Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Эффективность внутривенного введения препарата CoQ10 на моделях обратимой и необратимой ишемии миокарда

На правах рукописи

Иванов Александр Владимирович

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ВНУТРИВЕННОГО ВВЕДЕНИЯ ПРЕПАРАТА Со(3,0 НА МОДЕЛЯХ ОБРАТИМОЙ И НЕОБРАТИМОЙ ИШЕМИИ МИОКАРДА

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

! 7 НОЯ 2013

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2013

005537673

005537673

Работа выполнена на факультете фундаментальной медицины Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор Медведев Олег Стефанович

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией фармакологии цереброваскулярных расстройств ФГБУ "НИИ фармакологии

имени В.В .Закусова" РАМН Мирзоян Рубен Симонович

Доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой медико-социальной экспертизы и поликлинической терапии факультета послевузовского профессионального образования ГБОУ ВПО

«Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» МЗ РФ Сизова Жанна Михаиловна

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита диссертации состоится «/» ^ 2013 года в [-часов на заседании

диссертационного совета Д 001.024.01, созданного на базе ФГБУ "НИИ фармакологии имени В.В. Закусова" РАМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в ученой части ФГБУ "НИИ фармакологии имени В.В. Закусова" РАМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, д.8.

Автореферат разослан » ^_2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Вальдман Елена Артуровна

Актуальность темы. Инфаркт миокарда (ИМ), как проявление ишемической болезни сердца, является одной из важнейших проблем здравоохранения в мире и основной причиной заболеваемости и смертности (Fox et al. 2007). Ежегодно от ИМ умирают 3,8 млн. мужчин и 3,4 млн. женщин (Yellon et al. 2007), из них 30% умирают до и 5% -после госпитализации (Roger et al. 2007). Гибель миокарда наступает в результате окклюзии коронарной артерии. Восстановление коронарного кровотока ограничивает некроз ишемизированного миокарда, но, с другой стороны, реперфурзия сама вносит вклад в повреждение сердечной мышцы (Gross et al. 2007). Реперфузия инициирует продукцию свободных радикалов, внутриклеточную перегрузку Са2+, быструю смену значений рН, воспалительный ответ (Liehn et al. 2011; Vinten-Johansen et al. 2007). Если коронарный кровоток не восстановлен и сердце не получает кислород в течение длительного периода, ишемизированная, но еще жизнеспособная ткань подвергается необратимому повреждению и погибает.

Во время ишемии накапливается избыточное количество свободных радикалов, в частности, активных форм кислорода (АФК), запускающих открытие митохондриальных пор высокой проницаемости (тРТР), что приводит к гибели кардиомиоцитов (Dongo et al. 2011, Halestrap et al. 2009). Эндогенные антиоксиданты - естественные кардиопротек-торы от ишемического/реперфузионного повреждения (Turer et al. 2010). Ингибирование продукции АФК, открытия тРТР и ограничение интенсивности воспаления ИМ животных значительно уменьшает повреждение миокарда (Liehn et al. 2011).

Коэнзим Q10 (CoQ10) - жирорастворимый антиоксидант, синтезируемый эндогенно и в достаточных количествах у здоровых людей (Turunen et al. 2004). Содержание CoQm в плазме значительно снижено у людей с сердечно-сосудистыми заболеваниями (Kumar et al. 2009; Littarru et al. 2010 и является независимым предиктором смертности в когорте пациентов с хронической сердечной недостаточностью (ХСН) (Molyneux et al. 2008).

CoQio - необходимое звено митохондриальной дыхательной цепи. Хорошо установлены его антиоксидантные свойства (Bentinger et al. 2007). CoQio предотвращает открытие тРТР и препятствует деструкции митохондрий (Papucci et al. 2003), модулирует воспалительный ответ, влияя на экспрессию NFkBl-зависимых генов (Schmelzer et al. 2007), ограничивает эндотелиальную дисфункцию, стимулируя высвобождение эндотелием оксида азота NO (Hamilton et al. 2007). Кардиопротективные эффекты CoQio были

показаны в экспериментальных условиях на изолированных сердцах (Crestanello et al 2002; Maulik et al. 2000, Niibori et al. 1999), единичные работы проведены in vivo (Кале-никова Е.И. и др. 2007; Verma et al. 2007). Часть этих эффектов подтверждена в клинике (Makhija et al 2008; Rosenfeldt et al 2005; Rosenfeldt et al 2002).

Из-за липофильной структуры и низкой растворимости в воде биодоступность CoQio крайне низкая (2-3%) (Zhang et al. 1995). Уровни CoQ10 после приемаper os повышаются медленно в течение первых 1-2 часов, пик плазменной концентрации наблюдается к 6-8 часам (Miles et al. 2007). Для повышения его миокардиальных уровней и развития кардиопротективных эффектов CoQ10 следует принимать длительно (Каленикова Е.И. и др. 2007). В экстренных ситуациях, таких как ИМ, необходимо быстро защитить сердце от ишемии. Скорое пополнение миокардиального содержания CoQio может быть достигнуто после его внутривенного (в/в) введения.

В связи с вышеизложенным целью настоящего исследования была оценка эффективности экстренного пополнения миокардиальных уровней CoQ10 путем внутривенного введения раствора солюбилизированного CoQio для защиты миокарда от обратимой и необратимой ишемии.

Задачи исследования.

1. Оценить возможность повышения уровней CoQ]0 в интактном миокарде после однократного в/в введения препарата CoQio.

2. На модели экспериментальной ишемии и последующей реперфузии левого желудочка (ЛЖ) оценить влияние предварительного в/в введения препарата CoQio на степень нарушения сердечного ритма, степень ишемического/реперфузионного повреждения миокарда, тканевое содержание CoQio в конце реперфузии.

3. На модели необратимой ишемии миокарда и последующего в/в введения препарата CoQio оценить на 21 сутки содержание CoQio в миокарде, плазме и печени, степень повреждения и развития постинфарктной гипертрофии миокарда, функциональное состояние ЛЖ.

4. На модели необратимой ишемии миокарда оценить границы терапевтического окна для эффективного в/в введения препарата CoQio через 10, 60 или 180 мин после начала ишемии.

Научная новизна работы

1. Впервые показана возможность быстрого повышения уровней CoQio в миокарде через 30 мин после однократного в/в введения препарата CoQio в дозе 30 мг/кг.

2. На модели ишемии/реперфузии миокарда впервые были выявлены кардиопротек-тивные эффекты однократного в/в введения препарата CoQio в дозе 30 мг/кг. Впервые выявлена обратная взаимосвязь между содержанием CoQio в миокарде и размером инфарктной зоны. Показано, что содержание CoQ]0 в миокарде повышено через 180 мин после однократного в/в введения препарата CoQio.

3. Впервые исследована возможность защиты миокарда с помощью однократного в/в введения препарата CoQio в дозе 30 мг/кг после начала необратимой ишемии. На модели необратимой ишемии миокарда впервые исследованы отдаленные кардиопротективные эффекты препарата CoQio. Впервые выявлены повышенные плазменные и тканевые уровни CoQio на 21 сутки от момента введения препарата. Впервые показана взаимосвязь между содержанием CoQio в ЛЖ и функциональными параметрами ЛЖ. Впервые показано, что однократная в/в инъекция CoQio предотвращает развитие гипертрофии правого желудочка (ПЖ) после ИМ и ограничивает повреждение ЛЖ.

Научно-практическая значимость работы

Полученные в результате настоящей работы данные об эффектах препарата CoQio существенно дополняют имеющиеся сведения о данном препарате и могут быть использованы для разработки форм для в/в введения и для создания рекомендаций по их применению в клинической практике. Экспериментальные подходы, использованные в данной работе, могут быть использованы для оценки эффективности других кардиопротек-тивных средств. Результаты исследований функционального состояния ЛЖ после ИМ использованы в процессе обучения студентов факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова на лекциях по фармакологии и физиологии человека.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Возможно быстрое повышение миокардильных уровней CoQio после его однократного в/в введения.

2. Профилактическое повышение миокардильных уровней CoQio с помощью внутривенного введения CoQio защищает миокард от ишемического/реперфузионного повреждения.

3. В/в введение препарата CoQio после начала ИМ ограничивает ишемическое повреждение.

Личный вклад автора

Автор работы является основным исполнителем проведенного исследования на всех этапах: анализа данных литературы по теме диссертационной работы, проведения экспериментальной части исследования, обработки и анализа полученных результатов, формулировании выводов и рекомендаций. При непосредственном участии автора подготовлены публикации по результатам работы.

Публикации: основные положения диссертационной работы нашли отражение в 12 опубликованных в печати научных работах: 2 статьях, опубликованных в журналах, входящих в список, рекомендованных ВАК РФ, 1 статье, опубликованной в иностранном рецензируемом журнале из списка Academic Journals Database, и 9 тезисах, опубликованных в материалах российских и международных конференций. Результаты работы доложены на 23-ей ежегодной конференции Европейского общества по профилактике гипер-тензии и сердечно-сосудистых заболеваний (Италия, Милан, 2013), 7-ой конференции международной ассоциации CoQio (Испания, Севилья, 2012), XIX российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Россия, Москва, 2012), 21-ой ежегодной конференции Европейского общества по профилактике гипертензии и сердечно-сосудистых заболеваний (Италия, Милан, 2011), III Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика-2010 (Россия, Москва, 2010); на заседаниях кафедр фармакологии и фармацевтической химии, фармакогнозии и организации фармацевтического дела факультета фундаментальной медицины МГУ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка цитируемой литературы (258 источников, в том числе 14 отечественных и 244 зарубежных) и приложения, иллюстрирована 36 рисунками и 15 таблицами.

Материалы и методы исследования

Животные. Работа выполнена на самцах крыс Wistar, содержавшихся в условиях 12/12-часового светового режима и получавших стандартный корм и питьевую воду ad libitum. Все процедуры выполнены в соответствии с руководством Guide for the Care and

Use of Laboratory Animals после одобрения комитетом по биоэтике МГУ имени М.В.Ломоносова. В качестве наркоза использовали пентобарбитал натрия (45 мг/кг, вну-трибрюшинно). Во всех экспериментах вводили в/в CoQw в дозе 30 мг/кг в составе лекарственного препарата для медицинского применения «Кудесан раствор» (Аквион, Россия) либо физиологический раствор (физ.р-р, 0.9% NaCl, 1 мл/кг). Высокая кардиопро-тективная эффективность CoQio в дозе 10 мг/кг была выявлена ранее на модели ИМ крысы при введении внутрь в течение 3-х недель до и 3-х недель после окклюзии (Каленико-ва и дре., 2007). Впервые оценивая эффективность в/в введения, была увеличена доза CoQio до 30 мг/кг для получения принципиального ответа - эффективна ли однократная инъекция для увеличения его тканевого содержания и кардиопротекции.

1. Оценка содержания CoOin в миокарде крысы после однократного в/в введения препарата СоОш. Животным через полиэтиленовый катетер Р10/Р50 в бедренной вене вводили либо физ.р-р - группа «контроль» (п=7), либо CoQio - группа «CoQio» (п=5). Через 30 мин после инъекции животных умерщвляли (ЗМ KCl, 2 мл в/в), сердца извлекали и хранили при -20° С до анализа. Количественный анализ миокардиальных уровней CoQio был проведен с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с электрохимическим детектированием по методике, описанной ранее (Каленикова и др. 2007).

2. Оценка карднопротектнвной эффективности предварительного в/в введения препарата СоОш на модели ишемии-реперфузни.

Подготовка животных. Наркотизированных крыс (п=30) помещали на термостати-руемый операционный стол (постоянная температура тела животного 37,5±0,5°С). В качестве поддерживающего наркоза проводили постоянную инфузию пентобарбитала натрия (20 мг/мл, 200 цл/ч) через пластиковый катетер в бедренной вене. Для контроля артериального давления (АД) катетер в бедренной артерии подключали к измерительной установке «Macintosh - MacLab» («ADInstruments», Австралия), среднее АД определяли по формуле АДср=(АДсист+ 2хАДдИ1СТ)/3, где АД.,, - среднее АД, АДсИСТ - систолическое АД, АДдиаст - диастолическое АД. Сердечный ритм записывали с помощью ЭКГ в I отведении («MacLab», «ADInstruments», Австралия).

Модель обратимой ишемии миокарда. После интубации и подключения к аппарату искусственной вентиляции легких (ИВЛ, Inspira Advanced Safety Ventilator, Volume

7

Controlled 55-7058, Harvard Apparatus) выполняли левую торакотомию с удалением 4го ребра; под переднюю нисходящую ветвь левой коронарной артерии с помощью атравма-тичной иглы подводили лигатуру и оставляли животных на 30 мин для стабилизации показателей. За 30 мин до ишемии вводили в/в либо физ.р-р (группа «И/Р», п=11), либо CoQio (группа «CoQio+И/Р», п=10). Использована модель ишемии-реперфузии, вызванная временной окклюзией (30 мин) коронарной артерии с последующей реперфузией (120 мин). Ложнооперированным животным (группа «Ложная операция», п=9) вводили физ.р-р и проводили аналогичные манипуляции за исключением окклюзии коронарной артерии. Оценивали величину зоны некроза ЛЖ, частоту эпизодов аритмий и их длительность, изменение АД в ходе эксперимента, определяли содержание CoQio в миокарде ЛЖ.

Степень повреждения миокарда. Для определения зон риска и некроза с помощью методики "двойного окрашивания" по окончании реперфузии повторно перевязывали коронарную артерию и вводили в/в взвесь синего Эванса (5%, 0,5 мл). Животных умерщвляли (ЗМ KCl, 2 мл, в/в), сердца извлекали, отделяли ЛЖ. Окрашенный синим Эванса ЛЖ разделяли по оси от верхушки до основания на 5 продольных срезов и помещали при 37° С на 15 мин в 1% раствор трифенилтетразолия хлорида (ТТХ) в фосфатном буфере (рН=7,4). Определяли размер зоны риска как процентное отношение общей площади ишемизированных сегментов к общей площади срезов и размер зоны некроза как процентное отношение общей площади некроза к общей площади ишемизированных сегментов. После анализа срезы хранили при -20° С до количественного определения CoQl0 в миокарде методом ВЭЖХ с электрохимическим детектированием.

Анализ аритмий. Анализ частоты возникновения и тяжести желудочковых тахиа-ритмий (ЖТА) проводили в соответствии с международными рекомендациями Lambeth Conventions по критериям: 1) наличие эпизодов ЖТА (число животных, у которых развились нарушения ритма); 2) число эпизодов ЖТА у одного животного; 3) время наступления первого эпизода ЖТА; 4) суммарная продолжительность эпизодов ЖТА у одного животного; 5) число животных, у которых развились летальные ЖТА.

3. Оценка кардиопротективной эффективности в/в введения СоОш после начала необратимой ишемии миокарда была проведена на 3-х независимых сериях экспериментов (п=117) с в/в введением исследуемых веществ через 10 мин (п=37), 60 мин

(п=48) или 180 мин (п=32) после окклюзии коронарной артерии. Через 21 день после начала ИМ эффекты введения препарата CoQio оценивали по степени повреждения миокарда, постинфарктной гипертрофии ЛЖ и ПЖ, содержанию CoQ10 в миокарде, печени и плазме; в сериях 10- и 60-мин также по функции ЛЖ.

Модель необратимой ишемии миокарда. Постоянную ишемию миокарда осуществляли аналогично методике, описанной во второй части экспериментов, за исключением этапа реперфузии миокарда. После окклюзии коронарной артерии производили послойное ушивание раны (межреберные мышцы, поверхностные мышцы, кожа). После отключения аппарата ИВЛ и восстановления самостоятельного дыхания эндотрахеаль-ную трубку вынимали.

Введение веществ. Введение препарата CoQio (группы «ИМ+CoQio») либо физ.р-ра (группы «ИМ») осуществляли через 10, 60 или 180 мин после начала ИМ, ложноопери-рованным животным (группа «Л.операция») вводили физ.р-р. Для профилактики гнойно-септических осложнений вводили гентамицин (4 мг/кг/сут, внутрибрюшинно) сразу после операции и в течение 2х последующих дней.

Измерение функции ЛЖ. Давление-объем ЛЖ регистрировали с помощью кате-терного датчика Millar (1.4-Fr, SPR-838, Millar Instruments, Houston, TX), установленного в ЛЖ ретроградно через правую общую сонную артерию наркотизированных крыс в условиях закрытой грудной клетки. На конце датчика расположены датчик давления и четыре электрода для определения объема ЛЖ с помощью системы Pressure Volume Conductance System. Регистрацию и обработку данных осуществляли в программной среде Chart5 for Windows и PVAN 3.5 (Millar Instruments). На основе записанных данных рассчитывали показатели: частота сердечных сокращений (ЧСС, ударов/мин), конечно-систолический объем (КСО, мкл), конечно-диастолический объем (КДО, мкл), конечно-систолическое давление (КСД, мм рт.ст.), конечно-диастолическое давление (КДД, мм рт.ст.), ударный объем (УО, мкл), фракция выброса (ФВ, %), сердечный выброс (СВ, мл/мин), сократимость миокарда (dP/dtmax мм рт.ст./сек), расслабление миокарда (dP/dtmin, мм рт.ст./сек).

После измерений отбирали пробу крови и центрифугировали; плазму хранили при -20° С до анализа. Животных умерщвляли (ЗМ KCl, 2 мл в/в), выделяли желудочки сердца и образцы печени. Подсчитывали индексы массы ЛЖ и ПЖ как отношение массы желу-

дочка (г) к массе животного (кг). ЛЖ разделяли на 5 продольных срезов по оси от верхушки до основания и помещали при 37° на 15 мин в 1% раствор ТТХ в фосфатном буфере (рН=7,4). Планиметрически определяли зону некроза. Образцы печени и миокарда хранили при -20° С до количественного анализа CoQi0 методом ВЭЖХ с электрохимическим детектированием.

Статистический анализ и представление данных. Данные представлены в виде "среднее ± стандартное отклонение". В серии опытов с необратимой ишемией миокарда изменение параметров функции ЛЖ и уровни CoQ,o групп «ИМ» и «ИМ+CoQio» представлены в % отношении к соответствующим показателям группы «Л.операция». Статистическую значимость различий (р <0,05) между группами оценивали в Statistica 8.0 с помощью однофакторного дисперсионного анализа (one-way ANOVA) с последующим post hoc анализом множественных сравнений (метод Student-Newman-Keuls). Категориальные значения сравнивали с помощью теста Фишера.

Результаты исследования и их обсуждение

1. Возможность повышения содержания СоО™ в миокарде крысы через 30 мин после однократного в/в введения СоОш. Однократное в/в введение препарата CoQ10 привело к повышению его количества в интактном миокарде через 30 мин на 18,5% (р<0,05) относительно контрольных животных.

Ранее было показано, что ежедневное введение CoQ10 внутрь в дозе 10 мг/кг в течение 3-х недель приводит к пополнению его миокардиальных уровней на 20-30%, и этого прироста достаточно для ограничения последующего ишемического повреждения (Кале-никова и др. 2007). В данной работе выявлено, что через 30 мин после однократного в/в введения препарата CoQ10 наблюдается сходное повышение его содержания в миокарде. Этот факт обусловил выбор момента введения и дозы CoQio в серии экспериментов с ишемией-реперфузией и необратимой ишемией миокарда.

2. Оценка кардиопротективной эффективности предварительного в/в введения CoOin на модели ишемии-реперфузии.

В периоде ишемии животные инфарктных групп не различались по характеристикам аритмий. В начале реперфузии аритмии возникли у 8 из 9 животных в группе «И/Р» и у 2 из 9 животных в группе «CoQ10+H/P». В группе «CoQio+И/Р» реперфузионные

аритмии возникали позже и длились меньше (табл. 1). Исходные значения АДср были сопоставимы во всех группах, что указывает на одинаковые исходные условия (рис. I). Ишемия/реперфузия привела к постоянному снижению АДср. У группы «СоСЫ+И/Р» не выявлено отличий АДср от группы «И/Р». У ложнооперированных животных наблюдалось небольшое снижение АДср на всем протяжении эксперимента, что вероятно связано с постоянной инфузией пентобарбитала натрия.

Таблица 1. Нарушение сердечного ритма у крыс с ишемией/реперфузией миокарда.

Ишемия Реперфузия

ИР Со(21о+ИР ИР СоОю+ИР

Количество животных, п 11 10 9 9

Летальные ЖТА * (п) 2 1 0 0

Число животных с ЖТА (п) 8 8 8 2

Число эпизодов ЖТА у 1го животного 6,7±1,4 6,5±2,2 5,1±1,7 6,5±3,5

Время наступления первого эпизода ЖТА, сек 364±55 374±62 14±13 40±8

Суммарная продолжительность эпизодов ЖТА у одного животного, сек 103±41 92±58 52±17 26±14

* ЖТА - желудочковые тахиаритмии 120 -,

С 80 -

о. £ £

и

5 40 -

О

О 10 20 30 45 60 90 150 Время, мин

Рисунок 1. Изменение АДср животных из различных экспериментальных групп в течение всего опыта. *- р<0,05 в сравнении с исходным значением, # - р<0,05 в сравнении с группой «Ложная операция».

При равных величинах зоны риска в двух экспериментальных группах размер зоны некроза в группе «И/Р» составил 47±6%, в группе «СоСЬо+И/Р» - 31±7% (рис. 2А, 3). В результате в/в введения препарата СоС>ю произошло повышение его содержания в мио-

-Ложная операция -«-И/Р -*-СоСЦ0+И/Р

Ишемия 30 мин

Реперфузия120 мин

карде и печени. Через 180 мин после введения уровень CoQio в группе «CoQ10+HP» был выше в ЛЖ на 210% (р<0,01), в печени на 2081% (р<0,01) относительное группы «ИР». Анализ соотношения размера зоны некроза и содержания CoQi0 в миокарде животных из групп «И/Р» и «CoCho+И/Р» выявил, что большему количеству CoQ10 в миокарде соответствует меньший размер зоны некроза (г= - 0,774, р<0,001), рис. 2В.

60

I' gi. I ■

! I

_ ■_

А

Зона риска, %

Зона некроза, %

„ 60 п X

^ 40

20

А

А А

А

И/Р В CoQ10+ И/Р

В

О 20 40

CoQ10 в ЛЖ, мкг/г

60

Рисунок 2. А. Размер зоны риска и зоны некроза у крыс после однократного в/в введения физ.р-ра (И/Р) или препарата СоСЗю (СоСЬо+И/Р) за 30 мин до ишемии-реперфузии. * - р<0,01 в сравнении с группой «И/Р». В. Соотношение между содержанием СоСЗю в миокарде ЛЖ и размером зоны некроза ЛЖ у крыс после 30 мин ишемии и 120 мин реперфузии (г=-0,774, р=0,0002).

Ишемия (30 мин) и реперфузия (120 мин

CoQIO + ишемия (30 мин) и реперфузия (120 мин)

Рисунок 3. Срезы миокарда ЛЖ животного из группы «И/Р» (А) и «Со(2ю+И/Р» (С) после 30 мин ишемии и 120 мин реперфузии, окрашенные ТТХ и синим Эванса. В,Б - те же срезы с обозначенными зоной риска (красный цвет) и зоной некроза (белый цвет). В/в инъекция препарата СоСЬо (30 мг/кг) за 30 мин до окклюзии привела к ограничению необратимого повреждения миокарда.

Выявленный противоаритмический эффект CoQ10 в периоде реперфузии (уменьшение частоты возникновения и длительности аритмий) и отсутствие различий в периоде ишемии может быть признаком того, что CoQio ограничивает именно реперфузионное повреждение миокарда.

Немногочисленные экспериментальные исследования показали, что предварительное внутрикоронарное (Verma et al. 2007) или в/в введение (Niibori et al. 1999;; Whitman

й а1. 1997) липосомальных форм Со(Зю повышает уровни Со(310 в миокарде, ограничивает зону ишемического-реперфузионного повреждения и поддерживает функциональное состояние сердечной мышцы. В данной работе продемонстрировано, что внутривенное введение раствора солюбилизированного Со(Зю защищает миокард от последующей ишемии-реперфузии не менее эффективно, чем липосомальные формы, причем достигнутое повышение миокардиальных уровней СоС210 приводит к пропорциональному снижению зоны некроза. Взаимосвязь между тканевыми уровнями СоСЬо и выраженностью сердечо-сосудистой патологии выявлена и в клинике: у пациентов с ХСН сниженный уровень Со(Зю тесно коррелирует со смертностью (Мо1упеих е1 а1. 2008).

Таким образом, однократное предварительное внутривенное введение препарата СоСЬо в дозе 30 мг/кг обеспечивает быстрое повышение его уровней в сердечной мышце, что сопровождается ограничением ишемического-реперфузионного повреждения миокарда: снижением зоны некроза, количества эпизодов и длительности реперфузионных аритмий. Выявленный эффект может быть полезен при плановых операциях на сердце и в экстренных случаях, в частности, во время восстановления коронарного кровотока при инфаркте.

3. Оценка кардиопротективной эффективности в/в введения СоО™ после начала необратимой ишемии миокарда.

Всего в ходе работы над данной частью работы было прооперировано 117 животных в трех независимых сериях изучения введения препарата СоСЬо через 10 мин, 60 мин или 180 мин после окклюзии коронарной артерии (табл. 2).

Во всех экспериментах необратимая окклюзия коронарной артерии с последующим введением физ.р-ра (группы «ИМ») привела к некрозу миокарда и его замещению соединительно-тканной аневризмой в бассейне окклюдированной артерии (рис. 4). Внутривенное введение препарата Со<Зю ограничило повреждение сердечной мышцы в группах «ИМ+СоС2ю» с введением СоСЬо в дозе 30 мг/кг через 10 или 60 мин после окклюзии.

Таблица 2. Экспериментальные группы для изучения кардиопротективных эффектов пре-

Время введения после окклюзии Вес крыс, г Всего, п Выжило, 24ч после операции,п ИМ ИМ+CoQio Л.операция

10 мин 364±26 37 26 (70%) 8 11 7

60 мин 403±42 48 31 (65%) 9 12 10

180 мин 362±31 32 24 (75%) 9 8 7

Л.операция

им+Соши

О о о

J**' "»¿^

М U W

9 а ^

Общгя длина экр^жности

10 мин

60 мин

Длима руб jd

Рисунок 4. Влияние введения препарата CoQio на размеры зоны инфаркта. CoQio или физ.р-р были введены в/в через 10 мин (А), 60 мин (В) или 180 мин (С) после окклюзии коронарной артерии/ложной операции. Срезы сделаны на 21 й день после лигирования, окраска ТТХ. CoQio, введенный в/в через 10 мин или 60 мин после окклюзии, ограничил расширение камеры ЛЖ и формирование аневризмы; соединительная ткань локализована в толще стенки ЛЖ. D. Изображение ЛЖ на 21-й день после окклюзии коронарной артерии (стрелкой указано место окклюзии). Е. Поперечный срез ЛЖ, окрашенный ТТХ. При наличии аневризмы размер повреждения рассчитан как отношение наружной длины рубца к общей длине окружности.

ЗЛ. Эффекты введения препарата CoOin через 10 мин после окклюзии коронарной артерии.

На 21-й день после окклюзии у всех крыс группы «ИМ» (8 из 8) в бассейне кровоснабжения перевязанной коронарной артерии были обнаружены сформированные аневризмы, полностью заместившие мышечную стенку (рис. 4). Средний размер рубца составил 39,9±3,9% относительно общей длины окружности. У всех животных, получивших препарат CoQio через 10 мин после окклюзии (группа «HM+CoQ10», 11 из 11),

сформированной аневризмы обнаружено не было, постинфарктные рубцы были расположены в толще стенки, подверженной ишемии.

Измерение функции ЛЖ. До анализа повреждения миокарда в условиях закрытой грудной клетки на 21 й день была оценена функция ЛЖ (табл. 3). Запись параметров произведена в виде соотношения давление-объем ЛЖ каждого сердечного цикла (рис. 5).

Таблица 3. Параметры систолической и диастолической функции ЛЖ, рассчитанные на

Параметры гемодинамики Л.операция ИМ ИМ+ СоОю

ЧСС, уд/мин 377±47 348±52 356±31

КСО, мкл 99±4 173±50* 129±44

КДО, мкл 180±9 255±62* 234±58*

КСД, мм рт.ст. 128±6 130±31 134±20

КДД, мм рт.ст. 7,9±1,7 10,6±2,3* 7,9±1,21-

УО, мкл 95,1±4,9 73,7±18,2* 91,9±17,0+

ФВ, % 49,7±2,6 30,3±7,1* 41,1±4,4*+

СВ, мл/мин 38,1±3,4 23,5±6,4* 32,3±5,7+

ёР/Л тал, мм рт.ст./сек 10404±725 7273±1543* 8911±163т

<№/& тш, мм рт.ст./сек 10991±1517 5150±520* 7198±1540*+

* - р<0,05 Ув «Л.операция, t р < 0,05 уэ «ИМ».

50 100 150 200 250

Объем ЛЖ, мкл

Рисунок 5. Диаграммы давление-объем ЛЖ, записанные в различных экспериментальных группах (серия 10 мин) через 21 день после моделирования ИМ.

ИМ привел к увеличению объема ЛЖ за счет замещения мышечной ткани аневризмой, что выразилось в сдвиге диаграммы давление-объем вправо по оси объемов. В/в

5 5

I 100

Л.операция ИМ+СоОЮ ИМ

введение препарата CoQio частично сохранило жизнеспособный миокард и ограничило процесс постинфарктного ремоделирования ЛЖ, что отразилось в ограничении расширения полости ЛЖ и меньшими значениями КСО и КДО (рис. 6). Относительно ложно-оперированных животных ИМ привел к значительному падению (р<0,01) способности миокарда к сокращению dP/dtmax (на 30%) и расслаблению dP/dt^ (на 53%)

Расширение полости ЛЖ отразилось в повышении (р<0,01) КСО (на 75%), КДО (на 42%) и КДД (на 34%). У животных группы «ИМ» зарегистрировано значительное снижение (р<0,01) показателей УО (на 23%), СВ (на 38%) и ФВ (на 39%). В/в введение CoQ10 привело к сохранению УО (|) and КДД (+). В группе «ИМ+СоО10» выявлено снижение СВ (на 15% *,+), ФВ (на 17% *,+), дилатация ЛЖ: увеличение КСО (на 30% *,+), падение сократимости (на 14% *,+) и расслабления ЛЖ (на 35% *,+) в сравнении с группой «Л.операция», однако, в значительно меньшей степени, чем в группе «ИМ» (* -р<0,05 vs «Л.операция», t- р<0,05 vs «ИМ»),

ИМ привел к развитию гипертрофии ЛЖ, которая была менее выражена у животных, получивших CoQio (табл. 4). Гипертрофия ПЖ формировалась только у контрольных животных.

Таблица 4. Индексы гипертрофии ЛЖ и ПЖ животных различных эксперимен-

Время введения CoQio/физ.р-ра Индексы, г/кг ИМ ИМ+СоОю Л.операция

10 мин ЛЖ 2,17±0,11* 2,03±0,15*+ 1,84±0,07

ПЖ 0,59±0,10* 0,47±0,07| 0,48±0,04

60 мин ЛЖ 1,95±0,13 * 2,07±0,17 * 1,8±0,13

ПЖ 0,56±0,08 * 0,52±0,13 * 0,46±0,08

180 мин ЛЖ 2,26±0,24* 2,28±0,17* 2,09±0,12

ПЖ 0,62±0,12* 0,55±0,09f 0,50±0,04

* - р<0,05 уэ «Л. операция», р<0,05 ув «ИМ». Статистическую значимость следует рассматривать только между группами отдельных серий 10, 60 или 180 мин.

Содержание СоОю- Группы «ИМ» и «Л.операция» не отличались по тканевым уровням СоОю. Введение препарата СоОю привело к значительному (р<0,05) повышению его уровней в плазме (на 87%), ЛЖ (на 23%) и печени (на 1042%).

Введение СоСИО/физ.р-ра через 10 мин после

А

1т

кдо

кед

кдд

5 200

Введение СоОЮ/физ.р-ра через 60 мин после окклюзии

КДО

кед

кдд

* *+ * *х

* + * *■(■ * t

5- 150

ФВ св

йР/сК тах с(Р/<Л тт

» + Т * »+

ММ

с)Р*К тах т'т

□ Л.операция

О ИМ + СоСЦО

Рисунок 6. Функциональные показатели ЛЖ различных экспериментальных групп. Введение Со(5ю через 10 или 60 мин ограничило расширение камеры ЛЖ, сохранило УО, КДД и значительно ограничило падение СВ, ФВ, сократимости и расслабления ЛЖ. * - р<0,05 уэ «Л.операция»,"!"- р<0,05 УЭ «ИМ». % посчитаны относительно ложноооперированных животных. Статистическую значимость следует рассматривать только между группами отдельных серий 10 и 60 мин.

3.2. Эффекты введения препарата СоОи; через 60 мин после окклюзии коронарной артерии.

В группе «ИМ» у 5 из 9 животных обнаружены аневризмы (35,6±5,1% по длине окружности ЛЖ); у 4 из 9 - соединительная ткань в толще мышечной стенки. У всех животных группы «ИМ+Со(Зю» (12 из 12) соединительная ткань располагалась в толще

ишемизированной стенки (рис. 4). Индексы гипертрофии ЛЖ и ПЖ представлены в табл. 4.

В сравнении с ложнооперированными животными у группы «ИМ» были выявлены повышенные значения КДД (на 58%), КСО (на 83%), КДО (на 50%) и снижение УО (на 37%), ФВ (на 67%), СВ (на 48%), что отразилось в расширении полости ЛЖ и ухудшении способности миокарда к сокращению (dP/dtmax, на 26%) и расслаблению (dP/dtmin на 44%), р<0,05 vs «Л.операция».

В/в введение CoQ,0 привело к сохранению У О, СВ, dP/dtmax и ограничило расширение камеры ЛЖ: повышение КСО (на 27% *,t), КДО (на 19% *,+), р <0,05 vs «Л.операция», t - р <0,05 vs «ИМ»), В группе «ИМ+СоО10» выявлено снижение ФВ (на 29% *,+), и dP/dUm (12% *,+), в сравнении с группой «Л.операция», однако, в значительно меньшей степени, чем в группе «ИМ» (* - р<0,05 vs «Л.операция», t- р<0,05 vs «ИМ»), КДД было значительно повышено в группе «ИМ» (57%, р<0,05 vs «Sham»), но не «ИМ+СоОю», что характеризует начало диастолической сердечной недостаточности, ограниченной в группе животных, получивших CoQio (рис. 6).

Группы «ИМ» и «Л.операция» не отличались по тканевым уровням CoQio- Введение препарата CoQio привело к значительному (р<0,05) повышению его уровней в плазме (на 89%), ЛЖ (на 61%) и печени (на 1373%). Были установлены соотношения между уровнем CoQio в миокарде и показателями функции ЛЖ: КСО (г= - 0,65, р<0,001), КДО (г= -0,56, р<0,001), ФВ (г=0,67, р<0,001), dP/dt ^ (т= - 0,64, р<0,001) (рис. 7).

|200 -

J 150 • 0 -

20

О 20 40 60

Содержание CoQIO в ЛЖ, мкг/г

О 20 40 60

Содержание CoQIO в ЛЖ, мкг/г

S -5 £

т> -10

Содержание CoQIO в ЛЖ, мкг/г

Рисунок 7. Корреляции между уровнем СоОю и функциональными показателями ЛЖ инфарктных животных: КСО (г= - 0,65, р<0,001), ФВ (г=0,67, р<0,001), расслабление ЛЖ (ёРЛИ ш, 1= - 0,64, р<0,001). 21 день после операции. Инъекция препарата СоСЬо выполнена через 60 мин после окклюзии коронарной артерии.

3.3. Эффекты введения препарата CoQin через 180 мин после окклюзии коронарной артерии.

В группе «ИМ» обнаружены аневризмы ЛЖ (38,1±6,0% от общей длины окружности ЛЖ). Введение CoQio через 180 мин после начала ИМ не ограничило потерю массы миокарда и формирование аневризм, размер инфарктной зоны составил 36,5±6,8% от общей длины окружности ЛЖ (рис. 4). Группы «ИМ» и «Л.операция» не отличались по тканевым уровням CoQi0. Введение препарата CoQio привело к значительному (р<0,05) повышению его уровней в плазме (на 78%), ЛЖ (на 90%) и печени (на 1655%) и предотвращению развития гипертрофии ПЖ (табл .4)

Представленные данные показывают, что однократное в/в введение раствора солю-билизированного CoQ10 в дозе 30 мг/кг обеспечивает повышение не только его плазменных уровней, но и содержания в миокарде и печени. Следует заметить, что повышенный плазменный уровень CoQio на 21 сутки после однократного в/в введения не может быть следствием длительного циркулирования в крови, так как не соответствует его фармако-кинетическим характеристикам. Источником столь долгого повышенного содержания CoQio в плазме может быть его десятикратный прирост в печени - органе, осуществляющем синтез убихинона для поддержания эндогенного плазменного пула. Увеличенный плазменный уровень CoQio, в свою очередь, поддерживает его повышенное содержание в миокарде.

Внутривенное однократное введение CoQio после окклюзии коронарной артерии приводит к ограничению развития постинфарктной гипертрофии ЛЖ. В группе «ИМ» в процесс позднего ремоделирования вовлекается миокард как левого, так и правого желудочков. В группе «ИМ+CoQio» у животных не развивается гипертрофия ПЖ вследствие частичной компенсации функции ЛЖ.

С помощью внутрисердечного катетера, позволяющего одновременно и непрерывно определять значения давления и объема ЛЖ, показаны изменения функции ЛЖ через 21 день после моделирования инфаркта миокарда у крыс. Характеристика петли «давление-объем ЛЖ» позволяет детально описать изменения функционального состояния сердца после инфаркта и, в совокупности с исследованием морфологии миокарда, провести сравнение эффективности лечения кардиопротективными препаратами. У животных контрольной инфарктной группы сдвиг петли давление-объем вправо по оси объема го-

ворит об увеличении размера полости ЛЖ за счет замещения мышечной ткани соединительной и образования аневризмы. Повышение КДД ЛЖ свидетельствует о развитии диастолической дисфункции - одного из самых ранних признаков сердечной недостаточности.

В группе «ИМ+CoQio» по сравнению с контрольными инфарктными животными зарегистрированы лучшие значения показателей функционального состояния сердечной мышцы. Однократное в/в введение CoQio после окклюзии коронарной артерии приводит к лучшему сохранению систолической и диастолической функции, ограничению процесса позднего постинфарктного ремоделирования ЛЖ, что выразилось в ограничении прироста конечно-систолического и конечно-диастолического объемов за счет меньшего расширения полости ЛЖ.

В клинических исследованиях эффективности длительного перорального приема прапаратов CoQio показана его способность увеличивать УО, ФВ, КДО (Sander et al. 2006), при этом повышение содержания CoQio в плазме сопровождалось значительным улучшением состояния пациентов с ХСН (Kumar et al. 2009). Рассматриваются различные причины кардиопротективного действия CoQl0. Показано, что CoQ10 защищает миокард от последствий ишемии, повышая его энергетический и антиоксидантный статус (Лакомкин и др., 2005; Tsai et al. 2011; Whitman et al. 1997). Изучаются механизмы влияния CoQio на воспалительный ответ за счет уменьшения секреции фактора некроза опухолей а (ФНОа) (Bessler et al. 2010; Schmelzer et al. 2007), уровень которого повышен после начала инфаркта (Kaur et al. 2006; Kempf et al. 2006), при этом снижение уровня ФНОа приводит к уменьшению зоны некроза в миокарде (Sugano et al. 2004).

Таким образом, однократное в/в введение препарата CoQ10 в дозе 30 мг/кг через 10, 60 или 180 мин после начала ишемии миокарда обеспечивает повышение и долговременное поддержание высоких уровней CoQ10 в плазме и сердечной мышце крыс (по-видимому, за счет депо в печени). Результатом в/в введения CoQ10 через 10 или 60 мин после начала ИМ существенное ограничение развития систолической и диастолической дисфункции, зоны некроза, постинфарктной гипертрофии ЛЖ (10 мин) и предотвращение постинфарктной гипертрофии ПЖ (10 мин). Представленные данные свидетельствуют о перспективности разработки парентеральных лекарственных форм убихинона для терапии неотложных сердечно-сосудистых состояний.

выводы

1. Внутривенное введение препарата CoQ10 в дозе 30 мг/кг приводит к быстрому повышению уровней CoQm в интактном миокарде.

2. Предварительное однократное внутривенное введение препарата CoQ10 в дозе 30 мг/кг за 30 мин до окклюзии коронарной артерии на модели обратимой ишемии миокарда приводит к уменьшению частоты возникновения реперфузионных аритмий, ограничению зоны некроза левого желудочка, повышению уровней CoQ10 в миокарде, коррелирующих со степенью повреждения миокарда.

3. Ограничение зоны некроза и снижения функциональных показателей ЛЖ выявлено после внутривенного введения препарата CoQ10 в дозе 30 мг/кг через 10 или 60 мин после окклюзии коронарной артерии.

4. Внутривенное введение препарата CoQio в дозе 30 мг/кг через 10 или 60 мин после необратимой окклюзии коронарной артерии приводит на 21 сутки к сохранению повышенных уровней CoQ10 в миокарде, плазме и печени, ограничению размеров зоны инфаркта и постинфарктной гипертрофии миокарда ЛЖ и предотвращению постинфарктной гипертрофии ПЖ (10 мин), меньшей выраженности систолической и диастолической дисфункции ЛЖ.

5. Внутривенное введение препарата CoQio в дозе 30 мг/кг через 180 мин после необратимой окклюзии коронарной артерии приводит на 21 сутки к сохранению повышенных уровней CoQio в миокарде, плазме и печени и предотвращению постинфарктной гипертрофии ПЖ.

Практические рекомендации

На основании полученных данных возможна дальнейшая разработка форм CoQio для внутривенного введения и их применения в клинической практике.

Внутривенное введение CoQio может быть эффективно при других острых сердечно-сосудистых состояниях.

Использованный в работе метод оценки функциональных показателей работы ЛЖ может быть использован для исследования эффективности кардиопротекторов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Ivanov, A. Single intravenous injection of CoQio reduces infarct size in a rat model of ischemia and reperfusion injury [Текст] / A. Ivanov, E. Gorodetskaya, E. Kalenikova, O. Medvedev // World Journal of Cardiovascular Diseases. - 2013. - No. 3. - P. 1-7.

2. Иванов, A.B. Однократное внутривенное введение коэнзима Q10 защищает миокард, подвергшийся необратимой ишемии [Текст] / А.В. Иванов, Е.А. Городецкая, Е.И. Каленикова, О.С. Медведев // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2013. - Т. 155. - № 6. - С. 736-738.

3. Иванов, А.В. Коэнзим Q,0, введенный однократно внутривенно, защищает миокард от последующей ишемии-реперфузии [Текст] / А.В. Иванов, Е.А. Городецкая, Е.И. Каленикова, О.С. Медведев // Экспериментальная и клиническая фармакология. -2013. -Т. 76. -К» 2. - Стр. 6-8.

4. Medvedev, О. Single iv administration of CoQm lh after ligation of coronary a. prevents strong inhibition of cardiac contractility in 21 days [Текст] / О. Medvedev, A. Ivanov / The 23rd European meeting on Hypertension and Cardiovascular Protection, Milan-Italy, June 14-17, 2013. // Journal of Hypertension, e-Supplement A. - 2013. - Vol. 31. -e457.-PP.34.114.

5. Medvedev, O. CoQ10 infusion 1 hour after the onset of myocardial infarction limits irreversible damage of the heart [Текст] / О. Medvedev, A. Ivanov, O. Tokareva, E. Kalenikova, E. Gorodetskaya // Abstracts of the Seventh Conference of the International Coenzyme Q10 Association, Spain, Seville, 2012. - Spain, Seville, 2012. - P. 112-113.

6. Иванов, А.В. Отсроченные кардиопротективные эффекты препарата коэнзима Qio, введенного однократно в/в через 1 час после окклюзии коронарной артерии у крыс [Текст] / А.В. Иванов, О.Г. Токарева, Е.В. Харитонова, Е.А. Городецкая, Е.И. Каленикова, О.С. Медведев // Сборник материалов конгресса, тезисы докладов XIX Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 2012 г.-М„2012.-С. 508.

7. Городецкая, Е.А. Защита миокарда от ишемического-реперфузионного повреждения с помощью предварительного в/в введения коэнзима Qio [Текст] / Е.А. Городецкая, А.В. Иванов, Е.И. Каленикова, О.С. Медведев // Сборник материалов конгресса, тезисы докладов XIX Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 2012 г.- М., 2012. - С. 490.

8. Ivanov, A. Assessment of single intravenous infusion of coenzyme Qw effect on post-infarcted myocardium function with conductance catheter technique [Текст] / A. Ivanov, E. Kalenikova, E. Gorodetskaya, 0. Medvedev / 21st European meeting on Hypertension and Cardiovascular Prevention, Milan - Italy, June 2011. // Journal of Hypertension e-Supplement A. - 2011. - Vol. 29. - e 181. - PP.4.115.

9. Gorodetskaya, E. Single intravenous administration of coenzyme Q10 following chronic coronary occlusion limits postinfarct myocardial remodelling in rats [Текст] / E. Gorodetskaya, E. Kalenikova, A. Ivanov, O. Medvedev. / 21st European meeting on Hypertension and Cardiovascular Prevention, Milan - Italy, June 2011. // Journal of Hypertension e-Supplement A. - 2011. - Vol. 29. - e466. - PP.33.124.

10. Medvedev, O. Single intravenous administration of coenzyme Qi0 protects the myocardium from subsequent ischemia-reperfusion [Текст] / O.S.Medvedev, E.I.Kalenikova, E.A.Gorodetskaya, A.V.Ivanov // Programme and abstracts of the Sixth Conference of the International Coenzyme Qi0 Association. Brussels, Belgium, 2010. - Belgium, Brussels, 2010. -P.117.

11. Каленикова, Е.И. Внутривенное введение коэнзима Qio в начале ишемии ограничивает процессы постинфарктного ремоделирования миокарда [Текст] / Е.И. Каленикова, А.В. Иванов, Е.А. Городецкая, О.С. Медведев // Тезисы III Всероссийской конференции "Неотложная кардиология - 2010", 23-24 ноября 2010 года. - М., 2010.-С. 63-64.

12. Городецкая, Е.А. Однократное внутривенное введение коэнзима Q10 защищает миокард от последующего ишемического-реперфузионного повреждения [Текст] / Е.А. Городецкая, А.В. Иванов, Е.И. Каленикова, О.С. Медведев. // Тезисы III Всероссийской конференции "Неотложная кардиология - 2010", 23-24 ноября 2010 года - М„ 2010.-С. 65.

Список сокращений

Со(Зю коэнзим (Зю

ёР/<11 тах сократимость миокарда

с1Р/ск т1П расслабление миокарда

тРТР митохондриальные поры высокой проницаемости

АД артериальное давление

АФК активные формы кислорода

В/в внутривенно

ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография

ЖТА желудочковые тахиаритмии

ИВЛ искусственная вентиляция легких

ИМ инфаркт миокарда

кдд конечно-диастолическое давление

кдо конечно-диастолический объем

кед конечно-систолическое давление

ксо конечно-систолический объем

лж левый желудочек

пж правый желудочек

СВ сердечный выброс

ттх трифенилтетразолий хлорид

УО ударный объем

Физ.р-р физиологический раствор

ФВ фракция выброса

хен хроническая сердечная недостаточность

чсс частота сердечных сокращений

Подписано в печать: 28.10.2013 Тираж: 100 экз. Заказ № 1002 Объем: 1.0 усл.п. л. Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект д.74 (495)790-47-77 www.reglet.ru