Автореферат и диссертация по медицине (14.00.10) на тему:Динамика содержания растворимых антигенов и антител при экспериментальном токсоплазмозе кроликов по данным иммуноферментного анализа

РГ6 од - 1 ПНВ 1996

На правах рукописи

Соловьев Алексей Иванович

Динамика содержания растворимых антигенов и антител при экспериментальном токсоплазмозе кроликов по данным иммуноферментного анализа.

14.00.10 - инфекционные болезни 03.00.19 - паразитология, гельминтология

Автореферат

на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 1995

Работа выполнена в Военно-медицинской академии.

Научные руководители:

доктор медицинских наук профессор

А.Ф.Никитин,

доктор медицинских наук профессор Ю.ВЛобзин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор

А.Ф.Подлевский,

доктор медицинских наук доцент

А.Ф.Тумка

Ведущее учреждение:

Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П.Павлова

Зашита диссертации состоится января 1996 года в "//" часов на заседании диссертационного совета Д.106.03.05 при Военно-медицинской академии (194175, Санкт-Петербург, ул. Лебедева, 6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундо-ментальной библиотеке Военно-медицинской академии.

Автореферат разослан "¿¿"'декабря 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета доктор медицинских наук профессор Ляшенко Юрий Иванович

Актуальность работы. Токсоплазмоз - одна из наиболее распространенных инвазий человека. Toxoplasma gondii заражено в среднем около 30% населения мира (Лысенко А.Я., 1980).

В большинстве случаев токсоплазмоз протекает бессимптомно. Острые формы с выраженной клинической картиной встречаются сравнительно редко. Иногда может развиться хронический токсоплазмоз с многолетним рецидивирующим течением (Казанцев А.П., 1985).

Значение этой инвазии особенно велико в связи с возможностью внутриутробной передачи возбудителя, при которой нередко наблюдаются тяжелые поражения плода (Лысенко А.Я., 1980). Большую опасность токсоплазмоз представляет для лиц с пониженной иммунологической резистентностью. По данным Schwartlander В. et all (1991) среди протозойных инвазий, возникающих у ВИЧ-инфицированных больных, 19% случаев приходится на долю токсоплазмоза. Нередко генерализация токсоплазмоза наблюдается при лимфопролиферативных заболеваниях, трансплантациях, а также на фоне иммунодепрессивной терапии (Holliman R.E. et all, 1991; Borruat F.-X., et all 1993).

Полиморфизм клинических проявлений токсоплазмоза у человека существенно затрудняет его диагностику. Поэтому важное значение в установлении диагноза этого заболевания имеют результаты серологических исследований.

Анализ данных литературы свидетельствует, что в настоящее время серологическая диагностика токсоплазмоза во многом основывается на эмпирическом подходе. Многие исследователи, в стремлении повысить чувствительность той или иной реакции, используют разные антигены, не учитывая при этом их

свойства и особенности иммунного распознавания в различные периоды инфекционного процесса. Как следствие этого при одновременной постановке не только различных, но даже одной и той же реакции, результаты их не всегда сравнимы (Бойд У., 1969; Desmonts и Thulliez, 1985; Uggla А. и Buxton D.,1990).

Это существенно затрудняет интерпретацию результатов серологических исследований, что не может удовлетворять требованиям клиники, где первостепенное значение приобретает дифференциация различных форм токсоплазмоза и поиск достоверных критериев активности инфекционного процесса.

В последние годы предпринимаются попытки совершенствования серологической диагностики токсоплазмоза на основе изучения закономерностей иммунологического распознавания антигенов с учетом особенностей локализации их в различных структурах клетки на разных этапах ее онтогенеза (Decoster A., et all, 1988; Tenter А.М. и Johnson А.М., 1991).

Важность обнаружения антител к секреторно-экскреторным антигенам доя дифференциации острого токсоплазмоза от хронической инвазии и определения активности инфекционного процесса показана в работе Cesbron-Delauw M.F., Guy В., Torpier G. et all (1989).

Перспективным направлением диагностики токсоплазмоза, по мнению F.GAianjo и J.S.Remington (1980), Fu С. et all (1989), может также служить обнаружение растворимых антигенов токсоплазм в биологических жидкостях организма хозяина.

Успешная разработка этих вопросов стала возможной благодаря все более широкому внедрению в практику научных исследований современных имму-

нохимических методов, включая иммуноферментный анализ (ИФА).

Цель исследования. На модели экспериментального токсоплазмоза кроликов с использованием иммуноферментного анализа установить динамику содержания циркулирующих в крови растворимых антигенов и антител к различным антигенам T.gondii и определить ее значение для оценки активности ток-соплазмозной инвазии.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

1. Разработать на основе иммуноферментного анализа методы для определения специфических антител к различным антигенам T.gondii, а также для выявления растворимых антигенов возбудителя, циркулирующих в крови зараженного хозяина;

2. На модели экспериментального токсоплазмоза кроликов определить динамику содержания циркулирующих в крови растворимых антигенов и антител к различным антигенам Т .gondii и установить ее значение для оценки активности токсоплазмозной инвазии.

3. Определить динамику содержания циркулирующих в крови растворимых антигенов и антител к различным антигенам T.gondii у кроликов, облученных на фоне латентного токсоплазмоза, и установить ее значение для оценки активности инвазии при состояниях, характеризующихся иммунодепрессией

Научная новизна.

1. Впервые разработан вариант ИФА для выявления специфических антител к комплексному и структурному антигенам T.gondii, отличающийся высокой чувствительностью и специфичностью;

2. Впервые в нашей стране разработан "сэнд-вич"-вариант ИФА для определения растворимых ан-

тигенов Т^опсШ, циркулирующих в крови зараженного хозяина;

3. На модели экспериментального токсоплазмо-за кроликов с помощью иммуноферментного анализа определена динамика содержания циркулирующих в крови антигенов , а также антител к комплексному и структурному антигенам Т^опсШ и показано ее значение в оценке активности инвазии, в том числе при состояниях, характеризующихся иммунодепрессией.

4. Выдвинуто и обосновано положение о том, что инфекционная антигенемия при токсоплазмозе кроликов наблюдается лишь при недостаточной напряженности специфического гуморального иммунитета.

Практическое значение работы.

1. Доказана информативность результатов разработанных вариантов ИФА для определения циркулирующих в крови растворимых антигенов Т^опсШ и специфических антител к комплексному и структурному антигенам возбудителя в оценке активности токсоплазмозной инвазии.

2. Обоснована целесообразность использования разработанных вариантов ИФА в установлении активности токсоплазмозной инвазии при состояниях, характеризующихся иммунодепрессией.

Реализация результатов работы. Материалы диссертации вошли в проект "Методических рекомендаций по лабораторной диагностике протозойных оппортунистических инвазий", представленный на утверждение в ГВМУ МО РФ. Схема и методические рекомендации по лабораторной диагностике токсоп-лазмоза внедрены в практику лечебно-диагностической работы клиники инфекционных болезней, а также в учебный процесс на кафедрах общей и воен-

ной эпидемиологии, биологии (с курсом паразитологии) и инфекционных болезней ВМедА.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на научной конференции "Актуальные вопросы медицинской паразитологии", посвященной 110-летию со дня рождения академика Е.Н.Павловского (24.03.1994г.), на XXII научно-практической конференции врачей сан-эпидслужбы Санкт-Петербурга "Реализация концепции развития санэпидслужбы РФ в Санкт-Петербурге", посвященной 50-летию Победы в Великой Отечественной войне.

Положения, выносимые на защиту.

1. Разработанные варианты ИФА характеризуются высокой чувствительностью и специфичностью и могут быть использованы с целью определения антител к комплексному и структурному антигенам ток-соплазм, а также для выявления циркулирующих в крови растворимых антигенов паразитов.

2. В установлении активности токсоплазмозной инвазии, в том числе на фоне иммунодепрессии, важным показателем служит характер динамики содержания циркулирующих в крови растворимых антигенов и антител к комплексному и структурному антигенам возбудителя.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы.

Структура и объем работы. Диссертация содержит 156 страниц машинописного текста, включая 22 таблицы, 19 рисунков; состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов. Список литературы включает 40 отечественных и 175 иностранных источников.

Содержание работы.

ВЭ Материалы и методы исследования.

В экспериментах использовали кроликов массой 2-3 кг и нелинейных белых мышей массой 20-30 г.

Облучение кроликов проводили сублетальной дозой 500 р, которая вызывает у них заметное угнетение иммунологической реактивности. Кроликов облучали с помощью аппарата РУМ-3 при напряжении на трубке 180 КУ, силе тока 15 шА. Мощность дозы в центре фантома при фильтре 0.5 мм Си на расстоянии 60 см от анода составляла 43,8 р/мин.

Кровь для исследования получали из краевой вены уха. Кроликов во всех сериях опыта заражали подкожным введением 10 эндозоитов вирулентного штамма Т.СопсШ, полученного из института эпидемиологии и микробиологии им .Н.Ф.Гамалеи. Штамм поддерживали на нелинейных белых мышах, перевивая его через каждые 2-3 дня.

Для приготовления антигенов использовали пе-ритонеальный экссудат белых мышей, взятый через 3 дня после их заражения. К одному объему экссудата добавляли 5 объемов ФСБ (рН = 7,2) и смесь центрифугировали при 1500 об.мин в течение 15 минут. Образовавшийся осадок ресуспензировали в ФСБ и повторно центрифугировали. Эту процедуру повторяли трехкратно. Клетки токсоплазм отделяли от мышиных клеток и детрита фильтрованием экссудата через поликарбонатную мембрану (размер пор 3 мкм).

Термомеханическую дезинтеграцию клеток Т^опсШ проводили с помощью термического шока с последующей обработкой в механическом дезинтеграторе. Очищенные от мышиных клеток и детрита эндо-зоиты токсоплазм подвергали трехкратному

замораживанию при -20°С и оттаиванию на водяной бане при 60°С. Обработку в механическом дезинтеграторе осуществляли при 5000 об.мин. в течение 10 мин. Полученный гомогенизат центрифугировали в течение 20 мин при 6000 об.мин. и температуре 4°С. Супернатант использовали в дальнейшей работе.

Для химической дезинтеграции клетки T.gondii смешивали с равным объемом этилового эфира. Образовавшуюся взвесь паразитарных клеток суспензировали при помощи шприца с тонкой иглой. После 30-минутной экспозиции нижний водный слой отделяли и полученную пробу подвергали центрифугированию в течение 20 мин. при 6000 об.мин. и температуре 4°С. Супернатант использовали в дальнейшей работе. Ультразвуковую дезинтеграцию клеток проводили на установке фирмы "MSE". Озвучивание осуществляли с амплитудой 15 мкм при частоте 22 кГц, мощности 150 Вт и температуре 4°С. Полученный гомогенизат центрифугировали в течение 20 мин при 6000 об.мин.и температуре 4°С. Супернатант использовали в дальнейшей работе.

Контроль эффективности дезинтеграции осуществляли при помощи светового микроскопа путем определения среднего числа клеток в одном поле зрения при просмотре 25 полей (увеличение х400).

Подсчет числа клеток в культуральной среде в процессе получения структурного и комплексного антигенов проводили с помощью камеры Горяева.

Кроличью антитоксоплазменную иммунную сыворотку получали посредством многократного заражения животных T.gondii штамма-RH. Материалом для заражения служили эндозоиты токсоплазм, выделенные из перитонеального экссудата мышей. Экссудат центрифугировали при 2500 об.мин. в течение 10 минут. Образующийся осадок ресуспензировали в изото-

ническом растворе хлористого натрия и затем снова центрифугировали при тех же условиях. После трехкратного повторения указанной процедуры полученную суспензию клеток использовали для иммунизации кроликов. Концентрация мышиных клеток в материале, применяемом для иммунизации кроликов, не превышала 1% от общего количества клеточных элементов.

Кроликов заражали подкожным введением 10 клеток токсоплазм и спустя 10 дней животным еженедельно подкожно вводили 10 эндозоитов в течении 4 недель. Через 10 дней проводили завершающую внутривенную инъекцию 10 клеток токсоплазм. Животных обескровливали по прошествии 2-х месяцев после завершающей инъекции. Титр гипериммунной сыворотки в реакции иммунофлюоресценции составлял 1:32000 - 1:64000.

Выделение общеглобулиновых фракций проводили высаливанием сернокислым аммонием . Осаждение проводили двукратно при 50% и 40% или 50% и 33% насыщении и температуре 4°С.

Общеглобулиновые фракций разделяли на ДЕАЕ-целлюлозе в градиенте хлористого натрия.

На колонку с сорбентом (17x1,5 см), уравновешенную 0,0175М фосфатным буферным раствором рН = 6,3 наносили пробу общеглобулиновой фракции, содержащую 250мг белка.

Активность антител в получаемых иммунных препаратах оценивали по их удельным титрам, которые рассчитывали по формуле: Т1мг/мл = Т/С, где Т1мг/мл - удельный титр, Т - титр, полученный в данном методе, С - исходная концентрация белка в данной фракции, мг/ мл.

Конъюгат получали методом периодатного окисления. К 4мг пероксидазы хрена,растворенной в 1,0 мл

дистиллированной воды добавляли 0,2 мл свежеприготовленного ОДМ раствора периодата натрия и перемешивали 20 мин в темноте. Затем раствор окисленной пероксидазы диализовали против 0,001М ацетатного буферного раствора рН=4,4 при температуре 4°С в течение 18-20 часов. По окончании диализа рН раствора окисленной пероксидазы доводили ОДМ КБК, (рН = 9,5) до 9,5 и быстро смешивали его с 8 или 4 мг глобулинов, содержащихся в растворе 0,05М КБК с рН = 9,5. При этом достигалось молярное соотношение ПХ/белок=2/1 или 4/1 соответственно. Затем проверяли значение рН смеси и при необходимости доводили его до 9-,5. Полученный раствор перемешивали в течение 2 ч в темноте при температуре 20°С. После инкубации к нему добавляли 0,1мл 1% раствора боргидрида натрия и оставляли на 2 часа при температуре 4°С, а затем подвергали диализу против 0,01М ФБР рН = 7,2 в течение 18-20 часов.

Твердофазный иммуноферментный анализ для определения антител и антигенов Т^опсШ проводили по стандартным методикам с использованием плоскодонных планшет фирм "Кохинор" и "Медполимер". Учет результатов реакции осуществляли спектрофо-тометрически.

ВИЭФ для определения антигенов и антител и РНИФ выполняли по общепринятым методикам. При использовании ВИЭФ для определения антител применяли комплексный антиген Т^опсШ с концентрацией белка 10,0 мг/мл. Для обнаружения антигенов использовали гипериммунную кроличью сыворотку.

Содержание белка в исследуемых пробах определяли по методу Лоури и спектрофотометрически.

Статистическую обработку полученных результатов проводили по стандартным методикам.

Ш Разработка вариантов ИФА для выявления циркулирующих в крови растворимых антигенов и антител к различным антигенам T.gondii.

Существующие в настоящее время тест системы на основе ИФА для выявления антитоксоплазменных антител в основном позволяют обнаруживать антитела к антигенам, связанным с поверхностными структурами клетки (мембранные антигены). Вместе с тем в ряде работ показано, что для определения активности инфекционного процесса при токсоплазмозе большую ценность представляет обнаружение антител к экскреторно-секреторным антигенам (экзоантиге-нам) возбудителя. В связи с этим при разработке варианта ИФА для выявления специфических антител к T.gondii нами были использованы следующие два антигенных препарата: структурный антиген, состоящий из мембранного и соматического антигенов и комплексный антиген, содержащий наряду со структурными компонентами секреторно-экскреторные продукты (экзоантигены).

На первом этапе разработки ИФА для определения антител к структурному (ИФА-с) и комплексному (ИФА-к) антигенам T.gondii были апробированы различные методы и оптимизированы условия дезинтеграции клеток токсоплазм.

В результате сравнения различных методов дезинтеграции установлено, что наилучший эффект наблюдался при использовании ультразвукового излучения с частотой 22 кГц при мощности 150 Вт и длительности воздействия 15 мин.

Результаты дальнейших исследований показали, что оптимальные свойства иммуносорбента проявляются при использовании антигенных препаратов в концентрации 20 мкг/мл, экспозиции 16-18 часов, при температуре 4°С и рН буферного раствора 9,5.

Наибольшая чувствительность и специфичность ИФА-к и ИФА-с наблюдалась, в разведении сывороток крови 1:100, и их взаимодействии с иммуносорбентом в течение 1 часа при 37°С. Использование конъюгата на основе белка-А в концентрации 200 нг/мл не приводило к его неспецифическому связыванию. Для отмывки непрореагировавших компонентов реакции оптимальным оказалось применение ФСБ, содержащего 0,65М МаС1 и 0,05% твин-20.

Сравнительные исследования сывороток крови белых мышей и кроликов, зараженных ТдопсШ, и людей, страдающих различными заболеваниями, с помощью ИФА-к, ИФА-с, тест-системы ИФА фирмы "Ниармедик" и РНИФ выявили высокую корреляцию полученных результатов (г=0,01).

На предварительной стадии разработки варианта ИФА для определения антигенов Т^опсШ (ИФА-аг), был подобран оптимальный антительный препарат для получения иммуносорбента.

В результате сравнения 4-х различных иммунных препаратов было выяснено, что наиболее высокая чувствительность реакции достигается при использовании фракции иммуноглобулинов, полученной посредством ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе в градиенте хлористого натрия при элюировании белков 0,0175 М ФСБ (рН = 6,3).

В ходе дальнейших исследований было показано, что на этапах получения иммуносорбента и взаимодействия с ним исследуемой пробы, физико-химические условия проведения реакции, обеспечивающие наибольшую ее чувствительность, соответствовали таковым для ИФА-с и ИФА-к. Была установлена также возможность использования для получения конъюгата общеглобулиновой фракции, выделенной из кроличьей гипериммунной антитоксоплазменной сыво-

ротки. Максимальное устранение неспецифического связывания реагирующих компонентов обеспечивалось добавлением в конъюгат 1% нормальной кроличьей сыворотки.

Разработанный вариант ИФА позволял выявлять растворимые антигены Т^опсШ в концентрации 4 нг/ мл,что свидетельствует о его высокой чувствительности.

Ц Динамика содержания растворимых антигенов и антител к различным антигенам Т^опсШ.

С помощью разработанных методов, была изучена динамика содержания циркулирующих антигенов и антител к структурному и комплексному антигенам Т^опсШ в ходе экспериментальной инвазии кроликов. Полученные данные были сопоставлены с результатами определения циркулирующих антигенов и антител в ВИЭФ-аг, ВИЭФ-ат и РНИФ. Такое сопоставление позволяло определить значение результатов ИФА в оценке активности инфекционного процесса при ток-соплазмозе, маркерами которого, согласно данным литературы, служат увеличение титров антител в 4 и более раза при исследовании парных сывороток в РНИФ и обнаружение преципитинов.

Анализ полученных материалов показал, что при первичной инвазии ранее других (на 1-й неделе) обнаруживались антитела в ИФА-к (рис.1). Позже (на 2-й неделе) начинали определяться антитела с помощью ИФА-с (рис.1) и РНИФ (рис.2). Значимое возрастание уровня специфических антител в ИФА-к, ИФА-с и РНИФ, наблюдалось в первые 3-4 недели с момента заражения. В эти же сроки, а также в течение 5-ой, 6-ой недели обнаруживались растворимые антигены Т^опсШ и положительные результаты в ВИЭФ-ат. В последующем содержание антител по данным ИФА-к

Рис.1

Динамка уровня антител к комплексному и структурному антигенам Т^опсШ при экспериментальном токсоплазмозе кроликов.

По оси абсцисс - время с момента заражения,недели, месяцы; по оси ординат - величина оптической плотности.

1- динамика уровня антител к комплексному антигену; 1 - динамика уровня антител к структурному антигену

Рис.2

Динамика уровня флуоресциирующих антител при экспериментальном токсоплазмозе кроликов.

По оси абсцисс - время с момента заражения, недели, месяцы; по оси ординат - титр РНИФ, -^Т.

и ИФА-с постепенно снижалось и сохранялось на низком уровне в течение всего периода наблюдения (более года).

Четырехкратное возрастание титра антител в РНИФ, при исследовании парных сывороток, соответствующее активному проявлению инфекционного процесса, наблюдалось со 2-ой по 5-ю неделю инвазии. С увеличением временного интервала между взятием парных сывороток частота регистрации четырехкратного прироста титра антител в РНИФ закономерно возрастала.

При сопоставлении динамики четырехкратного нарастания титров антител в РНИФ и данных ВИЭФ-ат с результатами ИФА-к и ИФА-с установлено, что значимый прирост показателей оптической плотности в обеих реакциях наблюдался в течение первых трех недель инвазии и совпадал по времени с обнаружением преципитинов и четырехкратным возрастанием титров флуоресцирующих антител.

Результаты поиска надежных и простых критериев активности инфекционного процесса, основанных на сравнительном исследовании парных сывороток в ИФА-к и ИФА-с, показали, что этим требованиям отвечает увеличение значения показателя оптической плотности на 0,2 при исследовании парных сывороток, полученных с временным интервалом в две недели для ИФА-к и две - три недели для ИФА-с.

Показателем активности инвазии служит также наличие растворимых антигенов Т^опсШ в крови зараженного хозяина.

При первичном заражении кроликов Т^опсШ элиминация циркулирующих антигенов из кровотока по времени совпадала с достижением максимальных уровней антител в ИФА-к, ИФА-с и РНИФ. При реин-вазии, сопровождающейся быстрой мобилизацией

Рис.З

Динамика уровня антител к комплексному и структурному антигенам при реинвазии кроликов Т^опсШ.

По оси абсцисс - время с момента реинвазии, недели, месяцы; по оси ординат - величина оптической плотности.

1 - динамика уровня антител к комплексному антигену; 2 - динамика уровня антител к структурному антигену.

Рис.4

Динамика уровня флуоресциирующих антител при реинвазии кроликов Т^опсШ.

По оси абсцисс - время с момента реинвазии, недели, месяцы; по оси ординат - титр РНИФ, -^Т.

иммунного ответа (рис.3, рис.4), установить наличие растворимых антигенов не удалось.

Наблюдаемые особенности содержания в крови растворимых антигенов при первичном заражении кроликов T.gondii и при реинвазии позволяют предположить, что антигенемия в течение инфекционного процесса при токсоплазмозе наблюдается лишь при недостаточной напряженности гуморального иммунитета.

ш Динамика содержания в крови растворимых антигенов и антител к различным антигенам T.gondii при облучении на фоне предшествующей инвазии.

В опыте использовали кроликов, сыворотка крови которых отрицательно реагировала с токсоплаз-менными антигенами в ИФА, РНИФ и ВИЭФ. Кроликов заражали подкожным введением 10 эндо-зоитов. Через б месяцев после заражения, когда показатели оптической плотности в ИФА-к и ИФА-с и тиры антител в РНИФ не превышали пороговых значений, их облучали дозой 500 Р. Контролем служила группа не зараженных токсоплазмами кроликов, которых облучали аналогичным образом.

Выбор рентгеновского излучения, как фактора подавляющего иммунологическую реактивность организма хозяина, определялся возможностью моделирования с его помощью иммунодепрессии различной степени выраженности, широким использованием ионизирующих излучений в практике, а также возросшей вероятностью лучевых поражений в современных условиях.

Взятие сывороток крови производили на 1-й, 3-й, 5-й, 7-й дни после облучения, затем еженедельно в течение 3-х месяцев, а в последующем 1 раз в месяц.

Сыворотку крови исследовали с помощью ИФА-к, ИФА-с, ИФА-аг, РНИФ, ВИЭФ и ВИЭФ-аг на наличие специфических антител и циркулирующих антигенов Т^опсШ. Одновременно в крови определяли количество лейкоцитов и лейкоцитарную формулу.

В первые дни после облучения у всех кроликов наблюдались выраженные сдвиги в картине периферической крови: снижение количества лейкоцитов и изменения показателей лейкоцитарной формулы. Нормализация указанных показателей отмечалась спустя 6 недель с момента облучения.

Анализ результатов серологических исследований показал, что начиная с 5-й недели после облучения, наблюдалось увеличение средних значений показателя оптической плотности в ИФА-к (рис.5). В последующем, достоверное повышение среднего значения экстинкции в ИФА-с отмечалось на 9 неделе с момента воздействия (рис.5). Статистически значимых изменений титров антител в РНИФ (рис.6) и положительных результатов в ВИЭФ выявить не удалось .

Среди животных контрольной группы результаты ИФА-к, ИФА-с, РНИФ, ВИЭФ, ИФА-аг, ВИЭФ-аг на протяжении всего периода наблюдения оставались отрицательными.

Прирост значений экстинкции на 0,2 и выше, свидетельствующий об активности инфекционного процесса, в ИФА-к наблюдался у всех кроликов на 5-й 7-й неделях, позднее, на 7-9-й неделях, он определялся в ИФА-с у 3 животных . Четырехкратное нарастание титров антител в РНИФ отмечалось в период с 7-й по 9-ю неделю у 2 кроликов.

Таким образом в ИФА-к диагностически значимое повышение уровня антител при исследовании

Динамика уровня антител к комплексному и структурному антигенам 'Г^опсШ при облучении на фоне предшествующей токсоплазмозной инвазии.

По оси абсцисс - время с момента облучения, недели, месяцы; по оси ординат - величина оптической плотности.

1 - динамика уровня антител к комплексному антигену; 2 - динамика уровня антител к структурному антигену.

1 & & I & 1 » * I 1о Ь и11 1 4 I М 4 [о 1» и

Рис.6

Динамика уровня флуоресциирующих антител при облучении кроликов на фоне предшествующей токсоплазмозной инвазии.

По оси абсцисс - время с момента облучения, недели, месяцы; по оси ординат - титр РНИФ,

парных сывороток регистрировалось, чаще чем в других реакциях (р<0,01).

Анализ результатов исследования сывороток крови кроликов с помощью ИФА-аг показал, что при облучении на фоне латентной инвазии транзиторная антигенемия наблюдается в период со 2-ой по 6-ю неделю. На 4-ой,5-ой неделях циркулирующие антигены определялись также с помощью ВИЭФ-аг.

Можно полагать, что угнетение иммунитета на фоне латентного токсоплазмоза сопровождается активизацией инвазии, проявляющейся фазой инфекционной антигенемии. В последующем, по мере восстановления иммунитета, происходит элиминация циркулирующих антигенов из кровотока в результате связывания их образующимися антителами. Об этом свидетельствует совпадение по времени регистрации отрицательных результатов ИФА-аг с восстановлением количества лейкоцитов, нормализацией показателей лейкоцитарной формулы и возрастанием уровня специфических антител в ИФА-к.

Доказательством этого служит также высокая корреляция (г = 0,01) между повышением уровня антител в ИФА-к и снижением частоты положительных результатов в ИФА-аг в период с 4-й по 7-ю неделю с момента облучения. Напротив, какой-либо связи между частотой выявления антигенемии и динамикой уровня антител в ИФА-с и РНИФ обнаружить не удалось. Полученные результаты подтверждают предположение других авторов (Aranjo F., Remington J., 1980) о наличии в составе циркулирующих в крови растворимых антигенов T.gondii специфических антигенных детерминант, отсутствующих в поверхностных структурах паразитарной клетки.

Таким образом полученные материалы позволяют прийти к заключению, что угнетение иммунитета

на фоне латентного токсоплазмоза сопровождается активизацией инвазии, о чем свидетельствует повышение уровня антител при исследовании парных сывороток в ИФА-к (увеличение показателя оптической плотности на 0,2 и выше) и выявление инфекционной антигенемии.

Выводы.

1. Разработан вариант ИФА для определения антител к комплексному и структурному антигенам T.gondii, характеризующийся высокой чувствительностью и специфичностью (совпадение в 100% случаев результатов исследования сывороток крови лабораторных животных и людей, страдающих различными заболеваниями, с помощью ИФА-к, ИФА-с, тест-системы ИФА фирмы "Ниармедик" и РНИФ) и пригодный для выявления специфических антител в сыворотке крови.

2. Предложенный вариант ИФА для определения циркулирующих в крови растворимых антигенов T.gondii, характеризуется высокой чувствительностью, позволяя выявлять их в концентрации 4 нг/мл.

3. При первичном заражении кроликов возбудителем токсоплазмоза с 1-й недели регистрируются положительные результаты в ИФА-к, со 2-й недели -ИФА-с и РНИФ. Значимое возрастание уровня специфических антител, определяемых с помощью ИФА-к, ИФА-с и РНИФ наблюдается до 3-4 недели, в эти же сроки инвазии в крови выявляются растворимые антигены Т. gondii и преципитины.

4. Заражение кроликов Т. gondii на фоне предшествующей инвазии сопровождается возрастанием уровня специфических антител в ИФА-к, ИФА-с, с

1-ой по 3-ю неделю с момента реинвазии. Циркулирующие в крови растворимые антигены при повторном заражении не выявляются.

5. У кроликов, облученных на фоне предшествующей инвазии, значимое повышение уровня антител наблюдается в ИФА-к в период с 5-ой по 12-ю неделю с момента воздействия. Циркулирующие в крови растворимые антигены выявляются в период со 2-й по 6-ю неделю после облучения.

6. Признаками активного инфекционного процесса при экспериментальном токсоплазмозе кроликов по данным иммуноферментного анализа служит инфекционная антигенемия, а также нарастание уровня специфических антител, при котором наблюдается увеличение показателя оптической плотности на 0,2 в ИФА-к и ИФА-с при исследовании парных сывороток, взятых с интервалом в 2 и 3 недели соответственно.

¡3 Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Сравнительная оценка эффективности различных методов дезинтеграции Т.§опсШ для получения солюбилизированных антигенов возбудителя / / Научная конференция посвященная 110-летию со дня рождения академика Е.Н.Павловского "Актуальные вопросы медицинской паразитологии". - СПб, 1994-С.52.

2. Применение иммуноферментного анализа с солюбилизированным антигеном Т^опсШ для оценки распространения токсоплазмоза среди жителей Санкт-Петербурга //Там же.- С.53. (Е.Е.Белугина)

3. Антигенемия, как показатель активности инфекционного процесса при токсоплазмозе //Международный симпозиум посвященный году Пастера