Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Динамика восстановления кроветворения и гематопоэтический химеризм у больных гемобластозами после аллогенной трансплантации костного мозга

РГб од - 9 ИЮЛ «97

На правах рукописи

Демидова Ирина Анатольевна

Динамика восстановления кроветворения и гематопоэтический химеризм у больных гемобластозами после аллогенной трансплантации костного мозга

14.00.29 - Гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1997

Работа выполнена в Гематологическом научном центре РАМН

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор В.Г. Савченко

Официальные оппоненты: доктор медицинских наух, профессор Е.Б. Самочатова кандидат биологических наук А.Б. Судариков

Ведущее учреждение: Центр передовых медецинских технологий, г. Санкт-Петербург

Защита состоится "__"_1997г. в час.

на заседании диссертационного Совета Д 001.45.01 в Гематологическом научном центре РАМН (Москва, 125167, Новозыковский проезд, д.4а)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РАМН

Автореферат разослан "_"_1997г.

Ученый секретарь диссертацинного Совета кандидат биологических наук

В.Д.Реук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность В течение последних десятилетий трансплантация костного мозга (ТКМ) является одним из эффективных методов лечения разнообразной патологии системы крови и ряда наследственных заболеваний. Высокодозная хишю- или химиорадиотерапия, направленная на полное уничтожение опухоли, и последующая трансплантация костномозговых клеток преимущественно используется в терапии таких заболеваний системы крови, как острые лейкозы (ОЛ), хронический миелолейкоз (ХМЛ), лимфосаркомы.

Аплогенная ТКМ включает в себя химиорадиоподгтовку, уничтожающую как опухолевые клетки, так и собственное кроветворение больного. Далее пациенту трансплантируется костный мозг от совместимого донора-сибса или неродственного донора с целью восстановления кроветворения за счет нормальных донорских гемопоэтнческих клеток. По данным различных групп исследователей пятилетняя безрецидивная выживаемость после аллогенной ТКМ колеблется от 45-75% для больных ОЛ в первой ремиссии и ХМЛ в I хронической фазе, до 7-20% среди пациентов с рецидивами ОЛ или властным кризом хронического миелолейкоза (Савченко В.Г. и соавт).

Успех аллогенной ТКМ ограничивают многочисленные посттрансплантационные осложнения, в том числе, возникающие на фоне сложных клеточных взаимодействий между костным мозгом донора и организмом реципиента. К ним относятся отторжение трансплантата, реакция "трансплантат против хозяина" (острая вторичная болезнь), и возникновение посттрансплантационного рецидива. Каждое из перечисленных осложнений может привести больного к гибели.

Изучение динамики приживления костного мозга и связи ее с перечисленными осложнениями в течение посттрансплантационного периода играет важнейшую роль для правильной оценки состояния больного и проведения дальнейших лечебных мероприятий.

В настоящее время установлено существование нескольких типов приживления костного мозга: 1) полное приживление донорского костного мозга (полный донорский химеризм); 2) взаимное сосуществование гемопоэтических клеток донора и реципиента (смешанный химеризм); 3) отторжение трансплантата и возможное восстановление костного мозга реципиента (МсСап и соавт).

Определение типа кроветворения у больного после ТКМ имеет несомненно важное значение для изучения механизмов приживления и отторжения костного мозга, таких феноменов, как развитие постгрансплантациониой толерантности, реакции "трансплантат против хозяина" (РТПХ) и "трансплантат против лейкоза" (ТПЛ) (Truitt S., Knowlton D.T., Schouten НС.). В некоторых случаях исследование типа кроветворения позволяет предсказать надвигающийся рецидив заболевания, а также определить его происхождение.

В настоящее время дня лечения постгрансплантационных рецидивов широко используется адоптивная иммунотерапия. Сущность этого метода заключается в переливании реципиенту иммунокомпетентных клеток донора, зачастую с одновременным введением определенных цитокинов (интерлейкина-2, интерферона) (Klingemann H.G.). Основными задачами иммунотерапии является потенциирование реакции "трансплантат против лейкоза" с целью эрадикации опухолевого клона и обеспечения нормального функционирования трансплантата.

Существует множество методов, позволяющих отличать друг от друга клетки костного мозга донора и реципиента в процессе трансплантации. К ним относятся цитогенетические методы, определение различий антигенной структуры эритроцитов, исследование аллотипов иммуноглобулинов и т. д. (Forman S.G.). Среди них стоит выделить молекулярно-биологичесхие методы, отличающиеся высокой чувствительностью и простотой выполнения. В основе их лежит определение индивидуальных отличий в структурах ДНК. Это возможно в результате существования полиморфных (гипервариабельных) участков, являющихся маркерами каждого человека за счет своей разной длины. Самыми распространенными методами,

позволяющими их выделять, в последнее время стали: 1) энзиматическая рестрикция ДНК в полиморфных участках (сайтах) и 2) амплификация таких гипервариабельных участков с помощью полимеразной цепной реакции. Эти методы считаются наиболее удобными для изучения приживления донорского костного мозга после аллогенной трансплантации, так как не требуют большого количества анализируемого материала и обладают высокой чуствителыюстью, позволяя определять от 1 до 0,1% ДНК при использовании дополнительных модификаций.

Цель настоящей работы: определение типа гемопоэза у больных в различные сроки после аллогенной трансплантации костного мозга и взаимосвязи установившегося кроветворения с возникающими после нее осложнениями, такими как реакция "трансплантат против хозяина" и постгрансплантационный рецидив.

Был поставлен ряд задач

1) Определить индивидуальный маркер среди гипервариабельных участков ДНК для гемопоэтических клеток каждого больного, подвергнутого аллогенной ТКМ, и каждого донора.

2) Установить тип гемопоэза у больных гемобластозами в различные сроки после аллогенной ТКМ.

3) Определить зависимость установившегося типа кроветворения от режима кондиционирования, количества перелитых миелокариоцитов донорского костного мозга и стадии основного заболевания до ТКМ.

4) Изучить влияние РТПХ на тип гемопоэза после ТКМ.

5) Установить взаимосвязь между типом кроветворения после ТКМ и развитием посттрансплантационных рецидивов.

6) Изучить изменения типа гемопоэза, происходящие в процессе адоптивной иммунотерапии, проводимой по поводу рецидивов заболевания после ТКМ.

Научная новизна

В данной работе проведено изучение типа восстановления гемопоэза у больных в ранние сроки после аллогенной трансплантации костного

мозга с использованием метода амплификации полиморфных участков (сайтов) ДНК с помощью полимеразной цепной реакции. Установлена зависимость приживления трансплантата от объема опухолевой массы и фазы заболевания до ТКМ.

Показана корреляция между полным приживлением донорского костного мозга и развитием у больных хронической вторичной болезни после ТКМ. Доказано, что длительное существование смешанного типа гемопоэза ассоциируется с высоким риском возникновения ранних посттрансплантационных рецидивов.

Показано влияние адоптивной иммунотерапии на течение посттрансплантационных рецидивов и состояние кроветворения больного и определена связь между эффективностью данного вида лечения и развитием у больных хронической формы РТПХ. Практическая ценность работы

Проведенное с помощью метода установления индивидуальных полиморфных сайтов ДНК для донора и реципиента исследование позволяет в ранние сроки определять состояние кроветворения у больных после аллогенной трансплантации костного мозга и выявлять остаточный клон хозяйских гемопоэтических клеток. Высокая чувствительность (определение около 1% ДНК в смеси), независимость от трансфузий, относительная простота и быстрота исполнения позволяют широко использовать этот метод в клинике. Метод используется в работе отделения химиотерапии гемобластозов и ТКМ в течение трех лет для определения гемопоэтического химеризма у больных после аллогенной трансплантации костного мозга.

Изучение типа гемопоэтического химеризма позволило предполагать развитие у части больных таких осложнений, как рецидив основного заболевания в случаях длительного (более 3-х месяцев) существования смешанного типа кроветворения и отторжение трансплантата, а также изучать течение реакций "трансплантат против хозяина" и "трансплантат против лейкоза" и их влияние на приживление.

Исследование смены типов гемопоэза во время проведения иммунотерапии позволяет в ранние сроки судить об эффективности данного вида лечения и необходимом™ его продолжения, а также о возможности развития рецидива основного заболевания и в ряде случаев позволило определить природу возникшего после иммунотерапии рецидива.

Внедрение в практику

Метод определения установившегося типа гемопоэза с помощью полимеразной цепной реакции для амплификации полиморфных участков ДНК в течение 3 лет постоянно используется в работе отделения химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга ГНЦ РАМН. Публикации

По теме диссертации опубликовано 3 работы. Апробация диссертации

Основные положения диссертации доложены на Международной школе гематологов во Львове: июнь 1995г, Москве: январь 1996 года, нюнь 1996г; на Международной конференции " Чернобыль-Вильседе","Клиническая и экспериментальная гематология" г. Гомель, май 1996 г, на семинаре секции ТКМ " Blood & Marrow Clinic Conference" Техасского Университета, г. Хьюстон, США , сентябрь 1996г. Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 92 страницах, состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего 6 отечественных и 144 зарубежных источников литературы. В работе 5 таблиц, 8 рисунков. Диссертация выполнена в отделении химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга (зав. - доктор медицинских наук профессор В.Г.Савченко) ГНЦ РАМН (директор - академик АМН А.И:Воробьев)

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ

В настоящей работе приводятся результаты проведенного обследования 20 больных, которым была выполнена аллогенная трансплантация костного мозга в отделении химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга ГНЦ РАМН под руководством профессора д.м.н. Савченко В.Г. за период с декабря 1992 года по декабрь 1995 гада.

Первичное обследование с целью определения информативной метки среди гипервариабельных участков ДНК прошло 44 человека - 22 донора и 22 реципиента. Далее обследовались только реципиенты костного мозга, пережившие более 30 дней после трансплантации. 2 больных были исключены из исследования по причине ранней смерти и несоблюдения протокола исследования. Таким образом, группа полностью обследованных пациентов составила 20 человек. Среди них было 13 мужчин и 7 женщин. Медиана возраста составила 29 лет (15 - 44). 12 пациентов страдали различными вариантами острых лейкозов, 8 - хроническим миелолейкозом.

Все больные были поделены на 2 подгруппы. В первую вошли 17 человек, наблюдавшихся непосредственно после ТКМ, во вторую 3 - после проведенной по поводу поеттрансплантационного рецидива иммунотерапии (переливания лимфоцитов от донора костного мозга). Двое больных попали в обе подгруппы (Т8 и Т10), так как наблюдение за ними проводилось непосредственно после трансплантации и далее, во время иммунотерапии по поводу ранних рецидивов.

Основные данные по больным представлены в таблицах 1 и 2.

Методы исследования

С целью изучения динамики приживления костного мозга и гемопоэтического химеризма у больных после аллогенной трансплантации в работе был использован метод амплификации гипервариабельных участков генома с помощью ПЦР,

Для исследования приживления костного мозга у больных после трансплантации были выбраны фрагменты ДНК, которые могли бы служить индивидуальными маркерами, позволяющими эффективно отличать клетки донора от клеток реципиента - гипервариабельные участки генома с изменяющимся числом копий. .

Исследовались 4 гипервариабельных локуса: VNTR в.. 3 фланкирующем регионе гена аполипопротеина В (ароВ), VNTR в локусе DX S52 X хромосомы(ОХ S52) , STR в 40 интроне гена фактора Виллебранда (VWF), YNZ 22 - VNTR в локусе D17S30. Выбор указанных участков определялся следующими условиями: I) размер амплифицируемых фрагментов не должен превышать 2 Кб; 2) длина единицы повтора должна быть довольно высока, что позволило бы различать между собой близкие аллели без усложнения методики. Краткая характеристика каждого локуса представлена в таблице 3. Синтез праймеров н амплификация фрагментов проводилась согласно описанным методикам. Нуклеотидный состав праймеров представлен в таблице 4.

Для выделения геномной ДНК использовались лейкоциты периферической крови и миелокариоциты костного мозга реципиентов и доноров костного мозга. Первое исследование выполнялось до проведения ТКМ с целью определения генетического маркера, достаточно информативного для дальнейшего наблюдения. В некоторых случаях: для определения маркеров реципиента и донора использовалось выделение ДНК из клеток эпителия слизистой полости рта, полученных с помощью соскоба.

В группе больных, наблюдавшихся непосредственно после ТКМ, контрольными сроками для исследования клеточного происхождения кроветворения были +30, +60, +90 дни и далее каждые 3 мес в течение первого года наблюдения. Затем исследования проводились раз в полгода.

В группе больных, которым проводилась иммунотерапия, исследования приводились до начала лечения, во время его проведения, и по завершении, во время контрольных госпитализаций.

Таблица 1 Характеристика больных,

обследованных после ТКМ

No Возраст / пол Диагноз Режим подготовки Фаза заболевания перед ТКМ (ОВБ/ ХВБ) Исход

Т1 39/М ОМЛ Миелосан +Циклофосфан I ремиссия Н/+ +1130 день, ремиссия

Т2 26/М ОМЛ Миелосан +Циклофосфан I ремиссия 01+ +1094, ремиссия

Т4 25/Ж ОНЛ Тотальное облучение тела+Циклофосфан I ремиссия о/о Смерть на +59 день в ремиссии

Т6 28М ОЛЛ Тотальное облучение тела+Циклофосфан I ремиссия I/+ +812 день, ремиссия

Т8 23/Ж ОМЛ Миелосан +Циклофосфан Резистентное течение ОМЛ о/о Смерть в рецидиве на+109

Т9 44/Ж хмл Миелосан +Циклофосфан Хроническая фаза 010 Смерть в ремиссии на +96 день

Т10 23/М ОНЛ Тотальное облучение тела+Циклофосфан I рецидив о/о Смерть в рецидиве +138

Т11 28/М ОМЛ Тотальное облучение тела+Циклофосфан I ремиссия о/о Смерть на+ббдень в аплазии

Т12 21/Ж хмл Миелосан +Циклофосфан Хроническая фаза III-IV Смерть на +52 день

Т13 20/М хмл Миелосан +1Диклофосфан Хроническая фаза HI-IV Смерть на +66 день

Т14 35/М хмл Миелосан +Циклофосфан Фаза акселерации m-iv Смерть на +98 день

Т15 33/М хмл Миелосан +Цнклофосфан Хроническая фаза 0/+ +363 день, ремиссия

Т17 22/Ж ОМЛ Тотальное облучение тела+Циклофосфан П1 ремиссия шо Смерть на+53 день

Т18 15/М ХМЛ Миелосан +Циклофосфан Хроническая фаза ш/о Смерть па +37 день

Т21 24/М ХМЛ Миелосан +Циклофосфан Хроническая фаза о/о +80 день, ремиссия

Т22 36/М ОМЛ Тотальное облучение тела+Циклофосфан I ремиссия I-H/0 +60 день, ремиссия

Т23 17/М ОЛЛ Тотальное облучение тела -Щиклофосфан 11 ремиссия 1/0 30 день, ремиссия

Таблица 2 Характеристика больных,

которым проводилась иммунотерапия

N0 Возраст/ пол Диагноз Режим подготовки Состояние перед началом терапии (ОВБ/ ХВБ) Исход

Т5 32/Ж ОМЛ Тотальное облучение тела+Циклофосфан II ремиссия после проведенной ПХТ 0/+ +1430 полная ремиссия после рецидива на+751

Т7 23/Ж ОМЛ Тотальное облучыме тела+Циклофосфан П ремиссия после проведенной иммунотерапии О/О +1185, Л рецн.здв после ТКМ

Т8 23/Ж ОМЛ Миелосан +Цнклофосфан Рецидив после ткм О/О Смерть в рецидиве на+109

Т10 23/М онл •Тотальное облучение тела+Циклофосфан Рецидив после ТКМ О/О Смерть в рецидиве +138

Т19 38/М хмл Миелосан +Цнклофосфаи Рецидив после ТКМ 0/+ II ремиссия, +910

Выделение ДНК осуществлялось из лейкоцитов периферической крови и миелоцитов костного мозга после селективного лизиса эритроцитов 0,8% раствором ШтЦО по общепринятой методике; обработки крови додецил-сульфатом Иа ( 0,5%) в присутствии, протеиназы К в течение ночи и фенольной экстракции. Далее ДНК растворялась в деионизированной воде до концентрации 0,1-0,2 мкг/мл. Контроль концентрации ДНК проводился на спектрофотометре.

Во 2 подгруппе больных во время проведения иммунотерапии. ДНК выделялась отдельно из гранулоцитов и мононуклеаров периферической . крови после разделения центрифугированием в градиенте плотности фиколла.

Обьем реакционной смеси для ПЦР составлял 25 - 50 микролитров. Состав реакционного буфера : 50мМ Трис-НС1 ( рН 8,9 при 25°С)Г 16мМ сульфата аммония, 10 мкМ ЭДТА, ЮмМ 2-меркаптоэтанола, 170мщ/мл БСА, смесь основных четырех <1ЫТР с концентрацией 1мМ для каждого и по 30 мМоль/л каждого из праймеров. Концентрация МйСЬ составляла 1,0 мМоль/л для амплификации локуса vWF, 2,0 мМоль/л для локусов ОХ552 и YЫZ22 и 4,0 мМоль/л для АроВ соответственно. В реакционную смесь вносилось 2-2,5 ЕД термостабильной полимеразы Taq и 0,4-0,8 мкг исследуемой ДНК. Температурные режимы были следующими :1) для АроВ : 94°С-Г-58°С-6'- 30 циклов 2) для У№22 : 94°С-Г-58°С-Г-72?С-3. - 30 циклов 3) для ОХй52 : 94°С-Г-62оС-2'-720С-3' - 24 цикла 3) даа^Е ; 94°С-Г-52°С-Г-72°С-Г - 25 циклов. Амплификация проводилась с помощью автоматического термоциклера " Регкт-Е1тег СеШз ".

Анализ полученных после проведения ПЦР фрагментов осуществлялся методом электрофореза в полиакриламидном геле 6-12% концентрации и определения в ультрафиолетовом свете после прокрашивания бромистым этидием. Гели фотографировались в проходящем ультрафиолете, далее пленка проявлялась по обычной методике.

Таблица 3

Тандемные повторы с изменяющимся числом копий, используемые в йсследовании.

Область УЫТИ Хромосомная локализация Число аллелей Длина повтора (число пар нуклеотидов) Размер ампл. фрагмента (тысячи пар нуклеотидов) Процент гетерозигот в случайной выборке Ссылки

Ген АроВ АРОВ,2р23-р24 12 30 0,54-0,87 75 Воег«лпк1е и соавт.

БЫ 4 БХ552,Хя27-Хд28 15 60 0,7-3,0 71 Кайдалова и соавт.

уиг22 017830,17р13 10 70 0,17-0,870 86 Нош и соавт

у\¥Р 40 интрон vWF, 12хромосома 10 4 0,095-0,131 60 Мисюрин и соавт.

Таблица 4

Нуклеотидные последовательности праймеров, использованных в исследовании.

Локус Последовательность 5' - 3' (1 - прямой; 2 - обратный) Длина (число нуклеотидов) Ссылки

АРОВ 1 - АГООААРОСаАОАААТТАТО 2 - ССТТСТСАСТТСОСАААТАС 20 20 Воет1пк1е и соавт.

БЫ 4 1 - ООСАТСТСАТСАСТТСТСТСАТСТТ 2 -САССАСТССССТСАССТСАСТТ 25 22 Кайдалова и соавт.

УШ22 1 - ССААСАОТСААСТОСАСАСО 2 - САСАОТСТТТАТТСТТСРССС 20 20 Нот и соавт.

1 - АОСТАТАТАТСТАТТТАТСАТ 2 - АСАТАСАТАСАТАСАТАТАСС 21 21 Мисюрин и соавт.

При оценке результатов исследования мы пользовались следующими понятиями : 1) полный химеризм - в гемопоэтических клетках больного после ТКМ определяются маркеры только ДНК донорского типа; 2) смешанный химеризм - определяются маркеры ДНК как донорского, так и хозяйского типа; 3) несостоятельность трансплантата - не определяется ДНК донорского типа.

Методика выполнялась в лаборатории генной инженерии и геппых диагностикумов (рук. д.б.н. Соловьев Г.А.) под руководством с.н.с. Сурина В.Л. и при непосредственном участии Смирновой О.В..

Статистическая обработка произведена с.н.с. Масловой Е.Р. с помощью пакета компьютерных программ SAS (Statistical Analysis System Institute, USA). Оценка различий между группами осуществлялась с использованием методов описательной статистики и дисперсионного. анализа (лаборатория биомедицинской статистики, руководитель, к. ф-м. наук Куликов С.М.).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Первично было обследовано 44 человека (22 больных^ которым проводилась аллоТКМ и 22 донора костного мозга) с использованием описанной методики.

По результатам амплификации каждого из гипервариабельных локусов ДНК у больных и доноров был проведен анализ, позволяющий оценить степень гетерозиготности, частоту встречаемости наиболее типичных аллелей, степень информативности в данной популяции .

Общие данные по результатам проведенного исследования представлены в таблице 5.

Группа больных, обследованных после аллогеннной ТКМ.

В группу вошло 17 человек. Пятеро первично обследованных больных были исключены из исследования - двое по причине ранней смерти после ТКМ, трое - из-за несоблюдения сроков исследования. Средний срок

Таблица 5

Оценка частоты встречаемости аллелей трех гипервариабельных: участков генома среди первично обследованных доноров и реципиентов _(44 человека)_

Название локуса Номер аллели Длина ( пар нуклеотидов) Частота встречаемости (число аллелей (%))

ароВ 3 601 4 (0,047)

4 631 9(0,107)

5 661 24 (0,285)

6 691 11 (0,130)

7 721 6(0,071)

8 751 3 (0,023)

9 781 8 (0,083)

10 811 И (0,131)

11 841 5 (0,059)

12 871 5 (0,059)

88 (1,0)

YNZ22 1 170 7 (0,085)

2 240 14(0,158)

3 310 22 (0,268)

4 380 18 (0,214)

5 450 9 (0,09)

6 520 2 (0,024)

7 590 2 (0,024)

8 670 2 (0,024)

9 730 4 (0,048)

10 800 5 (0,060)

12 940 1 (0,012)

88 (1,0)

Stl4 1 700 4 (0,048)

6 1450 4 (0,048)

8 1570 5(0,061)

9 1630 23(0,2613)

10 1690 24 (0,285))

11 1750 7 (0,085)

13 1870 2(0,012)

14 1930 6 (0,073)

15 2100 8 (0,097)

17 2400 3 (0,036)

88 (1,0)

Прамечание:щи&раи.т аллелей представлена по Budowie et al, Boerwinkte et al, и , Кайдаловой и соавт.

наблюдения за больными составил 217 дней и колебался от +28 до +1130 дня. Число исследованных проб крови и костного мозга составило от 2. до 11, в среднем 4 от каждого больного.

Средняя продолжительность жизни пациентов составила 207 дней (от +37 до +1130). Из этих больных до настоящего времени живы 7 человек. Из 10 умерших 2 погибли от рецидива (на +138 и +139 дни), 5 от осложнений на фоне вторичной болезни (от +37 до +98 дня), одна пациентка - от инфекционных осложнений и отторжения трансплантата (на +96 день), одна больная - от токсических осложнений(+59 день), и один пациент - от инфекционных осложнений в результате несостоятельности трансплантата (на +41 день).

У 11 больных в пострансплантационном периоде развилась вторичная болезнь. Из них - у восьми человек - острая вторичная, болезнь (ОВБ), у четырех - хроническая (ХВБ). У одного больного острая форма вторичной болезни перешла в хроническую. Сроки возникновения ОВБ варьировали от +8 до +64 дня после ТКМ (в среднем +29 день), ХВБ - от +100 до +201 дня (в среднем +141 день).

Из этих больных живы 6 человек (4 с сохраняющейся клиникой ХВБ, 2 - с ОВБ).

Фрагменты ДНК, позволяющие отличать клетки донора от клеток реципиента, были обнаружены для всех 17 пациентов. Из них у семи больных исследования проводились по локусу АРОВ, у пятерых - по локусу DXS52, и у такого же числа больных - по участку YNZ22. В случае обнаружения нескольких информативных локусов, использовался наиболее удобный с учетом простоты выполнения и чувствительности.

После оценки полученных данных, удалось установить 3 типа состояния гемопоэза у больных после аллогенной трансплантации - полное приживление - у 11 человек, что составило 65%, смешанное кроветворение у 5 больных, что составило 34% обследованных пациентов и несостоятельность трансплантата в одном случае. Заслуживает внимания, что все 11 пациентов, у которых отмечалось полное приживление донорского костного мозга находились в полной ремиссии после ТКМ, а во

второй группе (со смешанным типом приживления) 2 больных с длительно существовавшим (более Зх месяцев) смешанным химеризмом развили рецидив от которого и погибли. Лишь у одного пациента в этой группе установился полный донорский химеризм в непосредственной связи с развитием хронической вторичной болезни.

Необходимо отметить, что ни особенности режима кондиционирования, ни количество перелитых донорских миеяокариоцитов ни оказали влияния на тип приживления. При оценке стадии заболевания пациентов до трансплайтации оказалось, что в группе с полным приживлением 7 человек, или около 70% были с полной ремиссией острых лейкозов, то есть -незначительной опухолевой массой. В группе больных со смешанным типом кроветворения 3 человека (или 60%) находились в развернутых стадиях гемобластозов - рецидивах острых лейкозов или властном кризе ХМЛ. Таким образом, можно предположить, что наличие значительной опухолевой массы и высокая агрессивность заболевания ведет к ухудшению приживления донорского костного мозга и дает возможность для репопуляции собственного кроветворения реципиента. В основе этого, скорее всего, лежит недостаточная эрадикация опухолевого клона за счет его значительного обьема и, возможно, резистентности к химио- и радиотерапии.

Особого внимания заслуживает развитие РТПХ в форме острой или хронической вторичной болезни в разных группа пациентов. В группе с полным приживлением ОВБ/ХВБ развилась у 9 человек, что составило 80%, а в группе с неполным приживлением - лишь у 2 больных, причем оба они погибли в ранние сроки после ТКМ и проследить дальнейшую динамику приживления не удалось. Таким образом, отмечается несомненная связь возникновения РТПХ, особенно хронической ее формы, с установлением донорского типа кроветворения, что, в целом, не противоречит литературным данным. Сохранение смешанного гемопоэтического химеризма в течение длительного (более 3-х месяцев) срока, судя по всему, ведет к установлению состояния толерантности, когда возникновение вторичной болезни уже маловероятно. С другой стороны, возможно,

Таблица 6

Результаты в группе больных, обследованных после ТКМ

Состояние кроветворения Число больных Наличие вторичной болезни Клинический статус Исход

полный донорский химеризм 11 ОВБ-5 ХВБ-7 ремиссия - 11 7 - живы 4 - смерть от разл.ичных причин

смешанный химеризм 5 ОВБ-2 рецидив - 3 не установлен - 2 1 - жив 2 - смерть в рецидиве 2 - смерть от различных причин

восстановление собств. гемопоэза 1 не установлен смерть от инфекционных осложнений

именно отсутствие РТПХ позволяет существовать собственному кроветворению реципиента и допускает высокую вероятность рецидива, что и было отмечено в нашем исследовании. Краткие данные по результатам в этой группе представлены в таблице 6.

Группа больных, проходивших иммунотерапию

В группу пациентов, которые наблюдались в процессе проводимой иммунотерапии, вошло 5 человек. Среди них было двое мужчин и три женщины. Возраст больных колебался от 21 года до 38 лет (среднее - 27). Четверо больных страдали различными формами OJT, один - ХМЛ в хронической фазе. Сроки возникновения рецидивов после аллогенной ТКМ колебались от +95 до + 750 дня (среднее - +303 день). Из них у 3 человек рецидив возник в ранние сроки после ТКМ (на +95 ; +110 и + 132 день), у двоих - в поздние сроки (на +424 и +750 день).

В качестве иммунотерапии больным производились переливания лейкоконцентратов от доноров костного мозга. Общее число переливаний составляло от 3 до 8 (в среднем - 5 переливаний). Количество лимфоцитов в каждом лейкоконцентрате колебалось от 3,7 до 26,2 на 107 (среднее 11,9 ±5,8 на 107/кг веса). Сроки между переливаниями лейкоконцентратов колебались от 3 до 90 дней. Более интенсивный режим применялся в начале лечения при индукции ремиссии. Далее введения проводились реже, в качестве поддерживающей терапии. Троим больным производилось одновременное ведение цитокинов: двое получали интерлейкин 2 в дозе 6 МЕ/м2 во время первых двух и первых трех переливаний, один больной получал реаферон в дозе 3 млн.Ед. трехкратно в течение недели, затем, в течение еще одной недели - в дозе 4 млн.Ед. по такой же схеме. Критериями прекращения терапии служили: 1) достижение стойкого длительного

противолейкемического эффекта; 2) полное отсутствие последнего и прогрессирование лейкозного процесса; 3) возникновение клинически диагностируемой РТПХ.

Надо отметить, что перед проведением лечения у всех пациентов отмечался смешанный химеризм, что говорило о неполном отторжении трансплантата

и возможности восстановления донорского кроветворения. У 2 пациентов проведенная терапия оказалась успешной и привела к возврату к полному донорскому химеризму. У обоих больных развилась хроническая вторичная болезнь. У двоих пациентов успеха достичь не удалось, и они погибли от рецидива заболевания. И у одной больной полное восстановление донорского гемопозза было достигнуто без признаков РТПХ, однако отмечался временный смешанный химеризм, а в дальнейшем экстрамедуллярный рецидив острого лейкоза.

Производить оценку факторов, имеющих значение для развития противлейкемического эффекта иммунотерапии чрезвычайно сложно, поскольку этот феномен изучен еще недостаточно. По данным исследования оказалось, что число перелитых лимфоцитов донора не влияет на установление ремиссии в процессе иммунотерапии. Не имела значения также фаза заболевания перед проведением переливаний и введение цитокинов в процессе иммунотерапии. Единственным фактором, повлиявшим на установление донорского гемопоэза стало развитие у больных РТПХ в форме ХВБ. У двоих пациентов стойкая, ремиссия заболевания была достигнута лишь после возникновения ХВБ. У остальных 3 больных признаков РТПХ не было. У 2 ремиссии вообще достичь не удалось, у одной больной возник поздний рецидив. К сожалению, малое число наблюдений не позволяет определить, насколько достоверны, полученные результаты, однако, в целом, они соответствуют литературным данным.

ВЫВОДЫ

1) Метод амплификации полиморфных участков генома с помощью полимеразной цепной реакции дает возможность установить индивидуальный генетический маркер для каждого больного и донора.

2) С помощью использованного метода возможно точно определить установившийся тип кроветворения у больных гемобластозами в ранние

сроки после трансплантации костного мозга и далее в течение всего срока наблюдения.

3) Тип посттрансплантационного гемопоэза зависит от фазы основого заболевания у больного перед трансплантацией. Полное приживление трансплантата в большинстве случаев происходит у пациентов с ремиссией острого лейкоза (70%), а установление смешанного кроветворения отмечается у больных с развернутой фазой заболеванияЦс хронической фазой хронического миелолейкоза или рецидивом острого лейкоза).

4) Развитие полного донорского кроветворения в 90% случаев ассоциируется с возникновением у больных после трансплантации костного мозга реакции трансплантат против хозяина, особенна в форме хронической вторичной болезни (60 %).

' 5) Показана высокая частота развития рецидива заболевания у больных с длительно существующим после трансплантации аллогешюго костного мозга (более трех месяцев) смешанным типом кроветворения^ В группе с полным приживлением донорского костного мозга не возникло ни одного рецидива.

6) Эффективность проводимой адоптивной иммунотерапии (трансфузий донорских лимфоцитов) и восстановление функции трансплантата у больных с посттрансплантационными рецидивами ассоциируется с развитием у них хронической вторичной болезни.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

(.Демидова И.А., Савченко В.Г.// Динамика приживления костного мозга и лнмфогематопоэтический химеризм у больных после аллогенной трансплантации костного мозга. Тер.Архив, 1995, 8

2. Demidova I.A., Surin V.L., Savchenko V.G.// Evaluation of chimerism after allogeneic bone marrow transplantation using amplification by polymerase chain reaction of hypervariable régions of human genome. Annals of Hematology, 1995, v 70, suppl 2, abstr 100.

3. Demidova I.A., Surin V.L.,Mendeleeva L.P., Luibimova L.S., Savchenko V.G. Evaluation of chimerism after allogeneic BMT. Br. J. of Hematology, 1996,. v 93, suppl 2, abstr 965.

Издательство АО "Диалог-МГУ". ЛР N 063999 от 04.04.95.

Подписано к печати 7.05.97г.

Усл.печ.л. 1,25. Тираж 100 экз. Заказ N 374.

Тел. 939-38-90, 939-38-91. Факс 939-38-93.

119899, Москва, Воробьевы Горы, МГУ