Автореферат и диссертация по медицине (14.01.08) на тему:Динамика активности матриксных металлопротеиназ и маркеров апоптоза при рассеянном склерозе у детей.

На правах рукописи

005531247

Шатилова Надежда Николаевна

ДИНАМИКА АКТИВНОСТИ МАТРИКСНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ И МАРКЕРОВ АПОПТОЗА ПРИ РАССЕЯННОМ СКЛЕРОЗЕ У ДЕТЕЙ

14.01.08 — Педиатрия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- Ї июл ¿013

Москва 2013

005531247

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр здоровья детей» РАМН.

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор Людмила Михайловна Кузенкова Доктор медицинских наук, профессор Иван Евгеньевич Смирнов

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор, Ольга Ивановна Маслова

заведующая отделом психоэмоциональной разгрузки, когнитивной поддержки и коррекционно-восстановительной помощи НИИ ПИ и ВЛ ФГБУ «НЦЗД» РАМН

Доктор медицинских наук, профессор Ирина Николаевна Захарова

заведующая кафедрой педиатрии,

ГБОУ ДПО «Российская медицинская

академия последипломного образования»

Минздрава России.

Ведущая организация: ГБУЗ МО МОНИКИ Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского

Защита диссертации состоится «9» июля 2013 года в «15.00» часов на заседании диссертационного совета Д 001.023.01 при ФГБУ «Научный центр здоровья детей» РАМН по адресу: 119991, г. Москва, Ломоносовский проспект, д. 2, стр.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научный центр здоровья детей» РАМН по адресу: 119991, г. Москва, Ломоносовский проспект, д. 2, стр.1.

Автореферат разослан « »_2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат медицинских наук А. Г. Тимофеева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Рассеянный склероз (РС) - хроническое прогрессирующее заболевание центральной нервной системы аутоиммунной природы, характеризующееся демиелинизацией и дегенерацией нервного волокна с полиморфной клинической картиной (Гусев Е.И., 2004). В последние годы установлено, что заболевание манифестирует в детском и подростковом возрасте у 2-10% больных, что ставит РС в перечень важных проблем детской неврологии (Бойко А.Н., 2009; Ness J.M., 2007). Выявленные варианты демиелинизации при РС - от преобладания воспалительных реакций до олигодендроглиоиатии и аномальной ремиелинизации, а также доказательства аксонального повреждения не только в активных очагах, но и во внешне не измененном белом веществе, сблизили РС с дегенеративными заболеваниями ЦНС (Завалишин И.А. и соавт.,2009).

Несмотря на разнонаправленные исследования, изучение различных аспектов РС остается актуальной проблемой, медицинская и социальная значимость которой обусловлена нарастающей заболеваемостью лиц молодого возраста, возможностью быстрого развития стойкой инвалидизации при недостаточной эффективности терапевтических средств. До сих пор анализ течения РС у детей сводится к описанию отдельных клинических случаев заболевания и только единичные публикации содержат информацию о более чем 100 больных (Ghezzi А., 2002, Gusev E.I., 2004).

На фоне значительных достижений в области инструментальной диагностики и лечения РС показатели нейрохимического статуса и влияния терапии препаратами, изменяющими течение РС - интерферонами-(3 1а (ИНФ- р 1а), на них у детей с РС, освещены все еще недостаточно (Yeh Е. А., 2012; Chitnis Т.,2013).

Отсутствуют данные о патогенетической значимости процессов апоптоза в формированиям дегенеративных изменений в ЦНС при PC у детей (Prineas J.W., 2012, Reichardt Н.М., 2012).

Недостаточно публикаций о проведении комплексных исследований больных с педиатрическим PC, в которых бы содержался анализ взаимосвязи клинической картины заболевания, данных нейровизуализации и иммунохимических показателей, что позволило бы на патофизиологическом уровне оценить процессы воспаления, демиелинизации и нейродегенерации, лежащие в основе заболевания с учетом его стадийности и длительности.

Значительный опыт исследований различных аспектов PC, а также современные методы лабораторно-инструментальной диагностики, имеющиеся в распоряжении ФГБУ «НЦЗД» РАМН, позволяют продолжить комплексное изучение этой тяжелой хронической демиелинизирующей патологии ЦНС в детском возрасте, включая, в том числе, нейроиммунологическую направленность научного поиска.

Таким образом, научное и практическое значение представляет оценка патофизиологических показателей у детей с PC в зависимости от характера течения болезни и её длительности с учетом терапии препаратами, изменяющими течение PC ИНФ-р 1а, что определило актуальность и своевременность выполнения данной работы, позволив сформулировать следующие цель и задачи исследования.

Цель исследования

Установить закономерности изменений матриксных металлопротеиназ (ММП), цитокинов и факторов апоптоза в сыворотке крови детей с ремиттирующим рассеянным склерозом (РРС) для оптимизации диагностики и оценки эффективности лечения.

Задачи исследования

1. Оценить клинические особенности дебюта и экзацербации PPC у детей.

2. Определить уровни ММП 9,8,3, тканевого ингибитора металлопротеиназ 1 (ТИМП 1), трансформирующего ростового фактора

(ТРФ Р) и фактора некроза опухоли-альфа (ФНО а) в сыворотке крови детей с РРС при разных стадиях болезни.

3. Оценить влияние терапии препаратами изменяющими течение PC -ИНФ - pía на уровни ММП 9,8,3 в сыворотке крови детей с РРС.

4. Определить уровни ТРФ-Р в сыворотке крови детей с РРС и выявить закономерности их изменений при разных стадиях болезни.

5. Определить уровни маркеров апоптоза (аннексии V, цитохром С, Fas-лиганд (Fas-L), Fas- рецептор (sAPO-1/Fas), оксид азота) в сыворотке крови детей с РРС и выявить зависимость их изменений от стадии и длительности болезни.

Научная новизна

Впервые в России проведено комплексное обследование большой группы детей с документированным РРС с применением клинических, инструментальных (магнитно-резонансная томография (МРТ) и лабораторных методов (исследование уровней биологически активных субстанций - ММП 9,8,3, ТИМП-1, ТРФ-pi, ФНОа, аннексии V, цитохром С, Fas-L, sAPO-1/Fas, оксида азота.

Впервые установлены закономерности изменений продукции ММП 9,8,3, ТИМП 1, ТРФ-Р и ФНОа в сыворотке крови детей с РРС. Доказано, что степень повышения уровней этих биологически активных соединений зависит от стадии заболевания.

Впервые в педиатрической неврологии выделена фаза субклинического обострения течения РРС у детей, характеризующаяся на нейрохимическом уровне выраженным увеличением продукции ММП и повышением в крови содержания провоспалительных цитокинов при отсутствии значимой клинико-томографической симптоматики, что является возможным предиктором обострения болезни.

Впервые в педиатрическом исследовании на репрезентативной группе пациентов доказано позитивное влияние терапии препаратами изменяющими

течение PC - ИНФ - р la на уровни ММП 9,8,3 в сыворотке крови детей с РРС.

Впервые в детской неврологии проведено исследование маркеров апоптоза (аннексии V, цитохром С, Fas-L, sAPO-1/Fas, метаболитов оксида азота) у детей с РРС, в результате которого установлено статистически значимое повышение факторов апоптоза в сыворотке крови в зависимости от стадии и длительности болезни.

Практическая значимость

Обоснована целесообразность определения уровней ММП 9,8,3 и ТРФ Р в сыворотке крови детей с РРС в качестве предиктора высокого риска развития клинического обострения для оптимизации проводимой терапии, направленной на предотвращение его развития.

Показана необходимость применение препаратов изменяющих течение PC ИНФ р la у детей с РРС с момента установления диагноза, обосновано их длительное и непрерывное применение.

Доказана целесообразность включения в комплексное лечение детей с РРС липотропных и антиоксидантных препаратов на всех стадиях болезни.

Внедрение полученных результатов в практику

Полученные данные об уровнях биологически активных субстанций детей с РРС, используются в работе отделения психоневрологии и психосоматической патологии, а также в отделении восстановительного лечения для детей с заболеваниями нервной системы ФГБУ «НЦЗД» РАМН.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на XVI Конгрессе педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии» с международным участием (Москва, 2012); на XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва,2012); на XVII Съезде педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии» с международным участием (Москва,2013).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ в российских рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобразования для результатов на соискание ученых степеней доктора и кандидата наук

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания объема и методов исследования, 2 главы с изложением результатов собственных исследований, обсуждения результатов работы, выводов, практических рекомендаций, приложения и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 13 таблицами и 29 рисунками. Библиографический указатель содержит 160 литературных источников, из них 60 отечественных и 100 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Работа выполнена в ФГБУ «НЦЗД» РАМН (директор - академик РАН и РАМН, проф. A.A. Баранов) в отделении психоневрологии и психосоматической патологии (зав. - д.м.н., проф. JI.M. Кузенкова) НИИ педиатрии ФГБУ «НЦЗД» РАМН.

Лабораторные исследования были выполнены в лаборатории патофизиологии с блоком радионуклидных исследований (зав.- д.м.н., проф. И.Е. Смирнов) НИИ педиатрии ФГБУ «НЦЗД» РАМН.

Инструментальные исследования проводились в отделе лучевой диагностики (зав. - к.м.н. A.B. Аникин) НИИ профилактической педиатрии и восстановительного лечения ФГБУ «НЦЗД» РАМН (директор - член-корреспондент РАМН, д.м.н., проф. JI.C. Намазова-Баранова).

Под наблюдением находилось 137 детей в возрасте от 8 до 18 лет. Все дети были комплексно обследованы с использованием современных клинических, инструментальных и лабораторных методов. Из них у 122

детей был диагностирован РРС. Референтную группу составили 15 условно здоровых детей того же возраста. Среди больных было 78 (64%) девочек и 44 (36%) мальчика с документированным диагнозом РРС согласно критериям W.I. McDonald и соавт. (в модификации 2005 г. с пересмотром 2011 г.).

У всех обследованных больных наличие очагов демиелинизации определялось при МРТ головного мозга в режимах T-1W, T-2W и FLAIR в 3-х ортогональных проекциях - сагиттальной, коронарной и аксиальной до и после парамагнитного контрастного усиления гадовистом. Эти исследования были проведены на магнитно-резонансном томографе Signa HDX 1,5 Т (GE, США).

У всех обследованных детей в сыворотке крови иммуноферментным методом определяли концентрации ММП 3, 8, 9, TIMP-1, а также ФНОа и ТРФ-ßl с помощью специальных наборов реагентов.

В связи с тем, что в настоящее время актуальна проблема адекватности методологий оценки активности нейродегенеративного процесса при PC (Davydovskaya M.V. et al., 2012), у всех обследованных детей в сыворотке крови определяли концентрации маркеров (Fas-L, sAPO-1/Fas, цитохром С, аннексии V) и регуляторов апоптоза (ФНОа) методом твердофазного энзим-связанного иммуносорбентного анализа (ELISA) с помощью специальных наборов реагентов ("Bender Medsystems"). Для определения в сыворотке крови суммарного содержания нитритов и нитратов, отражающих продукцию оксида азота, как индуктора апоптоза, использовали колориметрический микропланшетный метод. Подсчет оптической плотности в пробах осуществляли на анализаторе иммуноферментных реакций АИФР-Униплан (Россия).

Все полученные данные были обработаны статистически с использованием пакета прикладных программ Statistica-6 (StatSoft Inc., США). При этом статистически значимыми принимались различия с уровнем р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

У всех пациентов с РРС по данным анамнеза и клинической манифестации при госпитализации была оценена симптоматика дебюта заболевания. Моносимптомный дебют РРС отмечался в 32%, полисимптомный - был выявлен в 68% случаев и проявлялся сенсорными расстройствами (45%), нарушением функции глазодвигательных нервов (51%), оптическими невритами (43%), нарушением координации (24%), центральными гемипарезами различной степени выраженности (2%).

Для экзацербации РРС у детей было характерно наличие полиморфной неврологической симптоматики (78%), головной боли (52%), сопровождающейся тошнотой и рвотой (18%). Неврологические проявления обострения заболевания были сопоставимы с основными клиническими симптомами дебюта.

Для оценки показателей динамики ММП, цитокинов и маркеров апоптоза, согласно данным клинико-нейровизуализационной картины, все больные с РРС были распределены на три группы в зависимости от стадии болезни.

Первую группу составили 64 больных РРС в стадии обострения, из них было 46 (72%) девочек и 18 (28%) мальчиков. Неврологическая симптоматика у больных этой группы характеризовалась следующими проявлениями: нарушениями черепной иннервации в форме поражения глазодвигательных нервов у 45 (70%) больных, из них диплопия была выявлена у 20 детей (44%), оптические невриты - у 21 ребенка (47%), нистагм у 4 (10%); чувствительными нарушениями в форме гипестезии, парестезии у 32 больных (50%); двигательными расстройствами в форме гемипарезов у 22 детей (49 %); координаторными нарушениями в форме статической и динамической атаксии у 14 больных (22 %); тазовыми нарушениями у 2 детей (3%); головной болью у 37 больных (53%), локализованной преимущественно в лобно-височных областях, сопровождающейся тошнотой и рвотой у 11 детей (18%>). Важно отметить,

что в 78% наблюдений неврологическая симптоматика носила сочетанный характер. У больных этой группы при МРТ головного и спинного мозга с внутривенным контрастированием было установлено наличие новых контрастпозитивных очагов раздельно в головном мозге (28%) и спинном мозге (8%); появление новых контастнегативных очагов одновременно в головном и спинном мозге (44%) и отдельно в спинном мозге (8%); отсутствие значимой динамики по данным МРТ головного и спинного мозга (5%), положительная динамика в виде уменьшения контрастпозитивных очагов в головном и спинном мозге (3%).

Вторую группу составили 45 больных РРС в стадии ремиссии, из них было 25 (55%) девочек и 20 (45%) мальчиков. У этих больных отсутствовал неврологический дефицит и при проведении МРТ головного и спинного мозга с контрастированием очаговое поражение носило контрастнегативный характер. В этой группе в зависимости от получаемого препарата ИНФ-Р 1а были выделены следующие подгруппы: подгруппа 2а- 10 детей, получавших авонекс 30 мкг (6 млн. ME) х 1 раз в неделю в/м; подгруппа 2Ь - 14 подростков, получавших ребиф 22 мкг (6 млн. ME) х 3 раз в неделю п/к; подгруппа 2с - 11 детей, получавших ребиф 44 мкг (12 млн. ME х 3 раз в неделю п/к; подгруппа 2d - 10 подростков, не получавших лечения препаратами ИНФ-Р 1а.

Третью группу составили 13 больных РРС в стадии субклинического обострения, из них - 7 девочек (54%) и 6 мальчиков (46%). У детей этой группы была выявлена выраженная клинико-томографическая диссоциация симптоматики, которая в течение ближайших 30-45 дней проявилась как рецидив (экзацербация) заболевания. У этих детей при проведении МРТ определялись очаги (нередко множественные, вновь возникшие) накопления контрастного вещества по типу кольцо/полукольцо, что свидетельствовало о прогрессировании РРС, однако при оценке неврологического статуса клинически выраженный неврологический дефицит у них отсутствовал или

выражался отдельными разрозненными симптомами, не указывающими на очаговое поражение центральной нервной системы.

Наличие нейровизуализационных изменений у этих больных в сочетании с особенностями клинической картины и данными катамнеза позволяет полагать, что это состояние является промежуточной фазой между стабилизацией патологического процесса и назревающей клинической атакой РРС.

В зависимости от длительности течения РРС дети были распределены на 4 подгруппы: подгруппу А составил 21 больной с длительностью течения болезни до 12 мес.; подгруппу В - 34 ребенка с длительностью болезни от 12 до 24 мес.; подгруппу С - 30 детей с длительностью болезни от 24 до 36 мес.; подгруппу D — 37 пациентов с длительностью заболевания более 36 месяцев.

Проведенные исследования показали, что у детей с РРС выявлялись характерные изменения уровней ММП, ТИМП-1 и цитокинов в сыворотке крови, причем спектр этих изменений и их степень различались в зависимости от стадии заболевания и его продолжительности. (Рис.1). Было выявлено наиболее выраженное увеличение продукции ММП при обострении РРС. Именно в этой стадии заболевания отмечалось достоверное изменение максимального числа следующих параметров (р<0,05): уровней ММП-9, ММП-3 и ММП-8, соотношения ММП-9/ТИМП-1, которые превышали не только референтные значения, но и аналогичные показатели при ремиссии РРС. Полученные данные свидетельствуют об избыточной продукции ММП при обострении заболевания, увеличении вследствие этого проницаемости ГЭБ для аутоагрессивных лимфоцитов, которые запускают каскад нейрохимических реакций, приводящих к усилению повреждения миелиновой оболочки, формированию новых очагов поражения нервной ткани и появлению клинически значимой неврологической симптоматики.

При ремиссии РРС была установлена общая тенденция к снижению уровней ММП и ТИМП-1 в сыворотке крови по сравнению со стадией

обострения заболевания, однако сохранялось достоверное повышение их концентраций по сравнению с референтной группой.

Таким образом, в стадии ремиссии РРС даже на фоне ютинико-томографического благополучия сохранялись высокие уровни биологически активных субстанций ММП 3,8,9, что свидетельствует о продолжающемся течении заболевания.

Изменения уровней ММП в сыворотке крови отмечались также и у больных, выделенных в ходе исследования в группу субклинического обострения РРС (группа 3). У больных этой группы, уровни ММП-8 и ММП-3 были сопоставимы с показателями у детей с обострением РРС, тогда как уровень ММП-9 существенно не отличался от такового у пациентов находящихся в ремиссии РРС. Наличие подобных изменений параметров внутриклеточного матрикса (ВКМ) у больных с субклиническим обострением РРС свидетельствует о назревании срыва компенсации болезни, формировании морфологических субстратов и как следствие развитии очередной клинической атаки болезни.

Рис. 1. Изменения уровней ММП- 3,8,9 в сыворотке крови детей и подростков с РРС в зависимости от стадии болезни

Установленные нами изменения продукции ММП у больных РРС являются свидетельством участия этих соединений в изменении

проницаемости ГЭБ, что способствует инвазии в нервную ткань аутоагрессивных лимфоцитов и повышенному образованию провоспалительных цитокинов и их рецепторов (Cauwe В. et. al. 2010).

Анализ изменений сывороточных уровней ММП у детей с РРС, получавших лечение препаратами ИНФ-pia и без него, показал, что применение такой терапии сопровождалось существенным уменьшением содержания ММП-9 (более чем в 2 раза) и нормализацией содержания ТИМП-1, что способствовало уменьшению активности патологического процесса (рис.2). На это указывает также отмеченная нами повышенная экспрессия ТРФ-pi, как основного противовоспалительного и иммуносупрессивного цитокина у детей с ремиссией РРС.

референтная группа аоонексЗО ребиф22(66 ребиф44

группа сравнения мкг/нед мкг/нед) (132 мкг/нед) (без терапии ИНФР1а)

■ ММП 9

■ ММП 8

ММЛЗ

■ ФИО а

■ ТРФ (3

Рис. 2. Содержание ММП, цитокинов в сыворотке крови больных с РРС в зависимости от проводимой терапии

Достоверное повышение уровней ММП-9, ММП-8 и ММП-3 у детей с РРС, указывает на их влияние на проницаемость ГЭБ, в результате чего происходит миграция активированных Т-лимфоцитов в паренхиму мозга, они вырабатывают в избытке провоспалительные цитокины — у-интерферон, ФНО-а, ИЛ-1, 2, 6 активирующие В-лимфоциты и последние начинают синтезировать противомиелиновые антитела, которые формируют очаг воспалительной демиелинизации. Нарушение баланса в системе цитокинов

вызывает неконтролируемую активацию «запрещенных» клонов лимфоцитов, сенсибилизированных к антигенам миелина, что приводит к срыву толерантности и усугублению аутоиммунных реакций (Кулакова О.Г., 2004; Opdenakker G.,2011).

Согласно данным, полученным при исследовании взрослых пациентов с РРС наиболее информативным показателем развития воспаления в ЦНС при РРС является ФНОа (Boz С.,2006; Vilalta А.,2010), что и обусловило целесообразность его оценки в нашей работе. Установлено, что уровень ФНОа в сыворотке крови пациентов с РРС вне зависимости от стадии заболевания существенно превышал аналогичный показатель у детей референтной группы, то есть отмечалась высокая активность этого фактора на всем протяжении болезни (рис.3).

■1

референтная ремиссия РРС субклиническое обострение РРС группа обострение РРС

Рис. 3. Изменения уровней ФНОа в сыворотке крови пациентов с РРС в зависимости от стадии заболевания

Кроме того, ранее было показано, что повышение содержания в сыворотке крови взрослых больных РРС противовоспалительного фактора -белка ТФР-fSl, контролирующего пролиферацию, клеточную дифференцировку и другие функции в большинстве клеток можно рассматривать как один из маркеров ремиелинизации нервной ткани (Mirshafiey A. et al.,2009). В нашем исследовании уровни этого цитокина в крови детей с РРС вне зависимости от стадии болезни достоверно (р<0,05)

превышали аналогичные показатели у детей референтной группы. Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о значимости баланса про- и противовоспалительных цитокинов в течении болезни. Очевидно, что регуляторные механизмы, обеспечивающие этот баланс, а также своевременную супрессию иммунного ответа, оказываются несостоятельными при РРС у детей.

Поскольку ФНОа имеет в патогенезе PC особое значение, выражающееся в индуции (частично вместе с ИФНу) синтеза других цитокинов, метаболитов арахидоновой кислоты, кислородных радикалов и оксида азота, которые активируют клетки эндотелия и способствуют повышению миграции лейкоцитов, его роль в процессах апоптоза велика. Помимо этого, ФНОа поддерживает апоптоз Т-клеток и олигодендроцитов, что в свою очередь тормозит процессы ремиелинизации и обусловливает повреждение миелина.

Динамика маркеров апоптоза в сыворотке крови детей и подростков с РРС в зависимости от стадии заболевания, важная, но недостаточно изученная проблема.

В результате проведенного нами анализа была установлена достоверная зависимость уровней таких маркеров апоптоза как Fas-L, sAPO-1/Fas, аннексии V, цитохром С и оксид азота от стадии заболевания. Данная зависимость выражалась статистически значимым повышением показателей sAPO-1/Fas, аннексина V, оксид азота в стадии обострения РРС относительно группы пациентов, находящихся в ремиссии заболевания. Особо значимо повышались Fas-L, аннексии V, цитохром С, в стадии субклинического обострения, причем, исследованные параметры существенно повышались как по отношению к группе пациентов находящихся в ремиссии РРС, так и по отношении к группе больных с обострением болезни.

Полученные результаты позволяют полагать, что в период ремиссии РРС имеет место «деградационная» фаза апоптоза, когда происходит разрушение клетки, ее распад на отдельные апоптотические тельца и их достаточно

быстрая асиммиляция макрофагами и, реже, соседними клетками. При этом воспалительная реакция ЦНС не развивается, и, следовательно, не фиксируются специфические воспалительные изменения на МРТ головного и спинного мозга и не возникает клинически значимый неврологический дефицит.

Таким образом, обобщив полученные результаты, их можно представить в виде каскада следующих реакций: механизмы повреждения нервной ткани при PC включают иммуновоспалительную демиелинизацию с олигодендропатий и постепенно нарастающую нейродегенерацию. Эти явления связаны с нарушениями проницаемости ГЭБ и активным проникновением в ткань мозга Т-лимфоцитов, сенсибилизированных к антигенам миелина. Т-лимфоциты под действием ряда факторов активируются, пролиферируют и включают эффекторные реакции, повреждающие миелин и аксоны. В результате активации Т-лимфоциты (CD4+) становятся аутоагрессивными. На следующей стадии происходит проникновение С04+-Т-клеток в ЦНС через поврежденный ГЭБ, набухание Т-клеток и прикрепление их к эндотелиальным клеткам сосудов. Т-клетки инфильтрируют эндотелиоциты и секретируют ферменты - ММП, обеспечивающие проникновение Т-лимфоцитов в ЦНС. Активация CD4+-T-клеток происходит на фоне одновременного снижения супрессорной активности субпопуляции СВ8*-Т-клеток, нарушения В-клеточной толерантности, что ведет к нарастанию титра аутоантител к структурам миелина и олигодендроглии. Проникнув в ЦНС, Т-клетки, уже активированные по отношению к аутоантигену, взаимодействуют с антигенпрезентирующими клетками, в роли которых выступают периваскулярные макрофаги и микроглия. Аутоантигенами в ЦНС являются белки миелина: основной белок миелина, протеолипидный протеин, миелинолигодендроцитарный гликопротеин. Активированные Т-клетки, макрофаги и микроглия продуцируют провоспалительные цитокины: у-интерферон, ФНОа, ИЛ-2 и др. Воспалительные процессы ведут к разрыву

миелиновой оболочки. В результате дальнейшей активации патологического процесса прогрессирует демиелинизация и гибель олигодендроцитов, усиливаются глиотоксические факторы, происходит накопление свободнорадикальных соединений и медиаторов воспаления (Гусев Е.И.,2009; Rosenberg G.,2009). В ходе проведенного исследования нами было установлено, что уровень противовоспалительного цитокина ТРФ- pi компенсаторно повышается на всех стадиях заболевания, однако своего наивысшего значения он достигает при субклиническом обострении РРС. Данная закономерность свидетельствует о максимальной вовлеченности противовоспалительных факторов в процессы блокирования обострения заболевания на этапе субклинического обострения, и, следовательно, ТРФ-Р1 может рассматриваться как предиктор начала срыва ремиссии РРС. Параллельно с описанным каскадом запускается ещё одна патологическая цепочка: провоспалительный цитокин ФНОа, играющий важную роль в регуляции межклеточного взаимодействия, индуцирует апоптоз - его рецептор-зависимый сигнальный путь, запускаемый при воздействии неблагоприятных факторов на рецепторы, которые представляют собой экспрессированные на поверхность мембраны клетки белки, относящиеся к семейству рецепторов ФНОа. Наиболее известными рецепторами клеточной смерти являются Fas-L sAPO-1/Fas. При этом нами было установлено, что увеличение уровней маркеров апоптоза в сыворотке крови, в частности отвечающих за его внешний путь: sAPO-l/Fas, Fas-L и аннексина V, было наиболее выраженным при субклиническом обострении РРС. Это проявлялось значимым повышением их уровней не только в сравнении со стадией ремиссии заболевания, но и в сравнении со стадией клинического обострения РРС (рис. 4).

L 1.1 L- Ll

обострение субклиническое ремиссиия обострение

референтная группа

i Fas-лигэнд s sAPO-1/Fas Аннексии V я Цитохром С Оксид азота

Рис. 4. Изменения уровней маркеров апоптоза в сыворотке крови пациентов с РРС в зависимости от стадии заболевания

Одновременно с активацией внешнего пути происходит активация и митохондриального пути апоптоза, что проявляется усилением выработки цитохрома С и оксида азота. В частности, Oliveira S. et al (2012) показали, что механизм цитотоксического действия оксида азота связан с его повреждающим действием на митохондрии с образованием супероксидных радикалов, которые в совокупности с другими цитотоксическими факторами вызывают гибель части нейронов, что обусловливают возникновение неврологического дефицита различной степени выраженности. Нами было установлено, что у всех пациентов с РРС имеет место значимое повышение сывороточного уровня оксида азота по сравнению с показателями референтной группы. Стадия обострения РРС у обследованных больных характеризовалась максимальным увеличением продукции оксида азота, что может быть обусловлено максимальной выраженностью воспалительных процессов в ЦНС.

Сохраняющиеся при ремиссии РРС достоверное (р<0,05) по сравнению с показателями референтной группы повышение сывороточных уровней факторов апоптоза как внешнего, так и митохондриального пути обусловлено

продолжающейся программированной гибелью поврежденных олигодендроцитов. (рис. 5)

=1

У

|

л À /1 А dil Es! с 4

до 12 12-24 24-36 более 36 референтная

месяцев месяцев месяцев месяцев группа

п Fas-лиганд

□ sAPO-1/Fas

□ Аннексии V

□ Цитохром С ■ Оксид азота

Рис.5. Изменения уровней маркеров апоптоза в сыворотке крови пациентов с РРС в зависимости от длительности заболевания

Анализ изменений уровней маркеров апоптоза с учетом продолжительности болезни, позволяет заключить, что у детей с РРС нарушения апоптоза проявляются уже в первые месяцы заболевания и неуклонно нарастают по мере его прогрессирования. Данный факт подтверждается значимым по сравнению с показателями референтной группы повышением уровней sAPO-1/Fas и аннексина V в сыворотке крови больных с продолжительностью заболевания до 12 месяцев. При длительности течения РРС от 2-х лет и более происходит усиление активации обоих путей ПГК, о чем уже свидетельствует достоверно повышенные (р<0,05) концентраций не только Fas-L, sAPO-1/Fas, но и аннексина V, и цитохрома С. Своего максимального значения вышеуказанные показатели достигают при продолжительности заболевания более 3-х лет существенно превышая (р<0,05) уровни sAPO-1/Fas, аннексина V, Fas-L и цитохрома С с референтной группы, а также групп с меньшим стажем болезни.

Повышение уровней Fas-L, sAPO-1/Fas, аннексина V и цитохрома С в сыворотке крови детей и подростков с РРС дает основание заключить, что PC является нейродегенеративным заболеванием, связанным с патологически выраженным усилением апоптоза. Пропорциональное длительности течения РРС повышение уровней факторов апоптоза вызывает торможение ремиелинизации, и как следствие, постепенное преобладание процессов дегенерации над процессами восстановления миелина, что обусловливает прогрессирование заболевания и нарастание необратимого неврологического дефицита.

Выводы

1. Моносимптомный дебют РРС у детей выявляется в 32% наблюдений, полисимптомный дебют диагностируется в 68% случаев и проявляется сенсорными расстройствами (45%), нарушением функции глазодвигательных нервов (51%), оптическими невритами (43%), нарушением координации (24%), центральными гемипарезами различной степени выраженности (2%).

2. Для экзацербации РРС у детей характерно наличие полиморфной неврологической симптоматики (78%). Неврологические проявления обострения заболевания в виде сенсорных расстройств (37%), нарушений функции глазодвигательных нервов (35%), оптических невритов (40%) и нарушений координации (28%) сопоставимы с основными клиническими симптомами дебюта.

3. У детей с РРС имеет место статистически значимое (р<0,05) по сравнению с референтной группой повышение уровней ММП 3,8,9 и ТИМП 1 в сыворотке крови. Степень выраженности этих изменений различна в зависимости от стадии болезни. При экзацербации уровни изученных соединений достоверно (р<0,05) превышают аналогичные при ремиссии РРС, что обуславливает увеличение проницаемости ГЭБ

для аутоагрессивных лимфоцитов, запускающих каскад патологических реакций.

Содержание патогенетических значимых цитокинов - ФНОа и трансформирующего ростового фактора р в сыворотке крови детей с РРС существенно увеличивается при всех стадиях заболевания. Максимальные значения ТРФ pi (40,37±2,33 нг/мл) у пациентов с субклиническим обострением болезни свидетельствует о его вовлеченности в механизмы предотвращения развития экзацербации. Субклиническое обострение PPC у детей характеризуется отсутствием неврологической симптоматики, наличием активных очагов воспаления в центральной нервной системе по данным нейровизуализации и проявляется выраженным повышением содержания ММП 3 (9,37±1,63 нг/мл), ММП 8 (28,11±3,23 нг/мл) и ТРФ pi (40,37±2,33 нг/мл) в сыворотке крови по сравнению с их уровнями при ремиссии болезни. Совокупность выявленных нейровизуализационных и

иммунохимических изменений необходимо рассматривать как предиктор начала срыва ремиссии заболевания.

У детей с РРС отмечается статистически значимое повышение уровней маркеров апоптоза (аннексии V, цитохром С, Fas-L, sAPO-1/Fas, оксид азота) в сыворотке крови, максимально выраженное при субклиническом обострении заболевания, что является свидетельством участия механизмов апоптоза в формировании очагов демиелинизации в центральной нервной системы и последующем развитии экзацербации болезни.

У детей с РРС установлена прямая зависимость уровней маркеров апоптоза в сыворотке крови (аннексии V, цитохром С, Fas-L, sAPO-1/Fas, оксид азота) от длительности заболевания, которые достигают максимальных значений при продолжительности заболевания более 3 лет, достоверно превышая аналогичные показатели у пациентов с меньшим стажем болезни.

8. У детей с РРС установлена обратная корреляция между уровнями ММП 3,8,9 в сыворотке крови и терапией препаратами изменяющими течение PC ИНФ - р 1а.

9. Выявленные закономерности изменений сывороточных уровней ММП и цитокинов от характера течения РРС позволяют использовать их в качестве дополнительных биомаркеров степени активности течения болезни и оценки эффективности проводимой терапии.

Практические рекомендации

1. Рекомендуется использовать определение уровней ММП 9,8,3 и ТРФ Р в сыворотке крови детей с РРС в качестве предикторов высокого риска развития клинического обострения для оптимизации проводимой терапии, направленной на предотвращение его развития.

2. Применение препаратов изменяющих течение PC - ИНФ Р la у детей и подростков с РРС должно быть начато как моясно раньше от момента установления диагноза и быть длительным и непрерывным.

3. Патогенетическая роль оксидантного стресса с высоким уровнем метаболитов оксида азота в сыворотке крови детей и подростков с РРС в стадии обострения обусловливает необходимость включения в комплексное лечение болезни липотропных и антиоксидантных препаратов.

4. Комплексное исследование неврологического и соматического статуса детей, страдающих РРС, в сочетании с определением сывороточных уровней ММП, их ингибиторов и цитокинов дополняют диагностические критерии определения активности болезни и могут быть рекомендованы к использованию в специализированных отделениях.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Быкова О.В., Платонова А.Н., Шатилова H.H., Аникин A.B., Кузенкова Л.М. Клинически изолированный синдром у детей и подростков -факторы риска рассеянного склероза и перспективы применения внутримышечного интерферона бета 1а. Педиатрическая фармакология. 2010; 7(3): 91-94.

2. Смирнов И.Е., Кучеренко А.Г., Шатилова H.H., Кузенкова JIM. Матриксные металлопротеиназы при рассеянном склерозе у детей. Российский педиатрический журнал. 2012; 4: 4-9.

3. Студеникин В.М. Пак JI.A., Шелковский В.,И., Кузенкова JI.M.., Турсунхужаева С.Ш., Гутнов С.Р., Шатилова H.H. Педиатрический рассеянный склероз: что нового? Лечащий врач. 2012; 9: 30-33.

4. Студеникин В.М., Турсунхужаева С.Ш., Шелковский В.И., Шатилова H.H., Пак Л.А., Звонкова Н.Г. Нейродиетология и рассеянный склероз: новые данные // Вопросы детской диетологии. 2012; 10 (1): 27-32.

5. Смирнов И.Е., Кучеренко А.Г., Шатилова H.H., Кузенкова Л.М. Апоптоз при рассеянном склерозе у детей. Российский педиатрический журнал. 2013; 2: 4-10.

Подписано в печать 07 июня 2013 г.

Формат 60x90/16

Объём 1,5 п.л.

Тираж 100 экз.

Заказ №070613474

Оттиражировано на ризографе в ООО «УниверПринт»

ИНН/КПП 7728572912У772801001

Адрес: г. Москва, улица Ивана Бабушкина, д. 19/1.

Тел. 740-76-47, 989-15-83.

http://www.univerprint.ru