Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Эффективность гепатопротекторов лохеина и эплира в комплексной терапии экспериментальных злокачественных новообразований

На правах рукописи

МАЛИНОВСКАЯ ЕЛЕНА АНАТОЛЬЕВНА

ЭФФЕКТИВНОСТЬ I ЕПАТОПРОТЕКТОРОВ ЛОХЕИНА И ЭПЛИРА В КОМПЛЕКСНОЙ ТЕРАПИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Томск-2005

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательский институт онкологии Томского научного центра СО РАМН и ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Научный консультант.

доктор медицинских наук, профессор,

заслуженный деятель науки РФ

Чердынцева Надежда Викторовна

| Саратиков Альберт Самойлович |

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Новожеева Татьяна Петровна

кандидат биологических наук Крылова Светлана Геннадьевна

Ведущая организация: Московский научно-исследовательский онкологический институт им.П.А.Герцена МЗ РФ

Защита состоится «_»_ 2005 г. в _часов на заседании

диссертационного совета Д 001.031.01 при ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН (634028, г.Томск, пр. Ленина, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (г.Томск)

Автореферат разослан « з/ »ytu^in-a 2005 г.

Ученый секретарь _

диссертационного совета —-Z^'Y

кандидат биологических наук ff Амосова E.H.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

На современном этапе развития онкологии возможности дальнейшего повышения эффективности лечения путем монотерапии злокачественных опухолей традиционными методами (лекарственная и лучевая терапия, хирургическое вмешательство) практически исчерпаны. Для улучшения результатов лечения используются комбинации основных методов противоопухолевого воздействия, разрабатываются принципиально новые подходы к лечению рака (фотодинамическая терапия, генотерапия, использование моноклональных антител и т.п.) (Хансон К.П. и др., 1996; Якубовская Р.И., 2000; Adam R., 2003; Cerosimo R„ 2003; Барышников А.Ю., 2004).

В настоящее время химиотерапия стала неотъемлемым компонентом комплексного лечения многих злокачественных новообразований, однако в большинстве случаев ее резервов недостаточно для полной регрессии опухоли и эрадикации метастатических очагов, в связи с чем повышение эффективности цитостатического лечения является одной из актуальных проблем онкологии (Поддубная И.В., 1998; Переводчикова Н.И., 2001; Mamón Н. et al., 2005).

Принципы современной химиотерапии опухолей предполагают введение максимально переносимых доз цитостатиков с целью наиболее полного повреждения опухолевых клеток. Побочные эффекты цитостатической терапии -выраженная миелотоксичность, иммуносупрессия, гепатотоксичность - часто приводят к необходимости прекращения лечения и/или снижения доз противоопухолевых агентов (Богуш Т.А., Богуш Е.А., 1995; Kirwan J. et al., 2003). Гепатотоксическое действие химиотерапевтических агентов обусловливает снижение эффективности лечения и увеличение токсичности цитостатиков (King P., Perry М., 2001; Jaeschke Н. et al., 2002). Ключевую роль в этих процессах играет монооксигеназная система печени, осуществляющая одновременно активирующую и детоксицирующую функции. В исследованиях ряда авторов получены данные о том, что путем стимуляции монооксигеназ может быть достигнуто повышение эффективности противоопухолевой цитостатической терапии у больных с сопутствующими патологическими изменениями печени (Богуш Т.А. и др., 2000; Block К., Gyllenhaal С., 2002; Baldwin A. et al., 2003).

Природные средства с гепатозащитными свойствами традиционно используют у онкологических больных с целью улучшения переносимости цитостатической терапии (Chen X. et al., 2002). Широкий спектр точек приложения препаратов природного происхождения предполагает возможность их влияния на системы организма, контролирующие рост и метастазирование злокачественных опухолей. Известно, что система иммунитета занимает одну из ключевых позиций в обеспечении противоопухолевой резистентности, она способна оказывать не только прямое повреждающее действие на опухолевые клетки, но и осуществлять регуляцию взаимоотношения новообразования и организма, тем самым контролируя диссеминацию опухоли. Нарушение функционирования иммунной системы в условиях повреждающих воздействий, связанных с гиперактивацией процессов липопероксидации при злокачественном росте, операционном стрессе, лечении цитосгатиками, вносит определенный вклад в недостаточную

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С Петербург ,

200/РК (

эффективность терапии онкологических больных (Олейник A.B., 1985; Пальмина Н.П., Бурлакова Е.Б., 1985; Афонина Г.Б. и др., 1998; Муфазалова H.A., 2002; Чердынцева Н.В. и др., 2002). В этой связи именно антиоксидантные свойства препаратов-гепатопротекторов могут быть принципиально важными для восстановления нормального функционирования системы иммунитета в условиях противоопухолевой терапии.

Все вышесказанное указывает на перспективность использования гепатопротекторных средств с антиоксидантной активностью для повышения эффективности цитостатической терапии злокачественных новообразований.

Учеными Сибирского медицинского университета и Института химии нефти ТНЦ СО РАН разработаны и изучаются оригинальные гепатопротекторы лохеин - экстракт солянки холмовой и эплир - экстракт полярных липидов высокоминерализованных озерных отложений (Саратиков A.C. и др., 1990). Лечебно-профилактическое действие данных гепатопротекторов обусловлено собственными антирадикальными свойствами и способностью регулировать активность антиоксидантных факторов клеток, белковый, липидный и энергетический обмен. По эффективности терапевтического воздействия при повреждениях печени различной этиологии лохеин и эплир не уступают таким эффективным препаратам с гепатозащитным действием как легален, эссенциале, а по ряду показателей (например, защитное действие при нарушенной тетрахлорметаном антитоксической функции печени) превосходят их (Саратиков A.C. и др., 2000). На фоне интоксикации циклофосфаном лохеин и эплир снижают общую токсичность цитостатика, препятствуют развитию морфологических нарушений печени, в частности, некрозу гепатоцитов, нормализуют биохимические показатели (Ратькин A.B., 2003; Саратиков A.C. и др., 2004). Оба препарата обладают способностью нормализовать либо повышать активность ферментов метаболической биотрансформации (цитохрома Р-450, глутатион-S трансферазы и др.), что отражает способность гепатопротекторов модулировать детоксицирующую функцию печени (Саратиков A.C., Венгеровский А.И., 1999). Получены данные о нормализующем влиянии гепатопротекторов на показатели системы иммунитета у животных с хроническим токсическим гепатитом (Перевозчикова Т.В., 2003).

Таким образом, лохеин и эплир обладают широким спектром биомодулирующих и терапевтических эффектов, которые обусловлены входящим в их состав комплексом различных биологически активных субстанций. Полученные данные о прямом либо опосредованном через регуляцию ферментов биотрансформации антитоксическом действии, способности нормализовать липидно-белковый и энергетический обмен, восстанавливать функции иммунокомпетентных клеток являются многообещающими предпосылками для исследования перспективности применения указанных препаратов с целью повышения эффективности цитостатической терапии злокачественных опухолей.

Целью работы явилась экспериментальная оценка способности лохеина и эплира повышать эффективность цитостатической терапии опухолей и изучение механизмов их биомодулирукмцей активности.

Задачи:

1. Изучить влияние гепагопротекторов лохеина и эплира на эффективность цитостатической терапии злокачественных опухолей в эксперименте.

2. Оценить противоопухолевое и антиметастатическое действие лохеина и эплира у мышей с перевиваемыми опухолями и их влияние на процесс послеоперационного метастазировани*.

3. Исследовать влияние гепагопротекторов на функциональную активность иммунокомпетентных клеток у мышей с экспериментальными злокачественными опухолями.

4. Изучить способность лохеина и эплира модулировать действие цитостатического агента циклофосфана на морфо-физиологические показатели и функциональную активность клеток системы иммунитета.

5. Оценить влияние гепатопротекторов на формирование иммунного ответа, функциональную активность лимфоцитов и макрофагов у здоровых животных.

Научная новизна.

Впервые установлена способность гепагопротекторов лохеина и эплира повышать эффективность цитостатической терапии опухолей. Приоритет полученных данных подтвержден патентом РФ №2225720 от 20 марта 2004 г "Средство, повышающее противоопухолевую и антиметастатическую активность циклофосфана". На перевиваемых опухолях, метастазирукицих в легкие и печень, показано умеренное антиметастатическое действие лохеина. Эплир снижает образование метастатических колоний в легких. Оба изучаемых гепатопротектора ингибируют процесс послеоперационного метастазирования.

Установлено, что лохеин и эплир способны снижать токсическое действие высоких доз циклофосфана на клеточность тимуса и селезенки, модулировать пролиферативную активность лимфоцитов и развитие гуморального иммунного ответа на тимусзависимый антиген на фоне введения циклофосфана

Показана способность лохеина и эплира нормализовать клеточность тимуса и селезенки, активность натуральных киллеров, пролиферативный ответ спленоцитов, нарушенные при росте злокачественных опухолей у мышей. Изучаемые гепатопротекторыс средства повышают цитостатическую активность перитонеальных макрофагов мышей-опухоленосителей, что, по крайней мере частично, определяет антиметастатическую активность препаратов.

Полученные результаты о способности лохеина и эплира модулировать активность клеток системы естественной резистентности (макрофагов и натуральных киллеров) и пролиферативный ответ лимфоцитов дополняют существующие представления об иммунотропной активности данных препаратов.

Научно-практическая значимость.

В эксперименте на примере препаратов лохеин и эплир установлено, что гепагопротекторные средства природного происхождения с антиоксидантной активностью могут использоваться в качестве агентов, повышающих эффективность терапии злокачественных опухолей. Полученные результаты позволяют рекомендовать проведение клинической апробации лохеина и эплира в комплексной терапии больных со злокачественными новообразованиями.

Представленные в работе данные об иммунотропной активности лохеина и эплира при их применении у здоровых животных, у мышей с перевиваемыми опухолями, а также с иммунодепрессией, индуцированной введением высоких доз цитостатика, свидетельствуют о целесообразности включения данных препаратов в комплексное лечение пациентов со сниженной иммунореактивностью и получающих препараты, обладающие иммуно- и гепатотоксичностью.

Положения, выносимые на защиту.

1. Гепатопротекторы лохеин и эплир способны повышать эффективность терапии злокачественных опухолей циклофосфаном.

2. Лохеин и эплир обладают умеренным собственным антиметастатическим действием, которое может реализоваться за счет повышения функциональной активности лимфоцитов, макрофагов, натуральных киллерных клеток опухоленосителей.

3. Лохеин и эплир способны снижать выраженность иммунодепрессии, вызванной введением противоопухолевого препарата циклофосфана в высоких дозах.

4. У здоровых животных лохеин и эплир модулируют функциональную активность лимфоцитов, макрофагов и натуральных киллеров.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на ежегодных отчетных конференциях молодых ученых НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН в 2002, 2003, 2004 гг, конференции, посвященной 70-летию биолого-почвенного факультета ТГУ (Томск, 2003), V конгрессе молодых ученых и специалистов "Науки о человеке" (Томск, 2004), V молодежной научной конференции СО РАМН "Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины" (Новосибирск, 2004), III съезде онкологов и радиологов СНГ (Минск, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ. Получен патент на изобретение №2225720 от 20 марта 2004 г "Средство, повышающее противоопухолевую и антиметастатическую активность циклофосфана".

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на ISO страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, выводов, списка литературы, содержащего 235 источников, из них 119 иностранных. Работа проиллюстрирована 18 рисунками и 18 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные животные.

Работа выполнена на 648 мышах 1 категории разводки лаборатории экспериментального биомодслирования ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра Сибирского отделения РАМН (сертификат имеется) обоего пола в возрасте 8-14 недель, массой 18-24 г. Используемые линии мышей: C57B1/6J (Н-2^, CBA/CaLac (H-2k), DBA/2 J (H-2d), BALB/c (H-2d), (CBAxC57BI/6)Fl (Н-г1*). Животных содержали на стандартном рационе вивария со свободным доступом к воде в соответствии с Правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей.

Для получения исследуемого материала мышей забивали методом

цервикальной дислокации под эфирным наркозом. Каждый эксперимент был воспроизведен по крайней мере дважды.

Препараты.

Лохеин и эплир (ООО "Биолит", Томск) разрешены к применению в качестве БАД к пище с гепагопротекторным действием (протокол № 1 от 9 января 1997 г, регистрационные удостоверения МЗ РФ № 000945.Р.643.06.99 и № 000962.Р.643.06.99). Гепатопротекторы вводили внутрижелудочно в оптимальных терапевтических дозах: лохеин - 200 мг/кг (в водном растворе), эплир - 30 мг/кг (в масляном растворе). Введение осуществляли ежедневно, курсами от 4 до 18 дней в зависимости от схемы эксперимента. Контрольным группам внутрижелудочно вводили эквиобьемное количество растворителя по аналогичным схемам.

Циклофосфамид ("ЛэнсФарм", Москва) при терапии экспериментальных опухолей инъецировали внутрибрюшинно двукратно в дозах 120 или 40 мг/кг на 3-и и 7-е сутки после трансплантации опухоли. Группам без введения цитостатика по аналогичной схеме инъецировали эквиобъемные количества физиологического раствора. Иммунодепрессию у мышей (CBAxC57Bl/6)FI моделировали путем однократной внугрибрюшинной инъекции циклофосфана в дозе 120, 200 или 250 мг/кг (мышам контрольной группы вводили эквиобьемное количество физиологического раствора). Гепатопротекторы вводили со дня инъекции циклофосфана ежедневно. Оценку эффективности воздействий проводили на 4-е или 7-е сутки после введения цитостатика.

Для блокады функциональной активности макрофагов мышам с LLC вводили каррагенаи ("Sigma", США) в дозе 100 мг/кг внутрибрюшинно на 2, 7, 13-е сутки роста опухоли.

Модели экспериментальной онкология.

Противоопухолевое и антиметастатическое действие гепагопротскторов, их влияние на эффективность противоопухолевой терапии оценивали на моделях перевиваемых опухолей с гематогенным метастазированием: карциноме легких Льюис (LLC) и пигментном штамме меланомы В-16, полученных из банка опухолевых штаммов РОНЦ им.Н.Н.Блохина. Карциному легких Льюис перевивали мышам линии C57B1/6J в бедро внутримышечно по 106 клеток, меланому В-16 - подкожно по 5-106 клеток. Гепатопротекторы вводили со 2-го дня после перевивки опухоли на протяжении 18 дней. Эффективность терапии оценивали на 19-20-е сутки роста опухоли.

Гепатометастазы получали путем внутриселезеночной трансплантации мышам линии BALB/c 2-105 клеток аденокарциномы толстого кишечника (АКАТОЛ) под эфирным наркозом.

Хирургическое удаление опухоли (по голеностопному суставу) осуществляли на 10-е сутки после перевивки мышам линии C57BI/6J карциномы легких Льюис под апоневротическую пластинку задней лапы. Терапию гепагопротекторами начинали в день операции и проводили в течение 10 дней, после чего оценивали эффективность воздействия.

Эффективность терапии оценивали по торможению роста первичной опухоли и ингибиции метастазирования. Рассчитывали следующие показатели:

- торможение роста первичной опухоли (ТРО, %):

ТРО = (Мк - Mo) / Мк, гле Мк и Мо - масса опухоли в контрольной (без лечения) и опытной группах;

- индекс ингибиции метастазирования (ИИМ, %) - интегральный показатель, рассчитываемый по формуле: ИИМ = (Ак • Вк - Ао • Во) • 100 / (Ак • Вк), где Ак и Ао - доля животных с метастазами в контрольной и опытной группах, Вк и Во - среднее количество метастазов в контрольной и опытной группах;

- торможение роста метастазов (ТРМ, %): ТРМ = (Sk - So) / Sk, где Sk и So - суммарная площадь метастатических колоний в контрольной (без лечения) и опытной группах.

Методики оценки функциональной активности имму некомпетентных клеток.

Способность лимфоцитов к пролиферации в ответ на неспецифические стимулы оценивали в реакции бластгрансформации лимфоцитов по включению 5Н-тимидина в ДНК пролиферирующих клеток без дополнительной стимуляции и в присутствии митогенных лектинов (ЛПС - 5 мкг/мл ("Wako"), КонА - 5 мкг/мл ("ICN") (Хоробрых В.В. и др., 1984). Уровень включения радиоактивной метки оценивали с помощью сцинтилляционного р-счетчика Mark-Ill ("Trakor Analytic").

Цитостатическую активность макрофагов и лимфоцитов определяли по методике И.В.Богдашина (1986): оценивали антипролиферативное действие эффекторов на клетки-мишени Р-815 по снижению включения Н-тимидина в ДНК опухолевых клеток. Индекс цитостазиса (ИЦС, %) подсчитывали по формуле: ИЦС = (1-О/К) • 100, где О - количество импульсов в опытных лунках, К -количество импульсов в лунках, где инкубировали только клетки-мишени.

Активность натуральных киллеров определяли в мембранотоксическом тесте по лизису клеток-мишеней K-S62, меченых 3Н-уридином (Рыкова М.С. и др., 1981). Индекс мембранотоксичности (ИМТ, %) вычисляли по формуле: ИМТ = (1 -О / К) • 100, где О - количество импульсов в опытных лунках, К - количество импульсов в лунках, где инкубировались только клетки-мишени. Определяли количество литических единиц селезенки (ЛЕ). За 1 ЛЕ принимали количество лимфоцитов, лизируюших 30% клеток-мишеней в мембранотоксическом тесте.

Хемилюмнпесценцию перитонеальных макрофагов оценивали по методу C.Nathan (1980), основанному на регистрации активных форм кислорода, продуцируемых в процессе респираторного взрыва в ответ на стимуляторы: частицы опсонизированного мышиной сывороткой зимозана (ОЗ) (1 мг/мл), или форболмиристатацетат (ФМА) (3 мкМ). Измерение свечения проводили на приборе "Luminometer-1251" ("1KB", Швеция) в присутствии люминофора люминола в конечной концентрации 250 мкМ. Обработку данных осуществляли на персональном компьютере с использованием программы "Lumograf" (Чердынцев Е.С. и др., 1993). Определяли максимальную амплитуду свечения (mV), время ее достижения (мин), светосумму сигнала без добавления стимулятора и ее приращение под действием стимулятора (ФМА или ОЗ).

Число антителообразующих клеток (АОК) определяли методом локального гемолиза в модификации A.J.Cunningham (1965). Учет результатов реакции проводили, подсчитывая количество зон гемолиза (1 зона соответствует одной

АОК) на 500 обнаруженных в препарате селезеночных лимфоцитов. Вычисляли процентное содержание АОК среди спленоцитов и количество клеток, продуцирующих антитела, в пересчете на клеточность всей селезенки.

Для определения титра антител в сыворотке крови использовали реакцию гемагглютинации (Федосеева В.Н. и др., 1993). Определение классовой принадлежности антител основано на способности 2-меркаптоэтанола восстанавливать дисульфидные связи и вызывать диссоциацию антител IgM-идиотипа на субъединицы, неспособные агглютинировать эритроциты.

Клеточный иммунный ответ оценивали в реакции гиперчувствительности замедленного типа (Yoshikai Y. et al., 1979). Учет интенсивности воспалительной реакции осуществляли через 24 ч после введения разрешающей дозы антигена под апоневротическую пластинку задней лапы. Определяли индекс воспаления (ИВ, %):

ИВ = (О - К) / К • 100, где К и О - массы контрольной (введение

физиологического раствора) и опытной (введение антигена) лап.

Результаты экспериментов обрабатывались методами вариационной статистики: подсчитывали среднее арифметическое, среднее квадратическое отклонение, ошибку средней арифметической. Значимость различий показателей между группами оценивали с использованием критерия Вилкоксона-Манна-Уитни и <р-критерия Фишера. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Влияние лохеиня и эплира на эффективность терапии злокачественных опухолей цнклофосфаиом

Включение в схему лечения онкологических больных средств, повышающих эффективность проводимого лекарственного лечения и/или снижающих выраженность побочных эффектов цитостатиков, является одним из способов повышения эффективности противоопухолевой терапии. Природа и механизм воздействия средств, включаемых в комбинированную терапию опухолей, могут быть различны и связаны с их радиомодифицирующим, иммунотропным, адаптогенным. антиоксидантным, антитоксическим действием (Пашинский В.Г., Яременко К.В., 1983; Моисеенко В.М., 1998; Гольдберг Е.Д., Зуева Е.П., 2000; Wargovich М. et al., 2001).

Способность гепатопротекторов модулировать эффективность терапии экспериментальных злокачественных новообразований изучали на мышах с гематогенно метастазирующими опухолями: меланомой В-16 и карциномой легких Льюис (LLC).

При введении лохеина на фоне терапии LLC низкими терапевтическими дозами циклофосфана (40 мг/кг) наблюдалось более выраженное торможение образования метастазов (по сравнению с группой, получавшей только цитостатик): снижалась интенсивность образования метастатических колоний, индекс ингибиции метастазирования достигал 91% против 64% в контроле. Также отмечено усиление торможения роста метастазов на 70% по сравнению с группой животных, подвергавшихся только цитостатической терапии (табл. 1).

Таблица i

Влияние лохеина и эплира на противоопухолевую и антиметастатическую активность циклофосфана (40 мг/кг) при терапии карциномы легких Льюис и _ меланомы В-16 у мышей у мышей С57В1/6 (Х±т)_

Группы животных Масса первичной опухоли, г Число метастазов /мышь Частота метастазирования, % Индекс ингибиции метастазирования, % Площадь метастазов, мм2

1. LLC п=7 3,23±0Д8 16,5±3,02 100 - 8,53±1,3

LLC+ЦФ п=4 2,97±0,18 6,0+1,08* 100 64 0,71 ±0,15 *

LLC+U<I>+ лохеин п=7 2,24±0,09 »* 1,4±0,76 ** 66 91 0,23±0,12 **

2. LLC п=6 4,5510,23 11,8±0,87 100 - 1,66±0,4

LLC+ЦФ п=6 4,25±0Д2 3,67±0,19 * 100 67 0,53+0,18*

LLC+ЦФ+ эплир п=7 4,58±0Д8 1,71+0,63 *» 57* 92 0,03±0,02 **

3. В-16 п=5 5,46+0,41 11,4+2,8 100 - 1,73±0,65

В-16+ЦФ п=5 3,62±0,27 * 2,4±0,67 * 100 79 0,07+0,03 *

В-16+ЦФ+ лохеин п=6 3,27±0,17 0,6±0,33 ** 50* 97 0,01±0,003 **

В-16+ЦФ+ эплир п=6 3,84+0,24 2,8±0,48 100 75 0,07+0,02

* - различия статистически значимы по сравнению с соответствующей группой "LLC" или "8-/6". р<0,05.

** - различия статистически значимы по сравнению с соответствующей группой "LLC+ЦФ" или "В-!6+ЦФ '.р<0.05

Эплир в комплексной терапии LLC совместно с циклофосфаном в дозе 40 мг/кг не оказывал влияния на эффективность цитостатика в отношении первичного опухолевого узла, но снижал на 43% частоту метастазирования и на 53% интенсивность образования метастазов по отношению к группе животных, получавших только циклофосфан (индекс ингибиции метастазирования достигал 92% против 67% в контроле). Торможение роста метастатических колоний при введении эплира и циклофосфана на 94% выше по сравнению с животными, получавшими только инъекции цитостатического агента (табл. 1). Следует особо отметить синергизм действия гепатопротекторов и циклофосфана в отношении снижения интенсивности метастазирования.

Способность гематопро! екторов усиливать противоопухолевое действие ииклофосфана (40 мг/кг) была протестирована и на другой гематогенно метастазирующей модели злокачественного роста - меланоме В-16. Результаты экспериментов свидетельствуют об отсутствии повышения эффективности цитостатического препарата в отношении первичного опухолевого узла при включении в курс терапии лохеина и эплира (табл. 1). Вместе с тем выявлено повышение лохеином антиметастатической активности ииклофосфана: по сравнению с группой животных, получавших только цитостатик, на 50% снижалась частота метастазирования, на 75% - интенсивность образования метастазов; индекс ингибирования метастазирования составил 97% при 79% в контрольной группе. При этом торможение роста метастазов усилилось в 1,9 раза (табл. 1). Эплир не влиял на антиметастатическую активность ииклофосфана, применяемого в дозе 40 мг/кг при терапии меланомы В-16.

Следует отметить, что при включении гепатопротекторов в курс терапии опухолей на фоне введения цитостатика в лозе 40 мг/кг индекс ингибирования метастазирования во многих случаях достигал 90% и более (что соизмеримо с антиметастатической эффективностью циклофсофана в высокой терапевтической дозе 120 мг/кг), причем зачастую 50 - 60% животных в группе вообще не имели метастазов по окончании курса терапии. Это свидетельствует о перспективности использования гепатопротекторов для повышения эффективности низких терапевтических доз ииклофосфана

Таким образом, установлено, что включение гепатопротекторов в схему лечения злокачественных опухолей на фоне цитостатической терапии способствует увеличению терапевтической эффективности противоопухолевых агентов. Главным образом, наблюдается усиление ингибирования образования и роста метастатических колоний в легких.

Существенное повышение антиметастатического эффекта при совместном использовании цитостатика и гепатопротекторов несомненно свидетельствует о вкладе самостоятельного терапевтического действия лохеина и эплира. Поскольку ожидаемый суммарный эффект цитостатика и гепатопротекторов на метастазы оказался меньше реально полученного, можно полагать, что кроме суммирования самостоятельного действия препаратов определенный вклад может вносить снижение гепатотоксичности, приводящее к повышению активности цитостатика, и снижение токсического действия, в частности иммунодепрессивного, что способствует более эффективному функционированию защитных факторов организма.

Влияние гепатопротекторов в режиме монотерапии на рост и метастазирование экспериментальных опухолей

Повышение эффективности цитостатической терапии опухолей лохеином и эплиром может быть в определенной мере связано с собственным антибластомным действием гепатопротекторов, поскольку способность снижать диссеминацию опухолей показана для многих препаратов природного происхождения (Гольдберг Е.Д., Зуева Е.П., 2000; Вершинина С.Ф., Потявина Е.В., 2003; Яременко К.В., Пашинский В.Г., 2003). Нами была изучена противоопухолевая и

антиметастатическая активность лохеина и эплира на мышах с карциномой легких Льюис, меланомой В-16, аденокарциномой толстого кишечника (АКАТОЛ).

При тералии мышей с карциномой легких Льюис лохеин не влиял на массу первичного опухолевого узла. Частота метастазирования не изменялась при введении лохеина, однако, отмечено торможение роста метастатических колоний в легких на 71% по сравнению с группой опухоленосителей, не получавших лечения (табл. 2).

Таблица 2

Влияние лохеина и эплира на рост и метастазирование карциномы легких Льюис у

мышей C57BI/6 (Х±ш)

Группы животных Масса первичной опухоли, г Число метастазов /мышь Частота метастазирования, % Индекс ингибиции метастазирования, % Площадь метастазов мм2

1. LLC п=7 3,23±0,28 16,5±3,02 100 - 8,53±1,3

LLC+лохеин п=7 2,76±0,20 12,4±2,24 100 25 2,491032 *

2. LLC п=5 5,14±0,43 34±2,6 100 - 23,61±2,51

LLC+эплир п=5 6,29+0,17* 22±1,4 * 100 35 7,51±1,28*

1. В-16 п=6 5,26±0,53 9,7±0,24 100 - 0,78±0,07

В-16+лохеин п=6 4,16±0,44 4,0±2,0 ♦ 50* 79 0,19±0,09 *

2. В-16 п=5 2,46±0,14 39,6±7,6 100 - 4,30±0,81

B-16+эплир №=6 2,70±0,28 25,6±3,7 * 100 35 2,67±0,60

* - различия статистически значимы по сравнению с соответствующей группой "LLC" или -В-16 ', р<0,05

При введении эплира мышам с LLC отмечено некоторое усиление роста первичного опухолевого узла (на 22%). Однако при этом формирование легочных метастазов в группе животных, получавших эплир, снижалось на 35%, ингибирование роста метастатических колоний составляло 68% (табл. 2).

Наблюдаемое увеличение массы опухоли при ведении эплира мышам с карциномой Льюис свидетельствует о том, что его использование в комплексной терапии злокачественных опухолей может быть более целесообразно на фоне удаления первичного опухолевого очага, когда создаются более благоприятные условия для реализации антиметастатического действия препаратов естественного происхождения (Новиков В.И. и др., 1999; Гольдберг Р.Д., Зуева Е.П., 2000).

Умеренный собственный антиметастатический эффект гепатопротекторов был показан и на мышах с перевиваемой меланомой В-16. Установлено, что лохеин снижал частоту и интенсивность метастазирования меланомы В-16 на 50 и 59% соответственно, ингибировап рост метастазов на 76% (табл. 2). При введении эплира мышам с меланомой В-16 не отмечено влияния препарата на poci первичной опухоли, частоту метастазирования и площадь метастазов, однако показано снижение количества метастатических колоний на 35% (табл. 2).

Кроме моделей перевиваемых опухолей, образующих метастазы в легкие, антиметастатический эффект лохеина показан и на модели экспериментального метастазирования в печень: препарат снижает образование гепатометастазов АКАТОЛ в 1,8 раза (р<0,05).

Данные результаты подтверждают, что способность гепатопротекторов лохеина и эплира повышать эффективность цитостатической терапии перевиваемых опухолей может быть обусловлена их собственным антиметастатическим действием. Способность препятствовать диссеминации опухоли показана для многих препаратов биомодулирукицего действия: адаптогенов, антиоксидантов, витаминов (Пашинский В.Г., 1988; Гольдберг Е.Д., Зуева Е.П., 2000; Prasad К., 2004).

Применение биотерапевтических агентов особенно показано после удаления первичной опухоли. При хирургическом удалении первичного опухолевого узла "взрывное" усиление метастазирования наблюдается довольно часто, что указывает на необходимость включения в схему комбинированной терапии средств с антиметастатическим действием (Балицкий К.П., Шмалысо Ю.П., 1987; Новиков В.И. и др., 1999).

В используемой нами модели хирургического вмешательства удаление первичной опухоли у мышей с карциномой LLC приводило к увеличению количества метастазов в 2,2 раза, площади метастазов - в 5,7 раза (по сравнению с группой мышей без операции).

Таблица 3

Влияние лохеина и эплира на метастазирование карциномы легких Льюис при

удалении первичного опухолевого узла (Х±т)

Показатели LLC п=4 Операция п=5 Операция + лохеин п=5 Операция + эплир п=5

Частота метастазирования, % 100 100 80 100

Количество метастазов/мышь 5,7±0,6 12,6±0,96 * 2,0±0,70 **• * 3,5±0,8 **■»

Площадь метастазов, мм2 4,5±0,21 28,1 ±4,8 * 0,76±0,1 **' # 1,55±0,31 **' *

* статистически значимые различия с группой "LLC", р < 0,05 ** статистически значимые различия с группой "Операция" р < 0.05

Лохеин и эплир у мышей с удаленной первичной опухолью ингибировали образование (на 76% и 72% соответственно) и рост (на 97% и 94% соответственно) метастазов по сравнению с группой животных, подвергшихся только операции (табл. 3).

Следует отметить, что образование и рост метастазов при терапии гепатопротекторами на фоне удаления опухоли значимо ингибируются не только по сравнению с группой мышей, подвергшихся операции, приводящей к усилению метастазирования, но и по сравнению с группой опухоленосителей, не получавших лечения.

Элиминация опухолевых клеток в процессе их миграции в сосуды и

циркуляции по ним во многом зависит от согласованности взаимодействия систем свертывания крови и фибринолиза, кининообразования, ренин-ангиотензиновой и простагландиновой систем (РоИопап .1., 1995; ОтзЫЬп О., 1998; Мовевзоп М., 2000). Формированию метастатических колоний также в значительной мере препятствует система иммунитета (Суслов А.П., 1990; АЬои(1 М е( а!., 1993; Бережная Н.М., 1999). Иммунотропное действие гепатопротекторов показано как при патологических состояниях (токсический гепатит), так и на здоровых животных (Саратиков А.С. и др., 2000, Перевозчикова Т.В., 2003). Можно предположить, что значительная доля антиметастатического действия лохеина и эплира может быть связана с их иммуномодулирующим эффектом.

И ммунотропиая активность гепатопротекторов у мышей-опухол«носителей и здоровых животных

Способность лохеина и эплира нормализовать число ядросодержащих клеток тимуса и перитонеапьного экссудата, естественную цитотоксичность клеток тимуса, количество антителообразующих клеток селезенки и число активных макрофагов показана ранее на модели токсического гепатита у мышей (Перевозчикова Т.В., 2003).

Морфо-физиологические параметры тимуса и селезенки (относительный вес и клеточность) являются важными показателями, характеризующими общее состояние иммунной системы. Они изменяются при старении, инфекционных заболеваниях, росте злокачественных опухолей и проведении противоопухолевой терапии (Kringsholm В., Christoffersen Р., 1984; Ковбасюк С.А., 1985; Moynihan J., Cohen N„ 1989; Hale L., 2004).

В наших экспериментах развитие LLC приводило к снижению клеточности тимуса на 60 - 70%, в селезенке при росте опухоли наблюдалось увеличение количества кариоцитов (рис.1). Показано, что лохеин при введении мышам с карциномой легких Льюис вызывал снижение числа спленоцитов на 33% и увеличение количества тимоцитов в 2,5 раза. Эплир не влиял на клеточность тимуса и селезенки у мышей с 1,1,С, но повышал количество лейкоцитов в

периферической крови (рис. 1).

□ тимус 250 0 селезенка

□ количество лейкоцитов в перифер.крови

LLC

LLC+лохеин LLC+эплир

Рис. 1. Коли чество

лейкоцитов в

периферической крови, тимоцитов и спленоцитов при терапии мышей с карциномой легких Льюис лохеином и эплиром за фоновый уровень (100%) приняты значения показателей у животных которым опухоль не перевивалась.

* - статистически значимые различия с группой "LLC ". р <0.05

Способность лохеина влиять на состояние органов иммунитета показана и на мышах без опухолевой патологии: отмечено повышение количества кариоцитов

тимуса (на 25%) и лейкоцитов в периферической крови (на 55%). Вероятно, в реализации данного эффекта играет роль влияние гепатопротекторов на процессы перераспределения лимфоидных клеток из депо.

Противоопухолевое и особенно антиметастатическое действие иммунотропных средств в значительной мер>е определяются их модулирующим влиянием на способность макрофагов и натуральных киллерных клеток вызывать лизис и ингибировать пролиферацию опухолевых клеток (Young М. et al., 1986; Суслов А.П., 1990).

Развитие опухоли и проведение противоопухолевого лечения приводит к нарушению функциональной активности клеток системы естественной резистентности (Wiltrout R. et al., 1985; Duffie G., Young M„ 1991). У мышей с LLC отмечено снижение активности натуральных киллеров на 10%, однако, за счет увеличения количества спленоцитов, обусловленного влиянием растущей опухоли, суммарный литический потенциал селезенки увеличивался более чем в 2 раза по сравнению с группой безопухолевого контроля (табл. 4). При терапии опухоленосителей лохеином наблюдалось не только восстановление индекса мембранотоксичности до уровня животных без опухолевой патологии, но и некоторое превышение этого показателя.

Курсовое введение эплира не вызывало значительных изменений активности натуральных киллеров. Суммарный литический потенциал селезенки, зависящий от мембранотоксического индекса и клеточности селезенки, при терапии гепатолротекторами повышался на 17-32% по сравнению с группой опухоленосителей, не получавших терапии (табл. 4).

Цитостатическую активность перитонеальных макрофагов оценивали по торможению пролиферации клеток мастоцитомы Р-815. Рост LLC не оказывал существенного влияния на противоопухолевую активность макрофагов, в то время как при курсовом введении гепатопротекторов мышам-опухоленосителям способность макрофагов ингибировать пролиферацию опухолевых клеток увеличивалась: лохеином - на 33%, эплиром - на 12% (табл. 4).

Таблица 4

Влияние лохеина и эплира на активность макрофагов и натуральных киллеров у

мышей с карциномой легких Льюис (Х±т)

Показатели Контроль п=5 LLC п=7 LLC+лохеин п=6 LLC+эплир п=6

Активность натуральных киллеров: ИМТ, % ЛЕ 61,3±0,2 568±22 55±1,3 * 1387±52 * 65,7±1,0 ** 1833±46 ** 58,8±1,2 1617±87 **

Цитостатическая активность макрофагов, % 42±3,8 54±1,5 72±2,1 ** 60,5±0,7 "

Примечание ИК4Т индекс мембранотоксической активности натуральных кшлеров. ЛЕ -литические единицы.

* - статистически значимые различия с группой "контроль", р < 0.05. *• - статистически значимые различия с группой "LLC", р <0.05

Макрофаги играют значительную роль в контроле процесса диссеминации опухоли, причем способны проявлять как антиметастатическую активность, так и усиливать рост опухолевых очагов (Громов С.А. и др.,1988; Суслов А.П., 1990; DufTie G., Young М., 1991). Для изучения вклада макрофагов в обеспечение антиметастатического эффекта гепатопротекторов был проведен эксперимент с использованием каррагенана, препарата, который обратамо (на 24 ч) блокирует активность макрофагов (Гольдберг Е.Д. и др., 1992). Показано, что ингибирование функции макрофагов под действием каррагенана приводит к усилению роста первичной опухоли у мышей с карциномой LLC на 30%, интенсивность метастазирования увеличивается в 1,8 раза, размер метастатических колоний - в 1,5 раза. При введении гепатопротекторов на фоне каррагенана масса первичной опухоли значимо не изменяется, в то же время число и площадь метастатических колоний снижаются до уровня, характерного для мышей-опухоленосителей без введения фармакологических агентов. Стоит отметить, что сами гепатопротекторы не обладают способностью ингибировать развитие первичной опухоли, однако ингибируют рост метастазов на 70%, кроме того, эплир вызывает значимое торможение формирования метастатических колоний у мышей с LLC о чем уже упоминалось выше. Таким образом, гепатопротекторы не способны в полной мере реализовать свой антиметастатический потенциал на фоне блокады макрофагов каррагенаном. Это свидетельствует о том, что антиметастатическое действие лохеина и эплира обусловлено как модулированием функциональной активности макрофагов, так и влиянием на эффекторные клетки лимфоидной или гранулоцитарной природы.

У мышей без опухолевой патологии нами также была изучена активность эффекторов естественной резистентности: перитонеальных макрофагов и натуральных киллеров. Показано, что гепатопротекторы при курсовом введении повышали натуральную киллерную активность спленоцитов: лохеин - в 1,8 раза, эплир - в 2,3 раза (табл. 5).

Таблица 5

Влияние лохеина и эплира на функциональную активность макрофагов и

натуральных киллеров у мышей (CBAxC57BI/6)Fl (X±m)

Показатели "Контроль" "Лохеин" "Эплир"

Активность НК: ИМТ, % ЛЕ 20+1,1 176±16 36,3±2,8 * 408±8 * 45,8+2,3 » 336±29 *

Цитостати ческая активность макрофагов, % 27+4,1 56±6,6 * 19,5±3,3

Цитостати ческая активность спленоцитов, % 24,3±1,3 28,5+1,2 41,3+0,3 »

Примечание■ ИМТ - индекс мембранотоксической активности натуральных талеров. J1E-литические единицы.

статистически значимые различия с группой "контроль ",р< 0,05

Киллерный потенциал селезенки, зависящий как от индекса

мсмбранотокси'шости, так и от количества кариоцитов, увеличивался при введении гепатопротекторов. Также показано, что лохеин повышает цитостатическую активность перитонеальных макрофагов, а эплир - спленоцитов у безопухолевых мышей (табл. 5).

В реализацию ингибирующей активности макрофагов в отношении опухолевых клеток могут быть вовлечены кислородзависимые и кислороднезависимые механизмы. В первом случае эффекторами являются активированные формы кислорода, генерируемые в реакции метаболического респираторного взрыва. Второй тип цитотоксических реакций связан с продукцией макрофагами цитокинов с противоопухолевой активностью: интерлейкин-1, фактор некроза опухолей -а и др. (Tsunawaki S„ Nathan С., 1984; Суслов А.П., 1990). Поскольку лохеин и эплир обладают антиоксидантными свойствами, было целесообразно оценить влияние гепатопротекторов на выработку клетками кислородных метаболитов с цитотоксическим действием. Продукцию активных форм кислорода макрофагами оценивали в реакции спонтанной и индуцированной хемилюмннесценции. Для стимуляции респираторного взрыва макрофагов использовали растворимый (форболмиристатацетат (ФМА)) и корпускулярный (опсонизированный зимозан (ОЗ)) стимулирующие агенты.

Результаты эксперимента свидетельствуют о способности гепатопротекторов при курсовом введении здоровым мышам оказывать незначительное модулирующее действие на показатели продукции макрофагами активных форм кислорода. Следует отметить, что введение циклофосфана в высоких дозах (200 мг/кг) приводит к некоторому усилению продукции активных форм кислорода в ответ на стимуляторы. При этом лохеин и эплир способны несколько снижать выработку перитонеальными макрофагами активных метаболитов кислорода.

Результаты данного эксперимента согласуются с литературными данными о прооксидантной активности циклофосфана (Prasad К., 2004). С усилением продукции свободных радикалов связывают токсические эффекты цитостатика, в том числе его иммунодепрессивное действие (Kehrer J„ Biswal S., 2000). Умеренное ингибирование избыточной продукции свободных радикалов гепатопротекторами можно рассматривать как элемент цитопротективной способности препаратов в условиях введения цитостатика.

Помимо неблагоприятного влияния опухоли на неспецифические эффекторы системы иммунитета, отмечается нарушение функций клеток, непосредственно обеспечивающих специфический иммунный ответ. Так, у мышей с LLC отмечено увеличение спонтанной пролиферации спленоцитов при значимом снижении их пролиферативного ответа на адекватные стимулы (табл. 6), что косвенно свидетельствует о нарушении способности лимфоцитов к формированию полноценного иммунного ответа.

При терапии мышей-опухоленосителей лохеин и эплир вызвали снижение спонтанной пролиферации, повышенной под влиянием роста опухоли, (лохеин -на 44%, эплир - на 39%), однако, данный показатель оставался выше контрольного в 1,6- 1,8 раза.

Таблица 6

Влияние лохеина и эплира на пролиферативную активность спленоцитов у мышей _ с карциномой легких Лькжс(Х±т)__

Показатели Контроль п=5 LLC п=6 LLC+лохеин п=7 LLC+эплир п=7

Спонтанная пролиф., имп/мин 794±120 2271±376* 1277±% ** 1393±56 »*

ЛПС- индуцированная пролиферация, имп/мин 35681±406 16849±1272 * 16670±2355 20319±1380

КонА- индуцированная пролиферация, имп/мин 20696±810 9956±1118 * 14362±1193 ** 20625±3005 *«

* - статистически значимые различия с группой "контроль ", р < 0,05, ** - статистически значимые различия с группой "LLC", р < 0,05

Пролиферативный ответ B-лимфоцитов на ЛПС у опухоленосителей не изменялся при курсовом введении гепатопротекторов, а сниженная КонА-индуцированная пролиферация Т-клеток увеличивалась в 1,4-2,1 раза и под влиянием эплира достигала уровня интактных животных (табл.6).

Кроме того, лохеин и эплир обладают противовоспалительным эффектом, что было показано нами в реакции гиперчувствительности замедленного типа: препараты снижали индекс воспаления на 37% и 24% соответственно.

Влияние лохеина и эплира на иммунотоксичиость высоких и низких доз циклофосфана

Циклофосфан - алкилируюший агент с высокой эффективностью и широким спектром противоопухолевого действия. Однако, при проведении терапии больных злокачественными опухолями циклофосфаном, как и большинством противоопухолевых агентов, часто лимитирующими факторами являются миело- и иммунотоксичиость цитос(этических агентов, что вынуждает прекратить лечение или снизить дозы противоопухолевых препаратов (ten Berge R. et al., 1984; Птушкин B.B., 2002; Yoon S. et al„ 2003).

В наших экспериментах при проведении цитостатической терапии мышей с LLC циклофосфаном в дозе 40 мг/кг отмечены иммунотоксические эффекты: снижение клеточности тимуса и селезенки, количества лейкоцитов в периферической крови (рис. 2).

Лохеин способен повышать содержание кариоцитов в тимусе и селезенке, оба гепатопротектора нормализуют количество лейкоцитов в периферической крови, что свидетельствует о снижении иммунодепрессивного действия цитостатика (рис. 2).

Вероятно, гепатопротекторы способны снижать повреждающее действие метаболитов циклофосфана на кариоциты тимуса и селезенки, а также регулировать перераспределение иммуноцитов в организме.

Рис.2. Количество лейкоцитов в периферической крови,

тимоцитов и спленоцитов при терапии мышей с карциномой легких Льюис

гепатопротекторами и

циклофосфаном (40 мг/кг) за фоновый уровень (НИМ)) приняты имчепия показателей

беюпухшеаых м ивотиых, * статистически значимые

различия с группой "I/X'", р 0.05 ** статистически значимые

различия с группой "1,1,(' IЦФ", > 0.05

В терапии экспериментальных опухолей цитостатик обычно используется курсами, в дозах 20-200 мг/кг на одно введение (при максимально переносимой дозе 250-333 мг/кг для мышей различных линий (Масная Н.В. и др., 2003». В наших экспериментах на 4-е сутки после введения цитостатика в дозе 250 мг/кг мышам (СВА*С57В!/6)Р| отмечена выраженная иммунодепрессия: клеточность селезенки составляла 11% от уровня интактного контроля, тимуса - 7% (табл.7).

Таблица 7

Влияние гепатопротекторов на некоторые морфо-физиологические показатели системы иммунитета на 4 сутки после введения циклофосфана в дозах 250 и 120 мг/кг мышам (СВАхС57В1/6)Р, (Х±ш)

Группы животных Количество тимоцитов, млн/мышь Количество спленоцитов, млн/мышь Количество миелокарио-цитов (млн/ белр.кость) Количество лейкоцитов в пер. крови (млн/мл)

1. Контроль 11=5 33±3,6 80,7±4,5 9,2±0,8 16,13±1,28

ЦФ 250 мг/кг п=5 2,2±0,1 * 8,8±0,9 * 1±0,09 * 4,03±0,42 *

ЦФ 250 мг/кг +лохеин п=5 5,2±2,0 ** 12±0,2 ** 0,82±0,18 3,67±0,08

ЦФ 250 мг/кг +эплир п=5 3,1±0,45 ** 13,3±0,72 ** 0,73±0,1 10,82±1,63 **

2. Контроль п=5 67,8±6,5 151,8±17,4 10,8±0,64 13,36±0,98

ЦФ 120 мг/кг п=6 12,5±1,0 * 61,8±5,6 * 3,26±0,5 * 3,47±0,32 *

ЦФ 120 мг/кг + лохеин п=5 12,8±0,9 79,3±0J ** 3,58±0,27 6,1±0,12 **

ЦФ 120 мг/кг +эплир п=5 9,4±0,3 72,3±1,0 ** 2,65±0,13 6,31 ±0,49**

* - статистически значимые различия с группой "контроль" (мыши, получавшие физиологический раствор), р < 0.05.

** статистически значимые различия с группой "ЦФ 250 мг/кг" или "ЦФ 120 мг/кг". р<0,05

LLC LIC-HJ» LLCHWtnoxMH LLC-НЮиллир

Введение лохеина и эплира повышало клеточность селезенки в 1,4 - 1,5 раза, тимуса - в 1,4 - 2,4 раза (табл.7). Циклофосфан вызывал в периферической крови лейкопению (до 25% от фонового уровня), эплир в 2,5 раза увеличивал содержание лейкоцитов.

Однократное введение цитостатика в высокой терапевтической дозе (120 мг/кг) вызывает выраженную иммуносупрессию, хотя и р меньшей степени, чем при введении противоопухолевого агента в максимально переносимой дозе (250 мг/кг). При введении гепатопротекторов после воздействия циклофосфана в дозе 120 мг/кг показано увеличение количества лейкоцитов в периферической крови, некоторое повышение клеточности селезенки (табл.7).

Таким образом, лохеин и эплир способны умеренно корригировать морфо-физиологические параметры иммунокомпетентных органов, измененные при введении циклофосфана в высоких терапевтических дозах (вплоть до максимально переносимых). При этом следует отметить, что сниженное под влиянием циклофосфана число кариоцитов в костном мозге не восстанавливалось при введении гепатопротекторов. Это указывает на приоритетное значение перераспределительных процессов, лежащих в основе корригирующего действия лохеина и эплира на морфо-физиологические показатели иммунокомпетентных органов при введении циклофосфана

Таким образом, полученные в настоящем исследовании результаты свидетельствуют о способности гепатопротекторов лохеина и эплира повышать эффективность цитостатической терапии экспериментальных опухолей. Синер(ичный ингибирующий эффект совместного использования циклофосфана и указанных препаратов на процессы метастазирования перевиваемых опухолей обусловлен с одной стороны, их самостоятельной противоопухолевой активностью, с другой - способностью снижать токсическое действие цитостатика Полученные антитоксические эффекты, без сомнения, обусловлены антиоксидантными свойствами изучаемых агентов и их протекторным действием в отношении моиооксигеназной системы печени, а также регуляторным (нормализующим) влиянием на белковый, жировой и энергетический обмен. Антиметастатический эффект препаратов, выраженный в том числе в условиях операционного стресса и экспериментального метастазирования в печень (АКАТОЛ), кроме вовлечения вышеуказанных механизмов, очевидно, является результатом их положительного воздействия на функциональную активность эффекторных клеток системы иммунитета. В целом, на основании данных, полученных в нашей работе, исследуемые гепатопротекторы могут быть отнесены к модификаторам биологических реакций, существенными атрибутами которых является способность модулировать эффективность цитостатической терапии, снижать токсические проявления химиопрепаратов, восстанавливать эффекторный потенциал иммунокомпетентных клеток, устранять компоненты, способствующие опухолевому росту. Таким образом, лохеин и эплир можно рассматривать как перспективные средства для повышения эффективности цитостатической терапии.

ВЫВОДЫ

1. Лохеин потенцирует противоопухолевое и антиметастатическое действие циклофосфана, применяемого в максимальной и низкой терапевтических дозах при терапии мышей с карциномой легких Льюис (LLC), а также усиливает антиметастатическую эффективность низких доз цитостатика у мышей с меланомой В-16. Эплир усиливает ингибирование образования и роста метастазов LLC низкими терапевтическими дозами циклофосфана.

2. Лохеин и эплир проявляют умеренное антиметастатическое действие на моделях LLC и меланомы В-16 у мышей С57В1/6 (индекс ингибирования метастазирования составил 25-79%, торможение роста метастазов - 38-76%). У мышей с LLC при удалении первичной опухоли оба гепатопротектора ингибируют образование и рост метастатических колоний в легких. На мышах BALB/c показана способность лохеина снижать интенсивность метастазирования аденокарциномы толстого кишечника АКАТОЛ в печени в 1,8 раза.

3. Введение лохеина и эплира мышам с карциномой легких Льюис как на фоне проводимой химиотерапии и хирургического лечения, так и без терапевтических воздействий, оказывает положительное влияние на морфо-физиологические показатели тимуса и селезенки. У нелеченых мышей с LLC гепатопротекторы способствуют нормализации активности натуральных киллеров, спонтанной и КонА-индуцированной пролиферации спленоцитов.

4. Оба изучаемых гепатопротектора стимулируют цитостатическую активность перитонеальных макрофагов у мышей C57BI/6 с карциномой легких Льюис. При блокаде функциональной активности макрофагов каррагенаном лохеин и эплир не ингибируют образование и рост метастатических колоний, что свидетельствует о вовлечении макрофагов в реализацию антиметастатического действия препаратов.

5. Гепатопротекторы лохеин и эплир способны снижать проявления токсического действия высоких доз циклофосфана в отношении морфо-физиологического состояния органов иммунитета и функциональной активности иммунокомпетентных клеток.

6. Гепатопротекторы при курсовом введении здоровым мышам снижают реакцию гиперчувствительности замедленного типа (на 24-37%), повышают митоген-индуцированную пролиферацию Т-лимфоцитов (на 15%) и активность натуральных киллеров (в 1,8-2,3 раза). Эплир повышает цитостатическую активность спленоцитов, а лохеин - клеточность тимуса, количество лейкоцитов в периферической крови, цитостатическую активность перитонеальных макрофагов.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ

1. Влияние гепатопротекторов естественного происхождения на

эффективность цитостатической терапии экспериментальных опухолей //

Тезисы VI ежегодной Российской онкологической конференции. - Москва.

- 26-28 ноября 2002. - С. 199. (в соавт. с Чердынцевой Н.В., Саратиковым

A.C., Смольяниновым Е.С.)

2. Иммуномодулирующая активность гепатопротекторов естественного

происхождения // "Некоторые аспекты иммунопатогенеза воспалительного

процесса". - Красноярск. - 2003. - С.71-74.

3. Гепатопротектор лохеин повышает эффективность цитостатической терапии экспериментальных злокачественных опухолей Н Материалы VI конференции молодых онкологов Украины "Актуальные проблемы экспериментальной и клинической онкологии". - Киев. - 2003. - С.34—35.

4. Биомодулирующая активность гепатопротекторов // Вестник Томского > государственного университета. - 2003. - Приложение №8. - С.124-126.

5. Исследование эффективности гепатопротектора лохеина в комплексной терапии экспериментальных злокачественных опухолей // Сибирский онкологический журнал. - 2003. - №4. - С. 17-21.

6. Гепатопротекторы природного происхождения в терапии экспериментальных злокачественных опухолей // Материалы III съезда онкологов и радиологов СНГ. - Минск. - 25-28 мая 2004. - С.340 (в соавт. с Чердынцевой Н.В., Саратиковым A.C.).

7. Повышение гепатопротекторами лохеином и эплиром эффективности терапии экспериментальных опухолей циклофосфаном II Материалы V конгресса молодых ученых и специалистов "Науки о человеке". - Томск. -2004. - С.299-301.

8. Гепатопротекторы лохеин и эплир в терапии экспериментальных опухолей // Материалы V молодежной научной конференции СО РАМН "Фундаментальные и прикладные аспекты современной медицины". -Новосибирск. - 2004. - С.52-53.

9. Гепатопротекторы повышают эффективность терапии экспериментальных опухолей циклофосфаном II Российский онкологический журнал. - 2004. -№6. - С.29-33 (в соавт. с Саратиковым A.C., Чердынцевой Н.В.).

10. Средство, повышающее противоопухолевую и антиметастатическую активность циклофосфана Н патент РФ № 2225720 от 20 марта 2004 г (в соавт. с Ратькиным A.B., Чердынцевой Н.В., Чучалиным B.C., Саратиковым A.C.).

Подписано к печати 22.03.2005г. Тираж Г00 экз. Заказ №21. Бумага офсетная. Печать RISO. Отпечатано в типографии ООО «РауШ мбХ»

Лицензия Серия ПД№ 12-0092 от 03.05 2001г. 634034, г. Томск, ул. Усова 7, ком. 052. тел. (3822) 56-44-54

РНБ Русский фонд

2005-4 41858

í

Актуальность работы.

На современном этапе развития онкологии возможности дальнейшего повышения эффективности лечения путем монотерапии злокачественных опухолей традиционными методами (лекарственная и лучевая терапия, хирургическое вмешательство) практически исчерпаны. Для улучшения результатов лечения все чаще используются комбинации основных методов воздействия, разрабатываются принципиально новые подходы к лечению рака (фотодинамическая терапия, генотерапия, использование моноклональных антител и т.п.) (Хансон К.П. и др., 1996; Якубовская Р.И., 2000; Adam R., 2003; Cerosimo R., 2003; Барышников А.Ю., 2004). К сожалению, показатели общей онкологической смертности за последние десятилетия изменились незначительно. Даже возможность успешного лечения первичной опухоли не исключает гибели больного от метастазов, которые часто существуют уже на момент постановки диагноза (Новиков В.И. и др., 1999), и прогноз для больных местнораспространенными и метастатическими формами рака остается немногим лучше, чем 30 лет назад, несмотря на широкое использование химиотерапевтических средств (Хансон К.П. и др., 1996; Olivotto I. et al., 2003).

В настоящее время химиотерапия стала неотъемлемым компонентом комплексного лечения многих злокачественных опухолей. Хотя существует ряд опухолей, при которых на сегодняшний день возможно полное излечение методами химиотерапии (хорионэпителиома матки, лимфогранулематоз, злокачественные опухоли яичка, острый лимфобластный лейкоз), в большинстве случаев ее резервов недостаточно для полной регрессии опухоли и эрадикации метастатических очагов, в связи с чем повышение эффективности цитостатического лечения является одной из актуальных проблем онкологии (Поддубная И.В., 1998; Переводчикова Н.И., 2001; Mamon Н. et al., 2005).

Принципы современной химиотерапии опухолей предполагают введение максимально переносимых доз цитостатиков с целью наиболее полного повреждения опухолевых клеток. Побочные эффекты цитостатической терапии - выраженная миелотоксичность, иммуносупрессия, гепатотоксичность — часто приводят к необходимости прекращения лечения и/или снижению доз противоопухолевых агентов (Богуш Т.А., Богуш Е.А., 1995; Mackall С. et al., 1995; Kirwan J. et al., 2003). Гепатотоксическое действие цитостатической терапии приводит, во-первых, к снижению ее эффективности в связи с ингибирующим влиянием на ферментные системы, способствующие проявлению специфической активности цитостатиков, во-вторых, к увеличению их токсичности вследствие снижения детоксицирующей функции печени (Богуш Т.А. и др., 2001; King P., Perry М., 2001; Jaeschke Н. et al., 2002). Ключевую роль в этих процессах играет монооксигеназная система печени, осуществляющая одновременно активирующую и детоксицирующую функции, при этом показано, что нарушение активности монооксигеназ часто наблюдается при онкологических заболеваниях. В исследованиях ряда авторов получены данные о том, что путем стимуляции монооксигеназ может быть достигнуто повышение эффективности противоопухолевой цитостатической терапии у больных с сопутствующими патологическими изменениями печени (Богуш Т.А. и др., 2000; Block К., Gyllenhaal С., 2002; Baldwin A. et al., 2003).

Гепатопротекторные средства широко применяются для лечения поражений печени различной этиологии. Несмотря на то, что перечень средств с гепатозащитным действием довольно внушителен (растительные полифенолы, препараты фосфолипидов, витамины, аминокислоты и т.д.), наибольшее распространение в терапии патологии печени занимают препараты, содержащие силимарин (легалон, карсил, силимар, силибор и др.) и фосфолипидные комплексы, среди которых лидером является эссенциале форте (Егоров В.А. и др., 1999).

Широкий спектр точек приложения препаратов природного происхождения предполагает возможность влияния на многие системы организма, контролирующие рост и метастазирование злокачественных опухолей (Немцова Е.Р. и др., 2002). Показано в частности, что препараты, содержащие силимарин, способны оказывать опухолепротекторное действие, ингибируя развитие новообразований, индуцированных химическими канцерогенами, при этом эффект обусловлен преимущественно антиоксидантными свойствами соединений (Zhao J., Agarwal R., 1999; Zhao J. et al., 2000; Manna S. et al., 1999; Zhu W. et al., 2001).

Иммуномодулирующее действие — обязательный компонент действия многих препаратов природного происхождения, при этом именно антиоксидантные свойства могут быть принципиально важными для восстановления нормального функционирования иммунокомпетентных клеток в условиях повреждающих воздействий, связанных с активацией процессов липопероксидации (рост опухоли, цитостатическая терапия, операционный стресс) (Олейник А.В., 1985; Пальмина Н.П., Бурлакова Е.Б., 1985; Афонина Г.Б. и др., 1998; Новоселова Е.Г. и др., 1998; Муфазалова Н.А., 2002). Существуют многочисленные сведения о том, что повышение эффективности цитостатической терапии препаратами растительного происхождения реализуется через вовлечение иммунологических механизмов (Пашинский В.Г., Яременко К.В., 1983; Иваницкая Л.П., Вядро М.М., 1989; Новиков В.И. и др., 1999; Гольдберг Е.Д., Зуева Е.П., 2000).

Все вышесказанное указывает на перспективность использования гепатопротекторных средств с антиоксидантной активностью для повышения эффективности цитостатической терапии злокачественных новообразований.

Учеными Сибирского медицинского университета и Института химии нефти ТНЦ СО РАН разработаны и изучены оригинальные гепатопротекторы лохеин - экстракт солянки холмовой и эплир - экстракт полярных липидов высокоминерализованных озерных отложений (Саратиков А.С. и др., 1990 а, б). Терапевтический эффект лохеина обусловлен комплексом биологически активных веществ, важнейшими из которых являются глицинбетаин, флавоноиды, стерины и их гликозиды, каротиноиды, соли органических кислот, алкалоиды (Саратиков А.С. и др., 2000). Биологическая активность эплира связана с содержащимся в его составе комплексом фосфо- и сульфолипидов, каротиноидов, тиолов (Саратиков А.С. и др., 1995). Лечебно-профилактическое действие данных гепатопротекторов обусловлено собственными антирадикальными свойствами и способностью регулировать активность антиоксидантных факторов клеток, белковый, липидный и энергетический обмен. По эффективности терапевтического воздействия при повреждениях печени различной этиологии лохеин и эплир не уступают наиболее распространенным препаратам с гепатозащитным действием (легалон, эссенциале), а по ряду показателей (например, защитное действие на нарушенную тетрахлорметаном антитоксическую функцию печени) превосходят их (Саратиков А.С. и др., 2000). На фоне интоксикации циклофосфаном лохеин и эплир снижают общую токсичность цитостатика, препятствуют развитию морфологических нарушений печени, в частности, некрозу гепатоцитов, нормализуют биохимические показатели (Саратиков А.С. и др., 2004). Оба препарата обладают способностью нормализовать либо повышать активность ферментов метаболической биотрансформации (цитохрома Р-450, глутатион-S трансферазы и др.) (Саратиков А.С., Венгеровский А.И., 1999). Получены данные о нормализующем влиянии гепатопротекторов на показатели системы иммунитета у животных с хроническим токсическим гепатитом (Венгеровский А.И. и др., 1988; Перевозчикова Т.В., 2003).

Таким образом, в состав лохеина и эплира входит комплекс различных субстанций, обеспечивающий широкий спектр модулирующих и терапевтических эффектов этих препаратов. Полученные данные о прямом либо опосредованном через регуляцию ферментов биотрансформации антитоксическом действии, способности нормализовать липидно-белковый и энергетический обмен, восстанавливать функции иммунокомпетентных клеток являются многообещающими предпосылками для исследования перспективности применения указанных препаратов с целью повышения эффективности цитостатической терапии.

Целью работы явилась экспериментальная оценка способности лохеина и эплира повышать эффективность цитостатической терапии опухолей и изучение механизмов их биомодулирующей активности.

Задачи:

1. Изучить влияние гепатопротекторов лохеина и эплира на эффективность цитостатической терапии злокачественных опухолей в эксперименте.

2. Оценить противоопухолевое и антиметастатическое действие лохеина и эплира у мышей с перевиваемыми опухолями и их влияние на процесс послеоперационного метастазирования.

3. Исследовать влияние гепатопротекторов на функциональную активность иммунокомпетентных клеток у мышей с экспериментальными злокачественными опухолями.

4. Изучить способность лохеина и эплира модулировать действие цитостатического агента циклофосфана на морфо-физиологические показатели и функциональную активность клеток системы иммунитета.

5. Оценить влияние гепатопротекторов на формирование иммунного ответа, функциональную активность лимфоцитов и макрофагов у здоровых животных.

Научная новизна.

Впервые установлена способность гепатопротекторов лохеина и эплира повышать эффективность цитостатической терапии опухолей. Приоритет полученных данных подтвержден патентом РФ №2225720 от 20 марта 2004 г "Средство, повышающее противоопухолевую и антиметастатическую активность циклофосфана". На перевиваемых опухолях, метастазирующих в легкие и печень, показано умеренное антиметастатическое действие лохеина. Эплир ингибирует образование метастатических колоний в легких.

Оба изучаемых гепатопротектора ингибируют процесс послеоперационного метастазирования.

Установлено, что лохеин и эплир способны снижать токсическое действие высоких доз циклофосфана на ютеточность тимуса и селезенки, модулировать пролиферативную активность лимфоцитов и развитие гуморального иммунного ответа на тимусзависимый антиген на фоне введения циклофосфана.

Показана способность лохеина и эплира нормализовать клеточность тимуса и селезенки, активность натуральных киллеров, пролиферативный ответ спленоцитов, нарушенные при росте злокачественных опухолей у мышей. Изучаемые гепатопротекторые средства повышают цитостатическую активность перитонеальных макрофагов мышей-опухоленосителей, что, по крайней мере частично, определяет антиметастатическую активность препаратов.

Полученные результаты о способности лохеина и эплира модулировать активность клеток системы естественной резистентности (макрофагов и натуральных киллеров) и пролиферативный ответ лимфоцитов дополняют существующие представления об иммунотропной активности данных препаратов.

Научно-практическая значимость.

В эксперименте на примере препаратов лохеин и эплир установлено, что гепатопротекторные средства природного происхождения с антиоксидантной активностью могут использоваться в качестве агентов, повышающих эффективность терапии злокачественных опухолей. Полученные результаты позволяют рекомендовать проведение клинической апробации лохеина и эплира в комплексной терапии больных со злокачественными новообразованиями.

Представленные в работе данные об иммунотропной активности лохеина и эплира при их применении у интактных животных, у мышей с перевиваемыми опухолями, а также с иммунодепрессией, индуцированной введением высоких доз цитостатика, свидетельствуют о целесообразности включения данных препаратов в комплексное лечение пациентов со сниженной иммунореактивностью и получающих препараты, обладающие иммуно- и гепатотоксичностью.

Положения, выносимые на защиту.

1. Гепатопротекторы лохеин и эплир способны повышать эффективность терапии злокачественных опухолей циклофосфаном.

2. Лохеин и эплир обладают умеренным собственным антиметастатическим действием, которое может реализоваться за счет повышения функциональной активности лимфоцитов, макрофагов, натуральных киллерных клеток опухоленосителей.

3. Лохеин и эплир способны снижать выраженность иммунодепрессии, вызванной введением противоопухолевого препарата циклофосфана в высоких дозах.

4. У здоровых животных лохеин и эплир модулируют функциональную активность лимфоцитов, макрофагов и натуральных киллеров.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на ежегодных отчетных конференциях молодых ученых НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН в 2002, 2003, 2004 гг, конференции, посвященной 70-летию биолого-почвенного факультета ТГУ (Томск, 2003), V конгрессе молодых ученых и специалистов "Науки о человеке" (Томск, 2004), V молодежной научной конференции СО РАМН "Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины" (Новосибирск, 2004), III съезде онкологов и радиологов СНГ (Минск, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ. Получен патент на изобретение №2225720 от 20 марта 2004 г "Средство, повышающее противоопухолевую и антиметастатическую активность циклофосфана".

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 150 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, выводов,

выводы

1. Лохеин потенцирует противоопухолевое и антиметастатическое действие циклофосфана, применяемого в максимальной и низкой терапевтических дозах при терапии мышей с карциномой легких Льюис (LLC), а также усиливает антиметастатическую эффективность низких доз цитостатика у мышей с меланомой В-16. Эплир усиливает ингибирование образования и роста метастазов LLC низкими терапевтическими дозами циклофосфана.

2. Лохеин и эплир проявляют умеренное антиметастатическое действие на моделях LLC и меланомы В-16 у мышей С57В1/6 (индекс ингибирования метастазирования составил 25 - 79%, торможение роста метастазов - 38 -76%). У мышей с LLC при удалении первичной опухоли оба гепатопротектора ингибируют образование и рост метастатических колоний в легких. На мышах BALB/c показана способность лохеина снижать интенсивность метастазирования аденокарциномы толстого кишечника АКАТОЛ в печени в 1,8 раза.

3. Введение лохеина и эплира мышам с карциномой легких Льюис как на фоне проводимой химиотерапии и хирургического лечения, так и без терапевтических воздействий, оказывает положительное влияние на морфо-физиологические показатели тимуса и селезенки. У нелеченых мышей с LLC гепатопротекторы способствуют нормализации активности натуральных киллеров, спонтанной и КонА-индуцированной пролиферации спленоцитов.

4. Оба изучаемых гепатопротектора стимулируют цитостатическую активность перитонеальных макрофагов у мышей С57В1/6 с карциномой легких Льюис. При блокаде функциональной активности макрофагов каррагенаном лохеин и эплир не ингибируют образование и рост метастатических колоний, что свидетельствует о вовлечении макрофагов в реализацию антиметастатического действия препаратов.

5. Гепатопротекторы лохеин и эплир способны снижать проявления токсического действия высоких доз циклофосфана в отношении морфо-физиологического состояния органов иммунитета и функциональной активности иммунокомпетентных клеток.

6. Гепатопротекторы при курсовом введении здоровым мышам снижают реакцию гиперчувствительности замедленного типа (на 24 — 37%), повышают митоген-индуцированную пролиферацию Т-лимфоцитов (на 15%) и активность натуральных киллеров (в 1,8 - 2,3 раза). Эплир повышает цитостатическую активность спленоцитов, а лохеин - клеточность тимуса, количество лейкоцитов в периферической крови, цитостатическую активность перитонеальных макрофагов.