Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Экспериментальное изучение фармакокинетики и биотрансформации нового дипептидного ноотропа ноопепта

На правах рукописи

КОРОТКОВ Сергей Анатольевич

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ФАРМАКОКИНЕТИКИ И БИОТРАНСФОРМАЦИИ НОВОГО ДИПЕПТИДНОГО НООТРОПА

НООПЕПТА

14.00.25 фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертация на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва-2003

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте фармакологии им. В.В. Закусова Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук Гудашева Т.А.

Научный консультант:

кандидат биологических наук Бойко С.С.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Ковалев Г.И. кандидат биологических наук Гривенников И.А.

Ведущая организация:

Московский государственный медико-стоматологический университет

4Ь> МЛ^/Ь 2003 года в Цч.

Защита состоится «/ф> КиМ^Ш 2003 года в /у часов на заседании диссертационного совета Д 001.024,01 в ГУ НИИ фармакологии РАМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в ученой части ГУ НИИ фармакологии РАМН, адрес: 125315, Москва, ул. Балтийская, 8.

Автореферат разослан «%1>> ШАШшъ года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук Е.А. Вальдман

2ос>?

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Разнообразие и часто уникальность фармакологических эффектов эндогенных пептидов и их синтетических аналогов в сочетании с высокой активностью делают эти соединения перспективными в качестве потенциальных фармакологических средств (Ашмарин И.П., 1996; Мясоедов Н.Ф., 2001; Каменский A.A., 1999; Чипенс Г.И., 1988; Dutta A.S., 1993). Современные достижения в создании лекарственных форм пептидов, позволившие в значительной степени преодолеть такие негативные характеристики этих соединений, как низкую устойчивость к протеолитическим ферментам, плохую всасываемость и низкую проницаемость через различные барьеры организма, в соединении с улучшенными методами производства способствуют быстрому росту количества пептидных препаратов (Verlander М., 2001). Лекарственные средства пептидной природы интересны в качестве потенциальных ноотропов, поскольку в регуляции когнитивных функций основную роль играют нейропептиды.

В связи с большим количеством заболеваний, сопровождающихся нарушениями копштивных функций таких как травма мозга, инсульты, хроническая церебро-васкулярная недостаточность и т.п., представляется необходимым разработка и внедрение в клиническую практику новых ноотропных препаратов пептидной структуры, поскольку в большинстве случаев пептидные препараты более эффективны, чем препараты из других химических групп (Loffet А., 2001). Несмотря на значительный прогресс в создании лекарственных форм пептидных соединений, поиск пептидов, сохраняющих активность после приема внутрь, остается актуальным, поскольку именно этот путь введения предпочтителен при коррекции многих когнитивных нарушений, требующих проведения длительной терапии.

В ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН в результате

целенаправленного создания лекарственных сре^смфшкцтшпбьж^щоды на

библиотека

>RWCfoz t

С.Петербург/.</. !

оэ ж $*4>}ь \

основе структуры известных непептидных препаратов (Гудашева Т.А., Островская Р.У., Воронина Т.А., Середенин С.Б. (1985-2001)) был создан оригинальный дипептид - ноопепт, который имеет ноотропную активность, качественно и количественно превышающую активность классического ноотропа пирацетама, и при этом сохраняющий активность после приема внутрь (патент РФ № 2119496, US Patent № 5439930). К настоящему моменту, ноопепт прошел вторую фазу клинических испытаний на 60-больных в двух клиниках, подтвердивших высокую эффективность и безопасность препарата.

Общеизвестно, что экспериментальное изучение фармакокинетики позволяет выявить закономерности концентрационных изменений лекарственного вещества в организме. Знание этих закономерностей способствует пониманию процессов всасывания, распределения и элиминации лекарственных средств, выяснению фармакокинетической составляющей биологической активности, идентификации и оценки основных метаболитов, выбору оптимальной лекарственной формы и пути введения (Фирсов А.А. 2000; Жердев В.П., 1991). В конечном счете, изучение экспериментальной фармакокинетики направлено на решение главной задачи доклинических испытаний, заключающейся в обеспечении безопасного и эффективного использования лекарственных препаратов в клинике (Горьков В.А., 1987).

Актуальность исследования определяется тем, что доклиническое изучение фармакокинетики и путей биотрансформации ноопепта является необходимым этапом на пути внедрения этого оригинального препарата в клиническую практику.

Целью настоящего исследования являлось изучение фармакокинетики и биотрансформации ноопепта в эксперименте на двух видах животных.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать методики качественного и количественного анализа ноопепта и его предполагаемых метаболитов в биологическом материале.

2. Изучить фармакокинетику ноопепта после внутривенного и орального аведч«и5гу/крыс я йроащков.

i i * i Vt >

г,•>

. , it' м

3. Установить пути биотрансформации ноопепта после его внутривенного введения у крыс.

4. Оценить способность ноопепта проникать через гематоэнцефалический барьер.

5. Изучить фармакокинетику и определить относительную биологическую доступность таблетированной лекарственной формы ноопепта ' у кроликов.

Научная новизна. Впервые проведено изучение фармакокинетики и биотрансформации ноопепта у крыс и кроликов при разных путях введения субстанции и после введения таблеток ноопепта у кроликов. Показано, что при внутривенном пути введения неизмененный ноопспт регистрируется в плазме крови крыс в течение 25 мин, и за это время происходит его биотрансформация с образованием трех метаболитов - К-фенилацетилпролина, фенилуксусной кислоты и циклопролилглицина. Выявлено, что процесс элиминации ноопепта у кроликов протекает менее интенсивно, что обуславливает его более длительную циркуляцию в плазме крови у этого вида животных. Показано, что ноопепт способен проникать через гематоэнцефалический барьер, и его концентрация в мозге выше, чем в плазме крови. Кроме ноопепта в мозге были обнаружены два его метаболита - фенилуксусная кислота и циклопролилглицин, идентичные соответствующим эндогенным соединениям. Идентификация циклопролилглицина в качестве эндогенного соединения проведена впервые. Показано на двух видах животных, что оральное введение ноопепта характеризуется выраженным "эффектом первого прохождения" через желудочно-кишечный тракт и печень. Впервые проведена оценка относительной биологической доступности таблеток ноопепта по 10 мг у кроликов.

Научно-практическое значение. Данные исследования вошли в Материалы по доклиническому изучению ГВС-111 (ноопепт), представленные в Фармакологический Комитет Минздрава РФ для получения разрешения на клинические испытания таблеток ноопепта.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на VII Российском национальном конгрессе "Человек и Лекарство" (Москва 2000 г), на 3-й Международной Конференции "Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам" (Суздаль 2001 г) и на межлабораторной конференции лабораторий фармакокинетики и гетероатомных структур ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН (Москва 2002 г).

Связь темы диссертации с планом научно-исследовательских работ ГУ НИИ фармакологии РАМН. Диссертация выполнена в соответствии с плановой темой НИР НИИ фармакологии РАМН "Изучение молекулярных и клеточных механизмов эндо- и экзогенной регуляции функций ЦНС, создание нейрохимических основ для разработки новых оригинальных нейротропных средств" и с подпрограммой "Создание лекарственных средств методами химического и биологического синтеза" ФЦНТП "Исследования и разработка по приоритетным направлениям развития науки и техники".

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 136 страницах и иллюстрированы 20 таблицами и 14 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав результатов исследования, заключения и выводов. Библиография представлена 23 отечественными и 132 зарубежными работами.

Публикации. Основные положения диссертационной работы нашли отражение в восьми опубликованных в печати научных работах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследований являлись: субстанция ноопепта1 (этиловый эфир К-фенилацетил-Ь-пролилглицина); таблетки ноопепта2; активные метаболиты ноопепта - циклопролилглицин и фенилуксусная кислота.

Таблица 1

Химические структуры и физические свойства ноопепта и его активных

метаболитов

Ноопепт Циклопролилглицин (М-3) Фенилуксусная кислота (М-6)

5У 0>0 он'

М.в. 318; Тш= 96-98°С; [аЬ20-120.0°С (с 0.4; СНСЬз); мало растворим в воде; легко растворим в хлороформе; растворим в ацетонитрил М.в. 154; Тго= 213-214°С; [а]о20-214°С (с 0.4; вода); растворим в воде; мало растворим в хлороформе; растворим в ацетонитриле М.в. 136; Тпл^ 76-76.5°С; трудно растворим в воде; легко растворим в хлороформе; растворим в ацетонитриле

Способы введения ноопепта экспериментальным животным

Исследование фармакокинетики и основных путей биотрансформации ноопепта проводили на двух видах животных: белых беспородных крысах -самцах массой 230-280 г и кроликах - самцах породы Шиншилла массой 2.83.5 кг. Оба вида животных были получены из питомника "Столбовая" и перед экспериментом находились на стандартном рационе вивария не менее двух недель.

1 Синтез субстанций ноопепта и его метаболитов выполнен в химическом отделе, 2 таблетки ноопепта разработаны в опытно-технологическом отделе ГУ НИИ фармакологии им. В.В. ЗакусоваРАМН.

При внутривенном введении крысам водный раствор субстанции ноопепта вводили в боковую вену хвоста тонкой иглой в дозе 5 мг/кг. При оральном введении водный раствор субстанции ноопепта вводили крысам в желудок с помощью зонда в дозе 50 мг/кг, в объеме до 2 мл. В случае внутривенного введения ноопепта кроликам препарат вводили в краевую ушную вену в дозе 10 мг/кг. При оральном введении кроликам вводили водный раствор субстанции ноопепта в дозе 50 мг/кг в желудок с помощью эластичного зонда в объеме до 10 мл. Для изучения биодоступности таблеток ноопета экспериментальным животным вводили таблетки ноопепта в средней дозе 50 мг/кг с помощью зонда.

Образцы крови получали в дискретные интервалы времени у крыс декалитацией, у кроликов отбором из краевой ушной вены.

Метод количественного определения ноопепта и его метаболитов в плазме

крови животных

Совместное извлечение ноопепта и метаболитов Ы-фенилацетил-Ь-пролина (М-2), фенюгуксусной кислоты (М-3) и циклопролилглицина (М-6) выполняли последовательной экстракцией 5-кратными объемами ацетонитрила и хлороформа, для извлечения ноопепта использовали 5-кратный объем хлороформа.

Хроматографический анализ ноопепта и его фенилацетилсодержащих метаболитов проводили методом обращенно-фазной хроматографии на жидкостном хроматографе высокого давления (ВЭЖХ) с спектрофлуоресцентным детектором "БЫтаёти 1^-535". Для детектирования дезфенильных метаболитов использовали ультрафиолетовый детектор "Тгасог 970А". Автоматическая регистрация времен удержания и обсчет площадей пиков осуществлялась с помощью микропроцессора "БЬшш^ С-ЮА". Для более точной идентификации циклопролилглицина был дополнительно использован метод газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ). Хроматографирование проводили на газовом хроматографе "Модель 3700"

(Россия). Подобранные условия хроматографическош анализа ноопента и его предполагаемых метаболитов представлены в табл. 2, характеристики хроматографического анализа ноопепта и его основных метаболитов представлены в табл. 3.

Таблица 3

Характеристики методик хроматографического анализа

Изучаемые соединения Величина экстракции, % Предел обнаружения, мкг/мл (мкг/г) Параметры уравнения градуировочного графика3 t, мин Ошибка методики4, %

Ноопепт 93.7±1.46' 77.3±1.852 0.08' 0.112 Ь = 3.38 а = 2.67 10.7 5.94

М-3 97.9±1.27' 90.5±1.422 0.05' 0.072 b = 8.84 а = 0.37 7.75 3.40

М-6 77.0ttl.361 70.0±1.482 1.50' О.ОЗ2,5 b = 4.36 а = 0.69 11.50 8.705 4.54

Примечание: - плазма крови, - мозг, - у = bx+а (п=6), - для концентрации 1.0 мкг/мл,5 - ГЖХ

Масс-спектрометрический анализ эндогенного циклопролилглицина

Масс-спектрометрию 1 проводили на приборе Finigan MAT SQ-710 (США) с ионизацией электронным ударом, энергия ионизации - 70 эВ. Использовали температурное фракционирование путем линейного повышения температуры источника ионов с 25° до 350°С в течение двух минут, затем температуру удерживали при 350°С в течение еще четырех минут.

Молекулярный ион идентифицировали с помощью FAB-масс-спектроскопии на приборе FAB 50 ТС фирмы "Kratos", газ-реагент-ксенон, энергия газа 8 кэВ, стандартная матрица — глицерин.

1 Идентификация эндогенного циклопролилглицина выполнена совместно с в.н.с. Акпаровым В.Х. (Федеральный научный центр "ГНИИ Генетика").

Таблица 2

Условия хроматографического анализа ноопепта и его предполагаемых метаболитов

Условия проведения анализа Определяемое соединение

ноопепт, фенилуксусная кислота, N-Phac-L- Pro-Gly, N-Phac-L-Pro цикло (Pro-Gly), L- Pro-Gly, L- Pro-Gly-OC2H5 цикло (Рго-С1у)

Детектирование спектрофлуоресцентное 260/290 им ультрафиолетовое 220нм пламенно-ионизационное

Колонка "Ultrasphere -ODS" 250x4.6 мм; 5 мкм "Ultrasphere - CN" 250x4.6 мм; 5 мкм 3% ОУ-17 на хромосорбе в; 2мх4 мм

Подвижная фаза ацетонитрил - вода - ледяная уксусная кислота (30:70:0.1) v/v ацетонитрил -морфолинпропансульфокислота 0.1 М-вода (2:3:95) v/v расход водорода-30 мл/мин, воздуха - 300 мл/мин, газа-носителя (азот особой чистоты) — 40 мл/мин

Скорость подвижной фазы 0.7 мл/мин 0.7 мл/мин

Температура колонки комнатная комнатная 205°С

Примечение: Phac - фенилацетил, Pro - пролин, Gly- глицин, v/v - по объему

Фармакокинетические параметры, используемые для интерпретации экспериментальных данных

Расчет основных фармакокинетических параметров ноопепта и обнаруженных метаболитов проводили модельно-независимым методом с применением программы "M-Ind". Были рассчитаны абсолютная биодоступность (Fa6c.) ноопепта, относительная биодоступность (Готн.) таблеток ноопепта и максимально возможная биодоступность ( F). Максимально возможную биодоступность ( F) ноопепта рассчитывали по формуле: F = Qh/Qh+C1Po, где Qh - скорость кровотока через печень, С1ро-клиренс полученный после орального введения.

Статистическая обработка полученных результатов

Систематизация и обработка экспериментальных данных выполнена с помощью выборочного метода статистики и метода наименьших квадратов с применением программы SPSS 9.0.0. for Windows. Достоверность различий оценивали с помощью вышеуказанной программы по t-критерию Стьюдента (при р< 0.05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Предполагаемый метаболизм ноопепта

Необходимость изучения биотрансформации ноопепта продиктована возможностью образования в результате этого процесса метаболитов, имеющих биологическую активность. Установление структуры метаболитов хроматографическим методом предполагает наличие стандартов-свидетелей, времена удержания которых сопоставляют со временами удержания пиков веществ в хроматограммах опытных образцов. С целью синтеза стандартов-свидетелей основных метаболитов ноопепта предварительно была предложена схема трех наиболее вероятных путей биотрансформации ноопепта, включающая:

1. образование Ы-фенилацетил-Ь-пролилглицина (М-1) в результате гидролиза сложноэфирной связи эстеразами и дальнейшей деградации этого продукта до Ь-пролилглицина (М-4);

2. образование И-фенилацетил-Ь-пролина (М-2) и этилового эфира глицина (М-5) в результате гидролиза пептидной связи пептидазами;

3. дезацилирование ноопепта, приводящее к образованию фенилуксусной кислоты (М-3) и этилового эфира Ь-пролилглицина, который может спонтанно превращаться в циклический дипептид - циклопролилглицин (М-6).

Предполагаемая схема биотрансформации ноопепта, представленная на рис. 1, включает продукты первой фазы биотрансформации, образование которых возможно в результате действия гидролаз.

Ч^ч. М-1

о М-5

см

М-4 ^Ч^ М-2 ^ ^ М-6

Рис. 1. Предполагаемая схема биотрансформации ноопепта

Фармакокинетика ноопепта и его метаболитов в плазме крови крыс после внутривенного введения ноопепта

После внутривенного введения в плазме крови крыс, кроме ноопепта регистрировались метаболиты М-2, М-3 и М-6.

Время (часы)

Рис. 2. Динамика изменения концентраций ноопепта (1) и метаболитов - М-2 (2), М-3 (3) и М-6 (4) в плазме крови крыс после внутривенного введения ноопепта в дозе 5 мг/кг.

Изменение концентраций ноопепта в плазме крови крыс характеризовалось фармакокннетической кривой (рис. 2), имеющей однофазный характер. Более чем 10-кратное снижение концентрации ноопепта происходило за интервал от 2 до 25 мин. Быстрое снижение концентрации ноопепта сопровождалось нарастанием уровня метаболитов, которое затем через 0.5-1.0 ч сменялось относительно медленным снижением их концентраций, регистрируемым на протяжении 4 (М-6) и 6 ч (М-2, М-3). Максимальные концентрации метаболитов М-2 и М-3 значительно превышали уровень ноопепта, регистрируемый в первой экспериментальной точке, что, очевидно, связано с существованием наиболее быстрой фазы снижения его концентрации, начинающейся непосредственно после введения.

Фармакокинетический профиль ноопепта (табл. 4) характеризует его нахождение в организме крыс как непродолжительное. Так, величина Т\а, составляющая для ноопепта 0.19 ч, означает, что в течение этого времени в плазме крови происходит снижение его концентрации вдвое.

Таблица 4

Фармакокинетические параметры ноопепта и его метаболитов после внутривенного введения ноопепта

AUCo_»co, ко Tl/2, С1р, vd, MRT, Сщах, щ> Тщах, п»

мкг/млхч ч-1 ч л/ч л ч мкг/мл Ч

Ноопепт 0.31 3.68 0.19 4.03 1.10 0.22 - -

М-2 14.90 0.23 3.11 - - 3.32 3.97 0.50

М-3 12.76 0.15 4.66 - - 3.53 1.95 1.00

М-6 2.80 0.26 2.65 - - 2.52 0.83 0.50

Примечание: в таблице даны параметры, рассчитанные по усредненным кривым (5 крыс на временную точку).

Для ноопепта величина кажущегося объема распределения (Va), значительно превышает реальный объем всех жидкостей организма крыс. Это позволило предположить низкую степень связывания препарата с форменными элементами и белками плазмы крови, а также его значительное распределение из системного кровотока в ткани.

Выраженное распределение ноопепта должно было увеличить продолжительность нахождения его молекул в организме. Параметром, характеризующим длительность нахождения лекарственного средства в организме и независящим от его распределения, является среднее время удержания (MRT) молекул лекарственного вещества в организме. Величина MRT составила для ноопепта всего 0.22 ч. По-видимому, это связано с тем, что интенсивная элиминация ноопепта протекает не только в хорошо перфузируемых органах, но и непосредственно в плазме крови.

Константа элиминации (к,.),) равная для ноопепта 3.68 ч~~\ характеризует скорость элиминации данного фармакологического средства непосредственно в плазме крови, то есть за 1 мин будет элиминировать примерно 6 % ноопепта. Суммарная скорость всех возможных путей элиминации лекарственного средства оценивается по величине общего клиренса (С1р). Процесс элиминации ноопепта характеризуется высоким значением С1р (табл. 4). Это обусловливает непродолжительный и проходящий на невысоком концентрационном уровне

профиль фармакокинетической кривой. В результате площадь под фармакокипетической кривой (AUC) имеет для ноопепта небольшую величину, равную 0.31 мкг/млхч.

Сопоставление фармакокинетических параметров ноопепта и обнаруженных метаболитов дало основание утверждать, что все идентифицированные продукты биотрансформации характеризуются более длительным нахождением в плазме крови крыс по сравнению с исходным соединением. Величина параметра Т1Д метаболитов М-2, М-3, М-6 превышает величину этого параметра для ноопепта соответственно в 16.4, 24.5 и 14 раз. При этом величины kd для всех обнаруженных метаболитов более чем на порядок меньше значения константы элиминации исходного соединения.

Следует отметить, что концентрационные профили между изучаемыми метаболитами различались по времени достижения максимальной концентрации. Однако, строго говоря, скорость поступления метаболитов в системную циркуляцию не является характеристикой скорости их формирования. Расчет константы формирования метаболитов (kf) возможен при условии, что метаболизм протекает по одному пути (Houston J.B., 1986). Но, имея в виду наличие общих структурных фрагментов у метаболитов М-2 и М-3 и одновременное обнаружение всех трех метаболитов в первой экспериментальной точке, предположение о параллельных путях метаболизма ноопепта представляется вполне оправданным, а следовательно расчет kr не корректным.

Вместе с тем было возможно оценить степень превращения ноопепта в его метаболиты. Сопоставление площадей каждого из изучаемых метаболитов показало, что наибольший вклад в биотрансформацию ноопепта приходится на образование М-2 и М-3. В меньшей степени образуется М-6, площадь под фармакокинетической кривой которого наименьшая.

Таким образом, биотрансформация ноопепта характеризуется образованием метаболитов М-2, М-3 и М-6, причем вклад каждого из метаболитов в данный процесс уменьшается в ряду М-2 >М-3>М-6.

Изучение экскреции ноопепта и его основных метаболитов с мочой у крыс

Для изучения возможного вклада в элиминацию ноопепта процесса экскреции, а также идентификации выводимых с мочой метаболитов был проведен хроматографический анализ образцов мочи.

На хроматограммах опытных образцов не было выявлено пиков, соответствовавших по времени удержания стандарту-свидетелю ноопепта. Вместе с тем, на хроматограммах и контрольных и опытных образцов мочи присутствовал пик, соответствовавший стандарту-свидетелю М-3. Однако, в отличие от контрольных образцов, площадь пика в опытных образцах мочи была больше примерно в 2 раза. Содержание фенилуксусной кислоты в моче контрольных животных составило 2.44±0.52 мкг/мл суточной мочи крыс, после введения препарата ее содержание увеличивалось до 5.00±0.85 мкг/мл.

Таким образом, принимая во внимание непродолжительное нахождение ноопепта в организме и отсутствие экскреции данного лекарственного средства с мочой, можно предположить, что основным путем элиминации ноопепта является биотрансформация.

Фармакокииетика ноопепта у крыс после орального введения субстанции ноопепта

В большинстве случаев пептиды после их введения внутрь не сохраняют активность (Dutta A.S., 1993). В первую очередь это связано с пресистемной элиминацией, являющейся результатом интенсивной биотрансформации, осуществляемой в желудочно-кишечном тракте и/ или печени (Rao S., 1995; Samanen J., 1996; Braun К., 2001). Во вторую очередь - с анатомическими барьерами слизистой кишечника для этого класса соединений (Thanou М., 2000). Поэтому представлялось важным выяснение возможности поступления ноопепта в системной кровоток при этом пути введения.

Анализ концентрационной кривой показал (рис. 3), что в течение 20 минутного промежутка времени после введения ноопепта происходит увеличение его концентрационного уровня в результате постепенного

всасывания из желудочно-кишечного тракта и поступления в системный

А

—I—I—|—I—1—I—|—1—1—I 12 24 36 48 60

Время (млн)

Рис. 3. Динамика изменения концентраций ноопепта в плазме крови крыс после орального введения субстанции ноопепта в дозе 50 мг/кг.

В ходе исследования было установлено, что скорость всасывания ноопепта в системный кровоток характеризуется высоким значением параметра Стах/АиС равным 2.41ч"1 и непродолжительным временем всасывания (МАТ - среднее время всасывания) составляющим 0.20 ч. Вместе с тем, величина АиС, рассчитанная для орального введения (табл. 5), несколько меньше величины аналогичного параметра внутривенного введения (табл. 4), несмотря на 10-кратную разницу в дозах. Концентрационные потери ноопепта после орального введения являются результатом "эффекта первого прохождения", то есть пресистемной элиминации. Значение абсолютной биодоступности для ноопепта с учетом разницы в дозах составило 7.1 %.

кровоток.

я я

о *

0.5-

0.3-

0.1

0.0

Таблица 5

Фармакокинетические параметры ноопепта после орального введения

субстанции

AUCo-xr,, мкг/млхч Ti/2 eb Ч ч-1 С1р, л/ч vd, л MRT, ч

0.22 0.12 5.78 3.98 0.69 0.42

Примечание: в таблице даны параметры, рассчитанные по усредненным кривым (5 крыс на временную точку).

Под пресистемной элиминацией подразумевают совокупность факторов, влияющих на полноту всасывания fa лекарственного средства из ЖКТ, и элиминацию, протекающую в ЖКТ (Fi) и/ или в печени (FH). Взаимосвязь абсолютной биодоступности с факторами, составляющими понятие пресистемной элиминации, может быть представлена в виде: F^ = faFi FH (Hall S.D., 1999). Для выяснения того, какой из вышеперечисленных факторов является ведущим в "эффекте первого прохождения" ноопепта, была рассчитана максимально возможная биодоступность ( F). Максимально возможная биодоступность F составила для ноопепта 18 %, и, в случае отсутствия кишечной элиминации и при условии полного всасывания препарата, эта величина должна соответствовать величине FabS. Однако полученное значение F, в 2.5 раза превышала величину FabS, из чего следует, что причиной низкой биодоступности ноопепта, в первую очередь, является биотрансформация, протекающая в кишечнике. С практической точки зрения это означает возможность увеличения FabS3a счет фармацевтических подходов.

Следует отметить, что при внутривенном и оральном способах введения наблюдались качественные отличия в путях биотрансформации. В случае орального введения регистрировался метаболит, который отличался по своей структуре от метаболитов, идентифицированных ранее после внутривенного введения. Исходя из химической структуры ноопепта, можно предположить, что этот метаболит является продуктом биотрансформации, гидроксилированным по фенильному кольцу.

Фармакокинетика неизмененного ноопепта и его метаболитов в мозге

крыс

Предполагается, что ноотропный эффект ноопепта может быть достигнут при условии его проникновения и распределения в мозге. Характер и длительность этого эффекта может в значительной степени зависеть и от скорости и степени проникновения ноопепта через гематоэнцефалический барьер, и от времени его нахождения в мозге.

Для оценки способности ноопепта к проникновению через гематоэнцефалический барьер, расчета его тканевой доступности и характеристики распределения было проведено количественное определение данного лекарственного средства в мозге крыс после внутривенного введения.

и "й

В

а

я в

е

¡4

0.1

0 1 2 3 4 5 6

Время (часы)

Рис. 4. Динамика изменения концентраций ноопепта (1) и метаболитов - М-3 (2) и М-6 (3) в мозге крыс после внутривенного введения ноопепта в дозе 5 мг/кг.

При анализе фармакокинетической кривой ноопепта в мозге (рис. 4) установлено быстрое увеличение его концентраций в этом органе. Кроме того, начиная с экспериментальной точки, соответствующей 10 мин и во всех последующих, концентрация ноопепта в мозге превышала концентрацию в плазме, рассчитанную для этих временных интервалов. Отношение

концентраций мозг/плазма представляет собой коэффициент распределения (Кр), который характеризует способность тканей организма к захвату лекарственных средств из кровяного русла. Значения этого параметра для ноопепта составило через 10 мин - 2.7, 15 мин - 2.6 , 20 мин - 3, и через 25 мин - 9.7. Следствием более высокого уровня концентраций ноопепта в мозге по сравнению с плазмой является высокое значение тканевой доступности этого лекарственного средства для мозга, равного 161 %. Это указывает на интенсивное проникновение ноопепта в мозг.

При сопоставлении величин ке1 для мозга и плазмы не было выявлено существенных отличий (табл. 6), что говорит о примерно одинаковой скорости элиминации ноопепта из этих тканей.

Таблица 6

Фармакокинетические параметры ноопепта и его метаболитов в ткани мозга и в

плазме крови крыс

Параметр Ноопепт М-3 М-6

плазма мозг плазма мозг плазма мозг

АиСо-*», мкг/млхч 0.31 0.50 12.76 2.23 2.80 5.22

ке.,4-1 3.68 3.47 0.15 0.88 0.26 0.24

Т,/2,Ч 0.19 0.20 4.66 0.79 2.65 2.87

МКГ,ч 0.22 0.23 3.53 1.23 2.52 4.27

Кроме ноопепта в мозге регистрировались метаболиты М-3 и М-6. Согласно нашим результатом (табл. 6) длительность циркуляции М-3 в мозге менее продолжительна, чем в плазме крови. Уровень фенилуксусной кислоты в мозге быстро снижается, и через 1.5 - 2 ч после введения ноопепта её содержание соответствует уровню эндогенной фенилуксусной кислоты. Величина А11С фенилуксусной кислоты в плазме крови в 5 раз превышала величину аналогичного параметра в мозге. Это согласуется с литературными данными о том, что для фенилуксусной кислоты существуют механизмы гибкой регуляции

её содержания в мозге, реализуемые посредством транспорта из мозга и за счет образования конъюгатов [DyckL.E., 1993].

Как и в случае с фенилуксусной кислотой, второй метаболит - М-6, детектировался как в опытных, так и в контрольных образцах плазмы крови и мозга крыс. Для подтверждения эндогенной природы этого соединения были проведены исследования в биологическом материале с применением высокоэффективной жидкостной и газожидкостной хроматографии в разных условиях, а также масс-спектрометрический анализ с ионизацией электронным ударом. По данным анализа ГЖХ, провели количественное определение эндогенного циклопролилглицина. Содержание в мозге этого дипептида составило 2.8±0.3 нмоль/г.

Сопоставление фармакокинетических параметров, полученных для циклопролилглицина в плазме крови и в мозге показало, что в последнем случае значения каждого из параметров AUC, Tj/2 и MRT значительно превышают значения аналогичных параметров в плазме крови. Это свидетельствует, во-первых, о более длительном нахождении циклопролилглицина в мозге по сравнению с плазмой крови, во-вторых, о возможности накопления этого метаболита в мозге после введения ноопепта.

Поскольку в отличие от плазмы крови в мозге крыс не обнаруживается метаболит М-2, следует предположить, что пути биотрансформации ноопепта в крови и в мозге различаются. Основным путем биотрансформации ноопепта в мозге является отщепление фенилуксусной кислоты с последующей циклизацией образующегося линейного дипептида в М-6.

Таким образом, ноопепт способен проникать через гематоэнцефалический барьер. Интенсивность захвата ноопепта структурами мозга свидетельствует о выраженной тропности этого препарата к тканям мозга.

Фармакокинетика ноопепта в плазме крови кроликов после внутривенного введения

После внутривенного введения ноопепта в дозе 10 мг/кг кажущаяся концентрация Со в среднем составила 3.9 мкг/мл. В течение интервалов времени (от 5 до 45 мин) концентрации ноопепта в плазме крови кроликов последовательно снижались (рис. 5). Через 45 мин после введения ноопепта его концентрация составляла в плазме крови кроликов 0.13 мкг/мл, в следующем временном интервале препарат не определялся. Сопоставление фармакокинетических параметров, полученных у кроликов и у крыс после внутривенного введения, позволило заключить, что ноопепт циркулирует в крови кроликов более продолжительное время.

3,0-

1.0

&

01,

—I-1-Г"

0 6 0.8

—Г" 1.0

-1—I—I—I-1-1—

1.2 1.4 1 в

Время (часы)

Рис. 5. Динамика изменения концентраций ноопепта в плазме крови кроликов после внутривенного введения (I) в дозе 10 мг/кг и орального введения (2) субстанции в дозе 50 мг/кг.

Так, для кроликов величина Т\п, равная в среднем 0.24 ч, превышает величину аналогичного параметра у крыс. Более высокие значения параметров АиСо_м> и С1р у кроликов, по-видимому, являются следствием различия доз, вводимых этим животным, и межвидовыми различиями.

В общем, для ноопепта в организме кроликов характерна высокая интенсивность процесса "очищения", высокая степень распределения в периферические ткани и непродолжительная циркуляция в системном кровотоке.

Фармакокинетнка ноопепта у кроликов после орального введения субстанции ноопепта

После орального введения ноопепта в дозе 50 мг/кг (рис. 6), происходило постепенное увеличением его концентрации, максимум которой у большинства животных регистрировался через 30 мин. В следующие 45 мин происходило последовательное снижение концентрации ноопепта и спустя 1.5 ч после введения лекарственное средство не определялось.

2

«

© X

0.1-

-I-1-1-1-г—|-1-1-г—|-1-Г—г-1-1-1—

00 02 04 06 06 10 12 14 16

Время (часы)

Рис. 6. Динамика изменения концентраций ноопепта в плазме крови кроликов после орального введения (1) субстанции и после введения таблеток (2).

Статистический анализ показал, что такие параметры ноопепта, как к^ и Т\п (табл. 7), фактически не зависят от способа введения. Так, между величинами Т1/2, полученными после внутривенного и орального путей введения, нет значимых различий. Величина кеь полученная после орального введения,

фактически сопоставима с величиной аналогичного параметра внутривенного введения. Это свидетельствует о примерно одинаковой интенсивности элиминации ноопепта из плазмы крови для этих способов введения.

Таблица 7

Фармакокинетические параметры ноопепта после внутривенного и орального введений субстанции кроликам (Х±8х, п=5)

AUCo-kw Т|/2, Clp, vd,

мкг/мл хч ч ' Ч л/ч л

Внутривенное введение 1.32±0.08 2.92±0.36 0.24+0.03 23.8Ш.78 8.23+1.01

Оральное введение 0.70±0.10 2.86±0.31 0.25Ю.03 26.19±3.66 9.05±0.83

Статистический тест* S NS NS

Примечание: * 1-тсст для независимых выборок (тест Стьюдента); Б - значимые различия N8 - не наблюдается значимого различия

Заметим, что тенденция значительного снижения AUC, наблюдаемая у крыс при переходе от внутривенного введения к оральному, отмечается и для кроликов. Величина абсолютной биодоступности ноопепта у кроликов в среднем составила 10.3511.34 %. Это свидетельствует о выраженном "эффекте первого прохождения" ноопепта через ЖКТ и печень.

Были отмечены межвидовые различия, заключающиеся в более медленном всасывании ноопепта у кроликов после введения субстанции ноопепта внутрь. Так, по сравнению с крысами, скорость всасывания ноопепта у кроликов характеризуется меньшей величиной Cmax/AUC равной 1.53 ч'1, при этом у них наблюдается и значительное увеличение продолжительности всасывания.

Фармакокинетика ноопепта у кроликов при введении таблеток

Одной из задач настоящего исследования являлась оценка относительной биодоступности разработанной в опытно-технологическом отделе ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН лекарственной формы ноопепта -таблеток.

Представлялось важным изучение влияния полученной лекарственной формы на биодоступность и фармакокинетические характеристики ноопепта. Для сравнительной оценки всасывания таблеток ноопепта изучили фармакокинетику данной лекарственной формы на кроликах, сопоставили эти данные с ранее полученными результатами после введения раствора и рассчитали относительную биодоступность. Сопоставление фармакокинетических параметров, рассчитанных после введения внутрь субстанции и таблеток ноопепта (табл. 8), выявило различия в значениях параметров характеризующих фазу всасывания.

В случае введения таблеток, концентрация ноопепта достигала своего максимального значения через 45 мин, то есть в течение более продолжительного времени по сравнению с введением субстанции. Вместе с тем, не было выявлено достоверных различий в величинах Спш/АиС, что свидетельствует о примерно одинаковой скорости поступления ноопепта в системный кровоток.

Таблица 8

Сравнение средних значений фармакокинетических параметров, полученных после введения субстанции и таблеток ноопепта кроликам

АиСо-«» ТшеЬ Сдизу С щах/А11С, С1р,

мкг/млхч Ч мкг/мл Ч-' л/ч

Субстанция ноопепта 0.70+0.10 0.25±0.03 1.07+0.12 1.64±0.13 26.19±3.66

Таблетки ноопепта 0.69±0.08 0.30+0.03 0.93±0.03 1.39±0.16 22.31±3.22

Статистический тест» N8 N8 Ив N8 N8

Примечание: * Ьтест для независимых выборок (тест Стьюдента); N8 - не

наблюдается значимого различия

Более продолжительное всасывание ноопепта после введения таблеток объясняется многостадийностью всасывания лекарственной формы.

Поскольку после введения таблеток ноопепта Сщ^ незначительно меньше С щи, полученного при введении внутрь субстанции, можно заключить, что применение данной лекарственной формы фактически не влияет и на степень всасывания препарата. Близкие величины значение АиСо-*», таблеток и

субстанции также свидетельствуют о сопоставимой степени всасывания ноопепта при переходе от раствора к лекарственной форме.

Сходный угол наклона терминального участка у фармакокинетических кривых (рис. 6) после введения внутрь субстанции и таблеток ноопепта указывает на недостоверные различия таких параметров как Т1/2 и к^. Так, в случае введения животным таблеток величина Т1/2 составила 0.30 ч, в случае введения субстанции - 0.25 ч (табл. 8). Несмотря на различия на фазе всасывания, профили кинетических кривых субстанции и таблеток ноопепта в целом сопоставимы. Величина относительной биодоступности таблеток ноопепта характеризуется незначительной вариабельностью и находится в интервале 94.07 -106.02 %, составляя в среднем 99.71±4.36 %.

В результате фармакокинетического изучения установлено, что таблетированная лекарственная форма ноопепта соответствуют по скорости всасывания из ЖКТ, и по степени достижения системного кровотока вводимому внутрь водному раствору ноопепта. Из этого следует, что вспомогательные вещества, входящие в таблетированную лекарственную форму, индифферентны в фармакокинетическом отношении.

ВЫВОДЫ

1. Разработана методика количественного определения ноопепта и его основных метаболитов в биологическом материале с использованием ВЭЖХ.

2. Установлены два параллельных пути биотрансформации ноопепта в плазме крови: первый - расщепление пептидной связи с образованием фенилацетилпролина, второй - дезацилирование с образованием фенилуксусной кислоты и циклопролилглицина, совпадающих с соответствующими эндогенными соединениями. В мозге обнаружены метаболиты, образующиеся только по второму пути.

3. Период полувыведения ноопепта после его внутривенного введения в 2-3 раза продолжительнее периода полувыведения незамещенных ди- и трипептидов.

4. После введения ноопепта внутрь препарат быстро всасывается и поступает в системный кровоток; при этом его абсолютная биодоступность составляет более 7 %.

5. Ноопепт проникает через гематоэнцефалический барьер и его концентрация в мозге крыс, начиная с 10-минутного интервала после внутривенного введения значительно превышает его уровень в плазме.

6. Разработанная в ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН таблетированная лекарственная форма ноопепта обладает высокой относительной биодоступностью и рекомендована для клинических исследований.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Фармакокинетика и ноотропный эффект дипептида ГВС-111 при разных путях введения// Тез. докл. VII Российского национального конгресса "Человек и Лекарство", - М., 2000. - с. 46 (соавт. Бойко С.С., Мирзоев Т.Х., Гудашева Т.А., Островская Р.У., Жердев В.П., Воронина Т.А.)

2. Фармакокинетика и основные пути биотрансформации дипептида ГВС-111 при разных способах введения// Тез. докл. VII Российского национального конгресса "Человек и Лекарство", - М., 2000. - с. 46 (соавт. Бойко С.С., Жердев В. П., Гудашева Т.А.., Островская Р.У.)

3. Фармакокинетика и проницаемость через гематоэнцефалический барьер нового ацилпролилдипептида с ноотропными свойствами после перорального введения// БЭБиМ. - 2000,- Т. 129, № 4. - с. 426-429 (соавт. Бойко С.С., Островская Р.У., Жердев В. П., Гудашева Т.А., Воронина Т.А., Середенин С.Б.)

4. Межвидовые различия фармакокинетики и биотрансформации нового ацилпролилдипептида с ноотропными свойствами ГВС-111// Тез. докл. 3-й Международной Конференции "Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам", -Суздаль, 2001. - с. 24 (соавт. Бойко С.С., Жердев В.П., Гудашева Т.А.)

5. Фармакокинетика нового потенциального дипептидного ноотропного препарата ГВС-111 и его метаболитов в мозге крыс// Хим. Фарм. Журн.-2001.- Т. 35, № 9. . с. 38-40 (соавт. Бойко С.С., Жердев В.П., Гудашева Т.А., Островская Р.У.)

6. Фармакокинетика и биотрансформация пролилсодержащего дипептида ноопепта у крыс// Тез. докл. 2-го Съезда Российского Научного Общества фармакологов, - М., 2003. - ч. I. - с.70 (соавт. Бойко С.С., Жердев В.П., Островская Р.У., Гудашева Т.А.)

7. Межвидовые различия фармакокинетики и биотрансформации ноопепта// Эксп. и кл. фармакол,- 2003. - в печати (соавт. Бойко С.С., Жердев В.П., Гудашева Т.А., Островская Р.У., Воронина Т.А.)

8. Экспериментальная фармакокинетика и биотрансформация ноопепта// Тез. докл. Российского симпозиума по химии и биологии пептидов, -М., 2003. - с. (соавт. Бойко С.С., Жердев В.П., Гудашева Т.А., Островская Р.У.)

Подписано в печать 9.10.2003 г. Формат 60x90, 1/16. Объем 1,75 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 586

Отпечатано в ООО "Фирма Блок" 107140, г. Москва, ул. Русаковская, д. 1. т. 264-30-73 \vww.blok01 centre.narod.ru Изготовление брошюр, авторефератов, переплет диссертаций.

'1 'J

i

"Tés 75

116895

Разнообразие и часто уникальность фармакологических эффектов эндогенных пептидов и их синтетических аналогов в сочетании с высокой активностью делают эти соединения перспективными в качестве потенциальных фармакологических средств. Современные достижения в создании лекарственных форм пептидов, позволившие в значительной степени преодолеть такие негативные характеристики этих соединений, как низкую устойчивость к протеолитическим ферментам, плохую всасываемость и низкую проницаемость через различные барьеры организма, в соединении с улучшенными методами производства привели к возрождению интереса фармацевтической промышленности к пептидным соединениям [1].

На сегодняшний день фармацевтический рынок пептидов насчитывает свыше 40 препаратов различных фармакологических групп, вакцин и диагностических продуктов [1]. Среди наиболее коммерчески успешных препаратов пептидной структуры, выпускаемых за рубежом, следует отметить аналоги люлиберина леупролид (leuprolide (Lupron®)) и госерелин (goserelin (Zoladex®)), ингибитор ангиотензин-конвертирующего фермента лизиноприл (lisinopril (Zestril® и Prinivil®)). В нашей стране также был создан ряд препаратов пептидной структуры. Это созданный в ВКНЦ АМН СССР под руководством академика Е.И. Чазова структурный аналог Leu-энкефалина противоязвенный препарат даларгин, разработанный под руководством академика И.П. Ашмарина на основе фрагмента АКТГ4.10 ноотропный препарат семакс и созданный под руководством академика В.И. Покровского на основе тимопоэтина иммуномодулятор имунофан.

Лекарственные средства пептидной природы интересны в качестве потенциальных ноотропов, поскольку в регуляции когнитивных функций основную роль играют нейропептиды [2]. В связи с большим количеством состояний, сопровождающихся нарушениями когнитивных функций таких как травма мозга, инсульты, хроническая церебро-васкулярная недостаточность и т.п., представляется необходимым разработка и внедрение в клиническую практику новых ноотропных препаратов пептидной структуры, поскольку в большинстве случаев пептидные препараты более эффективны, чем препараты из других химических групп [3].

Несмотря на значительный прогресс в создании лекарственных форм пептидных соединений, поиск пептидов, сохраняющих активность после приема внутрь, остается актуальным, поскольку именно этот путь введения предпочтителен при коррекции многих когнитивных нарушений, требующих проведения длительной терапии.

В ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН в результате целенаправленного создания лекарственных средств дипептидной природы на основе структуры известных непептидных препаратов [4], был создан оригинальный дипептид ноопепт, который имеет ноотропную активность, качественно и количественно превышающую активность классического ноотропа пирацетама [5], и при этом сохраняющий активность после приема внутрь [6].

Общеизвестно, что экспериментальное изучение фармакокинетики позволяет выявить закономерности концентрационных изменений лекарственного вещества в организме. Знание этих закономерностей способствует пониманию процессов всасывания, распределения и элиминации лекарственных средств, выяснению фармакокинетической составляющей биологической активности, идентификации и оценки основных метаболитов, выбору оптимальной лекарственной формы и пути введения. В конечном счете, изучение экспериментальной фармакокинетики направлено на решение главной задачи доклинических испытаний, заключающейся в обеспечении безопасного и эффективного использования лекарственных препаратов в клинике [7].

Актуальность темы.

Актуальность исследования определяется тем, что доклиническое щ изучение фармакокинетики и путей биотрансформации ноопепта является необходимым этапом на пути внедрения этого оригинального препарата в клиническую практику.

Целью настоящего исследования является изучение фармакокинетики и биотрансформации ноопепта в эксперименте на двух видах животных. Задачи исследования.

1. Разработать методики качественного и количественного анализа ноопепта и его предполагаемых метаболитов в биологическом материале.

2. Изучить фармакокинетику ноопепта после внутривенного и орального введения у крыс и кроликов.

3. Установить пути биотрансформации ноопепта после его внутривенного введения у крыс.

4. Оценить способность ноопепта проникать через гематоэнцефалический барьер.

5. Изучить фармакокинетику и определить относительную биологическую доступность таблетированной лекарственной формы ноопепта у кроликов.

Основные положения выносимые на защиту.

1. Установлены два параллельных пути биотрансформации ноопепта: путь с расщеплением пептидной связи и путь с дезацилированием, в результате которых образуются: N-фенилацетилпролин, фенилуксусная кислота и циклопролилглицин.

2. Абсолютная биологическая доступность составляет у крыс около 7 %, а у кроликов в среднем 10 %.

3. Ноопепт проникает через гематоэнцефалический барьер и его концентрация в мозге выше, чем в плазме. Тканевая доступность ноопепта для мозга составила 161 % .

4. Выявлены различия во времени всасывании ноопепта в системный кровоток после введения кроликам таблеток и вводимой внутрь субстанцией. Вспомогательные вещества, входящие в таблетированную лекарственную форму, не влияют на скорость и степень всасывания ноопепта. Относительная биологическая доступность таблеток ноопепта составила в среднем 99.7 %

Научная новизна работы.

В настоящем исследовании впервые изучено фармакокинетическое поведение и основные пути биотрансформации ноопепта у крыс и кроликов при разных путях введения субстанции и после введения таблеток ноопепта у кроликов. Показано, что при внутривенном пути введения неизмененный ноопепт регистрируется в плазме крови крыс в течение 25 мин и за это время происходит его биотрансформация с образованием трех метаболитов - N-фенилацетилпролина, фенилуксусной кислоты и циклопролилглицина. Выявлено, что процесс элиминации ноопепта у кроликов протекает менее интенсивно, что обуславливает его более длительную циркуляцию в плазме крови у этого вида животных. Показано, что ноопепт способен проникать через гематоэнцефалический барьер и его количественное содержание в мозге превышает его содержание в плазме крови. Установлено, что в мозге, помимо ноопепта, регистрируются два его метаболита — фенилуксусная кислота и циклопролилглицин. Эти метаболиты являются идентичными соответствующим эндогенным соединениям, причем идентификация циклопролилглицина в качестве эндогенного соединения проведена впервые. Показано на двух видах животных, что ноопепт после введения внутрь подвергается "эффекту первого прохождения". Впервые проведена оценка относительной биологической доступности таблеток ноопепта у кроликов.

Практическая значимость работы.

Данные о фармакокинетике и биотрансформации ноопепта вошли в материалы, представленные в Фармакологический комитет РФ для получения разрешения на клинические испытания таблеток ноопепта. Данные настоящего исследования могут быть полезными при разработке новых лекарственных форм ноопепта.

Связь темы диссертации с планом научно-исследовательских работ ГУ НИИ фармакологии РАМН.

Диссертация выполнена в соответствии с плановой темой НИР НИИ фармакологии РАМН "Изучение молекулярных и клеточных механизмов эндо- и экзогенной регуляции функций ЦНС, создание нейрохимических основ для разработки новых оригинальных нейротропных средств" и с подпрограммой "Создание лекарственных средств методами химического и биологического синтеза" ФЦНТП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники".

Апробация работы.

Основные результаты работы доложены на VIII Российском национальном конгрессе "Человек и Лекарство", а также на 3-й Международной Конференции "Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам".

Объем и структура диссертации.

Материалы диссертации изложены на 136 страницах и иллюстрированы 20 таблицами и 14 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, заключения и выводов. Библиография представлена 25 отечественными и 130 зарубежными работами.

ВЫВОДЫ

1. Разработана методика количественного определения ноопепта и его основных метаболитов в биологическом материале с использованием ВЭЖХ.

2. Установлены два параллельных пути биотрансформации ноопепта в плазме крови: первый - расщепление пептидной связи с образованием N-фенилацетилпролина, второй - дезацилирование с образованием фенилуксусной кислоты и циклопролилглицина, совпадающих с соответствующими эндогенными соединениями. В мозге обнаружены метаболиты, образующиеся только по второму пути.

3. Период полувыведения ноопепта после его внутривенного введения в 2-3 раза продолжительнее периода полувыведения незамещенных ди- и трипептидов.

4. После введения ноопепта внутрь препарат быстро всасывается и поступает в системный кровоток; при этом его абсолютная биодоступность составляет более 7 %.

5. Ноопепт проникает через гематоэнцефалический барьер и его концентрация в мозге крыс, начиная с 10-минутного интервала после внутривенного введения значительно превышает его уровень в плазме.

6. Разработанная в ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН таблетированная лекарственная форма ноопепта обладает высокой относительной биодоступностью и рекомендована для клинических исследований.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Известно, что интенсивность фармакологического эффекта зависит от фармакодинамических и фармакокинетических характеристик лекарственного средства. Другими словами, фармакокинетические свойства лекарственного средства, характеризующие процессы его всасывания, распределения и элиминации являются необходимыми факторами биологической активности. С этой точки зрения представляется важным, во-первых, выяснение взаимосвязи концентрации лекарственного средства, регистрируемого в изучаемом биоматериале, с выраженностью фармакологического эффекта, и, во-вторых, выявления таких фармакокинетических характеристик лекарственного средства, которые являлись бы определяющими в реализации активности.

Принимая во внимание выраженную зависимость эффекта ноопепта от дозы [5, 6, 147], можно предположить, что определяющим фармакокинетическим фактором, обусловливающим реализацию эффекта этого ноотропа будет площадь под фармакокинетической кривой или значение максимальной концентрации. Вместе с тем, интенсивная элиминация ноопепта предопределяет его низкий концентрационный уровень в плазме крови, следствием чего явилась необходимость использовать в фармакокинетическом исследовании дозы, значительно превышающие эффективные. В связи с этим представляется затруднительным оценка минимально эффективной площади под фармакокинетической кривой, то есть такой величины AUC, которая была бы способна реализовать фармакологический эффект.

Во многих случаях, интенсивный метаболизм лекарственного средства приводит к снижению фармакологической активности или к её видоизменению. Для ноопепта следствием быстрого исчезновения из организма является расхождение во времени детектирования его в плазме крови или ткани мозга со временем регистрации ноотропной активности, то есть оцениваемые ноотропные эффекты ноопепта наблюдались уже после окончания циркуляции данного дипептида в организме. Несопоставимость во времени проявления эффекта, и профиля концентрационной кривой лекарственного средства в организме обычно подразумевает отсутствие корреляционной зависимости между эффектом и концентрацией. В этом случае, наиболее вероятными механизмами реализации эффекта представляется либо действие, опосредованное активными метаболитами, либо "запуск" ноопептом эндогенных механизмов, формирующих эффект. Если ноопепт является пролекарством, то предполагаемый активный метаболит должен, во-первых, проникать через гематоэнцефалический барьер после его введения, во-вторых, биологическая активность этого метаболита должны быть полностью сопоставима с фармакологическими эффектами исходного соединения.

Следовательно, для ответа на вышепоставленный вопрос необходимо сравнить биологическую активность метаболитов, способных к проникновению через гематоэнцефалический барьер, с фармакологическим эффектом исходного соединения.

В настоящем исследовании было установлено, что после внутривенного введения ноопепта в мозге определяются два метаболита - фенилуксусная кислота и циклопролилглицин.

По литературным данным, фенилуксусная кислота присутствует в организме человека и животных в мозге [146], в цереброспинальной жидкости [148], в плазме крови [149] и в моче [150]. Согласно результатам исследований последних лет, фенилуксусная кислота имеет высокую степень проникновения через гематоэнцефалический барьер, причем ее концентрация в мозге крыс регулируется не только за счет образования конъюгатов, но также и за счет транспорта из мозга [146]. В плазме крови крыс 90 % от всего содержания фенилуксусной кислоты находится в связанном состоянии в виде конъюгата с глютатионом, и только 10 % определяется в свободном виде [146].

Большое количество зарубежных публикаций, посвященных биологической активности фенилуксусной кислоты обусловлено её способностью подавлять рост опухолевых клеток различного происхождения без проявления общей токсичности [151]. Цитотоксическое действие фенилуксусной кислоты связано с подавлением генной экспрессии злокачественных клеток, причем независимо от фазы их клеточного цикла [152]. К настоящему времени, в США проходят клинические испытания этой кислоты в качестве противоопухолевого средства, используемого для лечения рака мозга и предстательной железы. Сообщалось [153] об изучении фармакокинетики фенилуксусной кислоты после внутривенного введения онкологическим пациентам. Было установлено, что фармакокинетика фенилуксусной кислоты имеет нелинейный характер, и что интенсивная элиминация является результатом быстрого образования конъюгата фенилуксусной кислоты, в виде которого она экскретируется с мочой в количестве 99 % от введенной дозы.

Вместе с тем, в доступной автору литературе, посвященной и эндогенной, и изучаемой после введения в условиях эксперимента и клиники фенилуксусной кислоты, отсутствуют сведения о ноотропной активности этого соединения.

Другим метаболитом, обнаруживаемым в ткани мозга крыс после введения ноопепта, является циклопролилглицин. Как и в случае с фенилуксусной кислотой, данный метаболит детектировался в биологических образцах опытных и контрольных животных. Это обстоятельство послужило основанием для предположения об эндогенной природе данного циклодипептида, что впоследствии и было подтверждено различными инструментальными методами. Всесторонний фармакологический анализ циклопролилглицина, выполненный в лаборатории психофармакологии ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН свидетельствует, во-первых, что циклопролилглицин имеет выраженную антиамнестическую активность, регистрируемую после внутрибрюшинного введения в дозах, сопоставимых с активными дозами ноопепта (0.1 — 1.0 мг/кг); во-вторых, что он обладает и значительной мнестической активностью [154]. Таким образом, циклопролилглицин, как и исходное соединение, обладает выраженным ноотропным эффектом. Однако при дальнейшем [147] изучении фармакологии циклопролилглицина, были отмечены различия во влияниях этого эндогенного циклодипептида и ноопепта на фазы памяти. В отличие от ноопепта, который способен облегчать все фазы памяти, включающие ввод информации, её консолидацию и извлечение, циклопролилглицин оказывает влияние только на начальные фазы. При этом, в отличие от ноопепта, влияние циклопролилглицина на извлечение информации напротив имеет тенденцию к торможению воспроизведения памятного следа [147].

Из приведенных данных следует, что ноотропный эффект ноопепта качественно отличается от сопоставляемого эффекта циклопролилглицина, и, следовательно, можно утверждать, что ноопепт не является пролекарством, хотя и возможен вклад этого метаболита в ноотропную активность ноопепта.

Другая возможность реализации эффекта ноопепта, отсроченного от времени его циркуляции в организме, может осуществляться по принципу "появился и исчез". Предполагается, что определенное количество ноопепта достигая клетку-мишень "запускает" эндогенные процессы, влияющие на формирование механизмов памяти. С фармакокинетической точки зрения, возможность реализация такого эффекта будет зависеть от минимального значения параметров Со или Стах (в зависимости от способа введения), которое бы обеспечило нахождение ноопепта в месте непосредственного приложения в количестве, достаточным для такого "запуска". Не рассматривая проблемы механизмов клеточного действия ноопепта на формирование памяти, можно предположить, что такой процесс, связанный с функциональными изменениями, будет продолжителен по времени и, следовательно, нахождение ноопепта в плазме крови и его действие будут разобщены во времени.

С предположениями, высказанными выше, согласуются данные о сохранении активности ноопепта после орального введения [6]. Во-первых, обычно пролекарство характеризуется изменением фармакологической активности после орального введения, что не наблюдалось у ноопепта, во-вторых, низкое значение биодоступности ноопепта при условии зависимости концентрации от эффекта предполагала бы отсутствие последнего.

В настоящее время предлагается [155] биофармацевтическая классификация лекарственных средств согласно их растворимости в воде и способности к проницаемости через биологические мембраны. Предполагается, что лекарственные средства, сгруппированные в один из 4 возможных классов по принципу отношения к вышеуказанным признакам, будут иметь сходное поведение при оценки биодоступности. Согласно этой классификации, ноопепт относится к группе И, в которую выделены лекарственные средства по таким признакам как низкая растворимость в воде и высокая проницаемость через биологические мембраны. Считается, что для этой группы фактором, ограничивающим биодоступность может выступать растворимость лекарственного средства в условиях in vivo, в связи с чем рекомендуется проводить тщательное изучение растворимости при физиологических значениях рН, в различных средах и по разным методикам.

По-видимому, растворимость ноопепта в условиях in vivo, не является причиной его низкой биодоступности (см. 3.4.4.). Можно утверждать, что низкая биодоступность ноопепта является результатом незначительной степени его всасывания в системный кровоток из-за интенсивной пресистемной биотрансформации, протекающей в кишечнике. А это означает возможность увеличения биодоступности с помощью биофармацевтических подходов без химической модификации исходного соединения.

Одной из задач настоящего исследования являлась оценка относительной биодоступности разработанной в опытно-технологическом отделе ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН лекарственной формы ноопепта — таблеток. В результате фармакокинетического изучения установлено, что таблетированная лекарственная форма ноопепта соответствуют по скорости всасывания из ЖКТ, и по степени достижения системного кровотока вводимому внутрь водному раствору ноопепта. Из этого следует, что вспомогательные вещества, входящие в таблетированную лекарственную форму, индифферентны в фармакокинетическом отношении.

Можно отметить, что с помощью использования вспомогательных веществ, возможно значительно снизить потери лекарственного вещества в желудочно-кишечном тракте. Поскольку, как указывалось выше, низкая биодоступность ноопепта является следствием именно биотрансформации, то в роли таких вспомогательных веществ должны выступать ингибиторы ферментов. В биофармацевтической практике в этом качестве, например, рассматривают: бестатин (bestatin); пепстатин (pepstatin); арфанамин (arphanamine) и ряд других специфических ингибиторов [10].

Возможно использование и других биофармацевтических подходов, реализуемых в настоящее время при создании препаратов на основе пептидов. Эти подходы позволяют преодолевать такие негативные характеристики этих соединений, как низкую устойчивость к протеолитическим ферментам, плохую всасываемость и их низкую проницаемость через различные барьеры организма включая слизистые оболочки. Наиболее успешной лекарственных формой для пептидов следует признать терапевтические системы с длительным высвобождением действующего начала, в частности, такой подход был реализован при создании нафарелина (nafarelin) и золадекса (zoladex) [1].

В заключение можно отметить, что современные достижения в области создания и производства пептидов обеспечили бурный рост количества препаратов этой группы в последние пять лет, и, возможно с началом использования проекта "геном человека" в терапии, пептидные соединения станут наиболее жизнеспособными кандидатам в фармакологические вещества.

117