Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Эффективность функции системы Т-супрессоров клеточного иммунитета

1 9«.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ

На правах рукописи

ЧЕИЮУСОВ АЛЕКСАНДР ДОИТгаЕВИЧ

УДК 612.112.94:017.1.064.08

ЭМЕКГОВДЕ ФУНКЦИИ СИСТЕМЫ Т-СУПЕЕССОРОВ КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА

14.00.36 - Аллергология и ишунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медйцинскдсс наук

Москва - 1991

Райога выполнена в Институте иммунологии Минздрава СССР. Научный консультант -

доктор медицинских наук, профессор Н.В.Медуницын

Официальные оппонента:

доктор медицинских наук С.С.Гамбаров доктор медицинских тук, профессор Б.Б.Фуко доктор медицинских наук, профессор А .А Лршош

Ведущее учреждение - Центральный научно-исследовательсшй институт вакцин и сывороток ил. И .И .Мечникова.

С' Защита состоится "_"_1991 г. в__

сов на заседании Специализированного совета Д 074.09.01 пртт. Институте иммунологии Минздрава СССР по адресу: Москва, II547E Каширское юоссе, д. 24, корп. 2.

С диссертациоР' можно ознакомиться в библиотеке Института иммунологии Шдздрава СССР.

Автореферат рааослан "_"_1991 г.

У-чвкый секретарь Специализированного совета доктор биологических наук

А.Б.Колобов

«it знал j

*«■ -i M-№i I -3-

Д>1ссе'ртдиий j ОБЩАЯ ХАРАКТЕШСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы» В настоящее время получены убедительные доказательства того, что Т-оупреосоры (То) во взрослом организма выполняют важнейшую физиологическую функцию, а именно, функцию поддержания толерантности к собственным тканям /Фонталян Л.Н. с соавт., I960; Mitchaeon, 1989; Tomita et а!., 1990; Strober et al., 1990/, первоначально обусловленную делецией аутореактивных ¡лимфоцитов /Bermt et al., IS90/. Дефицит То приводит к развитии патологических состояний - аллергии /Петров Р.В., I98S; Ishiza-ka , 1989/, аутоиммунных процессов / Anderson, 1986{Lider, 1989/, а юс активация - к имыуводефиняткому синдрому, например, при заместительной трансплантации костного мозга / wall et al., 1989/.

Указанные феномены связаны о звдунорвгулкторной функцией супреооорных клеток, обуславливающих негативную регуляцию тмур-ного ответа / sercara , 1989/. Однако регуляцией иммунного ответа вффекторные функции сяотеш Т-оупреосоров далеко не исчерпываются. Данные, полученныэ в лаборатории Е.А.Краскикой, показали, что Т-сулреосорам присуща "функция контроля над пролиферацией клеток" лимфоидного и нелимфоидного происхождения /Краскина H.A., 1987/. Кроме того, имеются многочисленные данные о том, ч-io идиотин- и изомшовязывагацие Т-оупреоооры обуславливают резистентность к опухолевому росту лимфом, экспрессируюцих соответствуюдий идиотип ИЛИ И80ТИП / Lyncü, 1984,1985; Maekawa, Ovary, 1966; Glosh ei, al»,1990/. Иными словами, данныо популяции южно рассматривать как эффекторы система клеточного иммунитета, препятстьующие прогрессии опухолей лимфсидпого происхождения, то есть обладающие в отношении них надзорной функцией. . •

Традиционно принято считать, что надзорная функция в отношении антигенпозитизных клеток (АГ+К), аыражавдаяся в их элиминации или подавлении пролиферации, определяется различными популяция™ эффекторов клеточного ишунитета. К ним, в первую очередь, относятся популяции естественных цитотоксических и цитостатических клеток С кк-и NC-клеток}, а также многочисленные субпопу.йции макрофагов /Славина Е.Г.,-1984; Суслов, А.П., 1984; Еогдашин И.В., 1986; Ehrlich et al., 1984; Pederson, 1285; Bainesa, 1955; sayeru et al., I98S/. В иммунном организме элиминация антигечпо-зитивных клеток обусловлена'как активировании,я макрофагами /п -.-kajama et al., 1985, Yandebriel et al., 1989/, так И эжектор-

ныш Т-лимфоцитами, непосредственно инфильтрирующими опухоль /Оуолов А.П., 1988; Оапгог, 1984; М1кНег31, 1990/.

Однако элиминировать антигенгсо зитивньга клерки или ингибиро-вдть их пролиферацию могут, по-видимому, и некоторые популяции антигеновяаываяцшс Т-оупресооров, которые, как и клатки, обуславливающие естественную резиотентность к актигенповитивным клеткам, распознают антиген вне контекста с продуктами Генов главного комплекса гистосовмеогкмооти и с окре тируют антигенсвязывавдие цитотоксичеокие факторы, активирующие в макрофагах продукцию свободам* форм кислорода и неспецифических цитоотатических факторов /гаива^б, 1980} Окийа е* аХ., 1581/.

Очевидно, что выявлений свойств эффекторов система клеточного иммунитета, направленных на элиминацию АГ+К или подавление их пролиферации, имеет большое теоретическое значение и чрезвычайно актуально, поскольку раскрывает новый механизм иммунного ответа против АГ+К, т.е. новый механизм иммунологического надзора.

Если Т-супрессоры действительно обладают свойствами эффекторов клеточного иммунитета, то принципиальным представляется вопрос, происходит ли их формирование только при толерантности или оно возможно при развитии клеточного иммунного ответа? В частности, при развитии реакций ГЗТ, поскольку они определяют важнейшие иммунологические феномены / 1игк> 1980/.

Цель и задачи исследование. Исходя из вышеизложенного, целью настоящего исследования явилось выявление функции эффекторов системы клеточного иммунитета, направленной на подавление пролиферации антигенпозитивных клеток ликвидного и нелимфоидиого происхождения, у Т-суирессоров, формирующихся при развитии реакций

гаг.-

В качестве модели ГЗГ на антигенпозитивныа клетки была использована модель ГЗТ, индуцированная внутривенным введением оин-генных клеток селезенки, модифицированных гаптеном - 2,4,6-три-нитрофенилсульфокислотой /Черяоусов с соавт., 1982/.

Для достижения поставленной цели потребовалось решение следующих задач:

1. Изучение функциональных свойств, фототипической характеристики и особенностей формирования Т-супрессоров при развитии рэакций ГЗГ;

2. Получение гибридом аю ь^нсвязывавдих Т-супреосоров;

3. Получение антигеневдзнваадих продуктов гибридом и иссле-

дованна их функциональных свойотв, иымунохимичеокой и биохимической характеристики;

4. Проведений анализа ангипролиферативного эффекта продуктов Т~гибридом, обусловленного прямым взаимодействием о антигенпози-тивной клеткойI

б. Выявление антипродиферативной активнооти макрофагов, активированных воздействием продуктов Т-гибридом.

6. Исследование возможности получения из клеток периферичео-кой крови человека линии оупросоороэ пролиферации, продукты которых специфически подавляли бы рост человеческой лимфомы.

При выполнении работы возникла необходимость в решении прикладных аспектов, связанных с проблемой регуляции ГЗТ к химическим аллергенам, В связи о этим а работе решались еще Я задачи:

7. Разработка модели отабильной формы ГЗТ к химическим аллергенам на фойе дефицита Т-супресооров{

8. Разработка способа выявления аллергенной активности хими-Чеокюс промышленных веществ и лекарственных препаратов на мылах.

Научна.^ г.озизщ. В результате проведенной работы:

- впервые показано, что рагуляторная функция Т-оупрассоров фазы индукции ГЗТ очень тесно связана о функцией эффекторов сио-тош клеточного иммунитета, Антигеисвяэывавдиэ продукты этих клеток способны специфически ингибировать пролиферацию лимфоидных и иелшфоидти лейкоаних кяэтон, модифицированных гаптеном, которым активированы Т-супраосори;

- выявлен ношй тип аитигенсвязывающих Т-оупреосоров, продуцирующих антигансвяанващий фактор, по своим свойотвам отличащий-оя от ранее известных продуктов Т-оупреосоров, и ингибирущий пролиферацию антэтеипо гттианкх клеток и антигекзависимуи пролиферацию, но не влиямций на интенсивность реакций ГЗТ;

- способность к подавлению пролиферации сингенных и ксено-генных лимфом продукта/ли Т-супрессоров может быть опосредояана макрофагами;

- впервые из клеток периферической крови человека получена линия супрессоров пролиферации, ингибирущих рост лимфомы человека.

- впервые установлено, что при развитии реакций ГЗТ происходит формирование Т-супрессоров фазы индукции ГЗТ;

- с учетом эффекторншс свойств Т-супрессоров пострсена схема иммунного ответа на антигешозитивные клетки и его рогуляции.

Практичеокями выводами из втой схемы явилась разработка модели стабильной формы ГЭГ в отсутствии Т-оупреаооров-эффекторов и способа определения аллергенных свойств химических промышленных веществ и лекарственных препаратов.

Научная значимость работы заключается: в выявлении новых свойств Т-супрессоров фазы индукции ГЗТ, поэводшвдих их отнеоти не только к регуляторным клеткам, но и к система Т-эффекторов« клеточного иммунитета, обуславливавдих подавление пролиферации антигенпозитивных клеток, и в связи с этим создании концепции иммунологического надзора, опосредованного как "традиционными эффекторами", так и антигенсзязыващиш Т-супрессораш.

Практическая значимость работы заключается:

- з обосновании подходов к получению илмунотерапевтичесвих препаратов на основе линий Т-супрессоров пролиферации и их продуктов, икгибируицих рост лшфомы человека и других АГ+К;

- в теоретическом- обосновании и разработка методов выявления аллергенных свойств химических промышленных веществ и лекарственных препаратов. Указанные методы легли а основу методических рекомендаций по оценке аллергенных свойств фармакологических средств. (Издание официальное) Министерство здравоохранения СССР, Управление по внедрению новых лекарственных средств я медицинской техники, фармакологический комитет СССР. Москва, 1988 г.

В работе представлена совокупность данных и положений, кото-, рая может служить основой для нового научного направления в иммунологии : создание для практического использования антипролифера-тивных ишунотерапевтическюс препаратов, подавляющих рост клеток лейкоза человека, на основа продуктов линие Т-супрессоров пролиферации, полученных из периферической крови человека.

Основные положения, выносимые на защиту:

X. Регуляторные эффекты антигенсвязьшакщих Т-супрессоров сочетаются с функцией эффекторов системы меточного иммунитета, супресскрущих пролиферацию антигенпозитивных клеток. Антипроли-; феративные свойства продуктов специфических Т-супрессоров могут быть опосредованы и макрофагами.

2. Индукция ГЗГ антягенпоактивными клетками сопровождается формированием целого спектра отличающихся по функциональным свойствам и молекулярной организации продуктов антигенсвязывакщих Т-супрессоров.

3. В регуляции реакций ГЗГ Т-супре ссорами реализуется меха-

низм подавления клеточного иммунитета, наблюдаемый при толерантности, индуцированной массивной дозой антигена.

4. Разработан високоэконимичшй экспресс-метод определения аллергенных: свойств низкоколекуляряых химических промышленных веществ и лекарственных препаратов на мшпах.

Апробация рзботн. Основные положения работы доложены и обсуждены на Объединенном пленуме научного совета по иммунологии АМН СССР и проблемной комиссии "Общая к прикладная иммунология" (Тбилиси, 1984; Минск, 1987; Киев, I9S8), 1-й Белорусской иммунологической конференции (Витебск, IS32), Всесоюзном симпозиума 'Медиаторы пшенного ответа в эксперименте и клинике" (Горький, 1983), 2-м Всесоюзном симпозиуме по генетике соматических клеток в культуре (Звенигород, 1983), 16-м Европейском биохимическом конгрессе (Москва, 1984), Всесоюзной конференции "Современные методы иммунотерапии" (Ташкент, 1984), 5-м Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1985), Всесоюзной конференции по аллергологии (Ташкент, 1986), б-м Съезде аллергологов к кшунологов Казахстана и Средней Азии (Алма-Ата, 1986), 8-м Европейском иммунологическом конгрессе (Югославия, Загреб, 1987), Международном симпозиуме по аллергологии (Болгария, Варна, 1987), Всесоюзном совещании "Клеточные и мол&кулярнца механизмы канцерогенеза и антиканцерогенеза" (Ленинград, 1988), Заседании № 3 секции № 3 Ученого совета Института иммунологии Минздрава СССР, состоявшемся 22 февраля 1990 г.

Публикации. Основные результаты исследований, рассмотренных в диссертации, изложины в 25 публикациях: II журнальных статьях, 13 тезисах докладов и I методические рекомендациях.

Объем и структура диссеттгащц. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, проиллюстрировано таблицами и. рисунками. Состоит из введения, Зх -частей, заключения, выводов, списка литературы, включающего отечественных и зарубежных источников. Каждая глава содержит обзор литературы, описание материалов и методов, результатов собственных исследований и обсуждение.

Несто выполнения работы. Работа выполнена в Институте иммунологии Минздрава СССР.

СОДЕШАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

JImum клеток и условия культивирования. В работе испольаова-НЫ линии клеток человека - сем, Jurkat, OL-4, CESS, Н-9, К562 и шаш - мчелома ?3-X63-Ag8,653, тимома BW5I47, В-З-гибридома, с секретиругащая AT к антигену 20 M.-tubercuioeio /Черноусова Л.Н., 198В/.

Клетки культивировали в среде iipmi-1640 с добавками - 10% сыворотки плода коровы (СПК), 4 Ш глютамина, 10 Ш нерез, 5*10"5 М 2-меркаптэтанола (2-ME), при +Э7°С в атмосфере, содержащей S^ С02. При получении линии супрессоров пролиферации из периферической крови человека среда вместо СЖ оодеряила 1С% аутоло-гичной сыворотки.

Кивотннэ. Работа проведена на мышах лиши оба, с57ы/б, вя.в/с и кроликах порода Шиншилла.

Антигены и xin/дческие аллергены. Для иммунизации животных использовали синганные ядросодержащие клетки селезенки, модифицированные I Ш растворами 2Д.б-тршштрофенилсульфокислотн (ТШСК) (Серва, ФРГ) или азобензенарсонага (AHA) (п-амино-арсанпловой кислоты, Олаииэ, СССР) по стандартной методике / (Jreene at al., IS78; Bach et al., 1979/.

Для индувдии стабильной форш 1ST к химическим аллергенам также были использованы 2,4,6-тринитрофенилхлорид (ТНФХ), синтезированный в Институте иммунологии Ш СССР Н.В.Молодцовым, окса-золон (ОКС) (Сигма, США) и различные сг.гдинвния пиридазинонового ряда, которые были предоставлены С .Г .Барлоговой (Братиславою^ институт гигиены ЧСФР /Барлогова С.Г., 1975/.

Коньюгат TUijg-BCA был предоставлен Н.В.Молодцовым, данспл-хлорид^-БСА - О.П.Тереховым. Получение коньюгата АБА-БСА проводили по стандартной методике.

Ксеногешще эритроциты, модифицированные ТНФСК, получали по методу RittenbergH Pratt /1969/.

Антисыворотки и моноклоиальные антитела (АС и МкАТ). АнтисЫворотки против иммуноглобулииовых (ИГ) фракций сыворотки крови мыши и человека получали многократной- внутримыиёчной иммунизацией кроликов 3-5 мг ИГ.

Мышиная анти- Thy 1.2 сыворотка была получена многократной

шгутрибршишюй ишуниэацке'! шшэй акп тимоцитана шгаэИ СБА 1Ш1 сзн /Reif, AUen, 1264/,

Подучонна анти-ТШ-АТ у ,.шшей и анти ТШ идаотипичэекой сыворотки кролта проводили по ранее описанной методике /Чорноу-сов А.Д. и соавт., IS8S6/. Полученные антиидиотипичвскио антитела бшш способны не только отзываться с соотзетствуицши антителаш или ?-клетками лолфоузлоа шмунких животных, ко и при рцутривен-ном введении индуцировать Те, а при подкожном, в сочетании о цгас-лофосфзмидом (ЦФ) - эжекторы ГЗТ.

Аллоантисшзоротка, выявляющая I-C детерминанту, была предоставлена М. Б .Зайцевой /Зайцева !Л.Б., 19В7/. Кроличья AG, выявляющая vu -датермгшааты иммуноглобулинов мши, была прэдоставлгапа АЛ.Кульбергом Дуль борг А .Я, Г986/.

Источником моноклоналъиых антител против х-к>: (ю.глб),

(K24.I99), l-Ek (14.4), I-J4 (н-б) служили супорнатанты соответстзушцгос гибридом. Указанные глбридомы были предоставлены Р.Г.Ваошговьш. МкАТ против СВ4 и с»В антигенов были предоотав-ле;щ Б.Д.Бровдзом.

Сорбенты на основе сефарозы 4в получали пр методу oautre-liasoeo Д971/.

Индуишя То и тестирование суноессии реакций ГЗТ. Для индукции Тс на фоне формирования эффекторов ГЗТ шалей иммунизировала внутривенным введением I05 модифицированных ядросодержащих клеток селезенки.

Супрессорную активность отдельных клеточных популяций тестировали по способности lmrudapcjaTb реакцию ГЗТ у мьашей - сенсибилизированных по стандартной методике внутрикожным введением З-ю'' ТИФ-или АЕА-КС /Greene et oi., 1978/. Уровень сенсибилизации определяли о помощью кожных проб /caurufuji et ai., 1283/. Для этого мышам в подуиечку задней лапы вводили 40 ыкл 10 r.i.l раствора ТНФСК pH 7,2 или 25 мкг в 15 мкл раствора АЕА. т>Н 8,2. Реакглю учитывали через 24 часа с помощью инженерного микрометра МК-О-25. Разница в толщине лап характеризовала интенсивность реакции. Контролем в этих опытах слуянли ингактные жвотные, которым ставили внутрихокные пробы с ТЛйСК или АЕА (отрицательный контроль) и сенсибилизированные животные (положительны?!, контроль). При тестировании оу про с сорной активности з базу индукции ГЗТ клетки переносили перед сенсибилизацией реципиентов, а в ¡разу экспрессии ГЗГ -перед постановкой кояиых проб.

Индукцию контактной чувствительности к ТНФХ и тестирование уровня сенсибилизации проводили по методу Atale et al., 1980/.

Для индукции отабильной формы 1ST к низкомолекулярным химическим веществам мышей иммунизировали в основание хвоста 60 мкл эмульсии 20 Ш раствора исследуемого соединения в полном адъюван-Т9 Фройнда (ПАФ) (1:1) Дершусов А.Д., 1987/. Сенсибилизированных животных тестировали в различные ороки 10 Ш растворами соответствующих препаратов внутрикокно или специально подобранными концентрациями накохшо.

Для доказательства Т-клеточной природы клеток, участвующих в развитии кожных реакций у сенсибижзированнга животных, проводили локальный перенос гиперчувствктельности кнтактным сингенным реципиентам /Чераоусов АД., Юрин Б.Л., 1981/.

Приготовление суспензий клеток селезенки и лимфоузлов проводили общепринятыми способами. Для повышения жизнеспособности и удаления эритроцитов использовали 0,17 М раствор iffl^ci. Обогащение Т-клеток проводили.на пластиковых чашках, покрытых антителами против иммуноглобулинов мши. / wysocki, Sato, 1978/. Количество ig+ клеток в обогащенной популяции Т-клеток не превышало 3%.

Антигенсвязывагацие, Id (ТНФ)-позитивные или антиидиотипичес-кие Т-клетки получали из обогащенной популяции Т-клегок на пластиковых чашках, покрытых антигеном (ТНФ-БСА), антиидиотипическими антителами кролика или анти-ТНФ-АТ мыши /Черноусов А.Д. с соавт.,, 19866/. В некоторых опытах удаление Т-клеток проводили с помощью енти-Thy х.2 ас и специально подобранного комплемента кролика.

Для характеристики клеток в работе использовали иммунофяюо-ресцентный анализ на стеклах /Черзонский A.B. с соавт., 1984/ или проточную цитомотрпю /bedtetter et al., 1979/.

Методы, использованные при получении антигенсвязывавдих Т- . гибридом и характеристики их продуктов.

Гибридизация клеток и селекция гибридом. Гибридизацию проводили с помощью П0ЛИЭТИЛ9ЯГЛШГОЛЯ 1500 по методу Дэвидсона / Davidson, 1976/. После гибридизации клетки ресуспендировали в селективной среде Литтлфилда Aittiefieid, 1966/ и засовали в лунки 96-луночной пластины по I04 в лунку. Для работы отбирали гибридомы, способные оОразовывать розетки с ЭБ, модифицированными ТН5-ЕСА /Эллиот, 1981/. ЭБ коньюгировали с Ш-БСА с помощью CrCl3-6ll20 /Goding, 1976/'.

Культивнповпиро гибридом in vivo и in vitro. Все отобранные гкбридомц пооло размножения е 4-6 лупках 24-луночной пластины по следа на толь но культивировали в пластиковых илл стеклянных флаконах большого объема в полной ростовой среда, Пассажи проводили 3 pasa в неделю о исходной плотность» 3*1 Ф кл/мл в течешм двух недель.

Дважды перед началом размножения и через 2 недели культуры обогащали сорбцией на пдаогиковах чашках, покрытых ТИФ-БОА, Этот щием был отработан ранее для сохранения функциональных свойств гибридом То /OkuUa et al., 1981/.

Для размножения in vivo мышам (akiixBALB/q )fx внутрпбршин-яо вводили 1,5-2,0-107 клеток гибридом, предварительно обогащенных на пластиковых чашках, покрытых антигеном. Забор асцитной жидкости и размноженных клеток проводили через 10 дней, 8а 7-14 дней до введения клеток мышам вводили по 0,5 ад пристана.

Посла определения функциональных свойств гибридома <5ши клонирована по 0,6 клетки на лунку,

Замораживание проводил» на всех этапах раота гибридом в СПК о 10/1 диматилсульфокоида.

Получение оупернатаптов гибридом (ОН), асцитной жидкости (АЛ) и экстрактов гибридом (ЭГ). Дда получения препаратов продуктов гибридом куль тура льную жидкость после каждого пассажа центрифугировали при 15000g в течение 20 минут, фильтровали через мембраны tíillipor 0,45 мкм и хранили до использования при -70°С.

ÁI посла получения в среду 199 о конечным содержанием гапа-piffla 25 ед/мл замораживали, от. айва ли, удаляли центрифугированием пленку фибрина, разводили в 2,5 раза той же средой, стерилизовали и хранили до использования при -?0°С.

ЭГ получали по стандартной методике с помощью замораэашания до -б0°0 и оттаивания гибридных клеток.

Получение антигенсвязывзиотс продуктов (АГсП). СН гибридош В6 разводом а 2 pasa в 3íP рН 7,4 и сорбировали на ТНФ-БСЛ-Се-фарозе 4В. Экстракты, предназначенные для выделения АГсП, перед сорбцией разводили в 2 раза, АН - в 6 раз так, что конечное разведение экстрактов и АЖ составило 1:10 и 1:30 соответственно, После сорбции на ТНФ-БСА сорбент промывали 0,5 М NaOi в 35? я злшровали препараты 0,175 1.1 глпцин-HCl рН 3,15. Материал срезу же нейтрализовали трясом, дмалгеовали и концентрировали г»а Оеи-triíio-25 против среды 199 по о';ноеэк:гп к исходному сб:.с!.7 в

-1210 раз и хранили при -70°0.

Тест подавления паалиДепашт АТ+К. Клетки различных клеточных линий культивировали в течение 48 часов при +20°С 8 талной ростовой среда, после ч&го модифицировала 0,005 Ш раствором ТКФСК. Модифицированные, отштыв клетки ресуопендарот;»и а среда ШРЫ1-1640 с добавками и инкубировали 24 часа при +37°С в Шапочной пластине по 2-4 »104 клеток в присутствии Ш или АГсП гибридам. За 4 часа до окончат» культивирования в лунки вносили 0,2 ыКя З-И-тшидина. При определения влияния продуктов гибридов на синтез ЕНК юга белка в лунки вносили по I иКи З-Н-уридина шш 14-0-еминокислот.

Аналогичным образом были отобраны клоны гябридош п.гв4.

Исследование влияния продуктов гибридом на тааидш ГИГ. Для сценки влшшин продуктов гибридом на реакция ГВГ СН, ЭГ шш АД, а такха АГсП вводили мышам в фазу индукции или фазу экспрессия ШГ.

Тес? ингибипяи антигензависимой тхшйарашм. В таете инги-биции антигензависимой пролиферации исследовали оупресссрную активность СН, АЕ или АГсП, Для этого 0,2 мл суспензии клэток лимфоузлов (5'10^/мл; мышай, ищгшшированиых подкояшо в основание хвоста 61) мкл 10 Ш эмульсии ТНФСК в ПАФ /Алкан С., 1961/, культивировали при +37°С в С02-инкубаторв, в круглодошщх еб-члуночнкх планнетах в течение 12 часов в среде Н№1-Хб40 о 5$ лошадиной - сыворотки, 10 Ш нвр£3 5'Ю"6 М 24Ш, 2 Ш глютамина, в присутствии ТНФ-БСА (10 мкг/мл), Затем клетки отшаали и инкубировали в -присутствии СН (1:10) или АГсП 2 часа. После отмывки клетки культивировали в среда о добавками. На 5-е оутки оценивали включение З-Н-тишднна. В качестве контроля иош»«ь'зовяли те ае суспензии клеток, стимулированные туберкулином нпо в концентрации ЗОлет/ми.

Тест опосредованной макгобагами ингибшии тюлиФероОии опухолевых клеток. В. тесте опосредованной макрофагами ингкбщии про': лиферацик опухолевых клеток были использованы макрофаги иитактти ' мышей. Цитостатическую активность исследовали по методу Уитиага "'в* «а. Д985/. После адгезии прилипающие клетки инкубировали I час с различными разведениями супернатантов гибридом, отмывали тёплбй средой с добавками, культивировали 24 часа с клетками лимфой человека н-9 и сингенной шеломы х.бз» и определяли включение З-Н-ташдика.

Определение ^одического аденозянмонойосйдта (цАМФ) и пше-тагландлна Е-й (П1Е-2) проводили с помощью набора АмегвНша по

, стацдартцой иэтодака.

Отозро»э;гта молекулярного веса аФФяннополучоняис АГсП проводила а двух вариантах: о помадью Днок-ДСН-ПААГ-фзреза ных АГсП /ЧарД Т.» 1661/ в 7,5$ геле в трубочках и в пластинах 12% геля по Ьветяи Давший!, 1970/. Иммунологический перенос на нктроцсллшюзную мембрану проводили на прибора о угояьннш элок-тродаый типа Hovolalot /lowbin at al., 1979/.

Иммуиохшичоекий анализ АГсП проводили о помовдю непрямого радкошмунологичэского метода /Чард Т., 1981/.

Получение культур» клвток-супрессороа иа периферической кроем чяловегл. пнгабируицих пролиферацию клеток лкмфсмы Н-9. Для получения культур« клэток-оупрэесоров I ши иононуклоароп перкфа-рэтоской крош! человека, выделенных на фикол-гигаке (Фармация), 1суяьтишцювади в 24-дуиочщас планшетах о 3 мгл клеток лейкоза Человека 119, облученных 180 Гр, п I мл орздн, содержащей 10?! аналогичной сиг.оротгш п 100 ад инторяепглна-2 (11Л-3). Препарат ГЛ-2 бил любезно прздоота&чен О.Ц.Тереховш. Начиная со 2-Й недели культивирования, в лунки помимо стимуляторов добавляли 5 »10^ об-лучыашг аутологичкых прпдкпавдга: клеток.

[Голучянид супертатаптод культур . Оупарпатантн пнактивирокш! 45 tnmy? при +5S°C, равводили d 30000 раз и концентрировали до исходного объект. на Oentriflo-25. Посла этого супернатант истощал! клзтка!.!И ликфош сен (10' кдетон на I ил) и хранили при -70°0. Для определения спэцифг-шоотл действия супернатанта ого истощали в аналогичных условиях п илаткаш лм.^эмы Н-9.

Определений »игостатичоmiotf активности супярнягавга. Для определения цитостатичаской активности супернатант добавляли к глоткам различных линий, предварительно культивировавшихся в течение 2-Х суток ПрИ +Й0°С. К оэткам ЛИНИЙ Н-9, СЕМ И Е562 (со 4•ТО'*, 2'Ю1 и 2 «10^ соответственно) добашши различные разведо-нкя супЬрнатйнта либо на I чао, либо на весь период культигирош-икл, т.о. на 24 часа. За 4 часа до окончания культивирования к клеткам добавляли 0,6 мКи З-Я-тимидша. Далее оценивали включение шткп.

Определение молекулярного веса антягэнсвязыазщвто суггооссор-ного Лчкгс pq. 2 (лл лиоФильн'о шсуконного СН штили i ¿bl. 'Леченлтгй СИ разводила в среде ята-1640 с 10% сыворотки крупного рогатого скота до 10® инд/мин. Далее клеток суспендировали а 0.2 мл меченного сулэрнатанта я шпеубирошля I час при +4°С. После этого

клегки многократно отшвали раствором Хенкса рН 7,2 и добавляла 50 мкл лизирукщего буфера дая образцов, содержащего I Ш cjatuui-ыатклоул1.фанилфлзоорида, кипятили 3 минуты, центрифугировали и проводили Диск-ДСН-ПААГ-фореа в трубочках в 7,5$ гелэ, как это было описано вше. После проведения фора за учитывали на Гоша-счетчике радиоактивность отрезков геля толщшой I мм.

V

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ вйЬекторных свойств Т-сУпреосоооп о помопаю гибгш.ом. Работами пооледшм лет было установлено, что Т-гибридош, полученные при слиянии различных популяций функционально активных Т-КЛ8Т0К и шшшых тимом, сохраняют функцию'иммунных Т-клэток, несут ев дифференцировочные антигены и синтезируют соответствующе факторы /см. Т oell hybridomao carrent topics tn Microbiology ana Imaunology, 1982, Springfild, Earlin/. ЭТО ПОЗВОЛИЛО ИСПОЛЬ-вовать Т-гибридомн не только как источник ыоноклональных продуктов, но и дая изучения функциональных свойотв и фенотипической характеристики различных субпопуляций Т-клэток, организации их рецепторов и механиэш яктихацкп /Фуко Б.Б. с ссавг., 1903; Ssdq et al., 1981; Dori et el., IS82; Yiebb et al,, IS83; Kuchroo et al., I98B,I9£0{ Zeng et al., 1989; OolUns ct al,, 1990/.

Данный подход был реализован к для характеристики эффектор-цых свойств антигенсвязывающих Т-клеток, формирование которых происходит у мышей при развитии реакций ГЗГ, индуцированных однократным внутривенным введением модифицированных гаптеком iuiotok. При этом о эффекторных свойствах антигмнсвязыващих гибридом суда-ли по функциональным свойствам СН, ЗГ и аффиннополученных продуктов из ОН и АЗС мшюй-носигелой гибридом.

Для гибридизации использовал! обогащенную популяции антиген-свяэывапцих Т-клвток, формирование которых происходит яри индукции ГЗТ тринитрофенилировашшш клетками селезенки. Популяция су-прессорных клеток в этой суспензии по сравнению с неразделонныш клетками селезенка была обогащена 1мк минимум в двадцать раз.

Партнером дня гибридизации служили клетки специально полученного субклона BiY5I47.3.I3.h, не обладающего иеспецифической суп-рессорной активностью ни в отноиении реакций ГЗГ, ни г отношения смешанной культуры лимфоцитов. Характеристика клеток, использованных дш гибридизации, представлена в табл. I.

-15- Таблица I

Характеристика клеток, использованных для гибридизации

Маркирующий признак BW5I47. Анги-ТНФ-Т

I Ьу Thy 1.2*" 0D4 (lyl) CD8 (Lv2) $PQK с Ш-БСА-ЭБ 95$ 0 0 Ü 0-3% 0 95?£* 92^ (71%)т н/т -

% супрессии ГЗГ экстрактом б -10® клеток клетками (5-кЯ) % оупрессии СКЛ клетками (5 -106) 0 -1055 0-10? о-го^ 88% 8 Ъ% н/т

Примечания, • - данные иммунофлюоресцокции подучены с

помощью проточной цитометрш', 535 - в скобках

приведен процент соответствующих популяций

Т-клеток ¡штактпых животных;

ххх

- выявление

АГ проведено с помощью МкАТ.

Были отобраны 6 антигенсвязывавдих гибридом, воа они эко-прессировалл рецепторы к ТНФ, плотность этих рецепторов была такова, что клетки могли образовывать розетки с эритроцитами барана, модифицированными тршнлрофеншшрованным бычьим сывороточным альбумином.

Специфическая супрессия АГ+К продуктами ангигеновязываших гибридом. Для шявления свойств эффекторов систэш клеточного иммунитета оупернатанты пяти полученных гибрвдом были тестированы на способность супрессировать пролиферацию модифицированных Ж клеток лейкоза человека, используемых как АГ+К, а после получения положительного результата гибридома °4 была клонирована по этому признаку. В табл. 2 праведоны суммарные данные этих опытое.

Как видно из табл. 2, супернатанг субклопа исходной тимомы в.< в отношении модифицированных клеток антипролкферативной активностью не обладал, а суп^рнатанты гибридом С7, Вб, В8 и яд суп-ре с сиро ваш: спонтанную пролиферацию модифицированных клеток, оцениваемую по включению З-Н-тшгцхина, но но влияли на про;л:фо рацию немодифицирошнных клеток. Супрессорний эффект проявлялся как в отношении меток лимфоидаого, так и нелюфзкдного ряда, в частности, клеток зритромиелобластоза человека К-562.

Таблица 2

Супрессия пролиферации модифицированных ТШСК (а) ж немодифшщроваанкг (б) клеток лейкоза человека суперпатантаии Т-гибрвдом {%)

Супернатант "jurkat- сем а-9 , сь-4 ceSs . к562 ,

гибридом а б аб а б , a tí a tí a б~

BvV5I47 (BW) 9Д 0,3 3,2 0,7 7.2 1,6 зд 0,2 8Д 1.4 4,8 ол

C3.IC7 (С7> 41.7 4Д 38,3 2Д 51,0 3,9 - - - - 39,4 -0.S

СЭ.2В6 (В6) 37 J -ЗД 39,4 40,4 2,5 38,0 0,17 44,2 -0,24 -0,8

W..2B8 (В8) 38,0 -0,2- 35,2 0.9 39,7 -0,4 39,4 2,2 43,9 -3,5 33,2 -2Д

FI.2G4 (G4) 50,0 О.П 40,0 2,0 45,5 -0,3 46 »3 0,29 51,2 -4,4 43,7 G.S

CT.2B4 (D4) 7,6 0,17 зд од 3.5 -0,6 - _ — — _ —

Супарнатант одной ив получошшх антигенсачашадици* гибридом Di оупрассорной активностью на обладал и в дальнейшей работе использован не был.

Поскольку вез регуляторныа аффекты продуктов гибридом, как правило, обусловлены антигзневдзнващим, идиотиппоэитивным материалом / Webb et al,, IS83¡ Dorf, Benaeerraf, 1Э84/, на следующем этапе было исследовано влияние удаления антигенснязызащего, идаотиппозитивного щтэриала, содержащегося в супернатантах гибридом , на способность оупреосиротать пролиферацию модифицированных клеток.

Данные, получешще в этих экспериментах /рис.1/, подтвердили, что аффект супернатантов специфичен, поокольку они не влияли на пролиферации клеток 3-В-гибридом, модифицированных кВк, и оффэгл ингибиции пролиферация антигенпозитивных клеток обусловлен антл-генсвязывакщим, идиотшшоэитивдыы материалом, поскольку он отг/.э- " кялся сорбцией СН на соотватстэукщшс сорбентах. Сорбция супернатантов па сорбентах о АЕА-ВСА или антителах кролика против иммуноглобулинов мши (контроли) но влияла на оигипролиферативную активность.

Однако идиотипичоскиб детерминанты гибридом G7, 34.к и е8 лазы были ассоциированы с id анти-ТКФ-АТ i-шой baib/o, a ia ТСФ гибридомц Еб был ассоциирован с идаотипом швей С57БГ./6.

Все супернатанты супрессорных гибридом подавляли синтез ДНК, оцениваемый по включению З-Н-тшдиНа (рио, 2), При этом происходило накопление РНК и общего белка, оцениваемое по включении ЭН-уридпна и 14С-ашшокислот. Указанные эффекты были обусловлены id+ штериалом, поскольку они отменялись сорбцией на сорбента с анти-идиотипическими антителами (на рисунка изображены столбиками со сплошной штриховкой).

Эффект подавления синтеза ДНК на фоне накопления РНК и белка был воспроизведен На различных клетках лейкоза человека.

Как известно, синтез ДНК происходит в s-фазо клеточного цикла, а синтез ШК и белка в oía и oiv> фазах клеточного цикла соответственно. Накопление меченных ШК и белка, по-видимому, объясняется тем, что факторы супресоорных гибридом препятствуют переходу клеток из oi-фазы ¡меточного цикла в а-фвзу.

Антипролииюративные эффекты самых разнообразных неспецифических супрессорных факторов обусловлены активацией аденилатцик-лазы и накоплением циклического аденозшипнофоофята (ца-mí)

Рис. I. Влияние удаления аитигенсвязыващего /Б/, идлсиш-позитшного /В/ материала из супернатантов гибридсм на включение ЗН-тимлдпна, клетками В-В-гябридош, кодифицированными ТКФСК или АБА /А/. По горизонтали - включение ЗН-гимидина в имл/мин /хЮ3/. Слева - условия опята. А - незаштрихованные столбики - величина включения при инкубации клеток с неистощенными супернатантами; косой штриховкоЛ обозначено вклвчение ЗК-тимидина при обработке супернатантами клеток, модифицированных АБА.

Рпс. 2 , Влияние» супернатантов гибридом на • включение КС-амлнокяслот (Л), ЗН-уридшга (Б) п ЗН-тишодпэ (В) клэтктлп Е-3 гибридома шши, модафмдарошшцш 11ЙСК. По вертикали - шишча-ние мотки а кш/мин (хЮ3)! сплошной итркхоший показан уровень включения mstwi под влиянием супергигантов, истощенных на сорбенте с кроличьими а нти (ТНЗ) идиотипиче скяни антителами.

/Keiler, öalvonico, 1984/, препятствувдего переходу клеток из СИ фави клеточного цикла в з-фазу /кадтог, I9Q8; Link et al., 1990/.

Как следует из наших данных, супэрнатанти супрассорных гибридом увеличивают а модифицирошшпа клет!сах В-В гпбридомн концентрацию ц/Л№.

Таким образом, результаты,.приведенные в этом раздела, свидетельствует о том, что антнгенсвяэыващио Т-супрессоры, подобно антиидиотипичосклм Т-сулйессорам, способны оупроссироватъ пролиферацию антигенпозитивных клеток как лш,$оилного, так и неликвидного происхождения.

Супрессия реакций ГЗТ продуктам; гибридом. Как следует иа табл. I, антигенсвязыпа'лцив Т-клзтки, нспользоааптге для гибрида-

Ошвд существенно обогещавд Х-а&дашш, супрв оскруквдаи ютеаашгостй реакций ТШ, Акшзга С'&укуория свойств получвгшх гцбрадом иокавап> что суорэоот реазаиш ТШ обусловлана форшро-езнжш раздаашк ионудяздай Т-суцрассоров, иродаавшдас свои активность в ракш фаш ГШ' (рно, 3),

Получешшэ раоультати покагздн, что продукты гкбредоио? к С4оупрассйровалн у ошгегашх реаашнтов фаэу ивдукдая ШТ.-Зисграаг гийрздома Б8 прошил cioa активность и в фазу пндук-ИШ» В и фаоу вксирооояя IOÍ. Экстракт гибрпдомы Bó не супроыш-Тгавад 1ш фаза вддуодш, ил $азц окспр-зссия ГиТ.

fue« 3. Влияние введения окотрактов онтигвневяаыааиздх гсб-ридом t рааякчныа фазы ГЗГ на интенсивность кожных реакций у мыкай, сенсибилизированных подкожным введением З'Ю7 ТИФ-КС, За по-льжителышй контроль принят уровень реакций животных, которым ШДйли аналогичную дозу вкстракта в«. По горизонтали - величи-йа отека о мм; справа, цифрами обозначен процент пупроосии ГЗГ.

Оупроосорккй рффгкг йнстраптоз гкбрздои бил спецпфгпсн я проявлялся только у гашоппк, сапспбиляапрзвашвя подкоянш гшз-дзгши Ш-КО, но нэ АБА-КО.

Рагулятсрпзя активность продуктов гпбрадои, гак св.каа, и у ракаа оплсашмс супреосорних факторов / 'льъ.о* а!,, 1983} Во г г эъ а1., 1084{ |ГепйПвак ей,, 1603/, била спдсаиа с аятягсп-сачецващсм, тедотгагаозакнашм продзгкгси, нэ акопроссирупцйи дд-?-0р!.2шата цельно}! молекул» ^•упогмбуднна, а супрзосорнэд АГсЛ Т-ГИбрЗДОУ цоглк бить полутон?! ШЕЙНОЙ со спсцпфотэского сорбента - ТН9-Е0А~Ссфарози.

Оущвааота .»тпр.^ратш «даяот.деэдймяч»^

уилотп?)ч . Хорога иавостпо, что рогулягорпиэ еф$з£йи различиях попующпй Т-супрзссороа а ЕнаготзяьксИ стошгз определяется йяшротЗзрмдапйя огю&сша / Поой о* «а,, 1633} Ьопоз et а1., 1925? ГШ.1аг, «ТопЗДпя, 1903/. Как погаегш наем ояити, оуггернатацти габрядси п пх с&гггпю пояучешшз АГсП тп'ло способна специфически оупросенроглод елкгиггнмшеямуа про-

клюоп гсткфоузлаз (зиэй, сонспбяпепраЕаягак ТШЯК в ПАЯ (р:гз. 4). .

СпосоЗ-

когтп» Ш- ?пкторов стци'&гсэакх Т-супр^зсврйй, рзгударугздкх ро-агзсп! ГО?, сггкяуййегпосак» о шврофаяш и сй&^лнроЕа^ь в ка нзстеяпЗзячзсцуп оупроссорпую амигнссть, йзиасрка давно /ка^ва

е1., 1970'. 5а«зя 1«, 1030/, Суйрэсспп рсйКЗЯЯ ГОТ в йЗШгсм сгуяо адзатяз с акгагсцгеЯ а какрафагсх сйигосз пгй-э и яругсг П9И!ЗЩ!2я«Г2Сейх суироссоргшх Зак5ор5в, Од.'»!» оегавзж>вь йэиз» г.зс?;;:яи сбгаяиз? <та изкро?аги, пктпЕирапзш&э суйрэсеоришя ёп::~ тога:.'.4.!» рогух'.ругдагн гйт, а'атг.прч^'фзрзтпгпой еийикюс-

тыэ.

1(лк показали наан опит», супоркптеигц гпбрх№ 04 и вз способны активнрэаа?ь макрофаги, Следствием этой актисацип теплел цигостагпчосг.:!П в ошзязйии сапгоптк п ксаногешнх ля.5-

фо!1, когорыЯ проявлялся на фоно 5:раткопрз(<оннсзго увеличения в макрофагах концентрации ЙГ2-Я. Аймтйция макрофагой б¡ш обусловлена Ы+- материалом, и его удаление !>а сорбенте с антиШШвдро-типическйми антителами отме:лло й усиление сеттеза ПГЕ-2 и цито-статпчоскуп активность. Уровшй. Иройферацкй клеток лейкоза человека и мши не изменялся при обработке макрофагов супернатантаьа гибридами £6 й тймомы ъ\и

Piîo, Влияние аф$шшополучвшдах адишшсвязывапднх продуктов Т-гпбрздом на антпгонзавискмую пролиферацию клоток лшд$оузлоа ведртшшс шавй при огкмуляции ТКФ-БСА (Л) в туберкулином (Б К Но оси ординат - включение ЗН-тнмидша в имд/шп (xICf). По осп aûc-1Дйсо - рагводонш' AMI- ( - 07 ; -04» -В8> -вб ). Косой итриховкой обозначен уроеззш пролк^ератишого ответа без добавления АГеП;. горизонтальной штриховкой - уровень сломанной пролиферации.

1Ъотюкии1<юс«пя характеристика АГоН гибридом и их тгаенткФг!-гшщя.. Сопоставление функциональных свойств, фенотипа гибридом, молекулярной оргаипзапип их аффишополученнше антигенешзызавднх продуктов- позволило идентифицировать полученные гибридош следую-l'^u.î образом (табл. 3) »

Таблица 3'

Ивдунвхшягеаскоя характеристика сф^ацкиюлучешик пит кгено ел зава щих продуктов Т-гпбридом

Продукт габрздома • Мол. шсса 1ÙX iai VU: la

С7 70 + - +

G4 72 + _ + _

' В8 45 и 27 + - + I-0d I-Jb'd'

36 72 - + + I-Cd

D4 S0.5G ,25 - + + I-Cd I-Ad

Антиг-енспявшавдий продукт GB4+ гпбридомы С7 супреосировал фазу яндугацш ТОГ, он представлял собой одну цопв, экспресоировал рогуллтораий вдиотип и детерминанту, выявляемую антитолаш к вариабельному упаотку тяжалсй цепи'ИГ. а такжо детерминанты, тетвлл»-гл-з анти- и анти-х-Е1* антителами. Этот продукт был идентифицирован ¡сак продукт гибридомы Тс-фазы индукции ГЗТ.

Аитигенсачиялкчий продукт ¿тонированной CD4+, CD8+ гкбридо-lsí g4s молекулярной массой 72 кД также экспресоировал иднотши-■адскую» н вэриотипкчоскую детерминанты, но нз экспрессировал датор-кзяантп» виявлиемые антн-х-А11, x-Áa, i-ca, i-3d л i-j4 антитола-:.iî. АГсП отой гибридомы супреосировал у подопытных аизотных только фазу индукции ГЗТ и данный продукт был идентифицирован как продукт гибридош Те фазы индукции ГЗТ. В специальных экспериментах öt'Jto показано, что. данный прод/кт подавлял пролиферацию клеток лейкоза- человека- "JurkaV я эритромиелобластоза IC-5G2,. мода-фгаироганякх ТНФСК, но на влиял на пролиферацию немодифицированных клеток,

Продукт СЕВ+ гибридомы ва представлял собой' гетеродаср> с жлэкулярлой массой цепей 45 и 27 кД, экспроссировал рагулнторяпй-идясти» И' вариотшшческую детормянанту и детерминанты, определяемо aiaií-i-od и i-jd антителами. AT cil данной гибридомы супрэс-спровал фазу газдукци» и фазу экспрессии ГЗТ н по совокупности ЕТ1Г.С признаков был идентифицирован' как продует гибридомы То эффек-тсроз-..

Продукт свЭ+ гибридомы вб экспрассирозал те яэ детерминанты, что и продукт ïc-эффекторовно в отличие от лэго, представлял собой одну цепь молекулярной массой 72 кД. В отличие от продуктов вшпе описанных гибридом, АГсП гибридош в б не оказывал на реакции ГЗТ никакого влияния и не стимулировал в макрофагах синте-

ПГЕ-2.. По своим свойствам продукт данной гибридомы с продуктами- ранее описанных Тс идентифицирован не был.

Приведенная выше характеристика АГсП гибридош вб полностью* согласовывалась с характеристикой факторов Тс-эффзкторов или ТсЗ-,. регулирующих poaicurai ГЗТ /Dorf et al., 1984; Fairohild, Koorriead, IS87; Kuchroo et al.,. 1989/.

По функциональным свойствам - способности супрессировать фазу индукции ГЗТ, продукты антигенсвязывавдих CD4+ и CD4+, св8* гибридом С7 и G4.K были отнесены к продуктам гибридом Т-супрес-соров фазы индукции ГЗТ а цепи идиот-ип - антЕидяотшшческой регу-

дяшш Г8Г у толерантных яавотшк / ¿«пагЧо&и et а!., 16СЗ|, 8$ео1 еЪ а1,, 1987/.

Ранее свойства оупреосорннх факторов антигенсвдвшшнк Тс, индукторов ш'лшдиотипичооких Тс2,бцли цсследошкы в оисташ :з> мунного ответа на синтетические юлкпептиды сае и о» у неотвэ-чащкх малой / ууаъъ ог ах,, 1683/. Укааашша (факторы, как ц продукты гибридом С7 и 04 акопрвосировалн идкгшишчоскиа ц са-риотипичэсгс'.о датерьщнаитч и дояоршваитц, опред&яяедао ашгц-Ха 1а, но 1гзс молекулярная маоса составляла 24 кДа. Молекулярная глс-са Тсф гибридом С7 и С4( рогулнрущих фаву йндуквдш ГЕГ, гаг. и многих супрессорны:: факторов Гс-з^фгкторов / ггеопо а еХ., 1&ЕЗ; Какыаага et цХ., 1990/, СОСТОШИЛа 70 1;Да.

'.'еобходкмо отмстить, что, пи мношш накоторик псслодокгео-. лэй, функцию супреоооров фавьг индукщгн ГОТ могут штшвш! ток навиваемые индукторц Т-супрессораэ, описанию в система рзгуда-шш антктелообрааошшш на ЭБ /огаапе е! а1,, 1983/, Однако, ш наш взгляд, данная клеточная: копуляция выполняет дашь функции хелперов Т-Т взаимодействия, фактор которого являемся дн^^кзрошгл-ровочнмм сигналом для 0В4+, опа+д-л-, да-1« транодукторщк клеток, нродударущзх фактор, акеивирукадШ прзкаоствэмгаки 03)2+, 1-.т-, оа-Х-Тс-оффэкюров. Саиор нослодгас: обра&ует супрзссоргай комплекс с продукта.! шао;сьа которого ягдгагся сои

холлорц Т-В ьзакмодойотьал /агвеае et а1., 1033/,

В системе регуляции ГШ' доле обстоит, по-видимому, несколько штче, хотя вцдамозк. трахка.иошодюй иепа передаче свдша к глоткам Тс-зффекторам сохраняется / 2огГ о* а!., 1984/. Однако такая аналогия чисто внешняя, Пр§эде всего потому, что в данной системе Тсф не выступает как дифференцированный фактор дня прзд-ыеотвоиников Тс-зффекторов или глотки, перадапцей сила л, а квля-отся распознаваемой идиотитшитивной структурой, В этом случае Тсф1 не действует непосредственно на акцепторные клотик, а активирует их после презентации на фэкторпрезенткруидкх клетках / йога» Бепасегга?, 1984/. Во-вторых, для активация свз+ анткидаоткпи-ч&ских Тс наличие Тсф! не является обязательным, Такие кльтки могут быть активированы идиотиппозитийным материалом, лродсташюп-ным на мембране., в том числе и АТ, коньюгировашшма с сингешшми клетками/«в1пЬегвег et аХ., 1080» АЬЪав ег »1., 1982/. То, что описанная система регуляции антителообраэрваиия отличается от мдаотЕп-антщяотитгческой системы регуляции ГЗТ, подтверждает и

~Я5

щвлячж в продуктах св8+ позитивны« То-эффвктсров этих систем. Й системе иэдуктор - трансдуктор - эффектор - это одноцепочочный -Фактор / агвеп в« а,, 1683/, В оиотеыа »даадтшмнииидаоти-гшчаской регуляции ГЭГ фактор То-оффэкторои представляет собой рлрцзпьаасй !-<!+ продукт / ?а1гоЫ1<1 а* их., 1088/,

Таким образом, продукты гибридом Т-супрвосоров фазы ивдук-цян ГЗТ - 07 к 04» супрэосир/щиэ трангиторнуо форму ГЗТ на ЛГ+К, отличается от продуктов То1 в систэмз регуляции антитоло-обрааоЕанпя т зал; и от у кязкоотвочакщих шнай и от продут индукторов То а система индуктор - эффектор, описанных при регуляции аитктелообразогашш «а 8Б»

По споим свойствам факторы этих гибридом были схожи о факторен То, подавляодях хелгарную функции ов4+ Т-клаток при ответа !ш вритроцяты барана /?гевао в* а!., 1982/. Указанный фактор представлял собой одну полипэптидную цепь, шел антиген-ояяваоващяй участок (к основному антигенному гликопротеину ЭБ -гликбфоряиу), ого молекулярная масса соотавляла приблизительно 70 «Да, и его еупрессорннй эффект, по-видш/ому, был связан о ал-типролифоративним действием в отношения СЮ4+ Т-клаток*

В цолом приведенные выше данные, полученные при использовали! гибрвдошой технологии, позволили провести анализ эффекторных оёойотп популяций Т-супрессороз, формировзишэ которых происходит при развитии реакций клеточного иммунитета на антигенпозитяпныо мотка, и вкяшпъ у антигансвязшаицих То фушдаю супрессии пролиферация АГ+К. Суммарные данные, характеризующие функциональную октивпость То, формирование которых происходит при развития реакций ГЗТ, предстаатэны в табл. 4,

Теоретические и практические аспекты, связанные с проблемой Т-супрессии.

Специфические Т-супрессош - регуляторный компонент клеточного иммунного ответа. Анализ свойств антигоксвязыващих Т-гибри-дом показал, что формирование различных популяций антигенсвязыва-вдих Т-супрессоров происходит не только при развитии различных форм высокозонной и низкозонной толерантности, но и при развитии ГЗТ. Поокольку формирование отдельных популяций Т-супреосоров пря развитии иммунного ответа было зарегистрировано в различных экспериментальных системах / ОогсИоп, 1984; Зегсагв, 1989/, сам по

Таблица 4

Эффекторные фунвдии антягенсвязыгащш: Т-супрессороз

Регуляторнне эффекты

Гкбридош , ^ Подавление Аг-

Вдияние га ГЗГ аавпеиша поо-лпферацки

Подавление пролиферации АГ+К

МФ-опосредованноС

ПРЯМОЙ

С7 Супрессия фазы

(Тс!) индукции

04 Супрессия фазы

(Тс1) индукции

Е8 Супрессия фгзн

(ТсЗ) экспрессии

¡о да

36

(Не идентифицирована)

(Не идекгифп-цировапа)

Не влияет

Стимулирует

Не влияет

Ш тестировали Ез тестировав Ев вдпкот

оебе этот факт привлекает к себе внимание только с двух точек зрения. Во-первнх, потому, что в работе экспериментально доказано формирование популяции То фазы индукция ГЗТ при развитии реакций Г31 (ранее формирование этой популяция Т-супрзссоров было описано только у толерантных ка уровне эффекторов ГЗТ животных / Sundy, 1581; Dorf, Benaoerraf, 1984/. И, во-вторых, В СВЯЗИ 0 вопросом о возможности реализации механизма цдпотип-антицдиоти- . пичеокой регуляции, наблюдаемого у толерантных ¡¡азотных при раэ-витии реакций ГЗГ. Этот вопрос имеет, на наш взгляд, принципиальное значение0,0 у°то%рантнш: аизогпых иммунные реакции организма .могут регулировать различные системы Т-супрэссороз /(Jill et al., 1978; Green at al., IS83; Dorf, Bens.cerraf., 1984; Kapp et al., 1585/, а такке В-кдэтки и ях продукты /Petrov et al., 1937/.

На основании данных функциональных тостов, показавших, что в ранниэ сроки поело внутривегаюй иммунизации происходит формирование антигенспязываидих идаотшгпололительньк Тс-эффекторов, про-являщих свою активность у яивотних, сеноибилизироЕанннх АГ в сочетании с ЦФ, а в поздние сроки антлядиотипических То, полученных при анализе эффекторных свойств Т-сулрессоров с помощью гибридом и их продуктов, была разработана схема регуляции ГЗТ Т-супрассорами (рис. 5).

0

Id+ CD8+

Тгзт

Id^D^Dö''

Id+ CD4+

алтз-rd

Рис. 5. Особенности формирования и механизм действия Т-сун-рессоров при развитии реакций ГЗГ.

Конкретно, при иммунном ответе на АГ+К, что моделируется внутривенным введением модифицированных гаптэком сингенпых клеток селезенки, формирование Т-эффекторов ГЗТ происходит на 3-4 сутки. При атом превышение уровня нормальных антител к гаптену на наблюдается, Параллельно о формированием эффекторов ГЗГ в селезенке происходит формирование антигексвязываюдш:, вдиотшшоложительшх Т-супресооров. Их предшественники чувствительны к действию низких доз ЦФ. При тестировании подопытных аивотных в это время кожные реакщш положительны. 3 более поздние сроки, на 12 сутки, в селезенке подопытных: животных происходит формирование антиидиотлпи-чеокж Т-супреосоров, в это время положительные кожные реакции на определяются и подопытные животные в течение длительного времени не способны к повторной сенсибилизации. Супроосорннй эффект OD4+ и 0В4+, cd8j- Т-супрессоров i ализуется а фазу индукции ГЗГ и подобные" То не влияют на интенсивность ГЗГ при их переносе или при введении их продуктов в фаву экспрессии ГШ'. Эти клетки являются Тс-фазц шздукцки ГЗГ или их функциональными эквивалентами, a их супрессорный эффект, так же как и в других моделях, где они обнаружены, опосредован индукцией антицдиотппичеоюих Т-супрессоров.

Антигенсвязывакщиа, идпотиппозитивные, оаб+ супроосоры регулируют интенсивность фазы экспрессии ГЗТ, но для проявления их активности необходе/,а кооперация с антиидиотипичесиими Т-оупрес-сораш, формярованко которых происходит в более поздние сроки (при индукции ГЗГ внутривенным введением ЛГ+К - на 12 сутки). Эти клотки были идентифицированы как Тс-эффекторы.

Супрессорный аффект идиотпппозитианых и цнтиидиотшшчэскшс Тс антигензавпскм, но гэ специфичен. При переносе сингешшм реципиентам, сенсибилизированным АЕЛ, Тс, активированные тринитрофени-лоМ; не супрессировали развитие ка.лнк реакций, но только до тех пор, пока для постановки кожных прони использовали смесь клеток селезенки, модифщированных АБА и ТНБО, т.е. антигенами, использованными для сенсибилизации и для индукции Т-оупрессоров. В этом случае супрессоры, активированные ТИФ, оупрессировали реакции ГЗТ, 1шдуцировашше ASA. В работе не был исследован детально механизм этого этапа в действии Тс, поэтому на схеме этот этап изображен просто прямоугольником. Но по литературным данным можно представить, что на этом этапе активируется, во-первых, каскад неспецифических Тс /Исч ítala et al., 1986 ¡ Malkovsky et al., 1986/ И, во-вторых, ижрофаги, синтезируюцие неспецифические супрессорные

факторы / Kojima at. al., 1979;. Taueeig, I960/,

Таким образом, различные популяции Т-супреоооров, в том числе и Тс-фазы индукции ГЗТ или Tel, являются естественным компонентом клеточного иммунного ответа и его длительность определяется сроками формирования То и к. оочетанным действием. При этом реализуется механизм регуляции, описанный ранее при толерантности на уровне Эффекторов ГЕСТ /Germain, Benacerraf, 1981 ; Dorf, Benaaerraf, 1984/.

Модель стабильной Фогш ГЗТ к химическим аллергенам, индуцированная на Фоне дефицита Т-супшссопоэ. к способ выявления ал- • лбсгенных свойств низкомолекудяших химических промышленных веществ и лекарственных препаратов. Из вывода о том, что Тс являются компонентом клеточного иммунного ответа, их формирование происходит параллельно с формированием эффекторов ГЗТ и они определяют интенсивность и длительность иммунного ответа, закономерно очень важное практическое следствие, а именно: создание условий, при которых не происходит формирование одной из популяций То, проявляющих свою активность в фазу окопреосии ГЗТ, будет приводить к индукции интенсивной и длительной сенсибилизации. Это следствие поолужило основой для разработки модели стабильной форм ГЗТ к химическому аллергену - тркнитрофенилсульфокислоте, и метода тестирования ¡аллергенной активнооти химических промышленных веществ и лекарстг'-лных соединений.

Хорошо известно, что интенсивность и длительность реакций ГЭГ к различным антигенам у мышей зависит от способа сенсибилизации. В частности, различают так называемые стабильные и транзи-торные формы ГЭГ / МасКсиозз et. al., 1974; Askenase et al., 1977/. Стабильная форма ГЗТ длится более 3-х недель; транзиторная - не более 10-14 дней. По предложению. Ptak et al./1980/, подобные особенности реакций ГЗТ- объясняются различием I-А-белков антиген-презентирунцих клеток, активирующих те или иные субпопуляции Т-клеток.

При стабильной форме ГЗТ I-A+ антигенпрезентиругацие клетки активируют Т-эффекторы ГЗТ; при транзиторноП форме в число анти-генпрезентируицих клеток входит и 1-е/с, и i-j-позитивные клетки, что приводит к активации Тс-эффектороь, ограничиващих длительность реакций ГЗТ. Впоследствии дашюе предположение полностью. подтвердилось / Ptak et al. ,. 1980;-.\sano, Taàa, 1989; Kunhroo et.al., 1989/. Поэтому при создании модели стабильной формы ГЗТ

-SO—

к химическому аллергену необходимо было использовать метод сенсибилизации, при котором не происходит формирования То-эффекто-ров, например, при введении антигена в Т1АФ, увеличивающего соотношение 1-Е/С - i-a-позитивных клеток в пользу последних / Ptak et al., 1980/, или на фоне предварительного введения ЦФ, элиминирующего предшественники антигенсвязывавдих Т-супрессоров /sun-¿у et. al., 1981/. Однако, элиминация предшественников Т-аупрес-соров с иомоцыо цитостатиков хотя и приводит к усилению реакций ГЗГ, индуцированных супраоптимальныш дозами, не оправдана, поскольку при введении ЦФ происходят и элиминация одной из оубпопу-ляций предшественников Т-эффекторов Асрноусов А.Д. с соавт., 1979/ и доза антигена, необходимая для индукция ГЗГ, долшщ быть существенно увеличена, что не целесообразно для веществ с высокой токсичностью. Поэтому, при разработке модели стабильной формы ГЗГ был апробирован метод индукции ГЗГ химическим аллергеном ТНФСК ь ПАФ. Полученные результаты (рис. .6) показали, что при таком способе сенсибилизации у мызей развиваются кожные реакции, намного лрезышйкщие реакции у шлей, сенсибилизированных подкожным введением 3 •ТСУ' ТШ-КС изи такой ка дозой ТНФ-КС, введенной в сочетают с ЦФ,. т.е. оптимальными для индукции ГШ' способами.

Специально проведенные исследования показали, что развитие чрезвычайно интенсивной и длительной сенсибилизации, наблюдаемой при введении хпшчосюа аллергенов в ПАФ, связано как минимум с деумя причинами: во-первых, с формированием различных популяций эффекторов ГЗГ, в том числе и тех, которые обуславливают выраженный ранний компонент косной реалиии / Van bdversn et al., 1984, 1989/, и, во-вторых, нарушением формирования и в селезенке, и в регионарных дк4оузлах Т-супрессоров, регулирующих интенсивность реакций ГЗТ. При этом, как показали последующ« опыты, уровень сенсибилизации был настолько высок, что-она, во-первых, могла быть обнаружена не только у линейных, но и у беспородных животных, и, во-вторых, в н'еоптишльннх условиях, например, при введении меньших на порядок количеств вещества дат сенсибилизации или дач тестирования, по сравнению с оптимальными. Последнее оо'стоя-тельство крайне- ваяно при определении аллергенных свойств шюхо растворимых ил: токсичных сседанегай. Кроме того, при данном способе иммунизация удается зыязить и ракшй компонент сенсибилизации , набладаемый через 2 часа поело постанови коишх проб. Всё это вместе взятое позволило для выявления аллергенных свойств

Рио. 6. Интенсивность твди реакций при тестировании в различные сроки пооло сенсибилизации ТНФСЯ о ГШ (чернив кружки) , ТНЗ-КС (белив крукки) м ТШ-КО в сочетании с ЦЭ (Селко треугольники). По оси абсцисс - срок после сенсибилизация; по оси ординат - величина отека у животных в ш. Чертой ограничена величина отека у яипотлых, которым вводили омульсию раствора Хонпса в Ш. Заштрихованная часть - величина отека у интактных амвотнцк.

низкомолекуЯнрнщ: химических соединений предлоиить метод подкожной сенсибилизации в ПАФ. Даниий метод апробирован при выявления аллергенных свойств нечаста, растворимых в вода, маслах и органических растворителях (ДЛСО).

Пшшшшан .создания твдкотетпевтических препаратов нд оо-шй днтигеисвязцвадпвд продуктов линии суптаосорон пполкйзпптт. Тот факт, что Т-супрессоры играот чрезвычайно важную роль в регуляции иммунного ответа, поолужило поводом хек к углубленному изучению свойств Тс, Так и к попыткам направленного изменения функциональной активности Тс с целью подавления иммунного отвота при сенсибилизация / иылэьа, 1989/ или трансплантации различных органов / ЬаггвНу а1,, 1983/, либо его усиления за счет элиминации Тс при противоопухолевом иммунитете / ЭргеаПоо, 1585/ юга

-запри развитии инспекционного пронесся /Наь», Кыивдш, 16811 Оо^о в* е!., 1991/.

Однако в практическом использовании знаний о спвцифячесюас То имеется еще один аспект, и именно - получение па периферической крови человека линий Тс пролиферации, продуцирующие факторн, обладающие специфической антипролиферативной активностью, способ-1ше оупреооировать пролиферацию клеток лиыфолейкоза человека, О возмояшостн втого направления свидетельствуют как данные литературы о способности идиотвп и изотипопецифичтк То ингибировать , протаферрцию различных лимфой, так и данные о антипролифаратиигш: аффектах специфггчвскго: антигепсадзывавдих Тс в отношении ЯЧ-К, приведенные а этой работе.

!Три получении супреосоров пролиферации в каюотве мявшей были взяты клетки яойкоза чековэка й-9. Подучеаниэ данные покаса-ли, что совместное культивирование КПК о обдучзнкыми клетками Н-6 в присутствии ИЛ-2 приводило к появлении в супернатанто трехнедельных культур активности, супреосируюцэй кар: клетка Н-9, так к К.562. Кроме того, в оупернатаите выявлялась активность, сткмуг лирувдая пролиферации клеток сем,

Хорозо известно, что при стимуляции клеток периферической крови человека возмсаша выделение самых разнообразных неспецифических супреооорнцх факторов, облададак цитостатачеоким действием /Еауогг. е-4 а1., 1988/. Поэтому, чтобы исключить дейстша ка-спецкфичэскик фжгороь, супернатаити шактшшровала при +66°С 45 минут, что устраняло действие интерферона, батем, дня элзсеса-цпи кивкомолзкулярных »¿специфических супрессорпих факторов, су-парнатанты разводщш в 30000 раз, концентрировали на Свг^г1По с-£5 и истощали на клетках лимфош человека оси.

Такая обработка оуперяатанта устраняла неспецифическую суп-рессорнуа активность, а специфическая супреосорная активность могла быть удалена только сорбцией клетками Н-9,

Таким обрезом, приведенные выше данные показали, что специфический компонент в супроссорной активнооти супернатанта обусловлен высокомолекулярным термостабильншл, антигеновяаываыцим материалом .

Дальнейшие исследования показали, что супрессорний эффект высокомолекулярной фракция был обусловлен фактором гликопротеино-вой природы, поскольку отменялся сорбцией на конконавалин-А-Сефа-розе 4В. Так же, как и Тсф шапй, супреосорный фактор, продуциру-

емый «ле®кал!И периферической крови человека, связывался на сорбенте о белком-А, а его относительная подвижность ( Rf) составляла 0,48, что соответствовало материалу о молекулярной шсосй 60 иДа.

Таким образом, наш получена культура КПК, продуцирующая термоотабильный, гликопротеиновой природы антигеновязывавдий фактор, молекулярной шссой 60 «Да, специфически супрэссирувщий пролиферации клеток лейкоза человека. Эти клетки получили условное название супрессоров пролиферации, Иными словами, была показана принципиальная возможность получения нммунотерапевтичозкюс, анти-пролифэративньос препаратов на основе продуктов специфических Тс, подавлявдих пролиферацию клеток лейкоза человека или других анти-гэнпозитивяшс клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Лнпдгенсшзыващие Т-судоессош 5а зц индукции ГЗТ

как эсЬйектош системы клеточного иммунитета .

Исследование эффекторных свойств сиотеш Тс клеточного т-г/унитета, в частности реакций ГЗТ, показало, что антигенемзытю-гойа То фазы индукции ГЗТ способ)« супросснровать пролиферативный ответ клеток лимфоузлов имьунных животных, активировать мэнрофа-га, в результате чего они приобретают антипролифератинные свойства, и что особенно важно, способность супресспровать пролиферации лейкозных клеток лпмфоидного и нолимфоядного происхождения, несущих детерминанты, к которым былч подучена То. То есть, рэгу-ляторная функция То фазы индукции ГЗГ проявляется параллельно о функцией эффекторов системы клеточного иммунитета, направленной на подавление пролиферации АГ+К.

Как известно, регуляториый эффект Tel в система вдиотш-аитнвдиотипической регуляции ГЗГ, подобно регулаторному эффекту фактора Тгзг, обуславливающему ранний кошонент ГЗТ /Vsn boveraa et ai., 1989), реализуется опосредованно. Е еду чао регуляция ГЗТ ТсФ1, за счет формирования антнидаотишгазехях Тс шш Тс2 /Dorf, Benaoerraf, 1984/ фактор которых (актй-1л ) совместно о АГ стимулирует CD8+ ia+ Тс-эффекторы (ТсЗ) /Kuchroo «t ai., 1939/. Эти клетки, в конечном итоге, являются последним -звоном в специфической регуляция ГЗГ.

На рио.7 представлен механизм, объяснявший сочетание рогулн-

торншс свойств и функции эффекторов системы клеточного шмуците-та у онгигенсшзивакщюс Т-оупреосоров фазы индукции ГЭТ (Toi).

Если Tel и, следовательно, синтезируемый ими ТоФ1, экопрес-сируют частный идиотиц (на рно.7 обозначен как idl), фактор анта- и То не будет способен активировать ТоЗ, несущие регуля-торный идаогил -idX.B в том случае проявится только опоообнооть такого типа суиресооров подавлять пролиферацию АГ+К (на рио, обозначено как im у idx, иеогнутая стрелка). При совпадении идиотина Toi с вдкатипом ТсЗ фактор антиидаотипкческих Тс будет спо-, собйн активировать ТсЗ ( idl = i'ix, прямая отрелка), в результате чего Tel будут способны подавлять фазу индукции Г8Т, то есть проявлять регулярные свойства и оупреосировагь пролиферацию АГ+К.,.

Рис .7.. Взаимосвязь рехуляторной функции и функции эффекторов система клеточного иммунитета у То фазы индукции Г31 (Тс!).

Способность супрессировать пролиферацию аитигекггазитишшх клеток как .галоидного, так и нелимфоидного происхождения продуктом гибрвдош Т-супрэссоров фазц индукции ГЗГ привлекает к донной клеточной популяции особое внимание. Данная популяция антиген-связишидих клеток способна активироваться антигенпозитивпой клеткой. При этом для активации достаточно только наличке детерминанты, распознаваемой как антигенной на мембране, а не в контексте с продуктами генов главного комплекса гистосозместямости

/ 1чеггев еъ а1., 1980/. С другой стороны, для секреции апткпро-лиферативных факторов этой клеточной популяцией достаточен лань повторный контакт с антигеном / Окийа ей аХ., 1281/. Кроме того, как следует иэ вышеприведенных данных, аптапролпферативные эффекты данной популяции аптигенсвяэывавдих 1-клеток могут быть опосредованы макрофагами.

Таким образом, ваглешэй функцией антигенсвязывавдих, идио-типпозитивных Т-супрессоров фазы индукции ГЗТ в цепи идиотип-антиидиогипической регуляции является прямое пли опосредованное макрофагами подавлений пролиферации антигенпозптивных хлэток. О этих позиций, при иммунном ответе на антигенпозитивные клетки данная меточная популяция мокет рассматриваться как популяция эффекторов оистемы |мвточнрго.вдлунитета, супрэссируыцих про.га-ферацию АГ+К. Поск1мьку~Арданяой клеточной популяцией происходит без его процессинга и презентации / Окчйа et а1., 1381; л>гГ, вепасет^, 1984/, данный тип клеток момэт быть "первой линяеи обороны" в сиотеме клеточного иммунитета, направленного на элиминацию актигенпозитивкых клеток.

Представления о том, что ангигенсвяэыаащпе Тс фазы индукции ГЗТ являются эффекторами системы клеточного иммунитета, обла-даквдими ангипролифэративными свойствами (оупрессоры пролиферации АГс+К - СП) и выполняющими надзорную функцию, иллюстрирует рис.8.

Супрессия прслифервции Индукция цитотонсичесних

механизмов

(сО —~ —г ш)

Рис.8. Схема иммунного ответа на АГ+К, опосредованная как супрессорами пролиферации, так и "классическими эффекторами" системы клеточного иммунитета.

-зй-

Согласно км Т супрессоры фазы индукции ГЗТ в системе идиэтип-аптшвдютшпкгаской регуляции способны ра ело знавать АГ+К наряду с актлгенраспознаэдюж клетками ( АГРК), активирующими систему клеточного иммунитета за счет продукции растворимого ыакро-фагермкруюцего фактора (рМАФ). Как ужа указывалось выше, СП обуславливает механизм, направленный на предотвращение размножения анткгенпозитивнюс клеток, определяемый как прямим антипролифера-тивным эффектом антигенсвяацваюдего продукта этих клеток, так и опосредованный макрофагами (обозначен стрелками с кое стон). Парал-.лвльчо с чтим развивается клаосичеокий клеточный шинный ответ на АГ+К /7апйеЪг1е1 еЛ а!., 1989/.

выводы

1.•Регулаторные эффекты Т-супрэосороь фазы индукции ГЗТ, распознающих антиген вне контекста с продуктами генов главного комплекса гистосовмеотиысеги, оочетаются о функцией эффекторов системы клеточного иммунитета, направленной на подавление пролиферации ентигеяпозитивных меток лшфоидаого и недимфоидного происхоадендя. .

2. Данная популяция Т-кладок является компонентом клеточного иммунного ответа, поскольку ее формирование происходит на только при толерантности, но и, как было показано в данной работе, при развития реакций ГЗТ.

3. Аналаз свойств гибридом антигеноь'язывавдих Т-супрессоров и их продуктов позволил обнаружить новый вш Т-супресеороь -ьффекторов, супресокруюцих пролифеБяцию оиткгвипозитивных клеток, и которые, в отличие от Тс-з$фекторов в цепи идиотип- онтиидио-типичеокой регуляции, секретпровали продукты, представляйте собой одну цепь и не активирующие в макрофагах синтез простаглан-даша Е2. Аишпролиферативние аффекты этой популяции Тс, а такке Тс фазы_индукции ГЗТ и Тс-эффекторов в цепи идиотип-антиидиоти-пвчеокой регуляции сопровождались накоплзнием. в клетках цА®.

4. Супрессия пролиферации антигенпозитпвншс меток антиген-связывавдими сулрзссораш, регулирувдими интенсивность ГЗТ, может быть опосредована макрофагами. Взаимодействие Тс факторов с ыекрофагаш: активирует в последних процессы, сопровождающиеся усилением синтеза лростаглакдана Е2.

-375. Общим свойством монохпоналышх продуктов различных суб- ' популяций антигеновяйывающих Т-супрессоров является супрессия антигензавиаишй пролиферации.

6. Факторы специфических супрессоров пролиферации, полученных из периферической крови человека, могут служить основой для получения иммуноторапевтических препаратов, подавлящих пролиферацию лимфом человека и других антигеннозитивных клеток,

7. Регудгадия транзиторнсй формы ГЗТ, индуцированной внутривенным введением антягекпозитивных клеток, обусловлена активацией цепи едиотип-йнтиидаоттгачоскгх т-супрессоров, а интенсивность ■ и длительность реакций ГЗТ зависит от сроков <ррмлрованш различных популяций Т-супрессороз, их сочетаиного действия и не зависит от В-клеточного компоненте.

8. Индукция реакций ГЗТ в условиях, приводящих к дефициту Т-супрессоров, способствует разлитию сенсибилизации чрезвычайной интенсивности и длительности. Это позволхяо разработать модель стабильной формы ГЗТ к химическим аллергенам.

9. На основании полученных данных разраоотап элективный й экономичный экспресс-метод выявления аллергенной активности химических промышленных веществ и лекарственных соединений.

СШСОК ПШИКАЩЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Черноусое А.Д., Молодцов Н.В., Медуницын Н.В. Индукция Т-зависиыоЙ гиперчувствительности к гаптену внутривенным введением сингешшх .клеток, модифицированных гайтаном // Иммунология.-1982.-;,« 5. С.20-22.

2. Черноусов Л.Д., Молодцов Н.В., Медушщын Н.В. Параллельное образование эффекторов и Т-супрессоров при гиперчузствитель-ности замедленного Типа к контактому аллергену // Вопр. пмчуколо-гии. Тез. докл. 1-й Белорусской иммунологической конф. Витебск, 1982.-С.57-58.

3. Черноусов А.Д., Молодцов Н.В., Медуницы« Н.В. Индукция Т-супрессоров гиперчувстзктельностл замедленного типа при формировании Т-эффекторов // Бюл. экспер. биол. и нед.-19£}3.-М 12.-С.62-64.

4. Черноусов А.Д., Молодцов Н.В., Червонский А.В., Медуни-цын Н.В. Роль Т-супрессоров и их растворимых факторов.в рогуля-

-Sfc-

цпи реакций птерчувстьительности замедленного типа, индуцированных внутривенным введением оптимальном для сенсибилизации дозы антигена // Медиаторы именного ответа в эксперименте и клинике. Тез докл. Зсэо. скмя,, Горький, 1983.-С.175-76.

5. Червонскяй A.B., Костров C.B., Черяоуеов А.Л., Броядз Б.Д. Катальная гетерогенность по признаку неспецифичеокой супрессии

в системе Н-2 мнпиной тимош В',/5147 и Т-Т-гибридом, полученных на ее основе // Тех. докл. 2-го Всес. им. по генетике соматических клеток в культуре. Звенигород, 3283.-С.43.

6. Черноусов А.Д., Червонский A.B.. Медуницын Н.В. Получение и характеристика Т-антагенс&чэывавдпх гибридом // Тез. докл. 2-го Безе. ошш. по генетике сомтатичеокпх клеток в культуре. Звенигород, 1883.-G.45.

7. Черноусов А.Д., Медункцын К.В. Т-супрессорный компонэнт в регуляции иммунного ответа на "модифицированное свое" // Современные метода иммунотерапии. Тез докл. Всес. конф.. Ташкент, 1984.-С .267.

8. Черноуооа А.Д., Молодцов Н.В., Ирин. Б.Л., Медуницын Н.В. Характеристика антигэновязиващих факторов Т-оупреооорных гибридом // Тез. докл. 16-й конф. ФЕБО, ISB4, разд.26, J5 25.-С.372.

9. Меадгимцын Н.В., Черноусов А.Д. Гиперчувствительность замедленного типа на модифицированное свое и ее регуляция // Тез. докл. 5-го сячп. по аллергологии и клинич. иммунологии социалист, стран, Варна, TS85.-C.4.

10. Черноусов А.Д., Медуницын Н.В. Кмлунохимическая характеристика и биологические свойства антигенсвязывавдих продуктов Т-гибридоы //Тез. симпоэ. докл. 5-го Зсес. биохимического съез-дь.-U.: Наука, 1985.-T.I.-С.180-81.

11. Медуницын Н.В., Черноусов А.Д., Крылов O.P., Подоплелов И. Иммунологическая регуляция реакции гиперчугствительиости замедленного типа // Тез. Всес. конф. по аллергологии, Ташкент, IS86. -0.17,

12. Мелунпцык Н.В., Черноусов А.Д., Крылов O.P., Подоплелов И. Иммунорегудяция гиперчувстяительности замедленного типа // 1ез. докл. 5-го съезда аллергологов ь ию,7нологое Казахстана и Сред. Азш, Алма-Ата, 1906.-С. I.

ТЗ. Черноусов А.Д., Червонский A.B., Молодцов К.В., Тарханова H.A., Черноусова Л.Н., Сабурова Л.:,;., Медуницын П.З. Регуляция ГЗТ. Анализ регулятбрной и перфекториой функции Т-супрессо-

-Сэров // Тез. Всео, симп. о междунар. участием "Иммунодефицита и аллергия".М.» 1986. (А) .-С.104-105.

14. Черноуоов А.Д., Молодцов И.В., Задорожный B.C., Лиоз-нер АД., Медуницын Н.З. Формирование идиотипподожительных Т-супреоооров, подавляющих фазу экспрессии ГЗТ // Иммунология.-1986.-й 6.-0.27-29.

15. Черноуоов А.Д., Червонский А.З., Познахирев Л.Р., Медуницын Н.В., Брондз Б.Д. Характеристика двух типов антигеновязы-вапцих Т-супреосоров, образующихся в ходе ямглу иного ответа, о помощью Т-Т-гибридом и их экстрактов // Бюл. экспер. б;юл. и мед.-19864.- С.450-52.

16. Черноусов А.Д. Метод определения аллергенной активности низкомолекулярних химических веществ на мышах // Гиг. труда и проф. забол.-1907.-гё 6.-0,45-47.

17. Черноусов А.Д., Терехов О .П., Сурнакова Я.Е., Медуницы« Н.В. Подавление АГ-зазисимой пролиферации факторами Т-гибри-дом // Иммуяологая.-198?,-й 4.-С.64-66.

18. Черноусов А.Д. Антигеновязываювде Т-оупре'ссоры как зф-фэкторн клеточного иммунитета (гипотеза) // Иммунология. -1587. -К 3.-С.78.

19. Черноусов А.Д., Медунхцын Н.В. Модель стабильной формы ГЗТ к хшфгческим аллергенам // Бюл. экспер. биол. и мед.-1987.-11 6.-С. 122-24.

20. Медуницын Н.Б., Черноусов А.Д. Т-супрессоры-индукторы как эффекторы системы клеточного иммунитета // Тез. докл. 8-й Европ. копф. по иммунологии, Югославия. Загреб, 1987.-С.90..

21. Черноусов А.Д., Зайцева М.Б., Медушадан Н.В. Линия Т-супрессоров периферической крови человека как возможный источник специфических антипролиферативных, иммуястераповтических препаратов // Клеточные к молекулярные механизмы канцерогенеза' и антиканцерогенеза. Тез. докл. Всео. совещания, Ленинград, 1988.-С.164.

22. Черноусов А.Д., Медуницын Н.З. Супрессия пролиферации модифицированных гаптеном клеток лейкоза человека гаптеноспеци-фическим фактором Т-супрессоров // Иммунология.-1989.3.- • С.94-95.

23. Черноусов А.Д., Медуницын Н.В. Механизм подавления пролиферации модифицированных гаптеном клетск лейкоза человека и мыши гаптенспецифическими факторам Т-супрессоров // Бюл.экспер.

<5иол. и мед.-1909..-0.67-69.

24. Черноуоов Л,Д., Корсукова Ы.Ц., Пинегнн Б.В., Медуни-цын Н.В. Подавление пролиферации клеток лим$ош макрофагами, ак-тиьировяиными факторами опецифичеоких Т-оупреоооров // Иммунология.-1969.-й 4.-С.83-85,

25. Методические рекоыещшки по оценке аллергенных овойста фармакологических средотв. (Издание официальное).-Министерство Здравоохранения СССР.-Москва, 1980.

Зап. М 423 поцп. к печати 13,05.61 г., тир. 100 эка. Ротапринт НИИ ГТиПЗ АМН СССР