Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Дифференцировка Т-лимфоцитов в динамике беременности

На правах рукописи

КАДЫРОВА ЛЮДМИЛА ВИКТОРОВНА

ДИФФЕРЕНЦИРОВКА Т-ЛИМФОЦИТОВ В ДИНАМИКЕ БЕРЕМЕННОСТИ

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

13 НОЯ 2014

Москва-2014

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении "Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова" Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Сотникова Наталья Юрьевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией иммунологии с группой по диагностике СПИД ФГБУ «Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии

имени Д.О. Отта» СЗО РАМН Сельков Сергей Алексеевич

доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией клеточной иммунологии ФБУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной»

Роспотребнадзора Талаев Владимир Юрьевич

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «_»_2014г. в_часов на заседании диссертационного

совета Д 208.072.05 при ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

Автореферат разослан «_»_2014г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат медицинских наук, доцент Т.Е. Кузнецова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

В настоящее время известно, что иммунные механизмы играют крайне важную роль в развитии беременности, определяя формирование маточно-плацентарного комплекса и обеспечивая сосуществование двух семиаллогенных организмов [Сотникова Н.Ю. с соавт., 2005]. Нарушение тех или иных звеньев в сложной цепочке иммуиорегуляции ведет к возникновению патологических процессов в системе мать-плацента-плод [Sallusto F. et al., 2004; Сотникова Н.Ю. с соавт., 2005; Lopez-Jaramillo P. et al., 2008].

Популяция Т-хелперов является важнейшим звеном в запуске реакций адаптивного иммунитета, при этом усиление функциональной активности той или иной субпопуляции Т-хелперов определяет тип иммунного ответа [Ярилин А.А., 2010]. Цитотоксические Т-лимфоциты являются одним из основных компонентов эффек-торной стадии иммунного ответа, осуществляющих цитолитическое действие в отношении различных клеток-мишеней благодаря продукции большого количества цитокинов и цитолитических молекул [Ярилин А.А., 2010]. В последние годы было показано, что уровень функциональной активности Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов определяется стадией их дифференцировки, при этом различают 4 пула Т-лимфоцитов, которые получили название наивных клеток, центральных, пре-терминально-дифференцированных и терминально-дифференцированных клеток памяти, характеризующихся различной экспрессией ряда функциональных и адгезионных молекул [Van Leeuvven Е.М. et al., 2006; Maldonado A. et al., 2003; Sallusto F. et al., 2004]. Однако в литературе имеются единичные работы по дифференцировке Т-лимфоиитов при неосложненной беременности [Сотникова Н.Ю., 2010], а данные о характере дифференцировки Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов в динамике гестационного процесса отсутствуют.

Известно, что беременность сопровождается инволюцией тимуса, выраженной в снижении его массы и клеточности [Abo Т. 2001; Dooley J. et al., 2012; Staal FJ. et al., 2001]. Предполагается, что во время беременности механизмом компенсации частичного подавления тимического пути развития лимфоцитов, является процесс экстратимической дифференцировки Т-клеток [Ширшев С.В. 2009; Abo Т. et al.,

2000]. Однако данный механизм поддержания пула Т-лимфоцитов при беременности не исследовался. Для изучения функциональной активности тимуса предлагается определять в лимфоцитах кольца реаранжировки генов а-цепи антигенраспоз-наюшего рецептора или TREC [Douek D.C. et al., 1998]. В литературе представлены работы об изменении уровня TREC при различных патологических состояниях [Puck J.M., 2012; Yamanaka К. et al., 2005; Hug A., 2003]. Можно предположить, что и при беременности уровень экспрессии TREC периферическими Т-лимфоцитами может изменяться. Однако данные об изменении количества TREC при беременности крайне малочисленны. В связи с этим планируемая работа является актуальной и позволит уточнить особенности поддержания иммунного гомеостаза во время беременности.

Цель исследования: установить особенности поддержания иммунного гомеостаза в динамике гестационного процесса с учетом дифференцировки наивных Т-клеток и Т-клеток памяти, на основании чего разработать новый способ прогнозирования раннего самопроизвольного выкидыша.

Задачи исследования:

1. Выявить особенности дифференцировки клеток памяти в популяциях Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов периферической крови в динамике гестационного процесса.

2. Оценить содержание клеток памяти, внутриклеточно продуцирующих цитокины и цитолитические молекулы, в популяциях Т-хелперов (IL-4, IFNy) и цитотоксических Т-лимфоцитов (Perforin, Granzyme В) в динамике гестационного процесса.

3. Выявить особенности содержания IL-2 и IL-15 в сыворотке периферической крови в динамике гестационного процесса.

4. Оценить уровень ранних тимических эмигрантов на основании изучения содержания CD31+1hymo и СТО 1 "СЯ1М| клеток в популяциях периферических Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов и экспрессии ДНК TREC Т-лимфоцитами в динамике гестационного процесса.

5. Разработать способ прогнозирования раннего самопроизвольного выкидыша у женщин с неосложненной на момент обследования беременностью.

Научная новизна исследования

Впервые установлено, что неосложненное течение беременности сочетается с изменением характера дифференцировки наивных клеток и Т-клеток памяти и их функциональной активности в популяциях Т-хеллеров и цитотоксических Т-лимфоцитов.

Выявлено, что отличительной чертой дифференцировки клеток памяти у беременных женщин является снижение содержания в периферической крови во 2 и 3 триместрах центральных клеток памяти в популяции Т-хелперов, а в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов уменьшение уровня претерминально-дифференцированных клеток памяти в 1 и 2 триместрах.

Установлено, что для беременных женщин характерно изменение продукции цитокинов разными субпопуляциями клеток памяти: в популяции Т-хелперов усилена внутриклеточная продукция IL-4 и IFNy наивными клетками в 1 триместре, повышена продукция IFNy в пулах претерминалыю- и терминально-дифференцированных клеток и IL-4 в пуле терминально-дифференцированных клеток во 2 триместре; в популяции ЦТЛ снижена внутриклеточная продукция Perform центральными и претерминально-дифференцированными клетками памяти, повышена выработка Granzyme В наивными клетками в 1 триместре, снижена продукция Perforin всеми типами клеток памяти во 2 триместре, снижена продукция Perforin центральными, претерминально- и терминально дифференцированными клетками памяти в 3 триместре.

Показано, что содержание различных пулов клеток памяти и их функциональная активность меняются в зависимости от срока гестации: в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов уровень центральных клеток памяти снижается во 2 триместре по сравнению с показателями 1 триместра, в 3 триместре количество претерми-налыю-дифференцированных ЦТЛ повышается по сравнению с таковым во 2 триместре; также во 2 триместре относительно 1 триместра увеличивается внутриклеточная продукция IL-4+ и IFNy+ терминально-дифференцированными клетками в популяции Т-хелперов; снижается выработка Perforin наивными клетками и терминально-дифференцированными клетками, а также уровень Granzyme В наивными клетками в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов; в 3 триместре уменьшается

5

внутриклеточная продукция IFNy претерминально- и терминально-дифференцированными клетками и IL-4 терминально-дифференцированными клетками памяти в популяции Т-хелперов, но повышается продукция Perforin наивными цитотоксическими Т-клетками.

Установлено, что во время беременности повышается сывороточный уровень IL-2 в 1 и 2 триместрах и IL-15 на протяжении всего гестационного периода.

Показано, что во время неосложненной беременности, в отличие от небеременных женщин, увеличено содержание наивных клеток в популяции Т-хелперов на протяжении всего гестационного периода и в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов - в 1, 2 триместрах, что сочетается со снижением в крови уровня ранних эмигрантов из тимуса в популяциях и Т-хелперов, и ЦТЛ, при этом уровень экспрессии ДНК TREC снижается во 2 триместре.

Впервые выявлено, что снижение в 5-8 недель беременности в периферической крови уровня центральных клеток памяти в популяции Т-хелперов на фоне повышения содержания терминально-дифференцированных клеток памяти в популяции Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов, а также повышение сывороточного уровня IL-15 предшествуют развитию самопроизвольного выкидыша в 10-12 недель беременности.

Впервые установлено, что высокое содержание в периферической крови CD45RA+CD62L+ лимфоцитов в популяции Т-хелперов является прогностическим критерием раннего самопроизвольного выкидыша.

Практическая значимость работы

В гинекологической практике предлагается использовать новый способ прогнозирования раннего самопроизвольного выкидыша, основанный на определении в периферической крови относительного содержания CD45RA+CD62L+ клеток в популяции CD4+ лимфоцитов.

Установлены нормативные показатели содержания наивных клеток, центральных, претерминально-дифференцированных и терминально-дифференцированных клеток памяти в популяциях Т-хелперов и ЦТЛ периферической крови в динамике гестационного процесса.

Положения, выносимые на защиту

Развитие гестационного процесса ассоциируется с изменением дифференци-ровки и функциональной активности наивных Т-клеток и Т-клеток памяти. Начиная с ранних сроков при неосложненной беременности, в результате воздействия антигенов плодового происхождения и стимулирующего влияния 1Ь-2 и 1Ь-15, в периферической крови усиливается процесс экстратимической дифференцировки наивных клеток в популяциях ТЫ, ТЬ2 и цитотоксических Т-лимфоцитов без последующего образования центральных и эффекторных клеток памяти, на фоне угнетения цито-литического потенциала клеток-памяти. Чрезмерная стимуляция антигенами плода на фоне повышения сывороточного уровня 1Ь-15 определяет усиление дифференцировки клеток памяти в популяциях Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов до терминальных этапов, что может приводить к развитию цитотоксических реакций, направленных на преждевременное прерывание беременности.

Высокое содержание С045КА+С062Ь+ клеток в популяции С154+ лимфоцитов периферической крови является прогностическим критерием раннего самопроизвольного выкидыша.

Внедрение результатов в практику

Разработанный «Способ прогнозирования самопроизвольного выкидыша» (патент № 2529788 от 06.08.2014г) прошел предрегистрационное испытание в гинекологической клинике Федерального государственного бюджетного учреждения «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Нормативные показатели содержания наивных клеток, центральных, претерми-налыю-дифференцированных и терминально-дифференцированных клеток памяти в популяциях Т-хелперов и ЦТЛ периферической крови в динамике гестационного процесса используются в работе врачей акушеров-гинекологов гинекологической клиники Федерального государственного бюджетного учреждения «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова» Министерства здравоохранения Российской Федерации и в учебном процессе на кафедре патофизиологии, клинической патофизиологии и иммунологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ивановская госу-

7

дарственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Фе дерации.

Апробация работы

Основные результаты исследований доложены и обсуждены на VI Съезде иммунологов России, Объединенном иммунологическом форуме, VI конференции по иммунологии репродукции (Нижний Новгород, 2013); V Российской конференции «Иммунология репродукции. Теоретические и клинические аспекты» (Иваново, 2012); VI Всемирный конгресс по иммунопатологии и респираторной аллергии, VIH Съезде аллергологов и иммунологов СНГ, V Съезде иммунологов России (Москва, 2011); XIV Всероссийском научном форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2011); VIII конференции иммунологов Урала (Сыктывкар, 2010); IV Всероссийской конференции «Иммунология репродукции» (Пермь, 2010); научно-практической конференции молодых ученых ФГБУ "ИвНИИ МиД им. В.Н. Городкова" Минздрава России, Иваново, 2011, 2013; научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Неделя науки - 2011», «Неделя науки - 2013» (Иваново, 2011, 2013).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 12 в рецензируемых журналах, включенных в перечень журналов, рекомендованных ВАК Минобрнауки России для публикаций научных результатов диссертаций.

Личное участие автора Автором самостоятельно проводился отбор пациенток на основании заключений врачей акушеров-гинекологов. Автор лично осуществлял все этапы иммунологических исследований, проводил систематизацию, статистико-математическую обработку данных, анализ и описание полученных результатов; сформулированы выводы и практические рекомендации.

Структура и объем диссертации Материалы диссертации изложены на 119 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 2 глав собственных исследований, главы «Обсуждение полученных

8

результатов», заключения, выводов и практических рекомендаций. Список литературы включает 215 источников, в том числе 39 отечественных и 176 иностранных. Работа иллюстрирована 19 таблицами и 4 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Работа выполнена на базе Федерального государственного бюджетного учреждения "Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (директор д.м.н. А.И. Малышкина). В работе проводилось обследование беременных женщин, вставших на диспансерный учет в территориальной женской консультации № 2 г. Иваново. Лабораторные исследования проводились в лаборатории клинической иммунологии - заведующая лабораторией заслуженный врач РФ, д.м.н., профессор Н.Ю. Сотникова.

Всего было обследовано:

- 36 небеременных женщин (контрольная группа);

- 85 беременных женщин (основная группа), обследованных лонгитудинально в динамике гестационного процесса в 1 (5-8 недель гестации), 2 (16-20 недель гестации) и 3 (28-32 недели гестации) триместрах беременности.

При ретроспективном анализе в зависимости от последующего характера течения гестационного процесса среди женщин основной группы была выделена группа женщин с развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем (10-12 недель гестации).

Материалом для исследования служила периферическая венозная кровь из локтевой вены.

Иммунологические методы исследования:

- выделение обогащенной популяции лимфоцитов из периферической крови стандартным методом скоростного центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина (d =1,078) [Boyum А., 1968].

- определение фенотипа и содержание клеток, внутриклеточно продуцирующих ци-токины, - методом многоцветной проточной цитометрии на приборе FACScan (Becton Dickinson, США) с помощью моноклональных антител (мАТ). В CD4+ и

9

CD8+ лимфоцитарном гейте определяли относительное содержание: наивных клеток (Тп); центральных (Тст), претерминалыю-дифференцированных (Теш), терминально-дифференцированных (Temra) клеток памяти. Процедуру окрашивания и фиксации клеток проводили стандартным способом в соответствии с указаниями фирмы-разработчика. Для оценки содержания клеток, внутриклеточно продуцирующих IL-4, IFNy в популяции CD4+ лимфоцитов и Perf и Gr В в популяции CD8+ лимфоцитов, проводили процедуру пермеабилизации клеточной мембраны с использованием коммерчиского набора FIX & PERM cell permeabilization reagents (Invinrogen, Camarillo, CA, США). В исследовании использовали следующие мАТ: CD4 PerCP-Cy5.5, CD8 PerCP-Cy5.5, CD45RA APC, CD62L FITC, CD31 РЕ-Су7, IFNy РЕ, Granzyme В РЕ, Perforin РЕ (eBioscience, США) IL-4 РЕ (Beckman Coulter, Фршщия). В каждом образце анализировали не менее 10000 клеток. Анализ результатов проводили в программе "Cell Quest Pro".

- определение экспрессии ДНК TREC в периферической крови - методом полуколичественной полимеразной цепной реакции в масштабе реального времени (RT-PCR) на амплификаторе с оптической насадкой iCycler iQ (Bio-Rad, США). В работе использовали набор реагентов для определения гена TREC (ООО «Синтол», Россия), для определения гена 18s rRNA (Biosourse, США).

- содержание цитокинов в сыворотке периферической крови - методом ELISA на микропланшетном ридере Multiscan EX (Labsystems, Финляндия).

Общее количество проведенных лабораторных исследований составило 3312.

Статистические методы исследования: обработка полученных данных проводилась по общепринятым методам вариационной статистики после проверки рядов данных на нормальность распределения. В зависимости от типа распределения достоверность различий между показателями независимых выборок оценивалась по непараметрическому U-критерию Манна-Уитни, при нормальном распределении по t-критерию Стьюдента. Расчет нормативных показателей содержания наивных клеток, центральных, претерминально-дифференцированных и терминально-дифференцированных клеток памяти в популяциях CD4+ и CD8+ лимфоцитов периферической крови проводился на основе 95% доверительного интервала. Стати-

стический анализ осуществлялся в пакете прикладных лицензионных программ "Statistica 6.О.", "Microsoft Office 2007", "MedCalc".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенные нами исследования выявили ряд особенностей дифференцировки наивных Т-клеток и Т-клеток памяти. По нашим данным, наступление беременности сопровождалось достоверным увеличением пула Тп в популяции Т-хелперов, которое сохранялось на всем протяжении гестационного процесса (34,46±1,55% — контроль; 38,98±1,58% - 1 триместр, р<0,05; 42,07±2,36% - 2 триместр, р<0,01; 39,74±1,50% - 3 триместр, р<0,05) по сравнению с показателями небеременных женщин. В популяции ЦТЛ повышение уровня Тп отмечалось в 1 (38,18±1,97%; р<0,05) и 2 (39,93±2,48%; р<0,05) триместрах гестации по сравнению с данными группы контроля (33,19±1,49%). Кроме того, в 1 триместре »(.'осложненной беременности в популяции CD4+ лимфоцитов возрастало содержание Тп клеток, внут-риклеточно продуцирующих IL-4 (3,04±0,30%— контроль; 4,69±0,58%— 1 триместр, р<0,05) и IFNy (4,13±0,55% - контроль; 5,88±0,64% - 1 триместр, р<0,05) при сравнении с показателями группы доноров. В популяции CD8+ лимфоцитов в 1 триместре относительно небеременных женщин рос уровень Тп клеток, продуцирующих Gr В, с последующим снижением во 2 триместре беременности по сравнению с таковым в 1 триместре (4,00±0,44% — контроль; 7,92±1,17% — 1 триместр, р<0,01; 3,29±0,58% — 2 триместр, р<0,01). Также во 2 триместре в пуле ЦТЛ падало содержание наивных клеток, продуцирующих Perf, по сравнению, как с параметрами группы контроля, так и беременных женщин 1 триместра гестации. В 3 триместре оно вновь возрастало относительно показателей 2 триместра беременности (5,83±0,84%-контроль; 6,15±0,89%- 1 триместр; 1,53±0,33%-2 триместр, р<0,001 в обоих случаях; 4,03±0,97% — 3 триместр, р<0,05).

По данным литературы известно, что основным источником наивных Т-клеток является тимус [Bain I., et al., 2009]. Многочисленными исследованиями было показано, что беременность сопровождается транзиторной инволюцией тимуса [Abo Т. 2001; Staal FJ. et al., 2001; Dooley J. et al., 2012]. Однако проведенное нами исследование показало, что на всем протяжении неосложненной беременности, как в популяции CD4+, так и CD8+ лимфоцитов периферической крови возрастало со-

11

держание Тп по сравнению с аналогичными показателями небеременных доноров. Учитывая этот факт, закономерно возникает вопрос о механизмах увеличен™ фракции наивных Т-лимфоцитов во время беременности.

Следует отметить, что образующийся пул наивных Т-хелперов, обладал способностью к продукции цитокинов ThI и Th2 типов. Это свидетельствует о способности этих клеток к индукции как клеточного, так и гуморального иммунного ответа. Отличительной чертой пула наивных ЦТЛ было усиление их способности к продукции цитолитических молекул без повышения выработки Perforin. Что, вероятно, при беременности ограничивает их цитотоксический потенциал в отношении клеток плодового происхождения.

Одним из показателей, позволяющих оценить характер дифференцировки Тп и выявить клетки, являющиеся недавними эмигрантами из тимуса, является определение колец реаранжировки генов а-цепи антигенраспознающего рецептора или TREC [Douek D.C. et al., 1998; Kong F.K. et al., 1999]. По нашим данным, в 1 триместре не-осложненной беременности уровень экспрессии ДНК TREC в общей фракции периферических Т-лимфоцитов не менялся (1,07±0,35%; р>0,05), но он резко снижался относительно показателей доноров и женщин 1 триместра гестации во 2 триместре беременности (0,20±0,10%; р<0,05 в обоих случаях). В 3 триместре беременности экспрессия ДНК TREC повышалась по сравнению с аналогичным показателем женщин с неосложненным течением беременности 2 триместра гестации (0,93±0,15%; р<0,001) и вновь достигала значений, характерных для доноров.

В качестве еще одного маркера недавно мигрировавших из тимуса клеток рассматривают молекулу РЕСАМ-1 или CD31 [Köhler S. et al., 2009]. CD31 экспресси-руется на поверхности наивных Т-лимфоцитов, недавних выходцев из тимуса, а вне-тимическое созревание наивных Т-лимфоцитов совпадает с прогрессирующим уменьшением экспрессии CD31 [Kimmig S. et al., 2002]. По нашим данным, во время беременности в 1, 2, 3 триместрах гестации в популяциях периферических CD4+ и CD8+ лимфоцитов относительно показателей контрольной группы отмечалось стойкое снижение ранних эмигрантов из тимуса - CD31+ihymlc (CD4+ - 56,52±2,59% -контроль; 43,61±1,89% - 1 триместр, р<0,001; 41,76±3,28% - 2 триместр, р<0,01; 43,77±2,98% - 3 триместр, р<0,01. CD8+ - 76,60±1,05% - контроль; 65,58±2,56% - 1

12

триместр, р<0,001; 57,48±1,92% - 2 триместр, р<0,001; 58,21±2,58% - 3 триместр, р<0,001) и увеличивалось содержание центральных наивных клеток - CD31 "амга1 (CD4+ - 43,48±2,59% - контроль; 56,39±1,89% - 1 триместр, р<0,001; 58,24±3,28% -2 триместр, р<0,01; 56,23±2,98% - 3 триместр, р<0,01. CD8+ - 23,40±1,05% - контроль; 34,42±2,56% - 1 триместр, р<0,001; 42,52±1,92% - 2 триместр, р<0,001; 41,79±2,58%- 3 триместр, р<0,001). Кроме того, во 2 триместре неосложненной беременности в популяции периферических наивных ЦТЛ достоверно снижался уровень CD31+thymio клеток, и повышалось содержание CD3Tcaltral клеток по сравнению с соответствующими показателями жешдин 1 триместра неосложненной беременности (р<0,02 в обоих случаях).

Таким образом, проведенные исследования показали, что при беременности рост уровня наивных Т-лимфоцитов на системном уровне не связан с функциональной активностью тимуса, но может быть обусловлен усилением экстратимической дифференцировки Т-лимфоцитов или пролиферацией клонов Тп на периферии в результате воздействия факторов ранней беременности. Известно, что во время беременности развитие Т-клеток может осуществляться в результате экстратимической дифференцировки лимфоцитов Т-ряда в лимфатических узлах, дренирующих матку, в деиидуальной оболочке матки и в печени [Ширшев C.B. 2009; Abo T. et al., 2000]. Вероятно, этот механизм позволяет компенсировать частичное подавление тимиче-ского пути развития Т-клеток во время беременности в результате транзиторной атрофии тимуса.

Увеличение пула Тп клеток при беременности могло определяться и гомеоста-тичеекой пролиферацией лимфоцитов на системном уровне под действием IL-2 [Pekalski M.L. et al., 2013]. С наступлением беременности мы выявили значительное увеличение сывороточного уровня IL-2 по сравнению с таковым у небеременных доноров, сохранявшееся и во 2 триместре. В 3 триместре сывороточный уровень IL-2 снижался относительно показателя 2 триместра (0 — контроль; 0,89±0,44%— 1 триместр, р<0,05; 2,51±1,05% - 2 триместр, р<0,05; 0,29±0,29% - 3 триместр; р<0,05).

Основными продуцентами IL-2 являются CD4+ лимфоциты [Ярилин А.А., 2010; Кетлинский С.А. и др., 2008]. Полученные нами данные позволяют предположить, что, начиная уже с ранних сроков беременности, на системном уровне проис-

13

ходит активация Т-хелперов под действием факторов, специфичных для гестацион-ного процесса. Таковыми могут быть плодовые АГ, т. к. в периферический кровоток матери во время беременности проникают фрагменты синцитиотрофобласта, ДНК и лимфоциты плода [Redman C.W. et al., 2012; Tannetta D.S. et al., 2013; Orozco A.F., 2010].

Как известно, при акушерской патологии проницаемость плацентарного барьера усиливается, что приводит к большему поступлению фетальных АГ в кровоток матери [Сотникова Н.Ю. и др., 2005; Germain S J. et al., 2007]. Возможно, именно это обусловило выявленную нами тенденцию к повышению содержания IL-2 в периферической крови женщин с развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем в 1 триместре гестации (0,89±0,44% - неосложненная беременность; 1,27±1,05%- развившийся выкидыш; р>0,05).

Кроме того, у женщин с развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем в популяции Th возрастал уровень Тп (38,98±1,58% - неосложненная беременность; 46,99±2,93% - развившийся выкидыш; р<0,05). Известно, что для беременности характерно явление микрохимеризма, характеризующееся наличием в организме генетически отличающихся клеток, на которые не происходит развитие иммунного ответа при низком уровне антигенной нагрузки [Adams К.М., 2008; Khosrotehrani К. et al., 2005]. При повышении порогового уровня - более 1% от всех клеток организма, идет пролиферация специфических клонов наивных клеток. Так, в работах ряда авторов было показано, что при развитии различной акушерско-гинекологической патологии в организме матери отмечается увеличение клеток микрохимер плодового происхождения [Redman C.W. et al., 2007; Saito S. et al., 2007]. Можно предположить, что выявленное нами повышение уровня наивных Т-лимфоцитов в популяции Т-хелперов при развитии самопроизвольного выкидыша связано именно с этим механизмом.

Мы оценили возможность использования уровня наивных клеток в популяции ТЪ для прогнозирования развития раннего самопроизвольного выкидыша. Выявлено, что для женщин с неосложненным на момент обследования течением беременности и развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем характерно более высокое содержание в периферической крови Тп клеток в пуле Т-хелперов. На

14

основании полученных данных был разработан способ прогнозирования самопроизвольного выкидыша. Способ основан на определении содержания Тп в популяции CD4+ лимфоцитов и при его значении равном или более 46,7% прогнозируют развитие самопроизвольного выкидыша с точностью 85,1% (патент N2 2529788 от 6 августа 2014г).

Наивные Т-лимфоциты в Т-зонах лимфоидных органов под действием АГ, презентируемого им дендритными клетками, подвергаются клональной экспансии и дифференцируются в короткоживущие эффекторные клетки, при этом часть из них приобретают свойства клеток памяти [Germain S.J. et al., 2007; Sallusto F. et al., 2004]. По нашим данным, в периферической крови женщин с неосложненным течением беременности в популяции Т-хелперов во 2 и 3 триместрах гестации снижался уровень Тст клеток относительно группы контроля (39,75±1,53% - контроль; 33,97±1,73% - 2 триместр, р<0,02; 34,13±1,41% - 3 триместр, р<0,01). В пуле ЦТЛ также отмечалось уменьшение содержания Тст во 2 триместре беременности по сравнению с аналогичным показателем, как группы доноров, так и беременных женщин 1 триместра гестации (12,26±0,89% - контроль; 11,24±0,69%- 1 триместр; 8,82±0,57% - 2 триместр, р<0,01 в обоих случаях). Кроме того, в популяции CD8+ лимфоцитов в 1 и 2 триместрах беременности снижался уровень Тет клеток относительно такового у небеременных женщин, который повышался к 3 триместру по сравнению с группой беременных женщин 2 триместра гестации (25,75±1,72% — контроль; 21,36±1,42% - 1 триместр, р<0,05; 19,06±1,45% - 2 триместр, р<0,01; 23,45±2,76% -3 триместр, р<0,05).

На основании полученных данных нами впервые были разработаны нормативные показатели содержания наивных клеток и клеток памяти в популяциях Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов в динамике неосложненной беременности, расчет которых проводился на основе 95% доверительного интервала.

Таким образом, в настоящий момент можно предположить, что при неосложненной беременности в периферической крови действуют факторы, блокирующие формирование пула клеток памяти в популяции Th и ЦТЛ, что может приводить к снижению циркулирующего пула высокоактивных эффекторных Т-лимфоцитов,

способных к осуществлению антиген-специфических цитотоксических реакций адаптивного иммунитета в отношении антигенов плодового происхождения.

По литературным данным известно, что на процесс дифференцировки Т-клеток памяти может оказывать влияние IL-15 [Ma A. et al., 2006; Sandau М.М. et al., 2010]. По нашим данным, с наступлением беременности уровень сывороточного IL-15 возрастал многократно, и был достоверно выше на всем ее протяжении по сравнению с показателями небеременных женщин (1,75±0,60%- контроль; 9,06±3,09%-1 триместр, р<0,05; 15,55±6,11% - 2 триместр, р<0,05; 14,82±4,45% - 3 триместр, р<0,01). Это могло быть обусловлено как его синтезом de novo, так и повышенной секрецией из цитоплазматических везикул или шеддингом с мембраны клеток. Однако данное повышение уровня IL-15 при неосложненной беременности не сопровождалось ростом содержания центральных и эффекторных клеток памяти в популяциях периферических Т-лимфоцитов.

Изучение особенностей функционального состояния клеток памяти при неосложненной беременности показало, что только во 2 триместре в популяции Т-хелперов рос уровень Тешга клеток, виутриклеточно продуцирующих IL-4, по сравнению с аналогичным показателем группы контроля и беременных женщин 1 триместра гестации, со снижением их уровня в 3 триместре относительно показателей 2 триместра (0,13±0,04% - контроль; 0,22±0,04% - 1 триместр; 0,84±0,26% - 2 триместр; 0,19±0,05 - 3 триместр, р<0,05 во всех случаях). В эти же сроки гестации в популяции CD4+ лимфоцитов по сравнению с контрольной группой рос уровень IFNy-позитивных клеток в пуле Tern, со снижением их количества в 3 триместре относительно параметров 2 триместра (0,93±0,38% - контроль; 2,85±0,72% - 2 триместр, р<0,05; 1,11±0,28% - 3 триместр, р<0,05). Также в популяции Т-хелперов во 2 триместре относительно показателей доноров и беременных женщин 1 триместра гестации достоверно повышался уровень Temra клеток, продуцирующих IFNy. в 3 триместре он снижался относительно такового во 2 триместре (0,09±0,02% - контроль; 0,3 Ш), 12%- 1 триместр; 1,09±0,23%-2 триместр, р<0,01, р<0,02 соответственно; 0,19±0,05 - 3 триместр, р<0,02). Известно, что в 16-18 недель гестации отмечается 2 волна инвазии трофобласта. Можно предположить, что выявленное нами увеличение именно в этом сроке беременности уровня эффекторных пулов Tern и

16

Temra является ответом на эту волну инвазии и отражает развитие материнского иммунного ответа, происходящее на локальном уровне.

В популяции ЦТЛ на протяжении всей беременности по сравнению с показателями небеременных доноров отмечалось стойкое снижение уровня Тст (7,16±0,61% - контроль; 4,26±0,92% - 1 триместр, р<0,02; 3,58±0,89% - 2 триместр, р<0,01; 3,72±0,95 - 3 триместр, р<0,01) и Tern клеток (17,84±2,47% - контроль; 9,69±1,57% - 1 триместр, р<0,02; 10,37±1,72% - 2 триместр, р<0,05; 8,39±2,30 - 3 триместр, р<0,02), внутриклеточно продуцирующих Perf, по сравнению с таковым в контрольной группе. Уровень Temra клеток, продуцирующих Perf, также снижался во 2 триместре беременности относительно, как группы контроля, так и женщин 1 триместра гестации, а в 3 триместре он был снижен относительно показателя контроля (9,86±1,31% - контроль; 8,93±1,58% - 1 триместр; 3,78±1,20% - 2 триместр, р<0,01, р<0,02 соответственно; 5,86±1,25%- 3 триместр, р<0,05). Ранее было показано, что в популяции ЦТЛ есть клетки, которые осуществляют свою цитотоксиче-скую активность независимо от Perforin [Takata Н. et al., 2006]. В свете этих данных можно предположить, что выявленное нами снижение уровня перфорин-продуцирующих ЦТЛ при отсутствии изменений со стороны продукции Granzyme В не приводит к значительному нарушению цитотоксической активности CD8+ лимфоцитов при беременности.

Процесс дифференцировки Т-лимфоцитов существенно менялся при развитии самопроизвольного выкидыша 1 триместра гестации. Так, в периферической крови женщин с неосложненным течением беременности на момент обследования и развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем в 1 триместре гестации в популяции Т-хелперов отмечалось снижение уровня Тст клеток памяти относительно такового у женщин с неосложненным течением гестационного процесса (37,58±1,50% - неосложненная беременность; 27,74±3,57% - развившийся выкидыш; р<0,05). В то же время, у женщин с развившимся впоследствии ранним самопроизвольным выкидышем отмечалось достоверное увеличение содержания высо-коэффекторных Temra клеток памяти, как в популяции Т-хелперов (2,56±0,41% -неосложненная беременность; 13,11±4,28% - развившийся выкидыш; р<0,05), так и популяции цитотоксических Т-клеток (29,23±1,89% — неосложненная беременность;

17

37,22±2,90%- развившийся выкидыш; р<0,05). Это могло определяться чрезмерной антигенной стимуляцией плодовыми антигенами, связанной с нарушениями ранних процессов формирования фето-плацентаного комплекса и усилением проницаемости плацентарного барьера. Нарушение дифференцировки лимфоцитов может вести к изменению иммунорегуляции, определяя неадекватный иммунный ответ матери на фетальные антигены, приводя тем самым к формированию патологии беременности.

Мы предположили, что при неосложненной беременности имеются механизмы, препятствующие проявлению «иммунологической памяти» материнских клеток в отношении плода, а при патологии беременности - эта защита нарушена. Наши исследования показали, что при неосложненной беременности контакт материнской иммунной системы с плодом практически не оказывает влияния на формирование «иммунологической памяти» и приводит к угнетению функции лимфоцитов, способных патологически воздействовать на плаценту и плод. Осложнения беременности возникали у тех женщин, у которых формировались высокоэффекторные клетки «памяти», обладающие повреждающим действием. Увеличение пула высокоэффек-торных клеток памяти при самопроизвольном выкидыше также могло быть обусловлено выявленным нами усилением системной продукции 1Ь-15 (9,06±3,09% -неосложненная беременность; 88,90±36,85% - развившийся выкидыш; р<0,05), т.к. именно этот цитокин в большей степени, чем 1Ь-2, стимулирует рост Тетга клеток.

Таким образом, гестационный процесс ассоциируется с выраженными изменениями дифференцировки наивных клеток и клеток памяти, как в популяции Т-хелперов, так и популяции цитотоксических Т-лимфоцитов, что, вероятно, связано с изменением цитокинового гомеостаза при беременности и аллогенной стимуляцией антигенами плода. Направленность дифференцировки Т-лимфоцитов, по-видимому, зависит от силы и длительности антигенной стимуляции, которая выражена в различной степени при неосложненном течении беременности и при развитии акушерской патологии.

ВЫВОДЫ

1. В периферической крови беременных женщин по сравнению с показателями небеременных женщин в популяции Т-хелперов на протяжении всего гестаци-

онного процесса повышено количество наивных клеток, во 2 и 3 триместрах снижен уровень центральных клеток памяти, а в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов увеличено содержание наивных Т-клеток в 1 и 2 триместрах, снижен уровень центральных во 2 триместре и претерминально-дифференцированных клеток памяти в 1 и 2 триместрах.

2. В 1 триместре неосложнешюй беременности по сравнению с показателями небеременных женщин усилена внутриклеточная продукция IL-4 и IFNy наивными Т-хелперами, а также увеличена продукция Granzyme В наивными цитоток-сическими Т-лимфоцитами, но снижена выработка Perforin центральными и претерминально-дифференцированными клетками памяти в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов; во 2 триместре в популяции Т-хелперов повышена продукция IFNy в пулах претерминалыю- и терминально-дифференцированных клеток, продукция IL-4 в пуле терминально-дифференцированных клеток, но снижена выработка Perforin всеми типами клеток памяти цитотоксических Т-лимфопитов; в 3 триместре уменьшена продукция Perforin центральными, пре-терминально- и терминально-дифференцированными клетками памяти.

3. В динамике беременности изменения в содержании клеток памяти, находящихся на разных стадиях дифференцировки, в популяции Т-хелперов отсутствуют, во 2 триместре снижается уровень центральных клеток памяти по сравнению с показателями 1 триместра, в 3 триместре повышается количество претерми-нально-дифференцированных клеток памяти по сравнению с таковым во 2 триместре в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов.

4. Внутриклеточная продукция нитокинов также меняется с увеличением срока беременности: во 2 триместре по сравнению с показателями 1 триместра повышается количество IL-4+ и IFNy+ терминально-дифференцированных клеток в популяции Т-хелперов; снижается продукция Perforin и Granzyme В наивными клетками, а также уровень Perforin+ терминально-дифференцированных клеток в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов; в 3 триместре уменьшается внутриклеточная продукция IFNy претерминалыю- и терминально-дифференцированными клетками и IL-4 терминально-дифференцированными

клетками памяти в популяции Т-хелперов, но повышается продукция Perforin наивными цитотоксическими Т-клетками.

5. В 1 и 2 триместрах неосложненной беременности по сравнению с показателями небеременных женщин повышен сывороточный уровень IL-2, который в 3 триместре снижается по сравнению с таковым во 2 триместре, сывороточное содержание IL-15 повышается в 1 триместре и остается повышенным на протяжении всего срока беременности.

6. Уровень наивных CD31+thymc клеток по сравнению с параметрами небеременных женщин снижается в 1 триместре и остается сниженным в течение всего гестационного периода, как в популяции Т-хелперов, так и цитотоксических Т-лимфоцитов, а количество наивных CD3rcentaI, наоборот, повышается в 1 триместре и остается повышенным на протяжении всей беременности. Уровень экспрессии ДНК TREC не отличается от такового у небеременных женщин в 1 и 3 триместрах неосложненной беременности и снижается во 2 триместре. Во 2 триместре происходит снижение экспрессии ДНК TREC по сравнению с ее уровнем в 1 триместре, в 3 триместре уровень экспрессии ДНК TREC повышается по сравнению с таковым во 2 триместре.

7. В группе женщин с неосложненной на момент обследования беременностью и развившимся впоследствии ранним самопроизвольным выкидышем по сравнению с показателями беременных женщин с неосложненным течением беременности 1 триместра гестации происходит снижение уровня центральных клеток памяти в популяции Т-хелперов на фоне повышения содержания терминально-дифференцированных клеток памяти в популяции Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов, а также повышается сывороточный уровень IL-15.

8. Высокое содержание CD45RA+CD62L+ лимфоцитов (равное или более 46,7%) в популяции периферических Т-хелперов позволяют с точностью 85,1% прогнозировать развитие самопроизвольного выкидыша в 1 триместре у женщин с неосложненной на момент обследования беременностью.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ У беременных женщин в сроке 6-12 недель для прогнозирования развития

раннего самопроизвольного выкидыша рекомендуется определять относительное

содержание CD45RA+CD62L+ клеток в популяции Т-хелперов периферической крови и при его содержании равном или более 46,7% прогнозируют самопроизвольный выкидыш с точностью 85,1%.

Врачам акушерам-гинекологам рекомендуются использовать нормативные значения содержания наивных клеток, центральных, претерминально- и терминально-дифференцированных клеток памяти в популяциях периферических Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов в 1, 2, 3 триместрах гестации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кадырова, Л.В. Формирование феномена иммунологической памяти в динамике гестационного процесса / Н.Ю. Сотникова, Л.В. Кадырова // Российский иммунологический журнал. - 2010. - Т. 4(13), № 4. - С. 383.

2. Кадырова. Л.В. Динамика показателей раннего и позднего апоптоза лимфоцитов при беременности / Л.В. Кадырова, Н.Ю. Сотникова // Вестник Уральской медицинской академической науки. Тематический выпуск по аллергологии и иммунологии. - 2011. - № 2/1 (35). - С. 34.

3. Кадырова, Л.В. Дифференцировка Т-лимфоцитов в динамике неосложненной беременности и при развитии акушерской патологии / Л.В. Кадырова, Н.Ю. Сотникова, A.B. Кудряшова // Медицинская иммунология. - 2011.- Т.13, № 4-5.- С. 424-425.

4. Kadyrova, L.V. The differentiation of peripheral T-lymphocytes in the dynamics of I, II and III trimesters / L.V. Kadyrova, N.Yu. Sotnikova. A.V. Kudryashova, I.V. Railyan // International J. Immunorehabilitation.- 2011,- Vol. 13, № 2,- P. 162.

5. Кадырова, Л.В. Дифференцировки Т-лимфоцитов в динамике I и II триместров беременности / Л.В. Кадырова // Материалы 91 ежегодной научно-практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя науки - 2011». -Иваново.-2011.-С.34.

6. Кадырова, Л.В. Внутриклеточная продукция гранзима В и перфорина в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов при беременности / Л.В. Кадырова, A.B. Кудряшова, Н.С. Лукина, Е.А. Москвина // Проблемы репродукции. - 2012. - Специальный выпуск. - С. 65-66.

7. Кадырова, JI.B. Функциональная активность и дифференцировка Т-лимфоцитов при фето-плацентарной недостаточности / JI.B. Кадырова // Российский иммунологический журнал. - 2012,- Т. 6(14), № 2(1).- С. 69-70.

8. Кадырова, JI.B. Дифференцировка клеток памяти в популяции Т-хелперов при неосложненной беременности и преэклампсии / A.B. Кудряшова, Н.Ю. Сотникова, И.А. Панова, JI.B. Кадырова // Журнал акушерства и женских болезней. -2013. - Т. LXII, № 2,- С. 110-116.

9. Кадырова, Л.В. Особенности дифференцировки Т-лимфоцитов при невынашивании беременности в ранние сроки гестации / Л.В. Кадырова, Н.Ю. Борзова, Н.И. Иваненкова//Российский иммунологический журнал. - 2013. - Т. 7(16), № 2-3. -С. 275.

10. Кадырова, Л.В. Изучение колец реаранжировки генов а-цепи антигенраспоз-нающего рецептора Т-лимфоцитов (TREC) в динамике беременности / Л.В. Кадырова, Н.Ю.Сотникова, A.B. Кудряшова // Бюллетень ФЦСКЭ им. В.А. Алма-зова. - 2013. - Приложение 2. - С. 46.

11. Кадырова, Л.В. Характеристика иммунопоэза в динамике гестационного процесса / Л.В. Кадырова // Молодые ученые - развитию Ивановской области: материалы 93-й ежегодной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Неделя науки-2013». - Иваново. - 2013. - С. 22.

12. Кадырова, Л.В.Сывороточный уровень IL-2 и IL-15 в динамике беременности / Л.В. Кадырова, Н.Ю. Сотникова // Мать и Дитя в Кузбассе. - 2014,- № 2 (57). - С. 46-48.

13. Кадырова, Л.В. Дифференцировка CD8+ клеток памяти при беременности / A.B. Кудряшова, Л.В. Кадырова // Российский иммунологический журнал. - 2014,- Т. 8 (17), № 1. - С. 79-82.

14. Кадырова, Л.В. Динамика содержания наивных Т-клеток при неосложненной беременности / Л.В. Кадырова, Н.Ю. Сотникова, A.B. Кудряшова // Российский иммунологический журнал,- 2014. - Т. 8 (17), № 1,- С. 54-60.

15. Кадырова, Л.В. Внутриклеточная продукция перфорина и гранзима В клетками памяти в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов при угрозе прерывания бе-

ременности / Н.И. Иваненкова, Н.Ю. Борзова, Н.Ю. Сотникова, JI.B. Кадырова // Цитокнны и воспаление,- 2014,- Т. 13, № 1,- С. 97-98.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ - антиген

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота мАТ - моноклональное антитело ЦТЛ - нитотоксические Т-лимфоциты АРС - аллофиконианин CD - кластер дифференцировки FITC - флюоресцеинизотиоцианат Gr В - Granzyme В IFNy - интерферон у IL - интерлейкин

PCR - полимеразная цепная реакция РЕ - фикоэритрин

РегСР - перидинин-хлорофил протеин 5.5 Perf - Perform

Tcm - центральные клетки памяти TCR - Т-клеточный рецептор

Tern - претерминально-дифференцированные клетки памяти Temra - терминально-дифференцированные клетки памяти Th - Т- хелперы Тп - наивные клетки

TREC - кольца реаранжировки генов а-цепи антигенраспознающего рецептора

Кадырова Людмила Викторовна

Дифференцировка Т-лимфоцитов в динамике беременности

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 21.10.2014. Печ. л.1,25. Формат 60x85 1/16. Тираж 70 экз.

Отпечатано с оригинал-макета в типографии ООО «Энтер. Ком» Иваново, ул. 8 Марта, 32, корпус «Б», 3 уровень, пав. № Тел./факс: (4932) 59-02-02