, A.P. Kaplun, V.I.Shvets).

9. DOPA containing liposomes'. Reciprocal oxidation inhibition of EGG phosphatidilcholine (EPC) and L-3,4-dixydxyphenylalanine (DOPA). // Ibid. - P. 175-178. (Co-authors. A.P. Kaplun, I.V. Zhigaltsev, O.V. Bogomolov, N.V. Borisova, V.G. Kucheryanu. M.M. Boruiukov, E.V. Nikushkin, G.N. Kryzhanovsky, V.I. Shvets).

10. Физико-химические свойства липосомных форм Ь-3,4-дигидроксифенилаланина и дофамина // Биоорганич. химия. - 1996. - Т. 22 - N. 10-11. - С. 851-856. (Соавт. Н.В. Борисова, А.П. Каплун, О.В. Богомолов, В.Б. Григорьев, Е.В. Никушкин, Г.Н. Крыжановский, В.И. Швец).

11. Does egg phosphatidilcholine bilayer protect the intraliposomal DOPA and dopamine against the oxidation as the chemical oxygen trap? // Abstr. of conference "Liposome Advances: Progress in Drug and Vaccine Delivery", London, England - 1996. - P. 57. (Coauthors. A.P. Kaplun, N.V. Borisova, I.V. Zhigaltsev, Y.N. Zorikova, V.G. Kucheryanu, G.N. Kryzhanovsky, V.I. Shvets).

12. Влияние липосомальной формы L-DOPA на содержание дофамина, его метаболите! и обмен фосфолипидов в стриатуме мышей с экспериментальным паркинсонический синдромом // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 1996. - Т. 122 - N. 12. - С. 614-617 (Соавт. Г.Н. Подгорный, В.Г. Кучеряну. B.C. Кудрин, Е.В. Никушкин. И.В. Жи гальцев, Ю.Г. Сандалов, А.П. Каплун, В.И. Швец, Г.Н. Крыжановский).

13. Влияние L-DOPA и его липосомальной формы на развитие паркинсонического син дрома у мышей II Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 1997. - Т. 123 - N. 1. - С. 29-33 (Соавт. В.Г. Кучеряну, Г.Н. Крыжановский, Е.В. Никушкин, И.В. Жигальцев, А.П Каплун, В.И. Швец),

14. Влияние длительного парентерального введения липосом и L-DOPA, заключенной в липосомы на обмен дофамина и его метаболитов в стриатуме мышей с экспери ментальным паркинсоническим синдромом // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 1997. Т. 123 - N. 2. - С. 150-153. (Соавт. В.Г. Кучеряну, B.C. Кудрин, И.В. Жигальцев, Е.В Никушкин, Ю.Г. Сандалов, А.П. Каплун, В.И. Швец).

15. Окисление в липосомах из яичного фосфатидилхолина, нагруженных L-3,4 дигидроксифенилаланином (DOPA) (и допамином): взаимное влияние компонентое // Биоорганич. химия. - 1997. - Т. 23, N 4. - С. 289-294. (Соавт. А.П. Каплун, Н.В. Бс рисова, О.В. Богомолов, И.В. Жигальцев. В.Г. Кучеряну, Г.Н. Крыжановский, Е.Е Никушкин, В.И. Швец).