Автореферат и диссертация по медицине (14.03.04) на тему:Экспериментальная оценка эффективности рекомбинантного интерлейкина-1β при токсической лейкопении

аичоы^-'—

На правах рукописи

ШИЛОВ Юрий Владимирович

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРЛЕЙКИНА-1Р ПРИ ТОКСИЧЕСКОЙ ЛЕЙКОПЕНИИ

14.03.04 - токсикология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт- Петербург 2010

2 2 тол ?ою

004608825

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ

Научный руководитель: доктор медицинских наук профессор Гребенюк Александр Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор Козяков Владимир Павлович

доктор медицинских наук профессор Щербак Сергей Григорьевич

Ведущая организация:

ФГУН «Институт токсикологии» ФМБА России

Защита диссертации состоится " 24 " сентября 2010 года в часов па заседании диссертационного совета Д 215.002.11 при ФГОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ (194044, Санкт-Петербург, ул. Лебедева, 6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГОУ ВПО «Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова» МО РФ.

Автореферат разослан " <( " ¿СсС^Л* 2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук профессор

Головко Александр Иванович

Актуальность. Одной из актуальных проблем военной и экстремальной медицины является разработка новых средств и методов лечения поражений цитотоксическими ядами [Бонитенко Ю.Ю. и др., 2004; Белевитин А.Б. и др., 2008]. Цитотоксиканты - большая группа высокотоксичных веществ, включающая боевые отравляющие вещества (иприт, люизит, ипритно-люизитные смеси), некоторые промышленные агенты (бензол, этиленоксид, тринитротолуол и др.), лекарственные препараты (циклофосфамид, 5-фторурацил, триметамин, азатиопрнн и др.).

Остается вероятность поражения; людей боевыми отравляющими веществами. Это связано, с одной стороны, с тем, что не все страны присоединились к «Конвенции о запрещении разработки, производства, накопления и применения химического оружия и о его уничтожении» (1993), что делает возможным его применение при межгосударственных конфликтах. С другой стороны, перед странами, ратифицировавшими Конвенцию, стоит задача по уничтожению имеющихся запасов химического оружия, что так же может привести к появлению пораженных при аварийных ситуациях [Рембовский В.Р., 2007; Филатов Б.Н. и др., 2007]. Не стоит забывать о десятках тысяч тонн отравляющих веществ кожно-нарывного действия, захороненных в акваториях Атлантического океана, Баренцева, Белого, Северного, Балтийского и Японского мерей [Tornes J., 2002]. С ростом хозяйственной деятельности по освоению минеральных и биологических ресурсов морей и океанов растут и риски поражения людей в результате контакта с затопленным химическим оружием [Белевитин А.Б. и др., 2009].

При интоксикации ипритом развиваются не только местные поражения, но и, вследствие его резорбтивного действия, угнетение кроветворения, центральной нервной системы, нарушения кровообращения, пищеварения, всех видов обмена веществ, терморегуляции и т.д. [Черкес А.И. и др., 1964]. Изменения в крови при отравлении ипритом обусловлены, с одной стороны, непосредственным действием на клетки костного мозга и зрелые форменные элементы, с другой - общим развитием патологического процесса в организме отравленного [Куценко С.А., 2004; Ghanei М., Vosoghi А., 2002]. Динамика нарушений со стороны системы крови напоминает картину, наблюдаемую при поражении ионизирующим излучением, поэтому иногда данный эффект называется «радиомиметическим» [Голиков С.Н., 1972; Albert А., 1979].

К началу XXI века терроризм вошел в число основных транснациональных угроз существования и развития современной цивилизации. Не исключена при этом и возможность применения веществ цитотоксического действия в качестве поражающих агентов при террористических атаках или диверсиях [Андреев В.Г., 2004; Шилов В.В., Сосюкин А.Е., 2005; Saladi R.N. et al., 200.'»].

С каждым годом растет химическое производство и промышленность. Вероятными последствиями выброса больших объемов аварийно опасных химических веществ могут стать поражения не только обслуживающего г ерсонала и сотрудников предприятий, но и людей, находящихся на

значительном расстоянии от места выброса. Одним из синдромов, который может формироваться под действием химических веществ у пораженных при аварийных ситуациях, является цитопенический синдром [Бонитенко Ю.Ю., Никифоров A.M., 2004; Гребенюк А.Н. и др., 2007; Каспаров A.A. и др., 2008].

Химиотерапия рассматривается как один из основных методов лечения злокачественных новообразований. Однако применение противоопухолевых препаратов сопровождается широким рядом побочных эффектов, один из которых - миелодепрессия [Калинина Н.М. и др., 2008; Lyman G.H., Kuderer N.M., 2003]. Лейкопения, развивающаяся у онкологических больных на фоне химиотерапии, является одним из определяющих факторов возможности дальнейшего противоопухолевого лечения. Риск развития инфекционных осложнений заставляет снижать интенсивность химиотерапии, что негативно сказывается на продолжительности и эффективности противоопухолевого лечения [Schiffer С.A. et al., 1996; Caggiano V. et al., 2005].

В связи с этим с особой остротой встает проблема разработки новых средств лечения поражений цитотоксикантами. Весьма перспективным для защиты организма от миелодепрессии представляется применение средств, повышающих неспецифическую резистентность организма и оказывающих стимулирующее влияние на гемо- и иммунопоэз. Таким действием обладают цитокины - эндогенные медиаторы, посредством которых работа различных клеток гемопоэтической системы становится скоординированной и регулируемой [Кетлинский С.А., Симбирцев A.C., 2008]. Именно эти свойства цитокинов открыли возможность целенаправленного воздействия на систему гемопоэза при лечении многих патологических состояний [Симбирцев A.C., Попович A.M., 1996; Романова Е.С. и др., 2000, 2002; Михайлова Н.Б. и др., 2003; Nemunaitis J. et al., 1994; Arpinati M. et al., 2000; Koukourakis M., Giatomanolaki A., 2000; Thomas J. et al., 2002; Krol J., 2006]. В настоящее время антидоты к боевым отравляющим веществам типа иприт и промышленным цитотоксикантам не разработаны, а для коррекции лейкопении, развивающейся на фоне химиотерапии, используют препараты, относящиеся к группе колониестимулирующих факторов: нейпоген, граноцит, лейкомакс и др. [Vellenga Е. et al., 1994; Larson R.A. et al., 1998; Vogel C.L. et al., 2005]. Их применение достоверно снижает длительность и глубину лейкопении, развивающейся на фоне лечения цитостатиками [Болотина Л.В. и др., 2006; Воробьев А.И и др., 2006; Толкушин А.Г., Моисеева Т.Н., 2008; Okamura J., 1992; Steward W.P., 2000]. Однако дороговизна вышеуказанных препаратов, развитие побочных эффектов при их применении предполагают дальнейший поиск лекарственных средств, лишенных этих недостатков и обладающих выраженным стимулирующим действием на миелоцитарный росток кроветворения.

Особый интерес в этом плане представляют препараты интерлейкина-lß - ключевого медиатора гемопоэза, регулирующего процессы пролиферации и дифференцировки, а также функциональную

активность клеток иммунной и гемопоэтической систем [Абрамов В.В., Абрамов Т.Я., 2007; Кетлинский С.А., Симбирцев A.C., 2008; Dinarello С.А., 1994]. Исследования последних лет показали способность интерлейкина-lß (ИЛ-lß) восстанавливать нарушенное вследствие радиационного и токсического воздействия костномозговое кроветворение [Гершанович МЛ. и др., 1998, 2000; Симбирцев A.C., 2001; Рождественский Л.М., 2002; Михайлова Н.Б., 2003; Гребенгок А.Н., и др. 2005; Crown J., 1991; Neta R„ 1997]. Однако вопрос о терапевтической эффективности ИЛ-Iß при лейкопеническом синдроме, формируемом цитотокснкантами в высоких дозах, не решен, что требует проведения дальнейших исследований.

Целью исследования явилась экспериментальная оценка эффективности рекомбинантиого интерлейкина-lß для лечения лейкопенического синдрома, вызванного цитотоксикантами.

Для реализации поставленной цели предстояло решить следующие основные задачи исследования:

1. Исследовать влияние лечебного применения интерлейкина-lß на показатели выживаемости мышей в условиях воздействия 5-фторурацила, циклофосфамида и 2.2-дихлордизтилсульфида в дозах ог 0,7 до 1,3 ЛД50.

2. Разработать модель токсической лейкопении у мелких лабораторных животных при отравлении веществами с различными механизмами цитотоксического действия.

3. Выявить особенности динамики клеточного состава периферической крови и функционально-метаболического состояния нейтрофилов крыс после введения 5-фторурацила, циклофосфамида и 2.2-дихлордиэтилсульфида без лечения и на фоне терапии интерлейкином-lß.

4. Провести сравнительную оценку эффективности применения интерлейкина-lß и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора по показателям клеточности органов кроветворения, количества и функциональной активности иммунокомпетентных клеток у животных, подвергнутых воздействию 5-фгорурацила.

Научная новизна. Е!первые проведена комплексная оценка эффективности применения ИЛ-lß в различных схемах при токсических лейкопениях. Показано, что применение ИЛ-lß через 24 ч после введения 5-фторурацила, циклофосфамида и 2.2-дихлордиэтилсульфида обладает более выраженным терапевтическим эффектом, чем его применение через 1 ч после введения цитотоксикантов.

Показано, что ИЛ-lß при его применении через 1 ч после введения 5-фторурацила, циклофосфамида и 2.2-дихлордиэтилсульфида не влияет на выживаемость, среднюю продолжительность жизни погибших животных, глубину и длительность лейкопении, функционально-метаболический статус нейтрофилов, а порой даже ухудшает эти показатели. Применение ИЛ-lß через 24 ч после цитотоксикантов снижает летальность затравленных животных, уменьшает глубину и длительность лейкопенического синдрома,

способствует более быстрому восстановлению содержания гликогена, активности миелопероксидазы и щелочной фосфатазы в нейтрофилах периферической крови.

Выявлено, что при использовании ИЛ-1Р для коррекции токсической лейкопении, вызванной введением 5-фторурацила, клеточность органов кроветворения, число стволовых клеток и зрелых форм гранулоцитов в косном мозге и селезенке, спонтанная и митоген-индуцированная пролиферативная активность спленоцитов у отравленных мышей на 7 сут после введения токсиканта была выше, чем аналогичные показатели у животных, леченных препаратом гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ).

Практическая значимость. Разработаны модели лейкопенического синдрома у мелких лабораторных животных (крыс), формируемого с помощью 5-фторурацила, циклофосфамида и 2.2-дихлордютилсульфида. Экспериментально обоснована целесообразность использования терапевтического введения ИЛ-1Р с целью уменьшения глубины и продолжительности лейкопенического синдрома, инициированного действием цитотоксических агентов, а также для восстановления функционально-метаболического статуса нейтрофилов и показателей специфического иммунитета. Определено время эффективного применения интерлейкина-1Р для коррекции токсической лейкопении, вызванной введением 5-фторурацила, циклофосфамида и 2.2-дихлордиэтилсульфида.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Применение интерлейкина-1р через 24 ч после 5-фторурацила, циклофосфамида и 2.2-дихлордиэтилсульфида в дозах, вызывающих интоксикацию тяжелой степени, увеличивает выживаемость лабораторных животных, снижает длительность и глубину лейкопении и способствует восстановлению функционально-метаболического статуса нейтрофилов периферической крови.

2. Препарат интерлейкина-1р при лейкопеническом синдроме, вызванном введением 5-фторурацила, позволяет более эффективно восстановить количество и функциональную активность клеток гемопоэтической и иммунной систем, чем препарат гранулоцитарного колониестимулирующего фактора.

Реализация результатов исследования. Результаты, полученные в ходе диссертационного исследования, используются в учебном процессе и научно-исследовательской работе на кафедре военной токсикологии и медицинской защиты Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова, а также в научной деятельности лаборатории иммунофармакологии Государственного научно-исследовательского института особо чистых биопрепаратов ФМБА России. Кроме того, результаты исследования реализованы при подготовке методических указаний «Профилактика,

клиника, диагностика и лечение острых отравлений в войсках» (М.: ГВМУ МО РФ, 2010).

В процессе выполнения диссертационного исследования подано и принято к использованию 4 рационализаторских предложения.

Апробация работы. Результаты исследования доложены на Российской научной конференции «Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии» (Санкт-Петербург, 2008), 3-м Всероссийском съезде токсикологов (Москва, 2008), 3-й международной научной конференции «Экспериментальная и клиническая фармакология» (Минск, 2009), Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы взаимодействия медицинских служб Вооруженных сил в условиях современных вызовов и угроз» (Светлогорск, 2009), научно-практической конференции «Химическая безопасность Российской Федерации в современных условиях» (Санкт-Петербург, 2010).

Связь диссертационного исследования с плановом тематикой научно-исследовательской работы учреждения. Исследование выполнялось в соответствии с плановой тематикой научно-исследовательских работ Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (темы НИР № УМА 02.02.06.1012/0203 шифр «Лейкин», УМА 02.02.02.0709/0228 шифр «Балтика»).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикации основных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата наук.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 160 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. В диссертации представлены 21 таблица и 14 рисунков. Список литературы содержит 151 библиографический источник, из них 59 отечественных и 92 иностранных публикации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные исследования проведены на 592 мышах-самцах (432 белых беспородных и 160 гибридах СВА х С57В1 первого поколения) массой 18-20 г и на 159 белых беспородных крысах-самках массой 220-240 г, полученных из питомника РАМН "Рапполово" (пос. Рапполово Ленинградской обл.). Животные в ходе исследования находились на обычном виварном режиме. Экспериментальные исследования с их использованием

проводились согласно требованиям Приказа Министра здравоохранения СССР от 12.08. 1977 г. № 755 "О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использонанием экспериментальных животных" и Приказа Министра здравоохранения РФ от 19.06. 2003 г. № 267 "Об утверждении правил лабораторной практики".

В качестве цитотоксикантов в работе использовали 5-фторурацил (фармакопейный препарат «5-Фгорурацил-Эбеве» производства EBEWE Pharma, Австрия), циклофосфамид (фармакопейный препарат циклофосфамида «Эндоксан» производства Baxter Oncology, Германия) и химически чистый 2.2-дихлордиэтилсульфид.

Препарат «5-Фторурацил-Эбеве» (5-ФУ) экспериментальным животным вводили внутрибрюшинно в дозах 50, 100, 150, 200, 225, 250, 275 и 300 мг/кг. Рабочий раствор 5-ФУ готовили непосредственно перед его введением, для чего фармакопейный препарат разводили водой для инъекций до нужной концентрации из расчета 0,1 мл на 10 г веса для мышей и 0,5 мл на 100 г веса для крыс.

Препарат «Эндоксан» (ЦФ) экспериментальным животным вводили внутрибрюшинно в дозах 25, 50, 100, 200, 450, 500, 550 и 600 мг/кг. Рабочий раствор ЦФ готовили непосредственно перед его введением, для чего фармакапейный препарат разводили физиологическим раствором до нужной концентрации из расчета 0,1 мл на 10 г веса для мышей и 0,5 мл на 100 г веса для крыс.

2.2-дихлордиэтилсульфид (2.2-ДХДЭС) экспериментальным животным вводили Подкожно в основание складки области пояса передних конечностей в дозах 0,4; 0,8; 1,6; 3,2; 5,0; 6,0 и 8,0 мг/кг. Рабочий раствор готовили непосредственно перед введением путем растворения в глицерине из расчета 0,1 мл на 10 г веса для мышей и 0,1 мл на 100 г веса для крыс.

В работе использовался рекомбинантный ИЛ-Iß человека производства Государственного научно-исследовательского института особо чистых биопрепаратов ФМБА России (Санкт-Петербург). Препарат экспериментальным животным вводили внутрибрюшинно в дозе 50 мкг/кг (1 мкг/особь) через 1 ч или 24 ч после введения цитотоксикантов, разведенным в 0,2. мл физиологического раствора. Также использовался рекомбинантный негликозилированный гранулоцигарный колониестимулирующий фактор «Филграстим» («Neupogen®») производства F.Hoffmann-La Roche Ltd (Швейцария). Препарат экспериментальным животным вводили подкожно в дозе 200 мкг/кг (4 мкг/особь) через 24 ч после введения цитотоксикантов, разведенным в 0,2 мл 5% раствора глюкозы. Животным контрольных групп вместо изучаемого препарата вводили растворитель по той же схеме и в те же сроки, что и животным опытных групп.

Оценку эффективности ИЛ-lß в качестве средства терапии поражений цитотоксикантами проводили в экспериментах на мышах и крысах.

На первом этапе исследований оценивали лечебную эффективность ИЛ-lß по критериям выживаемости и средней продолжительности жизни мышей, подвергнутых воздействию 5-ФУ, ЦФ и 2.2-ДХДЭС. По итогам 30-ти

суточного наблюдения рассчитывали процент павших и выживших особей, коэффициент терапевтической эффективности для препарата, а также среднюю продолжительность жизни погибших в результате токсического воздействия животных.

На втором этапе моделировали лейкопенический синдром путём введения крысам 5-ФУ, ЦФ и 2.2-ДХДЭС. Выраженность лейкопении оценивали по динамике общего числа лейкоцитов, абсолютного содержания лимфоцитов и нейтрофилов периферической крови.

На третьем этапе в экспериментах на крысах изучали возможность ИЛ-lß купировать лейкопенический синдром, развивающийся после введения вышеуказанных цитотоксикантов. Схема экспериментальной оценки терапевтической эффективности изучаемого препарата включала последовательное изучение динамики клеток циркулирующего пула периферической крови и измененнй функционально-метаболического статуса нейтрофилов.

На заключительном этапе в экспериментах на мышах оценивали влияние ИЛ-Iß на клеточность органов кроветворения, количество и функциональную активность иммунокомпетентных клеток у животных, подвергнутых воздействию 5-ФУ. В качестве препарата сравнения, обладающего способностью ускорять, восстановление числа лейкоцитов, использовали Г-КСФ.

Общее количество лейкоцитов определяли меланжерным методом с последующим подсчетом клеток в камере Горяева. Для исследования лейкоцитарной формулы применяли способ быстрой окраски мазков крови краской Романовского [Альтгаузен А.Я., 1964].

Цитохимическое определение миелопероксидазы проводили по методу R.K. Root (1974) при помощи набора реагентов Диахим-ЦитоСтейн-МПО. Интрацеллюлярное выявление щелочной фосфатазы осуществляли методом азосочетания [Kaplow L.S., 1955] при помощи набора реагентов Диахим-ЦитоСтейн-ЩФ. Цитохимическое выявление гликогена в нейтрофилах периферической крови проводили методом ШИК-реакции [McManus J.F.А, 1962] при помощи набора реагентов Диахим-ЦитоСтейн-ПАС.

Клеточность костного мозга, тимуса и селезенки отравленных животных определяли с помощью гематологического анализатора Abacus Junior Vet (Diatron Ltd, Австрия).

Абсолютное количество и относительное содержание CD3+, CD19+, CD117+, CD4-CD8-, CD4+CD8-, CD4-CD8+, CD4+CD8+, Ly6+CDllb+, Ly6-CDllb+ оценивали с помощью соответствующих моноклональных антител методом проточной цитофлюорометрии [Williams J.J., 1992]. Спонтанную и митоген-индуцированную пролиферативную активность спленоцитов изучали в реакции бласттрансформации путем определения ответа на КонА в дозах 0,25 и 1,0 мкг/мл [Кетлинский С.А., Калинина Н.М., 1998].

Обследование экспериментальных животных с оценкой гематологических, цитохимических и иммунологических показателей

г*

проводили до введения цитотоксикантов, а также каждые 2 сут до 10 дня эксперимента, затем через 3-4 сут до завершения исследования.

Полученные данные подвергали обработке методами вариационной статистики с расчетом среднего значения, ошибки средней и среднего квадратического отклонения. Расчет ЛД50 проводили методом пробит-анализа по Финни. Оценку различий данных, полученных при анализе выборок малого объема, проводили непараметрическими методами с использованием критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Обработка результатов, представленных в относительных единицах, осуществлялась с помощью таблиц B.C. Генеса (1967). Проверку значимости различий в выживаемости леченных и не леченных животных осуществляли с помощью точного метода Фишера. Вероятность р < 0,05 и ниже считали достаточной для вывода о статистической достоверности различий полученных данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В результате проведенных исследований было установлено, что при интоксикации мышей 5-ФУ или ЦФ наиболее эффективным по критериям выживаемости и средней продолжительности жизни погибших животных было применение ИЛ-ip через 2.4 ч после введения цитотоксиканта (табл. 1, табл. 2).

Таблица 1 - Выживаемость (%) и средняя продолжительность жизни (сут) белых беспородных мышей при внутрибрюшинном введении интерлейкина-ip через 1 или 24 ч после применения 5-фторурацила в дозах 225, 250, 275, 300 и 350 мг/кг

Доза, мг/кг Группа Количество животных в Выживаемость за 30 сут, Средняя продолжительность

группе % жизни,_сут

225 (0,8 ЛДзо) Контроль 12 S3 ± 11 9,5 ± 0,5

ИЛ-ф через 1 ч 12 50 ± 15 7,4 ±0,3

ИЛ-ф через 24 ч 12 83 ± 11 8,8 ±0,5

250 (0,9 ЛД50) Контроль 15 67 ±13 8,4 ± 0,2

ИЛ-1р через 1 ч 15 47 ± 13 8,8 ±0,5

ИЛ-ф через 24 ч 15 67 ± 13 8,0 ± 1,2

275 (1,0 ЛДзо) Контроль 16 50 ± 13 7,6 ± 0,7

ИЛ-ф через 1 ч 16 38± 12 9,0 ± 0,4

ИЛ-ф через 24 ч 16 63 ± 12 8,1 ±0,4

300 0,1 ЛДзо) Контроль 17 35 ± 12 7,7 ± 0,5

ИЛ-ф через 1 ч 17 53 ± 12 6,9 ± 1,2

ИЛ-ф через 24 ч 17 65 ±12 9,5 ± 0,4#

350 (1,3 ЛД50) Контроль 18 11 ± 8 8,3 ±0,5

ИЛ-ф через 1 ч 18 22 ± 10 9,5 ± 0,6

ИЛ-ф через 24 ч 18 56 ± 12 Ч 10,4 ±0,9*

*- р < 0,05 по сравнению с 5-ФУ (контролем) # - р < 0,05 по сравнению с группой животных, получивших ИЛ-ф через 1 ч

Применение ИЛ-1(3 через 1 ч после введения 5-ФУ или ЦФ не влияло на выживаемость животных, а порой даже увеличивало их гибель.

Индекс терапевтической эффективности ИЛ-ip, применяемого через 24 ч после введения 5-ФУ или ЦФ, составил 1,27 и 1,28 соответственно. Индекс терапевтической эффективности ИЛ-lf!, применяемого через 1 ч после введения 5-ФУ или ЦФ, составил 0,87 и 0,89 соответственно.

Таблица 2 - Выживаемость (%) и средняя продолжительность жизни (сут) белых беспородных мышей при внутрибрюшинном введении интерлейкина-1 Р через 1 или 24 ч после применения циклофосфамида ____в дозах 450, 500, 550 и 600 мг/кг _______

Доза, мг/кг Группа Количество животных в группе Выживаемость за 30 сут, % ' Средняя продолжительность жизни, сут

450 (0,8 ЛД5„) Контроль 9 88 ± 11 6

ИЛ-1р через 1 ч 9 67 ± 17 4,7 ± 1,8

ИЛ-1(3 через 24 ч 9 88 ± 11 г 10

500 (0,9 ЛД5„) Контроль 9 56 ± 18 4,7 ±3,6

ИЛ-1(1 через 1 ч 9 44 ± 18 6,0 ±2,6

ИЛ-1Р через 24 ч Г 9 44 ± 18 4,3 ± 1,0

550 О.ОЛД50) Контроль 9 67 ± 17 5,7 ± 1,8

ИЛ-1р через 1 ч 9 22 ± 14* 2.3 ± 0,7*

ИЛ-1р через 24 ч 9 67 ± 17 8,0 ± 3,3#

600 (М ЛД5») Контроль 9 11 ± 11 6,1 ± 1,3

ИЛ-1]3 через 1 ч 9 11 ± 11 3.3 ± 1,1*

ИЛ-1В через 24 ч 9 67 ± 17*# 4,0 ±0,9

*- р < 0,05 но сравнению с 5-ФУ (контролем) # - р < 0,05 по сравнению с группой животных, получивших ИЛ-1 (1 через 1 ч

Введение ИЛ-ip на фоне интоксикации 2.2-ДХДЭС не оказывало влияния на выживаемость и среднюю продолжительность жизни погибших животных.

Следующим этапом исследований была разработка модели лейкопенического синдрома на белых беспородных крысах. Лейкопению вызывали парентеральным введением 5-ФУ, ЦФ или 2.2-ДХДЭС. Для дальнейшей оценки терапевтической эффективности ИЛ-1 р использовали модели с лейкопеническим синдромом максимальной длительности и глубины.

5-ФУ вводили однократно внутрибрюшинно в дозах 100, 150, 200 и 250 мг/кг однократно; 100 мг/кг двукратно ежедневно и 50 мг/кг трехкратно ежедневно. По данным предварительных экспериментов при однократном введении 5-ФУ дозе 0,25 ЛД50 соответствовала доза 50 мг/кг, дозе 0,5 ЛД50 -100 мг/кг, дозе 0,8 ЛД50 - 150 мг/кг, дозе 1,0 ЛД50 - 195 мг/кг, дозе 1,1 ЛД50 -200 мг/кг и дозе 1,3 ЛД50 - 250 мг/кг.

Максимальное снижение числа лейкоцитов периферической крови у животных всех групп после введения 5-ФУ отмечалось на 7 сут (рис. 1).

—»- 250 мг/кгоднократно —■ — 150 мг/кг однократно

200 т

—ж—200 мг/кг однократно

*

180 --

О 120 -■

о

¡Í 60 -О

л 40 --

20 --

0

фон 2 4 7 10 13 17 20 23 26 29 Сроки после введения 5-ФУ, сут

Рисунок 1 - Динамика общего числа лейкоцитов периферической крови белых беспородных крыс-самок после внутрибрюшинного введения 5-фторурацила в дозах 150, 200 и 250 мг/кг *- р < 0,05 по сравнению с исходным уровнем

Минимальное число лейкоцитов наблюдалось у животных, получивших 5-ФУ в дозе 250 мг/кг однократно и 100 мг/кг двукратно ежедневно.

Длительность лейкопенического синдрома в среднем составляла 13 сут. У животных, получивших 5-ФУ в дозах 200 или 250 мг/кг однократно, длительность лейкопении составляла около 17 сут.

Динамика числа лимфоцитов и нейтрофилов периферической кроки животных, получивших 5-ФУ, совпадала с изменениями общего числа лейкоцитов. Максимальное снижение также наблюдалось на 7 сут с последующим восстановлением до исходного уровня к 13 сут.

Исходя из полученных на этом этапе данных, для дальнейшей оценки терапевтической эффективности применения ИЛ-ip после введения 5-ФУ мы использовали модель лейкопенического синдрома, формируемого однократным введением 5-ФУ в дозе 250 мг/кг.

Для моделирования лейкопенического синдрома ЦФ вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 200 мг/кг; в дозе 100 мг/кг однократно, двукратно и трехкратно (через день); в дозе 50 мг/кг трехкратно (ежедневно и через день); в дозе 25 мг/кг трехкратно (ежедневно и через день) и пятикратно (через день). По данным предварительных экспериментов при однократном введении ЦФ дозе 0,1 ЛД50 соответствовала доза 25 мг/кг, дозе 0,2 ЛД50 - 50 мг/кг, дозе 0,4 ЛД50 - 100 мг/кг, дозе 0,8 ЛД50 - 200 мг/кг и дозе 1,0 ЛД50 - 250 мг/кг.

Максимальное снижение числа лейкоцитов периферической крови после введения ЦФ у животных отмечалось на 4-6 сут во всех группах. Однако, минимальное число лейкоцитов на 6 сут наблюдалось у животных, получивших ЦФ в дозе 200 мг/кг однократно и 50 мг/кг трехкратно ежедневно.

Длительность лейкопенического синдрома в среднем составляла 10-13 сут. Наибольшая продолжительность лейкопении регистрировалось после введения ЦФ в дозе 200 мг/кг и 50 мг/кг трехкратно ежедневно.

Динамика числа лимфоцитов и нейтрофилов периферической крови животных, получивших ЦФ, совпадала с изменениями общего числа лейкоцитов. Максимальное снижение количества лимфоцитов наблюдалось на 4-8 сут в зависимости от дозы и схемы введения ЦФ. Восстановление числа лимфоцитов до исходного уровня регистрировалось к 13 сут, за исключением животных, получивших ЦФ в дозах 100 мг/кг однократно и 25 мг/кг пятикратно через день, у которых восстановление отмечалось только на 23 сут. Максимальная нейтропения отмечалась на 4-6 сут, а восстановление числа нейтрофилов до исходного уровня происходило к 10-13 сут.

Исходя из этого, для дальнейшей оценки терапевтической эффективности применения ИЛ-1р при интоксикации ЦФ мы использовали модель лейкопенического синдрома, формируемого однократным введением токсиканта в дозе 200 мг/кг.

С целью моделирования лейкопенического синдрома 2.2-ДХДЭС вводили подкожно однократно в дозах 0,4; 0,8; 1,6 и 3,2 мг/кг (рис. 2).

♦ -0,4 мг/кг —х— о,8 мг/кг —я-1,6 мг/кг —*- 3,2 мг/кг

фон 1 3 5 7 9 12 15 18 25 30

Сроки после введения 2.2-ДХДЭС, сут

Рисунок 2 - Динамика общего числа лейкоцитов периферической крови белых беспородных крыс-самок после однократного подкожного введения 2.2-дихлордиэтилсульфида в дозах 0,4; 0,8; 1,6 и 3,2 мг/кг

р < 0,05 по сравнению с исходным уровнем

По данным предварительных экспериментов при однократном введении 2.2-ДХДЭС дозе 0,1 ЛД50 соответствовала доза 0,4 мг/кг, дозе 0,2 ЛД50- 0,8 мг/кг, дозе 0,35 ЛД50 - 1,6 мг/кг и дозе 0,7 ЛД50 - 3,2 мг/кг, дозе 1,0 ЛД50- 4,5 мг/кг.

Максимальное снижение числа лейкоцитов периферической крови во всех группах отмечалось на 3 сут после введения 2.2-ДХДЭС. Минимальный уровень лейкоцитов отмечался у животных, получивших 2.2-ДХДЭС в дозе 3,2 мг/кг. Длительность лейкопенического синдрома после введения 2.2-ДХДЭС в этой дозе была максимальной и составляла 5 сут. Исходя из этого для дальнейшей оценки терапевтической эффективности применения ИЛ-1 (3 при интоксикации 2.2-ДХДЭС мы использовали модель лейкопенического синдрома, формируемого однократным введением токсиканта в дозе 3,2 мг/кг.

В ходе дальнейших исследований на разработанных моделях лейкопенического синдрома было установлено, что применение ИЛ-ф через 24 ч после цитотоксикантов уменьшает глубину и длительность лейкопенического синдрома, в то время как применение ИЛ-ф через 1 ч не оказывает влияния на лейкопению, а порой даже усугубляет её.

Так, применение ИЛ-ф через I ч после 5-ФУ не оказывало влияния на число лейкоцитов периферической крови по сравнению с контролем. Количество лимфоцитов и нейтрофилов периферической крови не отличалось от аналогичных показателей у животных контрольной группы.

При использовании ИЛ-ф через 24 ч после введения 5-ФУ число лейкоцитов в периферической крови на глубине лейкопении было на 40% больше аналогичного показателя контрольной группы. На 8 сут количество лимфоцитов и нейтрофилов превышало аналогичные показатели у контрольной группы в 1,4 и 2,8 раза соответственно. Восстановление количества лейкоцитов до исходного уровня происходило к 15 сут.

Динамика общего числа лейкоцитов в периферической крови крыс, отравленных ЦФ, без лечения и после введения им ИЛ-ф через 1 или 24 ч после затравки представлена на рисунке 3.

У животных, получавших ИЛ-ф через 1 ч после введения ЦФ, как и у животных контрольной группы к 2 сут количество лейкоцитов периферической крови снижалось до 10% от первоначального уровня, на 4 сут уменьшалось до 0,5% от исходного уровня, а с 6 сут отмечалась тенденция к восстановлению их числа. Восстановление числа лейкоцитов наблюдалось на 10 сут.

Введение ИЛ-1р через 1 ч после введения ЦФ не влияло на число лимфоцитов и нейтрофилов периферической крови по сравнению с аналогичным показателем у животных контрольной группы. Только на б сут отмечалось снижение числа лимфоцитов периферической крови почти в 3 раза по сравнению с уровнем лимфоцитов у животных контрольной группы.

При применении ИЛ-ф через 24 ч после ведения ЦФ число лейкоцитов периферической крови на 2 сут было в 1,8 раза больше, чем в контроле. Максимальная лейкопения также отмечалась на 4 сут, но количество

лейкоцитов было в 3 раза больше аналогичного показателя у животных контрольной группы. Восстановление числа лейкоцитов отмечалось к 12 сут.

—9— Цф —о- ЦФ+ИЛ-1 р через 1ч —о - ЦФ+ИЛ-1 (5 через 24 ч

Сроки после введения ЦФ сут

Рисунок 3 - Динамика общего числа лейкоцитов периферической крози самок-крыс при лейкопеническом синдроме, вызванном циклофосфамидом, после введении интерлейкина-1Р через 1 или 24 ч с момента затравки *- р < 0,05 по сравнению с контролем

Введение ИЛ-1р через 24 ч после ЦФ уменьшало уровень снижения количества лимфоцитов и нейтрофилов периферической крови. Так, у леченных животных, количество лимфоцитов на 2, 4 и 6 сут превышало аналогичный показатель у животных контрольной группы в 1/1-2 раза, а число нейтрофилов было выше показателей контроля на 2 сут в 1,5 раза, на 4 сут в 5 раз, на б сут в 3 раза и на 8 сут в 2 раза.

Применение ИЛ-1Р через 1 ч после введения 2.2-ДХДЭС на 10% увеличивало глубину лейкопении, уменьшая общее число лимфоцитов и не оказывая влияния на количество нейтрофилов периферической крови. Стоит отметить, что введение ИЛ-1Р через 1 ч после токсиканта не предотвращало снижения числа лейкоцитов на 21, 26 и 30 сут. ,

Введение ИЛ-1р через 24 ч после 2.2-ДХДЭС уменьшало глубину лейкопенического синдрома на 30% и сокращало его длительность в 2,5 раза, а также предотвращало развитие повторного снижения числа лейкоцитов через 26 сут после введения токсиканта.

При введении цитотоксикантов изменялось не только количество клеток крови, но и модифицировалось функционально-метаболическое состояние нейтрофилов, что проявлялось снижением содержания гликогена, уменьшением активности миелопероксидазы и щелочной фосфатазы.

В результате проведенных исследовании было установлено, что при применении ИЛ-1 [3 через 24 ч после введения цитотоксикантов в нейтрофилах периферической крови крыс изменения активности миелопероксидазы, щелочной фосфатазы и содержание гликогена были менее выражены. Также наблюдалось бэлее быстрое их восстановление до исходного уровня по сравнению с аналогичными показателями у животных контрольной группы. Применение ИЛ-1Р через 1 ч после введения токсикантов не влияло, а порой даже ухудшало вышеуказанные показатели по сравнению с контролем.

В частности, на 2 сут после введения 5-ФУ активность щелочной фосфатазы у животных контрольной группы и животных, получивших ИЛ-1Р через 1 ч после введения токсиканта, была снижена на 50%. В этот же период у животных, получивших ИЛ-1 р через 24 ч после введения 5-ФУ, активность фермента была снижена только на 35%. В дальнейшем у животных, получивших ИЛ-ф через 1 или 24 ч, отмечалась тенденция к восстановлению активности щелочной фосфатазы, а к 15 сут наблюдения этот показатель возвращался к норме.

Содержание гликогена в нейтрофилах периферической крови на 2 сут после введения 5-ФУ снижалось на 40% у животных контрольной группы и животных, получивших ИЛ-1р через 1 ч после введения токсиканта. У животных, получивших ИЛ-1Р через 24 ч после 5-ФУ, содержание гликогена в нейтрофилах на 2 сут снижалось только на 25%. К 15 сут содержание гликогена в нейтрофилах периферической крови у животных, получивших ИЛ-1р, восстанавливалось до исходного уровня.

Как видно из данных, представленных в таблице 3, применение ИЛ-1Р через 24 ч после ЦФ способствовало увеличению содержания щелочной фосфатазы на 2, 6, 12 и 20 сут, миелопероксидазы на 2 и 6 сут, гликогена на 2, 6 и 20 сут по сравнению с аналогичными показателями у животных контрольной группы. Введение ИЛ-1Р через 1 ч после ЦФ не влияло на уровень миелопероксидазы и гликогена в нейтрофилах периферической крови, однако способствовало снижению активности щелочной фосфатазы на 15% по сравнению с контролем.

Введение 2.2-ДХДЭС к 2 сут приводило к уменьшению содержания гликогена, снижению активности щелочной фосфатазы и миелопероксидазы в нейтрофилах периферической крови на 20%, 25% и 15% от исходного уровня соответственно. Восстановление содержания гликогена и активности ферментов отмечалось на 6 сут.

Применение ИЛ-1)3 через 1 ч после введения 2.2-ДХДЭС не влияло на активность щелочной фосфатазы и миелопероксидазы в нейтрофилах периферической крови по сравнению с аналогичным показателем у животных контрольной группы. Применение ИЛ-1Р через 24 ч после введения токсиканта предотвращало снижение содержания гликогена и активности ферментов в нейтрофилах периферической крови.

В ходе дальнейших исследований была проведена сравнительная оценка эффективности применения ИЛ-1р и Г-КСФ по показателям

Таблица 3 - Содержание щелочной фосфатазы, миелопероксидазы и гликогена в нейхрофилах периферической крови белых беспородных крыс-самок при введении интерлейкина-1 (3 через 1 или 24 ч после затравки

циклофосфамидом в дозе 200 мг/кг, усл. ед.

Показатель Условия эксперимента До ведения Сроки исследования после введения ЦФ, сут

2 | 6 12 20 30

Щелочная фосфатаза ЦФ (контроль) 1,68 ±0,05 1,06 ±0,04 0,65 ±0,04 1,42 ±0,04 1,57 ±0,03 1,63 ±0,03

ЦФ + ИЛ-1р через 1ч 1,73 ±0,03 1,02 ±0,03 0,44 ±0,04* 1,48 ±0,04 1,54 ±0,03 1,68 ±0,03

ЦФ + ИЛ-1Р через 24ч 1,65 ±0,02 1,17 ± 0,04*# 0,77 ± 0,05 Н 1,58 ±0,03* 1,32 ± 0,05*# 1,69 ±0,02

Миело-пероксияаза ЦФ (контроль) 1,35 ±0,04 0,82 ± 0,07 0,62 ± 0,04 1,21± 0,03 1,29 ±0,03 1,33 ±0,03

ЦФ + ИЛ-1Р через 1ч 1,32 ±0,03 0,86 ± 0,05 0,64 ± 0,04 1,27 ± 0,04 1,23 ±0,05 1,31 ±0,05

ЦФ + ИЛ-1 р через 24ч 1,34 х 0,02 1,08 ±0,04*// | 0,81±0,05*# 1,32 ±0,03* 1,28 ±0,03 1,29 ±0,02

Гликоген ЦФ (контроль) 1,47 ±0,04 0,91 ± 0,04 0,72 ± 0,04 1,38 ±0,04 1,43 ±0,04 1,46 ±0,03

ЦФ + ИЛ-1(5 через 1ч 1,47 ±0,03 0,94 ± 0,05 0,75 ± 0,04 1,42 ±0,04 1,42 ±0,03 1,51 ±0,03

ЦФ + ИЛ-1Р через 24ч 1,50 ±0,02 1,13 ± 0,04*" 0,86 ± 0,05*# 1,48 ±0,03* 1,51 ±0,03 1,48 ±0,02

* - р < 0,05 по сравнению с ЦФ (контролем) # - р < 0,05 по сравнению с группой животных, получавших ИЛ-1 р через 1 ч

клеточности органов кроветворения, количества и функциональной активности иммунокомпетентных клеток у животных, подвергнутых воздействию 5-ФУ.

Установлено, что введение 5-ФУ приводило к снижению клеточности селезенки, красного костного мозга и тимуса на 2 и 7 сут (рис. 4).

Применение Г-КСФ через 24 ч после 5-ФУ не влияло на клеточность селезенки и костного мозга по сравнению с контролем. Применение ИЛ-1Р через 1 ч после введения 5-ФУ приводило к снижению клеточности селезенки на 2 сут, а на 7 сут увеличивало клеточность костного мозга по сравнению с аналогичным показателем у животных, получивших Г-КСФ.

В Исходный уровень В 5-ФУ □ 5-ФУ + Г-КСФ через 24 ч

И 5-ФУ + ИЛ-1 р через 1 ч О 5-ФУ + ИЛ-1р через 24 ч

Рисунок 4 - Динамика клеточности красного костного мозга у мышей

гибридов (СВА х С57В1) Р1 при введении интерлейкина-1 Р или гранулоцитарного колониестимулирующего фактора после затравки 5-фторурацилом в дозе 250 мг/кг, млн./кость

• - р < 0,05 по сравнению с группой животных, получавших Г-КСФ

•

Введение ИЛ-1р через 24 ч после 5-ФУ не влияло на клеточность селезенки, но на 7 сут интоксикация увеличивало клеточность костного мозга в большей степени, чем у животных, получивших Г-КСФ.

Г-КСФ не оказывал влияния на количество клеток тимуса на 2 сут, но к 7 сут клеточность тимуса была почти в 2 раза меньше аналогичного показателя у животных контрольной группы.

Применение ИЛ-1р через 1 ч после введения токсиканта на 2 сут приводило к снижению клеточности тимуса на 50%, а на 7 сут - к снижению на 65% относительно аналогичного показателя у животных, получивших

2

Сроки после введения 5-ФУ, сут

7

5-ФУ.

Применение ИЛ-1Р через 24 ч после введения токсиканта не оказывало влияния на глубину снижения клеточности тимуса у мышей после введения 5-ФУ в течение всего срока наблюдения.

Как видно из данных, представленных в таблице 4, введение 5-ФУ приводило к снижению числа СБ117+ клеток в красном косном мозге на 2 сут в 4 раза и росту их количества в 2,5 раза на 7 сут по сравнению с первоначальным уровнем. Также отмечалось снижение количества ранних форм гранулоцитов на 2 сут в 7 раз с последующим восстановлением их числа к 7 сут. Число зрелых гранулоцитов на 2 сут превышало исходный уровень на 66%, однако к 7 сут отмечалось их снижение в 8,5 раз по сравнению с первоначальным количеством.

Применение Г-КСФ через 24 ч после введения 5-ФУ приводило на 2 сут к снижению числа СБ117+ клеток на 45%, а на 7 сут - на 65% по сравнению с числом клеток у животных контрольной группы. Число промежуточных форм гранулоцитов на 2 сут было почти в 3 раза больше аналогичного показателя у контроля. На 7 сут отмечалось снижение количества ранних форм гранулоцитов до контрольного уровня. Количество зрелых гранулоцитов снижалось на 2 сут на 20%, с последующим снижением на 80% к 7 сут.

Таблица 4 - Динамика числа ранних плюрипотентных клеток, промежуточных форм и зрелых гранулоцитов в красном костном мозге мышей гибридов (СВА х С57В1) Р1 при введении интерлейкина-1р или гранулоцитарного колониестимулирующего фактора после затравки 5-фторурацилом в дозе 250 мг/кг, %

Показатель Условия эксперимента До введения Сроки исследования после введения 5-ФУ, сут

2 7

СБ117+ 5-ФУ (контроль) 7,2 ±2,1 1,7 ±0,2 18,5 ±4,2

5-ФУ + Г-КСФ 1,1 ±0,1* 6,2 ±3,2*

5-ФУ + ИЛ- 1Р через 1 ч 2,3 ± 1,7# 16,9 ± 11,7#

5-ФУ + ИЛ-1Р через 24 ч 2,2 + 0,2#" 14,3 ± 8,5#

Ьуб-СШ1+ 5-ФУ (контроль) 17,6 ±3,2 2,5 ± 0,5 17,0 ±6,7

5-ФУ + Г-КСФ 7,2 ±1,6* 14,6 ±3,9

5-ФУ + ИЛ-10 через 1 ч 4,3 ± 0,9*# 26,7 ± 6,9*1?

5-ФУ + ИЛ-1Р через 24 ч 6,4 ± 1,6* 10,1+4,6"

Ьу6+СБ11+ 5-ФУ (контроль) 44,7 ± 9,2 74,5 ±11,5 5,2 ± 4,6

5-ФУ + Г-КСФ 60,3 + 6,1* 1,1 +0,8*

5-ФУ + ИЛ-1Р через 1 ч 69,5 ± 5,2 5,1 ± 3,0#

5-ФУ+ ИЛ-1Р через 24 ч 63,1 ±3,2* 2,3 ± 1,0*

* - р ^ 0,05 по сравнению с 5-ФУ (контролем); # - р < 0,05 по сравненшо с группой животных, получавших Г-КСФ; " - р < 0,05 по сравнению с группой животных, получавших ИЛ-1Р через 1 ч

Применение ИЛ-ф через 1 ч после введения 5-ФУ не влияло на число СП) 17+ клеток косного мозга в сравнении с аналогичным показателем у животных контрольной группы весь период наблюдения. Однако их число было на 2 и 7 сут в 2-2,5 раза больше чем у животных, получивших Г-КСФ. Число промежуточных форм гранулоцитов на 2 сут на 15% было меньше, а на 7 сут почти в 2 раза больше аналогичного показателя у животных, получивших Г-КСФ. На 7 сут количество зрелых форм гранулоцитов было почти в 4 раза больше, чем у животных после введения Г-КСФ.

Применение ИЛ-1(3 через 24 ч после введения 5-ФУ несколько увеличивало количество СО 117+ клеток костного мозга по сравнению с контролем, однако их число превосходило аналогичный показатель у животных, получивших Г-КСФ.

В результате проведенных исследований установлено, что на 2 сут после введения 5-ФУ в селезёнках мышей отмечался рост числа СОЗ+ лимфоцитов на 15% и СО 19+ лимфоцитов на 10%, а также снижение числа зрелых (Ьуб+СОПЬ+) и промежуточных (Ьу6-С011Ь+) форм гранулоцитов в 1,8 и 6 раз от первоначального уровня соответственно. К 7 сут регистрировалось дальнейшее снижение количества зрелых форм гранулоцитов до 2% и рост числа промежуточных форм гранулоцитов до 58% от исходного значения.

Применение Г-КСФ через 24 ч после введения 5-ФУ на 2 сут не влияло на число Т-лимфоцитов (СОЗ+) в селезенке мышей, однако на 7 сут отмечалось их снижение на 20% по сравнению с аналогичным показателем животных контрольной группы. Количество В-лимфоцитов (СЭ19+) на 2 сут снижалось на 23%, но на 7 сут их число не отличалось от аналогичного показателя у животных контрольной группы. Введение Г-КСФ после 5-ФУ к 7 сут приводило к снижению числа промежуточных форм гранулоцитов на 48% в сравнении с контролем.

Применение ИЛ-1Р через 1 ч после введения 5-ФУ на 2 сут увеличивало число Т-лимфоцитов на 15% от первоначального уровня, уменьшало количество промежуточных форм гранулоцитов в 6 раз и не влияло на уровень В-клеток. На 7 сут отмечалось увеличение числа В-клеток на 20% от исходного уровня, рост количества промежуточных форм гранулоцитов на 35% по сравнению с аналогичным показателем у контроля.

У животных, получивших ИЛ-1Р через 24 ч после введения 5-ФУ, отмечалось повышение числа В-лимфоцитов на 2 и 7 сут на 15-10% от первоначального уровня. Количество Т-лимфоцитов на 2 сут не отличалось от аналогичного показателя у животных контрольной группы, однако на 7 сут наблюдалось увеличение их числа на 25% по сравнению с их числом у животных в контроле.

Установлено также, что введение 5-ФУ не оказывало влияния на пролиферативную активность спленоцитов мышей-гибридов на 2 сут после введения токсиканта, а на 7 сут увеличивало её в 5,8 раза.

Применение Г-КСФ приводило к увеличению пролиферативной активности спленоцитов на 2 сут в 1,4 раза, с последующим её снижением в 2

раза на 7 сут по сравнению с аналогичным показателем у животных контрольной группы.

Введение ИЛ-1Р через 1 ч после 5-ФУ не влияло на спонтанную пролиферацию спленоцитов, в то время как применение ИЛ-1Р через 24 ч после введения 5-ФУ вызывало снижение данного показателя на 7 сут почти в 2 раза.

В результате проведенных исследований также установлено, что введение 5-ФУ значительно снижало митоген-индуцированную пролиферативную активность спленоцитов (рис. 5).

НИсходный уровень 0 5-ФУ □ 5-ФУ + Г-КСФ через 24 ч

И 5-ФУ + ИЛ-113 через 1 ч О 5-ФУ + ИЛ-1 р через 24 ч

Рисунок 5 - Митоген-игдуцированная (КонА в дозе 0,25 мг/кг) пролиферация клеток селезенки у мышей гибридов (СВА х С57В1) П при введении интерлейкина-1р или гранулоцитарного колониестимулирующего фактора после затравки 5-фторурацилом в дозе 250 мг/кг, тыс. имп./мин

* - р < 0,05 по сравнению с 5-ФУ (контролем);

# - р < 0,05 по сравнению с группой животных, получавших Г-КСФ,

" - р < 0,05 но сравнению с группой животных, получавших ИЛ-1Р через 1 ч

При изучении пролиферации спленоцитов в ответ на введение КонА в дозе 0,25 мкг/мл у мышей, получавших Г-КСФ, установлено, что их пролиферативная активность на 2 сут почти в 2,5 выше, а на 7 сут в 2,5 раза меньше, чем у животных контрольной группы.

Применение ИЛ-1 р через 1 ч после введения 5-ФУ не влияло на пролиферативную активность спленоцитов по сравнению с контролем, а на 7 сут отмечалось увеличение пролиферативной активности в 2,5 раза по сравнению с аналогичным показателем у животных, получивших Г-КСФ.

Применение ИЛ-1р через 24 ч с момента введения 5-ФУ не влияло на митоген-индуцированную пролиферативную активность спленоцитов на 2 сут. Однако, на 7 сут данный показатель составлял 30% от фонового значения

80 -

2

Сроки после введения 5-ФУ, сут

7

и был в 1,8 раза выше, чем у животных из группы контроля, и в 8 раз выше, чем у животных, получивших Г-КСФ.

Полученные нами данные о терапевтической эффективности ИЛ-lß в отношении выживаемости животных после введения ЦФ или 5-ФУ согласуются с данными других авторов [Castelli М.Р. et al., 1988; Benjamin W.R. et al., 1989; Moore M.A., et al. 1990]. По мнению ряда авторов, применение ИЛ-lß после введения цитотоксикантов не только способствует повышению выживаемости отравленных животных, но и приводит к увеличению клеточности костного мозга и повышению числа КОЕ на селезенке по сравнению с животными контрольной группы [Casparetto С. et al., 1990; Ido M. et al., 1992; Dalmau S.R. et al., 1993; Gardner R.V., 2003].

Данный терапевтически эффект ИЛ-lß в первую очередь связан с его способностью стимулировать митотическую активность клеток костного мозга, в результате чего происходит выход покоящихся стволовых кроветворных клеток в цикл, стабилизация их популяции и стимуляция клеточной дифференцировки [Симбирцев A.C., 1998; Casparetto С. et al., 1989; Laver J. et al., 1989]. С другой стороны, ИЛ-lß активирует метаболизм соединительной ткани, стимулируя пролифирацию фибробластов и выработку ими ростовых факторов, интерлейкинов и интеферонов, воздействует на функциональную активность Т-лимфоцитов и макрофагов, увеличивает среди спленоцитов долю клеток с фенотипом Т-хелперов [Кетлинский С.А., Симбирцев A.C., 2008]. На наш взгляд, вышеуказанные эффекты могут способствовать восстановлению структурно-функциональной организации костного мозга, а значит и восстановлению гемопоэза.

Ещё одним из механизмов терапевтического действия ИЛ-lß является его способность увеличивать чувствительность клеток-предшественников к ростовым факторам, стимулировать их продукцию клетками эндотелия, гепатоцитами, Т-лимфоцитами и клетками стромы костного мозга [Кетлинский С.А., Симбирцев A.C., 2008; Zucali J.R. et al., 1990; Dinarello С.A., 1994; Lai C.F., Baumann H., 1996; Neta R„ 1997]. Повышение пролиферативной активности стволовых кроветворных клеток, в свою очередь, приводит к ускорению темпов восстановления нарушенного вследствие химического воздействия гемопоэза и, как итог, к увеличению числа зрелых клеток в периферической крови.

Этим механизмом действия можно объяснить низкую эффективность или даже пагубность применения ИЛ-lß через 1 ч после введения 5-ФУ, ЦФ и 2.2-ДХДЭС, которую мы наблюдали в экспериментах. Активация процессов пролиферации на фоне циркуляции химических агентов в крови приводит к гибели стволовых клеток, а значит и к увеличению глубины лейкопенического синдрома, что мы отмечали в ходе выполнения исследований.

Результаты изучения функционально-метаболического состояния нейтрофилов периферической крови после ведения 5-ФУ, ЦФ или 2.2-ДХДЭС свидетельствуют о цитопротекторном действии ИЛ-lß. Аналогичные результаты были получены и другими авторами, показавшими активирующее

влияние ИЛ-1Р на функционально-метаболическое состояние нейтрофилов при лейкопении как токсического, так и радиационного генеза [Сидоров Д.А., 2000; Аксенова Н.В., 2004; Зацепин В.В., 2009].

Таким образом, в ходе наших исследований были разработаны модели лейкопенического синдрома у мелких лабораторных животных (белых беспородных крысах), формируемого однократным внутрибрюшинным (ЦФ и 5-ФУ) или подкожным (2.2-ДХДЭС) введением цитотоксикантов, которые в дальнейшем использовались в работе. Установлено, что применение ИЛ-1(3 через 24 после 5-ФУ или ЦФ способствует повышению выживаемости животных, в то время как использование ИЛ-1Р через 1 ч не влияет на этот показатель. Введение ИЛ-1Р через 24 ч после 5-ФУ, ЦФ и 2.2-ДХДЭС способствует уменьшению глубины и длительности лейкопенического синдрома, улучшению функционально-метаболического состояния нейтрофилов в период лейкопении и более быстрому восстановлению содержания гликогена, активности миелопероксидазы и щелочной фосфатазы в них. Применение ИЛ-1Р через 1 ч после токсикантов практически не оказывает положительного влияния на течение лейкопенического синдрома и даже порой его утяжеляет. Применение ИЛ-1Р через 24 ч после 5-ФУ не уступает по эффективности Г-КСФ при оценке показателей гемо- и иммунопоэза в ранние сроки интоксикации, а в поздние сроки по ряду критериев даже более эффективно.

ВЫВОДЫ

1. Интерлейкин-1 р в дозе 50 мкг/кг при применении через 24 ч после введения 5-фторурацила или циклофосфамида в среднесмертельных дозах увеличивает на 40% выживаемость мышей, в то время как его применение через 1 ч после введения токсикантов не влияет на выживаемость. Введение интерлейкина-1р в дозе 50 мкг/кг через 1 или 24 ч после 2.2-дихлордиэтилсульфида не оказывает влияния на выживаемость мышей.

2. Для моделирования на белых беспородных крысах лейкопенического синдрома максимальной длительности и глубины с помощью химического агента целесообразно использовать однократное внутрибрюшинное введение 5-фторурацила в дозе 1,3 ЛД50, циклофосфамида в дозе 0,8 ЛДзо или однократное подкожное введение 2.2-дихлордиэтилсульфида в дозе, не менее 0,7 ЛД50.

3. Использование интерлейкина-1р в дозе 50 мкг/кг у крыс через 1 ч после 5-фторурацила в дозе 1,3 ЛД5о не влияет на длительность и глубину лейкопении. Применение интерлейкина-1Р через 1 ч после циклофосфамида в дозе 0,8 ЛД50 вызывает снижение числа лимфоцитов и нейтрофилов в периферической крови почти в 3 раза по сравнению с аналогичными показателями контроля, но не влияет на длительность лейкопенического синдрома. Введение интерлейкина-1р через 1 ч после 2.2-дихлордиэтилсульфида в дозе 0,7 ЛД50 в 1,5 раза увеличивает глубину лейкопении, уменьшая общее число лимфоцитов, не оказывает влияния на

количество нейтрофилов периферической крови, но способствует уменьшению длительности лейкопении.

4. Применение у крыс интерлейкина-113 в дозе 50 мкг/кг через 24 ч после введения 5-фторурацила в дозе 1,3 ЛД50 способствует увеличению числа лейкоцитов, лимфоцитов и нейтрофилов в периферической крови. Введение интерлейкина-113 через 24 ч после шклофосфамида в дозе 0,8 ЛД50 снижает глубину лейкопении, увеличивая число лимфоцитов и нейтрофилов периферической крови по сравнению с аналогичными показателями у животных контрольной крупы в 1,5-2 раза. Введение интерлейкина-1 Р через 24 ч после 2.2-дихлордиэтилсульфида в дозе 0,7 ЛД50 на 30 % снижает глубину лейкопении и в 3 раза уменьшает длительность лейкопенического синдрома, а также предотвращает развитие повторного снижения числа лейкоцитов в отдаленном периоде.

5. Использование интерлейкина-1 р в дозе 50 мкг/кг у крыс через 1 ч после 5-фторурацила в дозе 1,3 ЛД50, циклофосфамида в дозе 0,8 ЛД50 или 2.2-дихлордиэтилсульфида в дозе 0,7 ЛД50 не влияет на функциональную активность нейтрофилов периферической крови. Применение интерлейкина-1р в той же дозе через 24 ч после 5-фторурацила, циклофосфамида или 2.2-дихлордиэтилсульфида снижает выраженность нарушений функционально-метаболического статуса нейтрофилов периферической крови в период лейкопенического синдрома и способствует его восстановлению.

6. Интерлейкин-1 р, используемый в дозе 50 мкг/кг через 24 ч после введения 5-фторурзцила, не уступает по эффективности применению гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в дозе 200 мкг/кг на 2 сут после введения токсиканта при её оценке по критериям клеточности селезенки и тимуса, числу СОП7+ в костном мозге мышей. По критериям клеточности костного мозга и тимуса, числа СШ17+ в костном мозге, спонтанной и митоген-индуцированной пролиферации спленоцитов на 7 сут интоксикации применение интерлейкина-1 Р через 24 ч после 5-фторурацила более эффективно, чем использование гранулоцитарного колониестимулирующего фактора.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные результаты позволяют рекомендовать разработанные на крысах модели лейкопенического синдрома с помощью однократного введения 5-фторурацила, циклофосфамида и 2.2-дихлордиэтилсульфида для изучения патогенеза интоксикации и оценки эффективности лекарственных средств в доклинических исследованиях.

2. Результаты экспериментальных исследований, свидетельствующие о более эффективном использовании интерлейкина-1 р через 24 ч после введения цитотоксикантов, позволяют рекомендовать дальнейшее изучение возможности применения интерлейкина-1 р для лечения лейкопенического синдрома, вызванного химическими агентами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шилов Ю.В. Перспективы использования интерлейкина-lß для коррекции лейкопенического синдрома, сформированного под воздействием цитотоксикантов / Ю.В. Шилов // Вопросы обеспечения химической безопасности в Российской Федерации: Сб. науч. трудов совместного заседания секции № 4 «Токсикология, гигиена, профпатология, индикация, дегазация при работе с высокотоксичными веществами» Проблемной комиссии ФМБА России. - СПб.: Фолиант, 2007. - С. 107.

2. Гребенюк А.Н. Современные подходы к фармакологической коррекции токсической нейтропении / А.Н. Гребенюк, С.М. Алексеев, Н.В. Станчева, Ю.В. Шилов // Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2008. -№ 1 (21).-С. 175-181.

3. Шилов Ю.В. Токсические эффекты циклофосфана и подходы к их фармакологической коррекции / Ю.В. Шилов, В.А. Кашуро, Л.В. Минаева, P.A. Грашин // Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2008. -№ 3 (23). - С. 68-72.

4. Шилов Ю.В. Моделирование лейкопенического синдрома у крыс с помощью циклофосфана / Ю.В. Шилов // Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2008. - № 3 (23). - Приложение 1, - С. 111.

5. Шилов Ю.В. Моделирование лейкопенического синдрома у крыс с помощью 5-фторурацила / Ю.В. Шилов // 3-й съезд токсикологов России: Тез. докл. - М., 2008. - С. 345-346.

6. Шилов Ю.В. Экспериментальная оценка эффективности интерлейкина-lß для коррекции токсической лейкопении, вызванной 5-фторурацилом / Ю.В. Шилов, Н.В. Аксенова, А.Н. Гребенюк // Экспериментальная и клиническая фармакология: Материалы 3-й международ, науч. конф. -Минск, 2009. - С. 133-135.

7. Шилов Ю.В. Современные подходы к лечению поражений цитотоксикантами / Ю.В. Шилов, А.Н. Гребенюк // Актуальные вопросы взаимодействия медицинских служб Вооруженных сил в условиях современных вызовов и угроз: Тез. докл. междунар. науч.-практ. конф. - М.: ГВКГ им. H.H. Бурденко, 2009. - С. 49.

8. Гребенюк А.Н. Экспериментальные модели лейкопенического синдрома химической этиологии / А.Н. Гребенюк, Ю.В. Шилов, A.B. Носов // Военно-медицинский журнал. - 2010. -Т. 331, № 2. - С. 59-60.

9. Профилактика, клиника, диагностика и лечение острых отравлений в войсках: методические указания / А.Н. Гребенюк, А.Е. Сосюкин, В.Б. Василюк и др.; под ред. А.Б. Белевитина. - М.: ГВМУ МО РФ, 2010. - 352 с.

10. Шилов Ю.В. Эффективность интерлейкина-lß при острой интоксикации 2.2-дихлордиэтилсульфидом / Ю.В. Шилов // Химическая безопасность Российской Федерации в современных условиях: Материалы Всерос. науч.-практ. конф. - СПб.: Фолиант, 2010. - С. 243-245.

11. Шилов Ю.В. Влияние гидрогеля, содержащего альгинат натрия, димексид и беталейкин, на местные и резорбтивные проявления

интоксикации 2.2-дихлордиэтилсульфидом / Ю.В. Шилов, А.Н. Гребенюк, A.B. Носов // Химическая безопасность Российской Федерации в современных условиях: Материалы Всерос. науч.-практ. конф. - СПб.: Фолиант, 2010.-С.245.

Подписано в печать 23.06.10 Формат 60x84/16

Обьсм 1 п.л. Тираж 100 экз. Заказ №595

Типография BMA, 194044, СПб., ул. Академика Лебедева, 6.