Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Динамика активности протеинкиназ А и С в фибробластах кожи больных псориазом при терапии рибонуклеазой

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ РЕГИОНАЛЬНОЙ ПАТОЛОГИИ И ПАТОМОРФОЛОГИИ

РГ6 од

На правах рукописи

ЕРМАКОВ Михаил Николаевич

ДИНАМИКА АКТИВНОСТИ

ПРОТЕИНКИНАЗ А И С В ФИБРОБЛАСТАХ КОЖИ БОЛЬНЫХ ПСОРИАЗОМ ПРИ ТЕРАПИИ РИБОНУКЛЕАЗОЙ

14.00.16 — патологическая физиология 14.00.11 — кожные и венерические болезни

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

НОВОСИБИРСК 1996

Работа выполнена в Новосибирском медицинском институте МЗМП РФ и в Научно-исследовательском институте региональной патологии и патоморфологии Сибирского отделения РАМН (Новосибирск)

Научные руководители:

Заслуженный деятель науки России

доктор медицинских наук, профессор л.м. непомнящих

доктор медицинских наук, профессор б.н. кривошеев

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор е.ф. бочаров доктор медицинских наук, профессор с.г. милевская

Ведущая организация:

НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН (Лаборатория патологической физиологии)

Защита диссертации состоится 1996 г.

в СО часов на заседании Диссертационного совета Д 001.40.01 в НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2; тел. 8-383-2-32-31-56, факс 8-383-2-32-43-39)

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН

Автореферат диссертации разослан "

1996 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 001.40.01

доктор биологических наук Е.л. лушникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Вопросы этиологии, патогенеза и терапии псориаза в течение многих лет остаются одной из важнейших и актуальнейших проблем современной дерматологии. Это связано с тем, что псориаз занимает ведущее место среди хронических рецидивирующих заболеваний кожи (Скрипкин Ю.К., 1979; Задорожный Б.А., 1983; Антоньев АЛ., 1987; Мордовцев В.Н. и др., 1991; Довжанский С.И., 1992). Хроническое, рецидивирующее течение заболевания часто приводит к потере трудоспособности, а тяжелые формы и осложнения к инва-лидизации (Бадокин В.В., 1977; Суворова К.Н. и др., 1977; Ка-ламкарян А.А. и др., 1982). Особенно актуальной проблема становится, если учесть, что большинство больных — это лица среднего возраста, относящиеся к наиболее трудоспособному населению (Криницына Ю.М. и др., 1995).

Неясность этиологии и не полностью изученный патогенез заболевания в значительной степени затрудняют разработку эффективных методов лечения и профилактики рецидивов псориаза. Вместе с тем, по сведениям многих авторов, количество больных псориазом в последние годы неуклонно увеличивается (Каламкарян А.А. и др., 1981; Шахтмейстер И.Я. и др., 1982; Владимиров В.В. и др., 1985). В связи с этим изучение вопросов патогенеза, а также поиск и разработку новых методов лечения псориаза следует отнести к важнейшим проблемам современной дерматологии. На протяжении многих лет изучению псориаза отечественные и зарубежные исследователи уделяют большое внимание. Важным этапом в развитии учения о псориазе явились генетические исследования, которые установили мультифакториальный характер болезни (Мордовцев В.Н. и др., 1977). Получены новые данные по изменению иммунологических характеристик при псориазе, нарушению метаболизма витаминов и микроэлементов в коже, создана экспериментальная модель псориаза (Чернух А.М., Фролов Е.П., 1982). Ряд авторов высказывали точку зрения, что первопричиной возникновения псориаза является латентная вирусная инфекция (Ухин А.Ф., 1964; Кричевский А.М., 1957; Поздняков ОЛ., 1967). В крови, моче, эпидермальных клетках больных псориа-

зом были выделены ретровирусоподобные частицы (Dalen et al., 1983; Iversen, 1983; Rodahl, 1989). Изучены тонкие взаимоотношения биохимических процессов в клетках кожи и характер эпидермо-дермальных взаимоотношений (Цветкова Г.М. и др., 1980; Мушет Г.В. и др., 1984). В последние годы изучено влияние на тонкую биохимическую организацию клеток эпидермиса при псориазе циклических аденозинмонофосфата (цАМФ) и 1уанозинмонофосфата (цГМФ), являющихся посредниками передачи в клетку внешнего сигнала (Беренбейн Б.А. и др., 1982; Шумай Н.И., 1985). В настоящее время активно исследуется влияние цАМФ и цАМФ-зависимой протеинкина-зы А, фосфорилирукнцей важнейшие белки клетки, активизирующей процессы клеточного деления и дифференцировки (Yoshikava et al., 1983, Foster et al., 1983). Большое значение в процессе регуляции пролиферации придается полифосфоино-зитидной системе вторичных посредников передачи внешнего сигнала в клетку. При активации этой системы протеинкиназа С фосфорилирует важнейшие белки, участвующие в создании цитоскелета, функционировании ионных каналов (Litchfield et al., 1987; Shaw et al., 1988). Активация протеинкиназы С в клеточной мембране может усилить Na+/H+ обмен, вызывая увеличение клеточного рН (Civan et al., 1988; Rasmussen et al., 1993).

При изучении лизосомальных ферментов было показано, что активность кислой и щелочной фосфатаз в паракератоти-ческих чешуйках, в гомогенате кожи и в сыворотке крови больных псориазом увеличена более, чем в 2 раза по сравнению с контролем (Мушет Г.В., 1983). В очагах пораженной кожи при псориазе снижена активность дезоксирибонуклеазы и рибо-нуклеазы (Фролов Е.П. и др., 1981; Foster et al., 1975), причем степень снижения коррелирует с распространенностью и тяжестью псориатического процесса (Мушет Г.В., 1987). Между тем, многие вопросы, касающиеся интимных механизмов развития псориатического процесса, нуждаются в уточнении.

Лечение больных псориазом представляет большие трудности. Внедрение в практику цитостатиков, ароматических рети-ноидов, фотохимиотерапии, сорбционных методов позволило расширить арсенал средств и методов, однако разрешить проблему лечения псориаза так и не смогло. Применение проти-

вовирусных средств при псориазе представляется перспективным направлением дерматологии. В доступной литературе сведения ограничиваются применением лейкоцитарного интерферона (Игошин Ю.М., 1983). АЛ.Машкиллейсон (1985) применил панкреатическую рибонуклеазу в терапии псориаза с хорошим эффектом. Продолжаются исследования для разработки новых методов терапии. Одним из перспективных направлений является изучение возможности воздействия на механизмы включения гиперпролиферативных процессов в клетке.

Исходя из предположительно вирусной этиологии псориаза (Поздняков ОЛ., 1970; Dalen et ai., 1983; Iversen et al., 1983, 1985, 1990; Basset, 1987; Rodahl, 1989 и др.) и учитывая снижение уровня рибонуклеазы в коже больных псориазом (Фролов Е.П. и др., 1981; Мушет Г.В., 1987; Foster et al., 1975), мы с терапевтическими целями применили противовирусный фермент — панкреатическую рибонуклеазу и провели изучили ее воздействие на содержание циклических нуклеотидов в коже и аденилатциклазную и полифосфоинозитидную системы вторичных посредников передачи внешнего сигнала в клетку.

Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования — изучить активность протеинкиназ А и С в фибробластах кожи больных псориазом и оценить влияние терапии рибонук-леазой на их активность, разработать комплексный метод лечения больных псориазом противовирусным препаратом рибо-нуклеазой, оценить его эффективность и изучить влияние рибонуклеазы на содержания цАМФ и цГМФ в коже.

Были поставлены следующие задачи:

1. Изучить активность протеинкиназ А и С в фибробластах кожи больных псориазом до и после лечения рибонуклеазой и сравнить их показатели с активностью протеинкиназ А и С фибробластов кожи, полученных от здоровых лиц.

2. Изучить в динамике на фоне терапии рибонуклеазой содержание цАМФ и цГМФ в коже, митотическую активность клеток эпидермиса.

3. Изучить клиническое течение псориаза при лечении рибонуклеазой.

4. Подобрать наиболее эффективные дозировки препарата, разработать показания и противопоказания для назначения

рибонуклеазы.

Научная новизна. Впервые в отечественной литературе показано, что в фибробластах кожи больных псориазом имеется гиперактивация фосфатидилинозитольной и ингабирование аденилатциклазной систем вторичных посредников передачи внешнего сигнала в клетку.

Впервые разработан и предложен комплексный метод лечения, включающий противовирусный препарат рибонуклеаза. Показаны преимущества метода, позволившего добиться уменьшения сроков лечения и увеличения продолжительности клинической ремиссии.

Установлено, что предложенный метод лечения приводит к нормализации активности фосфатидилинозитольной и аденилатциклазной систем вторичных посредников, хотя и не в полном объеме.

Практическая значимость. Разработан новый комплексный метод терапии больных псориазом. Использование предложенного метода имеет ряд преимуществ перед традиционными, так как способствует достаточно быстрому регрессу клинических проявлений, особенно у лиц с небольшой давностью заболевания, характеризуется малым числом побочных явлений. Лечение псориаза рибонуклеазой внедрено в практику Клиники кожных болезней Новосибирского медицинского института, Дорожной клинической больницы Западно-Сибирской железной дороги г. Новосибирск, кожно-венерологических диспансеров г. Новосибирска.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на: конференции "Региональная патология кожи в Сибири" (Новосибирск, 1993 г.), научной сессии сотрудников Новосибирского медицинского института (1995 г.), научных конференциях студентов,и молодых ученых Новосибирского медицинского института (1993, 1994 гг.), III, IV и V научно-практических конференциях врачей г.Новосибирска (1993, 1994, 1995 гг.), конференции дерматовенерологов Новосибирской области (1994 г.), заседаниях Новосибирского областного научного общества дерматовенерологов (1994, 1995 гг), заседаниях кафедры дерматовенерологии Новосибирского медицинского института и лаборатории общей дерматопатолопш

НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (1993, 1994 гг.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 90 страницах машинописного текста, состоит из введения, 3 глав, заключения и выводов, списка литературы, включающего 121 отечественных и 120 иностранных источников. Диссертация иллюстрирована 7 таблицами, 2 рисунками и 25 графиками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика клинических наблюдений. Нами проведено обследование и лечение 243 больных псориазом, находившихся в стационаре клиники кожных болезней Новосибирского медицинского института с 1983 по 1995 годы. Среди больных было 110 мужчин (45,3%) и 133 женщин (54,7%) в возрасте от 16 до 59 лет. До 1 года страдали псориазом 42 (17,3%) больных, от 1 года до 20 лет — 189 (77,9%) и болеё 20 лет — 12 (4,8%) больных. Семейный характер псориаза установлен у 64 (26,3%) человек. У 197 больных диагностирована обычная форма псориаза, у 41 — экссудативная, у 3 — эритродермическая и у 2 — артропатическая форма. В прогрессивной стадии болезни поступили в клинику 144 (59,3%) пациента, в стационарной стадии — 70 (28,8%), в регрессирующей — 29 (11,9%). У 158 человек патологический процесс характеризовался множественными диссеминированными бляшками, из них у 33 — клинические проявления соответствовали каплевидному псориазу. У 3 больных поражение кожи было универсальным. Кожный патологический процесс сопровождался зудом у 54 больных. Рецидивы заболевания в основном в зимнее время отмечали 136 (56,6%), летом — 29 (12%) больных. У 78 (32%) человек заболевание носило внесезонный характер. У 60% больных течение псориаза характеризовалось частыми обострениями, короткими периодами ремиссии и резистентностью к традиционным методам терапии.

В анамнезе у 139 больных отмечены острые респираторные

заболевания, у 39 — частые ангины, 6 человек перенесли вирусный гепатит. У 56 больных диагностирован сопутствующий хронический гастрит, 26 — хронический тонзиллит и 8 — сахарный диабет.

Для оценки терапевтической эффективности рибонуклеазы полученные результаты анализировали дифференцированно по 4 группам больных в зависимости от применявшихся методов лечения. Первая (основная) группа включала 171 человека. Больных этой группы лечили панкреатической рибонуклеазой производства завода медицинских препаратов ПО "Ленмясо-комбинат" с удельной активностью 5000 ед/мг. Препарат в дозе 20 мг разводили в 5 мл 0,5% новокаина или физиологического раствора и вводили внутримышечно 2 раза в сутки с интервалом в 12 часов. Перед началом лечения в обязательном порядке производили пробу на индивидуальную чувствительность к препарату по методу Безредки. При отсутствии общей и местной реакции лечение продолжали в течение 10 — 15 дней. При недостаточно выраженном клиническом эффекте через 2 — 2,5 недели проводили дополнительный курс лечения по той же схеме. Вторая группа (плацебо) состояла из 16 человек, которых лечили одновременно с больными первой 1руппы, но вместо рибонуклеазы им вводили стерильную дистиллированную воду по 5 мл внутримышечно 2 раза в сутки в течение 10 дней. В третьей группе был 21 больной, которым проводили лечение метотрексатом по щадящему методу (10 мг в неделю). Четвертую (контрольную) ipynny составили 38 больных, получавших комплекс витаминов в сочетании с седативными, десенсибилизирующими и антигастаминными препаратами.

Характеристика лабораторных методов исследования. Больные до лечения были обследованы с применением общеклинических анализов крови и мочи, биохимических методов с исследованием активности сывороточных ферментов (AJIT, ACT), уровня общего белка и его фракций, остаточного азота, сахара крови, холестерина, билирубина.

Биопсии кожи для изучения активности цАМФ и цГМФ и получения первичных культур фибробластов брали (с обязательного согласия пациентов) в одно и то же время суток (от 11 до 13 часов дня). Биопсии проводили пациентам до лечения и

сразу же по окончании лечения рибонуклеазой: до лечения — из участка псориатической папулы или бляшки и участка видимо здоровой кожи, после лечения — из псориатической бляшки или из участка кожи, где бляшка уже регрессировала на фоне лечения рибонуклеазой.

Для оценки системы циклических нуклеотидов изучали содержание циклических нуклеотидов (цАМФ и цГМФ) по методу В.Ф.Равинского и др., (1985) с помощью стандартных наборов "Cyclic AMP Assay Kit" (производство Amersham, Великобритания) и "Cyclic GMP Ria Kit" (производство Чехословакии). Митотическую активность клеток эпидермиса и число мито-фаз в пораженной коже определяли по методу ИА.Алова, (1981).

Работа по выращиванию первичной культуры фибробла-стов, определению активности протеинкиназ проводилась в отделе молекулярной генетики (зав. — акад. РАН Р.И. Салганик) Института цитологии и генетики СО РАН.

Выделение первичной культуры фибробластов проводилось согласно "Методическим рекомендациям по культивированию клеток для диагностики наследственных болезней человека", составленным К.Н.Гринберг и соавт., (1988). Поскольку эта работа требует стерильных условий и особо тщательной подготовки лабораторной посуды, то исследования проводились в стерильном боксовом помещении. Для постановки опыта требовалось в среднем 30 — 40 х 10" клеток. С момента помещения кусочка кожи до снятия клеток проходило 2,5 — 3 месяца. После наработки первичной культуры проводили снятие и гомогенизацию фибробластов, фракционное центрифугирование и разделение цитозольной и мембранных фракций. Протеин-киназы А и С, содержащиеся в цитозоле, и протеинкиназу С, содержащуюся в мембранной фракции, очищали ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе. Активность протеинкиназ А и С определяли по переносу з2Р с /у-32Р/АТФ на гистон Нг Активность выражали в пикомолях 32Р на пробу за 1 минуту. Сравнения полученных результатов проводили по величине максимальных пиков активности.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Наблюдения и исследования проводили в динамике на протяжении 6 лет. Лечение рибонуклеазой назначалось 171 больному. У 3 человек из первой труппы после первых инъекций рибонуклеазы возникли обильные уртикарные элементы, в связи с чем лечение им было прервано, и в дальнейший анализ они не вошли. 168 больным лечение проведено в полном объеме, из них 1 курс лечения получили 104 человека, два 10-дневных курса получил 41 человек, удлиненный до 15 дней курс получили 23 человека. У 28 больных в терапии использовали только рибонуклеазу, а у 140 — препарат включали в комплексную терапию с традиционными методами лечения. Всем больным одновременно с рибонуклеазой назначались антигистаминные препараты.

Отчетливый клинический эффект от применения рибонуклеазы отмечен у 136 из 168 человек (80,9%). У 49 человек, начавших лечение в стационарной стадии псориаза, обычно через 5 — 7 дней вокруг элементов развивался псевдоатрофи-ческий ободок Воронова. У 102 больных с прогрессирующей стадией болезни приблизительно в эти же сроки прекращались новые высыпания, а через 7 — 10 дней появлялись первые признаки ре1ресса элементов. В среднем первые признаки улучшения в виде прекращения зуда, отсутствия появления новых элементов и уменьшения шелушения отмечались на 7,05 ± 0,12 день от начала лечения. Псевдоатрофический ободок Воронова в среднем отмечался на 9,9 ± 0,14 день лечения. Положительная клиническая динамика прослеживалась у больных и по завершении лечения рибонуклеазой. Полное или частичное разрешение патологического процесса наступало в сроки до 5 недель после окончания лечения. К исходу указанного срока у 26 (15,6%) из 168 больных констатировано клиническое выздоровление, у 110 (65,3%) — улучшение, у 32 (19,1%) клинический эффект отсутствовал или положительная динамика была выражена незначительно.

Терапевтический эффект от рибонуклеазы в большей степени наблюдался у больных с обычной формой псориаза, сопровождавшейся мелкими диссеминированными элементами

без инфильтрации кожи и при длительности болезни до 2 лет.

Ближайшие результаты в контрольных группах оказались следующими. Из 16 больных группы плацебо у 12 отмечено улучшение и у 4 эффекта не было. В группе больных, лечившихся метотрексатом, клиническое выздоровление констатировано у 2, улучшение у 13 и у 6 человек клинический эффект отсутствовал. Из 38 больных, получавших традиционные методы терапии, у 28 достигнуто улучшение и у 10 лечение оказалось малоэффективным. Сравнительная оценка ближайших результатов лечения методом у} показала, что в распределении больных в зависимости от достигнутого клинического эффекта дифференцированно по группам существенных различий не было (х2 = 11,15; р > 0,1 при п' = 6), т.е. терапевтический эффект от рибонуклеазы в ближайшем периоде не отличается от такового при других методах лечения.

Отдаленные результаты сроком до 6 лет прослежены у 92 (54,7%) больных, лечившихся рибонуклеазой, 15 — метотрексатом, 28 — комплексом витаминов и 12 — из группы плацебо. После комплексной витаминотерапии рецидив чаще всего возникал в ближайшие 6 месяцев по окончании лечения (средние сроки ремиссии 4,5 ± 0,4 мес.). Более продолжительная ремиссия оказалась у больных, лечившихся метотрексатом (6,0 ± 0,6 мес.). В группе плацебо ухудшение состояния наступало в ближайшие недели после выписки из стационара, а средние сроки сохранения полученного эффекта составляли 2,0 ± 0,3 мес. Положительные клинические результаты в этой группе, по-видимому, были связаны с психологическим состоянием больных в условиях лечебного учреждения, когда факторы, неблагоприятно влияющие на течение болезни, сведены к минимуму.

В группе больных, получавших лечение рибонуклеазой, рецидив псориаза в ближайшие 6 месяцев наступил у 31 (33,7%) больных, у 29 (31,5%) — ремиссия продолжалась до 1 года и у 32 (34,8%) — до 2 и более лет, в том числе у 21 (22,8%) больного сроки ремиссии составляли от 3 до 6 лет. У 38 больных с длительными сроками ремиссии периодически возникали ослабленные рецидивы, которые относительно легко купировались обычными методами лечения. Больные оставались трудоспособными и не нуждались в стационарном лечении. Средние

сроки ремиссии в этой 1руппе составляли 19,0 ± 2,0 месяцев и при оценке методом хи-квадрат были достоверно более продолжительными (%2 = 34,61; р < 0,001 при п' = 6), чем в контрольных группах.

У всех пациентов существенных изменений количества эритроцитов (4,29 ± 0,32 х 1012/л ) и лейкоцитов (6,26 ± 1,8 х 10п/л) не отмечено. У большинства обследованных больных СОЭ была в пределах нормы (8,7 ± 2,9 мм/час), и лишь у 28 больных, преимущественно с эритродермической и артропатической формой псориаза, СОЭ была ускорена (18 ± 3,6 мм/час). В общеклиническом анализе мочи ни до, ни во время, ни после лечения патологических изменений не обнаружено. В функциональных пробах печени отклонений от нормы до и после лечения не выявлено. Формоловая проба у всех больных была отрицательная, сулемовая — 1,82 ± 1,44 мл, тимоловая — 2,5 ± 2,41 ед 8Н. Активность сывороточных ферментов у всех больных колебалась в пределах нормы (АЛТ 0,26 ± 0,15 мкмоль/л; АСТ 0,19 ± 0,11 мкмоль/л). Уровень общего белка — 73,9 ± 5,8 г/л; альбумины — 54,8 ± 1,59 г/л; а1 — 4,4 ± 2,3 г/л; а2 — 8,6 ± 2,9 г/л; р — 9,5 ± 2,6 г/л; у — 18,0 ± 6,3 г/л. Уровень холестерина составил 5,45 ± 0,93 мкмоль/л. Уровень общего билирубина — 10,3 ± 5,2 мкмоль/л; прямого — 3,8 ± 2,6 мкмоль/л; непрямого — 9,0 ± 3,8 мкмоль/л. Сахар крови был 4,8 ± 2,1 ммоль/л.

Исследована система циклических нуклеотидов 15 больных, получавших лечение рибонуклеазой, 15 — метотрексатом, 5 — плацебо. Полученные результаты сравнивали с показателями 10 здоровых лиц. Проведено изучение активности протеинки-наз А и С в цитозольной фракции фибробластов из видимо здоровой кожи 6 больных псориазом, из псориатической папулы — 9 больных. По окончании лечения рибонуклеазой аналогичные показатели получены от 7 больных псориазом из псориатической папулы или места, где была регрессировавшая во время лечения папула. Активность протеинкиназы С в мембранной фракции фибробластов исследована у 3 больных из видимо здоровой кожи и 4 больных из псориатической папулы до лечения. Аналогичный показатель из псориатической папулы после лечения получен у 4 больных. Результаты цитозоль-

ных фракций сравнивались с показателями 4 здоровых доноров, мембранные фракции протеинкиназы С сравнивались с показателями от 3 здоровых доноров.

Изучение системы циклических нуклеотидов показало, что до лечения содержание цАМФ (318,3 ± 2,5 пмоль/г ткани) у обследованных больных оказалось существенно (р < 0,001) ниже нормальных значений (539,2 ± 1,8 пмоль/г ткани), а содержание цГМФ (12,2 ± 0,4 пмоль/г ткани) в среднем в 2 раза превышало норму (6,5 ± 0,4 пмоль/г ткани). Митотическая активность клеток эпидермиса (14,7 ± 0,2 %; норма — 4,1 ±0,1 %) характеризовалась 3-кратным повышением, а число метафаз (53,5 ± 0,7 %; норма — 32 ± 0,6 %) было увеличено в 1,5 раза. К концу лечения РНК-азой содержание цАМФ (404,2 ±2,5 пмоль/г ткани) в коже достоверно (р < 0,001) повышалось, но не достигало нормы. Уровень цГМФ (12,8 ± 0,3 пмоль/г ткани) оставался на прежнем уровне. Митотическая активность клеток эпидермиса (9,0 ± 0,3 %) и число метафаз (41,7 ± 0,3 %) существенно (р < 0,001) снижались, но не достигали нормальных значений. У больных, получавших метотрексат, содержание цАМФ и цГМФ, митотическая активность эпдцермоцитов и число метафаз также имели тенденцию к нормализации, но положительная динамика была выражена в меньшей степени. В группе плацебо динамика изучавшихся показателей практически отсутствовала (табл. 1).

Изучение активности протеинкиназ А и С в фибробластах больных псориазом показало следующие результаты. Средняя активность протеинкиназы А в цитозольной фракции фиброб-ластов из видимо здоровой кожи больных псориазом составила в среднем 7,728 ± 2,639 пмоль 32Р на пробу за 1 минуту. В цитозольной фракции фибробластов из псориатической папулы ее активность оказалась ниже и равнялась в среднем 5,026 ± 1,182 пмоль 32Р на пробу за 1 минуту. После лечения рибонуклеазой активность протеинкиназы А в цитозольной фракции возрастала в среднем до 9,876 ± 2,730 пмоль 32Р на пробу за 1 минуту. Активность протеинкиназы С в цитозольной фракции фибробластов из псориатической папулы до лечения рибонуклеазой составила 6,077± 1,285 пмоль 32Р на пробу за 1 минуту и была в 1,65 раза ниже, чем в видимо здоровой

Таблица 1. Циклические нуклеотиды и цитологические показатели в процессе лечения рибо-нуклеазой и метотрексатом (М + т)

Биохимические Контроль Методы лечения и сроки обследования

и цитологические (п = 10) Рибонуклеаза Метотрексат Плацебо

показатели (п = 15) (п = 15) <п = 5)

цАМФ, пмоль/г ткани 539,2 ± 1,8 318,3 ±2.5* 313,5 ±4,1* 317.8 ±2.4*

404,2 ±2,5" 340,5 ± 1,3** 321,8 ± 1,8*

цГМФ, пмоль/г ткани 6,5 ±0,4 12.2 ±0.4* 12.4 ±0.4* 12,6 ±0,4*

12,8 ± 0,4* 11,9 ±0,2* 12,7 ±0,4*

цАМФ/цГМФ 85,1 ±4,9 26.3 ± 1.1* 22.3 ±0,8* 25.3 ±0,9*

31,6 ±1,0" 28,8 ±0,5" 25,5 ±0,8*

Митотическая

активность клеток 4,1 ±0,1 14.7 ±0.2* 14.8 ±0,3* 13,2 ± 0.4*

эпидермиса, % 9,0 ±0,3** 8,7 ±0,1" 13,6 ±0,7*

Число метафаз, % 32,2 ±0,6 53,5 ± 1.3* 50,5 ± 1,3* 52.6 ±0,5*

41,7 ±0,3" 41,5 ±0,7" 53,8 ± 0,9*

Примените: в числителе показатели до, в знаменателе — после лечения; одна звездочка — различия статистически достоверны (р < 0,01 — 0,001) с контролем, две — с контролем и результатами лечения.

коже (3,683 ± 0,679 пмоль 32Р на пробу за 1 минуту). Наиболее высокая активность протеинкиназы С отмечена в мембранной фракции фибробластов из псориатической папулы — 26,728 ± 3,300 пмоль 32Р на пробу за 1 минуту. Высокой оказалась и активность протеинкиназы С в мембранной фракции фибробластов из видимо здоровой кожи — 18,705 ± 7,181 пмоль 32Р на пробу за 1 минуту. После лечения рибонуклеазой отмечено заметное снижение активности протеинкиназы С в фиб-робластах из пораженной кожи, которая составила в среднем 16,709 ± 5,433 пмоль 32Р на пробу за 1 минуту. Полученные результаты сравнивали с показателями здоровых доноров, у которых средняя активность в цитозольной фракции протеинкиназы А составила 6,637 ± 1,225 пмоль 32Р на пробу за 1 минуту, протеинкиназы С — 6,088 ± 0,783 пмоль 32Р на пробу за 1 минуту. Средняя активность протеинкиназы С в мембранной фракции здоровых доноров составила 5, 796 ± 0,492 пмоль 32Р на пробу за 1 минуту (табл. 2).

При псориазе многие авторы (Суворов А.П., 1981, 1984; Шу-май Н.И., 1983; Гребенников В.А. и др., 1987; Каграманова А.Т. и др., 1987; Самотейкина Ю.М., 1987; Довжанский С.И., 1992; Robinson et al., 1971; Miura, 1985) отмечают нарушение в содержания цАМФ и в соотношении цАМФ/цГМФ. В нашей работе мы также отметили, что содержание цАМФ у обследованных больных оказалось существенно ниже нормальных значений, а содержание цГМФ в среднем в 2 раза превышало норму. Эти результаты полностью соответствуют данным литературы об увеличении количества цГМФ при псориазе. Вероятно, адени-латциклазная система вторичных посредников находится в состоянии ингибирования под действием внешних стимулов, что приводит к нарушению процессов клеточной дифференциров-ки на фоне увеличения пролиферативной активности клеток эпидермиса, регуляция которой осуществляется в большей степени полифосфоинозитидной системой вторичных посредников.

Активность протеинкиназы А в непораженной коже больных псориазом до лечения оказалась выше, чем у здоровых доноров на 16%. Вместе с тем, в пораженной коже ее активность была снижена на 17,5% по сравнению с аналогичными

Таблица 2. Средние показатели активности протеинкиназ А и С у здоровых доноров, в видимо здоровой коже и в псориатических папулах больных псориазом до и после лечения рибо-нуклеазой (в пмоль 32Р на пробу за 1 мин)

Фракции Здоровые доноры Больные псо] з и аз о м

до лечения рибонуклеазой после лечения рибонуклеазой

непораженная кожа псориатическая папула псориатическая папула

Цитозольная фракция: протенкиназа А: протеинкиназа С: Мембранная фракция: протеинкиназа С: 6,637 ± 1,225 100% 6,088 ± 0,783 100% 5,796 ± 0,492 100% 7,729 ±2,639 116% 3,683 ± 0,679* 60,5% 18,705 ± 7,187 322% 5,026 ± 1,182 82,5% 6,077 ± 1,285 99,8% 26,728 ± 3,300* 461% 9,876 ± 2,730 149% 9,689 ± 1,440 159% 16,709 ± 5,433 288%

Примечания: звездочкой отмечены статистически достоверные (Р < 0,05 — 0,001) различия по сравнению с контролем.

показателями здоровых людей. Уровень цАМФ у больных псориазом по сравнению со здоровыми людьми снижен на 41%. Эти данные также находятся в полном соответствии с данными литературы. В частности, Brion et al., (1986); Raynaud et al., (1988); Eedy et al., (1990) отмечали снижение активности про-теинкиназы А в фибробластах кожи больных псориазом, причем это снижение коррелировало с тяжестью поражений кожи. Было показано также, что добавление в питательную среду цАМФ, компенсировавшее ее дефицит в клетке, усиливало цАМФ-зависимое фосфорилирование белков (Brion et al., 1986). В сообщении Raynaud et al., (1987), показано, что обработка ретиноиевой кислотой также приводит к активизации цАМФ-зависимой протеинкиназы С.

По полученным нами данным, к концу лечения РНК-азой содержание цАМФ в коже достоверно повышалось, но не достигало нормы. Уровень цГМФ оставался на прежнем уровне. Активность протеинкиназы А после лечения рибонуклеазой в псориатической папуле увеличилась до 9,88 ± 2,73 пмоль 32Р на пробу за мин, что на 49% выше уровня активности протеинкиназы С в цитозольной фракции фибробластов здоровых доноров (6,64 ± 1,23 пмоль пмоль 32Р на пробу за мин) и на 66% (5,03 ± 1,18 пмоль 32Р на пробу за мин) по сравнению с ее уровнем до лечения рибонуклеазой.

Особый интерес в работе представляло изучение состояния и возможной динамики активности протеинкиназы С, характеризующей состояние полифосфоинозитидной системы вторичных посредников трансдукции внешнего сигнала в клетку. Большой интерес представляет эта система в связи с тем, что она предполагается многими авторами ведущей в промоции опухолевого роста, активации гиперпролиферативного процесса (Castagna et al., 1982, 1991; Couturier et al., 1984; Fujiki et al., 1989). Так как псориаз сопровождается высокой скоростью пролиферации клеток кожи, этот процесс может быть характерен и для этого дерматоза. В покоящихся клетках количественное содержание фермента в цитозоле оценивается в 80 — 90%. После стимуляции рецепторов и образования диацилглицери-на содержание протеинкиназы С в цитозоле снижается в 2 — 3 раза (Farbo et al., 1985; Craven, DeRubertis, 1987; Fisher et al.,

1993). Немногочисленные работы по изучению состояния по-лифосфоинозитидной системы вторичных посредников в фиб-робластах кожи больных псориазом показывали, что активность этого фермента снижена в цитозольной фракции, а большая часть всего количества фермента транслоцирована в мембранные структуры, что характерно для высоко пролиферирующих тканей (Brion et al., 1986; Spader et al., 1989; Bergers et al., 1990; Eedy et al., 1990; Griffiths et al., 1990; Raynaud et al., 1991). Активация аденилатциклазной и полифосфоинозитидной систем вторичных посредников передачи внешнего сигнала в клетку при пролиферации клеток является всеобщей патофизиологической закономерностью для всех клеток и тканей.

По сравнению со здоровыми людьми в видимо здоровой коже больных псориазом в цитозольной фракции активность протеинкиназы С оказалась снижена до 60,5% (6,088 ± 0,78 пмоль 32Р на пробу за мин), т.е. можно предполагать, что про-теинкиназа С в результате активации полифосфоинозитидной системы транслоцирована в мембраны. В мебранной же фракции фибробластов из видимо здоровой кожи больных псориазом она повышена до 18,705 ± 0,78 пмоль 32Р на пробу за мин, что более, чем в 3 раза превышает аналогичный показатель здоровых лиц. Это может свидетельствовать, что патологический процесс при псориазе не ограничивается только пораженной кожей, но и в видимо здоровой коже также имеется значительное повышение функциональной активности клеток.

Более выраженные изменения активности протеинкиназы С зафиксированы в псориатической папуле. Здесь активность протеинкиназы С сравнима с аналогичным показателем у здоровых лиц (99,8%). Но в то же время резко (до 26,73 ± 0,78 пмоль 32Р на пробу за мин), что составило 461% от показателя здоровых лиц, повышена активность протеинкиназы С в мембранной фракции. Это полностью согласуется с данными литературы, что при активации под действием внешнего сигнала полифосфоинозитидной системы вторичных посредников происходит транслокация протеинкиназы С в мембранные структуры клетки, активизируя фосфорилирование важнейших для процесса пролиферации белков. Повторные исследования мы проводили сразу же по окончании лечения и исследовали толь-

ко пораженную псориазом кожу. По окончании лечения активность протеинкиназы С в цитозольной фракции значительно повышалась. Показатель активности в цитозольной фракции составил 9,89 ± 1,44 пмоль 32Р на пробу за мин- (159% от аналогичного показателя здоровых доноров), т.е. увеличился почти на 60% от первоначального уровня. Наиболее значительное снижение протеинкиназы С произошло в мембранной фракции — до 16,71 ± 5,43 пмоль 32Р на пробу за мин (почти в 1,6 раза). Однако этот показатель все-таки превышал нормальные показатели почти в 3 раза. По-видимому, если биоптаты забирались бы поздней, то результат снижения был бы еще более значительным.

Таким образом, исследуя аденилатциклазную и лолифос-фоинозитидную системы вторичных посредников передачи внешнего сигнала в клетку до и после лечения рибонуклеазой, мы зафиксировали снижение их активности в мембранных фракциях фибробластов и увеличение активности в цитозоль-ных фракциях, а значит и снижение гиперпролиферативного процесса в клетке.

Результаты лечения рибонуклеазой сравнивали с группами лиц, получавших традиционную терапию (витамины, наружная терапия), лечившихся метотрексатом и получавших плацебо. В группе плацебо на фоне терапии наблюдался эффект, но в ближайшее после лечения время отмечалось обострение. Сравнивая средние сроки ремиссии в группах больных, отмечается достоверное увеличение средних сроков ремиссии при лечении рибонуклеазой (19,0 ± 2,0 мес) по сравнению с больными, получавшими метотрексат (6,0 ± 0,6 мес) и больными, лечившимися традиционными средствами (4,5 ± 0,4 мес).

О точном механизме действия препарата при псориазе в настоящее время говорить не представляется возможным. Могут предполагаться следующие пути:

1) воздействие на РНК вирусов в стадии до встраивания его в геном клетки человека;

2) заместительная терапия недостаточной активности в коже рибонуклеазы и влияние этой коррекции на пролиферацию и дифференцировку клеток эпидермиса;

3) влияние на мембранные рецепторы или на аденилатцик-

лазную и полифосфоинозитидную системы вторичных посредников передачи внешнего сигнала в клетку.

ВЫВОДЫ

1. У больных псориазом в видимо здоровой коже и особенно в псориатических папулах снижена активность протеинки-наз А и С в цитозольных фракциях и резко повышена (в 4,6 раза) активность протеинкиназы С в мембранных фракциях фибробластов по сравнению с показателями здоровых доноров, что свидетельствует о резкой активации полифосфоино-зитидной системы вторичных посредников трансдукции внешнего сигнала в клетку и может являться одним из патофизиологических механизмов, способствующих увеличению клеточной пролиферации.

2. К 10 дню лечения рибонуклеазой происходит увеличение активности протеинкиназ А и С в цитозольных фракциях в 1,7 и 1,4 раза соответственно и снижение активности протеинкиназы С в мембранных фракциях в 1,6 раза, что сопровождается положительной клинической динамикой (частичным или полным разрешением изменений на коже).

3. К концу лечения рибонуклеазой в очагах пораженной кожи хотя и сохраняются патологические отклонения в содержании циклических нуклеотидов, однако у больных достоверно повышается уровень цАМФ, снижается митотическая активность клеток эпидермиса и уменьшается число метафаз.

4. Рибонуклеаза при псориазе обладает отчетливым терапевтическим действием и у 80,9% больных дает положительные результаты. Терапевтический эффект в большей степени выражен при обычной форме псориаза, сопровождающейся мелкими диссеминированными элементами с умеренной инфильтрацией и сроками давности дерматоза не более 2 лет.

5. В отдаленном периоде у 34% больных сохраняется клиническая ремиссия, а возникающие ослабленные рецидивы относительно быстро купируются обычными методами терапии.

6. Рибонуклеаза как терапевтическое средство может быть рекомендована в качестве одного из методов лечения больных

псориазом в условиях дерматологического стационара.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Опыт применения рибонуклеазы в терапии псориаза // Современные вопросы дерматологии и венерологии: Научные труды Новосибирского мед. ин-та — Новосибирск. — 1993. — Т. 145. — С. 30 — 35. (Соавт. — Б.Н.Кривошеев и др.).

2. Рибонуклеаза в комплексной терапии псориаза // Новые методы диагностики, лечения и профилактики заболеваний: Тезисы докл. 3-й научно-практич. конф. врачей. — Новосибирск. - 1993. - С. 271 - 273.

3. Применение геля полиэтиленоксида с рибонуклеазой в комплексной терапии псориаза // Тезисы докл. 54-й итоговой научной конф. студентов и молодых ученых. — Новосибирск, 1994. -С. 12 — 73.

4. Динамика активности протеинкиназы С в цитозоле фиб-робластов кожи больных псориазом до и после лечения рибонуклеазой // Актуальные вопросы современной медицины: Тезисы докл. 4-й научно-практич. конф. врачей. — Новосибирск, 1994. - С. 145 - 147.

5. Клинические особенности псориаза в Новосибирской области // Региональная патология кожи в Сибири: Научные труды НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН. - Новосибирск, 1995. - С. 16 - 20. (Соавт. Ю.М.Кри-ницына и др.).

6. Изучение адснилатциклазной и полифосфоинозитидной систем вторичных посредников фибробластов кожи больных псориазом до и после лечения рибонуклеазой // Там же. — С. 20 — 25. (Соавт. О.М.Сидоркина и др.).

7. Динамика активности протеинкиназы С в фибробластах кожи больных псориазом в процессе лечения рибонуклеазой // Тезисы докл. научной сессии сотрудников НМИ. — Новоси-

бирск, 1995. — Т. 1. — С. 125 - 125.

8. Распространенность псориаза среди населения различных районов г. Новосибирска // Актуальные воросы современной медхщины. Тезисы докл. 6-й научно-практич. конф. врачей. — Новосибирск, 1996. — С. 453 — 453. (Соавт. Ю.М.Кри-ницына).

Подписано в печать 29.03.96. Формат бумага 60 x 84/16. Усл. печ. л. 1,0. Заказ № 56. Тираж 100 экз. Оригинал-макет подготовлен в редакцион-но-издательском отделе НИИ региональной патологии и патоморфо-логаи СО РАМН. Редактор-корректор Г.Мезенцева.

Типография СО РАМН, 1996 г.

630117 Новосибирск, ул. Акад. Тимакова, 2

Соискатель

М.Н.Ермаков