Автореферат и диссертация по медицине (14.00.01) на тему:Диагностика и медикаментозная коррекция эндотелиальной дисфункции при гестозе

На правах рукописи

МОЗГОВАЯ Елена Витальевна

ДИАГНОСТИКА И МЕДИКАМЕНТОЗНАЯ КОРРЕКЦИЯ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ ПРИ ГЕСТОЗЕ

14.00.01 - акушерство и гинекология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Санкт-Петербург- 2004

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте акушерства и гинекологии имени Д.О. Отта РАМН

Научные консультанты:

академик РАМН, заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор АИЛАМАЗЯН Эдуард Карпович

заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор ПЕТРИЩЕВ Николай Николаевич

Официальные оппоненты:

заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук,1 профессор КОШЕЛЕВА Нонна Георгиевна

доктор медицинских наук, профессор КОСТЮЧЕК Дина Федоровна

доктор медицинских наук, профессор ЗАЙЧИК Альберт Шмульевич

Ведущая организация: Российский университет дружбы народов Защита состоится « /3 » lU^ff-S 2004 года в /3 часов на заседании диссертационного совета Д 001.021.01 при ГУ Научно-исследовательском институте акушерства и гинекологии имени Д.О. Отта РАМН (199034, Санкт-Петербург, Менделеевская линия,3)

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ГУ НИИАГ им. Д.О. Orra РАМН.

Автореферат разослан «_ <f » Mas 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

БОБКОВ Валентин Михайлович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Гестоз является одной из основных причин материнской и перинатальной

заболеваемости и смертности. Частота гестоза в России превышает 20% и не

1

снижается, поскольку до сих пор недостаточно изучены вопросы этиологии, патогенеза, профилактики, диагностики и лечения этой акушерской патологии (Кулаков В.И., Мурашко Л.Е.,1998; Серов В.Н., 2001).

Гестоз относится к мультафакториальным заболеваниям, при этом центральным звеном его патогенеза является эндотелиальная дисфункция (Супряга О.М., 1995; Макацария А.Д., Бицадзе В.О., 2001; Dekker G.A., Sibai В.М., 1998; Arbogast B.W., 2001; Granger J.G., 2001), проявляющаяся повышением адгезионных свойств тромбоцитов и лейкоцитов, продукции цитокинов, плазменного уровня эндотелий--зависимых факторов коагуляции (Dekker G.A., Sibai B.M., 1998). В циркулирующей плазме при повреждения эндотелия может быть обнаружен растворимый тромбомодулин (Hayashi M., 2002). При гестозе некоторыми авторами отмечается торможение системы фибринолиза, в первую очередь изменение уровней тканевого активатора плазминогена и его ингибитора 1 типа, синтезируемых эндотелием (Roes E.M., 2002). Однако до настоящего времени не определен полный спектр эндотелиальных факторов, вовлеченных в патогенез гестоза, их взаимосвязь и последующее влияние на другие системы организма.

Известно, что генетический полиморфизм, широко представленный в популяции, приводит к вариациям в структуре белков и тем самым формирует биохимическую индивидуальность (Баранов B.C., 2000). Функционально неполноценные варианты генов сопряжены с повышением риска развития многих заболеваний, в том числе и гестоза. Очевидно, что гестоз имеет целый ряд генов предрасположенности (Arngrimsson R., 1990; Cooper D.W., 1993).

Исходя из современных представлений о патогенезе гестоза, высока вероятность ассоциации с гестозом совокупности полиморфизмов генов, вовлеченных в сложный процесс функций

эндотелия. Исследования последнего десятилетия демонстрируют противоречивые данные о взаимосвязи полиморфизма отдельных генов с гестозом. Так, выявленная ассоциация полиморфизма гена ангиотензинконвертирующего фермента с гестозом (Zhou N., 1999) не подтверждается другим исследованием (Jaana Т., 2001). Отмечена ассоциация полиморфизма гена эндотелиальной синтазы оксида азота с гестозом (Tempfer С, 1999, 2001), оспариваемая другими авторами (Arngrimsson R., 1999). У беременных с гестозом отмечено увеличение частоты функционально ослабленного гена ингибитора активатора плазминогена (Eriksson P., 1995; Glueck C.J., 1999, 2000), однако отсутствуют сведения об исследовании полиморфизма гена активатора плазминогена. Крайне скудны и противоречивы данные об исследовании при гестозе полиморфизма генов, регулирующих белковую продукцию цитокинов (Lachmeijer A.M., 2001; Livingston J.C, 2001) и ферментов антиоксидантной системы ( Zusterzeel P., 2002). Всестороннее исследование полиморфизмов генов, ответственных за функционирование факторов и межклеточных взаимодействий в эндотелиальной системе, позволит уточнить механизм развития эндотелиальной дисфункции при гестозе и заблаговременно выявлять пациенток с повышенным риском его развития.

Известно, что гликозаминогликаны стенок сосудов, в первую очередь гепарин, защищают эндотелий от повреждения, а в циркуляции обладают выраженной антитромботической и умеренной антикоагулянтной активностью (Баркаган З.С., 1998). Низкомолекулярные производные гепарина, сохраняя его эндотелиопротекторное действие, проявляют большую противотромботическую активность, достоверно гораздо более низкую выраженность геморрагических осложнений и других побочных эффектов (Сидоренко Б.А., 1996). Применение производных гепарина в комплексной терапии гестоза позволяет ожидать улучшение показателей функции эндотелия, как основы для достижения клинического эффекта.

Генетическое тестирование групп повышенного риска развития гестоза, ранняя доклиническая диагностика развивающейся эндотелиальной

дисфункции и применение производных гепарина в качестве патогенетического средства ее коррекции должны стать эффективными методами профилактики развития и прогрессирования гестоза.

Цель и задачи исследования

Целью исследования явилось изучение механизма развития эндотелиальной дисфункции при гестозе на основе выявления содержания в крови маркеров и медиаторов эндотелиальной дисфункции и исследования полиморфизма генов, вовлеченных в регуляцию функции эндотелия, а также определение перспективных путей профилактики И" фармакологической коррекции данного заболевания.

Для достижения вышеизложенной цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить степень выраженности эндотелиальной дисфункции у беременных с гестозом на основе определения уровня тканевого активатора плазминогена и его ингибитора 1 типа, адгезивных молекул и цитокинов, тромбомодулина, фактора Виллебранда и десквамированных эндотелиоцитов в плазме крови.

2. Изучить полиморфизм генов, вовлеченных в генез эндотелиальной дисфункции при гестозе: ферментов системы фибринолиза PLAT и PAI-1, ангиотензинпревращающего фермента АСЕ, эндотелиальной NO-синтазы, цитокина TNF-a, фермента антиоксидантной системы GSTpl.

3. Выявить связь функционально ослабленных аллельных вариантов генов, участвующих в регуляции функции эндотелия, с неблагоприятными изменениями уровня маркеров эндотелиальной дисфункции.

4. Оценить полиморфизм кандидатных генов предрасположенности к эндотелиальной дисфункции и уровень маркеров эндотелиального повреждения у беременных с гестозом, не имеющих сочетанной патологии.

5. Оценить полиморфизм кандидатных генов предрасположенности к эндотелиальной дисфункции и уровень маркеров эндотелиального повреждения

у беременных с гестозом на фоне исходной артериальной гипертензии, заболеваний почек и сахарного диабета различных типов.

6. Оценить эффективность применения комплексного гликозаминогликана, препарата сулодексид, с целью коррекции эндотелиальной дисфункции у беременных с гестозом.

Научная новизна и значимость

В работе впервые проведена комплексная оценка функционального состояния эндотелия при различных формах и стадиях гестоза на основе исследования уровня ферментов системы фибринолиза (тканевого активатора плазминогена и его ингибитора 1 типа), факторов коагуляции и антикоагуляции (фактора Виллебранда и тромбомодулина), провоспалительных цитокинов и молекул адгезии, количества циркулирующих эндотелиоцитов.

Впервые проведено комплексное исследование полиморфизма группы генов, участвующих в регуляции функции эндотелия, у беременных с различными формами и степенями тяжести гестоза.

Впервые показана взаимосвязь генетического полиморфизма с проявлениями эндотелиальной дисфункции на основе сравнения клинических показателей и показателей эндотелиальной дисфункции с вариантами исследованных генотипов.

Выявлено, что уровень маркеров эндотелиальной дисфункции в крови и частота функционально ослабленных аллельных вариантов генов, регулирующих функции эндотелия, при сочетанным гестозе выше, чем при гестозе без сопутствующих заболеваний, что обусловлено более значительной ролью эндотелиальной дисфункции в патогенезе гестоза, развившегося у беременных с экстрагенитальной патологией.

Впервые раскрыт механизм действия комплексного гликозаминогликана сулодексида при гестозе, оказывающего положительный клинический эффект вследствие корригирующего воздействия на выявленную дисфункцию эндотелия.

Практическая значимость

Проведенное исследование позволило определить эффективные методы ранней диагностики развивающейся эндотелиальной дисфункции при гестозе; определить группы повышенного риска развития гестоза на основе генетического тестирования полиморфизма генов, участвующих в регуляции функции эндотелия. Доказана эффективность применения сулодексида в комплексной терапии и профилактике гестоза как патогенетического средства коррекции эндотелиальной дисфункции и определены показания к применению данного препарата при гестозе.

Апробация работы и личный вклад автора По теме диссертации опубликовано 27 печатных работ, в том числе методические рекомендации. Результаты доложены на VII и VIII конгрессах акушеров-гинекологов Балтийских стран (Санкт-Петербург, 1999г., Рига,2001г.), заседаниях ассоциаций акушеров-гинекологов гг. Кирова (ноябрь 2001 г), Новгорода (февраль 2002г), Санкт-Петербурга (март 2003г) и Калининграда (июнь 2003 г), анестезиологов Санкт-Петербурга (апрель 2002г). Результаты исследований используются в лаборатории пренатальной диагностики и акушерских отделениях НИИАГ им. Д.О.Отта, в родильных домах Санкт-Петербурга; включены в учебный процесс СПбГМУ им. акад.И.П.Павлова.

Определение уровня тканевого активатора плазминогена и его ингибитора первого типа в плазме производилось в лаборатории иммунологии 122 МСЧ, фактора Виллебранда - в лабораториях иммунологии НИИ онкологии им. проф. Н.Н.Петрова Минздрава РФ и 122 МСЧ, уровня тромбомодулина - в лаборатории иммунологии НИИ АГ им.Д.О.Отта РАМН. Исследование аллельных вариантов рассматриваемых генов производилось автором в лаборатории пренатальной диагностики НИИ АГ им.Д.О.Отта РАМН под руководством члена-корреспондента РАМН профессора В.С.Баранова. Определение циркулирующих эндотелиоцитов, алгоритм обследования и лечения, клинические наблюдения, статистическая обработка данных и анализ полученных результатов производились автором самостоятельно.

Положения, выносимые на защиту

1. Гестоз проявляется нарушением множественных функций эндотелия, подтвержденных изменением уровней маркеров и медиаторов эвдотелиальной дисфункции, а именно: количества циркулирующих в крови десквамированных эндотелиоцитов, содержания в крови фактора Виллебранда, тромбомодулина, тканевого активатора плазминогена и его активатора 1 типа t-PA и PAI-1, уровня в крови факторов межклеточного взаимодействия (лейкоцитарной адгезии и провоспалительных цитокинов).

2. При гестозе обмечается увеличение частоты неблагоприятных аллельных вариантов генов, регулирующих белковый синтез маркеров и медиаторов эндотелиальной дисфункции (PLAT, PA1-1, АСЕ, eNOS, TNF-a, GSTP1), по сравнению со здоровыми беременными.

3. У беременных с гестозом, имеющих функционально ослабленные варианты генов, участвующих в регуляции функции эндотелия, отмечаются более выраженные нарушения уровней маркеров эндотелиальной дисфункции по сравнению с имеющими протекторные генотипы.

4. Частота неблагоприятных аллельных вариантов генов, участвующих в регуляции функции эндотелия, а также изменение в крови уровня маркеров эндотелиальной дисфункции различается в зависимости от тяжести гестоза и наличия сопутствующих заболеваний, предрасполагающих к повреждению эндотелия. При сочетанном гестозе имеются более выраженные признаки вовлечения эндотелия в патологический процесс.

5. Применение гликозаминогликана сулодексида в комплексной терапии гестоза является патогенетическим методом лечения, поскольку приводит к улучшению показателей состояния эндотелия и способствует улучшению клинического течения гестоза.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 233 страницах машинописи и состоит из введения, 6 глав, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Она иллюстрирована 60 таблицами и 41

рисунком. Список литературы включает 465 источников, в том числе 61 отечественных и 404 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Для решения поставленных задач было обследовано 688 женщин. Основную группу составили 335 беременных с гестозом, проходивших обследование и лечение в НИИ АГ им. Д.О.Отта РАМН. Основная - группа являлась неоднородной по наличию или отсутствию фоновых болезней, развившихся до беременности: у 85 беременных не было выявлено заболеваний, известных как предрасполагающих к гестозу, а у 128 беременных отмечалось наличие артериальной гипертензии (ВСД по гипертоническому типу или гипертонической болезни), заболеваний почек (хронического пиелонефрита или гломерулонефрита, аномалий развития мочевыводящих путей, мочекаменной болезни), сахарного диабета 1 и 2 типа или гестационного. У части беременных наблюдалось сочетание нескольких фоновых заболеваний, предрасполагающих к гестозу. Группа сравнения состояла из 178 беременных и родильниц, не имевших каких-либо признаков гестоза и хронической патологии и 175 небеременных (140 здоровых, 15 имевших заболевания сердечно-сосудистой системы и 20 сахарный диабет 1 или 2 типа).

Методы исследования

1. Определение количества циркулирующих эндотелиоцитов производилось методом подсчета клеток в камере Горяева при фазово-контрастной микроскопии. Предварительно 1 мл плазмы смешивался с 0,2 мл натриевой соли аденозиндифосфата (АДФ-№) в концентрации 1мг/мл в течение 10 минут, после чего производилось центрифугирование, полученный осадок суспензировался в 0,1 мл 0,9% раствора №С1 и помещался в камеру Горяева. При условии, что одна сетка камеры Горяева помещает 0,1 мл содержимого, подсчет количества эндотелиальных клеток производился из расчета • 104/ л.

2. Определение содержания фактора Виллебранда в плазме производилось методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа

с использованием отечественных образцов моноклональных антител к фактору Виллебранда. Содержание фактора Виллебранда определяли в процентах от стандартной пробы с помощью калибровочной кривой, с использованием ряда последовательных разведений плазменного стандарта из образцов плазмы здоровых людей.

3. Определение уровня тромбомодулина плазмы производилось общепринятым методом «ELISA» (твердофазный иммуноферментный анализ), с использованием двух наборов KIT фирмы DAKO LSAB. Оценивалась критическая оптическая плотность ТМ в сравнении с оптической плотностью отрицательного контроля.

4. Определение содержания активатора плазминогена тканевого типа и его ингибитора в плазме производилось методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием тест-системы Asserachrom t-PA, основанной на технологии ELISA, производства фирмы Roshe, Diagnostica Stago (США). Производилось количественное определение содержания t-AP и PAI-1 в плазме двухступенчатым «сандвич-методом» с использованием высокоспецифичных моноклональных антител к t-AP и PAI-1.

5. Определение количества адгезивных молекул семейства интегринов CDllp/CD18 на нейтрофилах, моноцитах, лимфоцитах проводилось методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител производства НПЦ «Медбиоспектр» (Москва). Анализ проб проводили на проточном цитометре EPICS XL (Coulter Corp., USA). Области гейтирования лимфоцитов и моноцитов определялись с использованием aHra-CD45-FITC/ анти-СБМ-РЕ-антител (IOTest, Coulter Corp., USA). В качестве негативного контроля использовались пробы, окрашенные изоспецифическими антителами IgGl-FITCAgGl-PE. Данные анализировались с помощью программы Coulter System II.

6. Определение количества цитокинов TNF-a, IL-lfi, IL-8 в периферической крови производилось методом иммуноферментного анализа с

использованием стандартных тест-систем производства ООО «Цитокин» и «Протеиновый контур», Санкт-Петербург.

7. Молекулярно-биологическое исследование полиморфных аллелей генов, PLAT, PAI-1, eNOS, АСЕ, TNF-a и GSTP1 исследовали методом полимеразной цепной реакции. Образцы ДНК получали стандартным способом из лимфоцитов крови. Для амплификации использовали программируемый термоциклер Perkin-Elmer Cetus (USA). После амплификации продукты ПЦР подвергались расщеплению с помощью специфических эндонуклеаз по прописям, рекомендованным фирмой-изготовителем рестриктаз в буфере, прилагаемом к ферменту. После амплификации (и рестрикции) продукты реакции анализировали в 7,0% полиакриламидном геле с последующей окраской этидиумбромидом и визуализацией в проходящем УФ свете.

8. Клшшко-лабораторное обследование беременных, включающее клинические и биохимические анализы крови, общий анализ мочи, суточную потерю белка и функциональные почечные пробы, проводилось по общепринятым методикам. Агрегационная активность тромбоцитов определялась методом фотометрирования плазмы крови по Вогп-у. Определение кровотока в сосудах плода и маточной артерии проводилось при помощи ультразвукового диагностического прибора «ALOKA 2000»; основным параметром исследования являлось систоло-диастолическое отношение (СДО) сосудов, представляющее собой отношение величин максимальной, систолической и конечной диастолической скоростей кровотока.

9. Статистическая обработка результатов исследования производилась на персональном компьютере с применением стандартных пакетов программ прикладного статистического анализа (GraphPad Instat, Statistica for Windows v.4.0, Exel 2000 и др.). Проверку гипотез о равенстве двух средних проводили с помощью t-критерия Стьюдента. Выявление ведущих стохастических связей между параметрами осуществлялось на основе линейного корреляционного анализа. В ходе исследований контролировалось 130 параметров каждой пациентки.

При сравнении частот генотипов использовали стандартный критерий Относительный риск (ОЯ) развития заболевания при определенном генотипе рассчитывали по стандартной формуле. ОЯ>1 рассматривали как положительную ассоциацию заболевания с аллелем или генотипом; ОЯ<1 - как отрицательную.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Были выявлены некоторые отличия в клиническом течении гестоза в зависимости от его тяжести и наличия фоновых заболеваний. Для беременных с тяжелым гестозом на фоне заболеваний почек и сахарного диабета было характерно достоверно более раннее появление протеинурии по сравнению с аналогичной подгруппой на фоне АГ (соответственно 23,81+3,0 и 24,22+2,6 нед. по сравнению с 32,55+2,9 нед.). Гипертензия появлялась в более ранние сроки у беременных с гестозом на фоне АГ по сравнению с другими подгруппами, с достоверным отличием при легком гестозё (в 20,94+3,1 нед. по сравнению с пациентками с заболеваниями почек - в 30,1+2,7 нед.). Цифры АД достоверно повышались при нарастании тяжести гестоза у пациенток с АГ и почечной патологией.

В основной группе беременным с целью лечения гестоза проводилась комплексная терапия. Магнезиальную терапия по схеме получили 92,9% беременных с нефропатией III, 81,8% - с нефропатией II и 5,1% с нефропатией I. Инфузионная терапия проводилась у всех беременных с нефропатией III, у 84,1% с нефропатией II и у 24,8% с нефропатией I. Применялись солевые растворы, альбумин, эуфиллин, мафусол по общепринятым схемам и дозировкам, в том числе антиагрегантная терапия с применением трентала и реополиглюкина. Гипотензивную терапию клофелином получали 89,3% беременных с нефропатией Ш со средней суточной дозой препарата 0,275+0,166 мг. При нефропатии II и I клофелин получали соответственно 31,8% и 39,1% беременных со средней суточной дозой 0,275+0,184 мг и 0,136+0,16 мг.

Родоразрешение у всех беременных группы сравнения произошло при доношенном сроке, в среднем в 38,9+0,75 недель. Из них через естественные

родовые пути 77(65,3%), абдоминальным путём - 41(34,7%), в плановом порядке по причинам, не связанным с гестозом. Все рожденные дети имели оценку по шкале Апгар в среднем 7,8±0,5 баллов, при физиологическом течении периода новорожденности. В основной группе при доношенном сроке были родоразрешены.132 беременные (62%), преждевременно- 81(38%). Операцией кесарева сечения родоразрешены 111 беременных (51,6%). Из них - экстренно в связи с нарастанием гестоза и/или прогрессированием плацентарной недостаточности - 68 (31,9%) пациенток. У 18 новорожденных (8,4%) оценка по шкале Апгар была менее 7 баллов, 1 глубоко недоношенный ребенок умер. Гипотрофия 1-Ш степени имела место у 49 (23%) новорожденных. В условиях палаты интенсивной терапии наблюдалось 54 ребенка (25,4%). Тяжесть состояния детей была обусловлена недоношенностью и гипотрофией, хронической внутриутробной гипоксией.

Результаты исследования маркеров эндотелиалыюй дисфункции Количество циркулирующих в крови эндотелиоцитов У беременных с гестозом выявлено достоверное повышение в крови количества свободных эндотелиальных клеток, при этом отмечено увеличение их количества при возрастании тяжести гестоза (г=0,71). У беременных с гестозом, не имеющих сочетанной патологии, количество эндотелиоцитов было достоверно выше, чем при физиологической беременности (11,9±1,3-104/л), но несколько ниже, чем во всей группе беременных с гестозом в целом (соответственно 18,2 ±1,1 и 37,3±2,3-104/л). При гестозе на фоне заболеваний почек отмечен более высокий уровень десквамированных эндотелиальных клеток и при легком гестозе (нефропатия I), и при тяжелом ((нефропатия И-Ш), соответственно 22,5±1,8 и 40,1±2,0-104/л. При гестозе на фоне АГ этот маркер был достоверно выше, чем при чистом гестозе (соответственно 26,9±1,9; р<0,01 и 45,1±2,2-104/л; р<0,05). Максимальный уровень эндотелиоцитов был выявлен у беремешшх с сахарным диабетом 1 типа и соответствовал 28,2±0,98-104/л при нефропатии1,38,6±2,17-104/л при нефропатии II и 53,9±3,21-104/л при нефропатии Ш (рр<0,001 по сравнению с чистым гестозом).

Уровень фактораВиплебранда плазмы

Уровень фВб при гестозе, был достоверно выше, чем при физиологической беременности и достоверно увеличивался по мере нарастании степени тяжести гестоза (г = 0,72). У беременных с гестозом без сочетанной патологии, уровень фВб также достоверно возрастал по сравнению с физиологической беременностью (рр<0,05), но был достоверно ниже, чем во всей группе беременных с гестозом в целом - соответственно 145,4+14,0 и 193,3+18,7% (рр <0,01). При сочетанном гестозе на фоне заболеваний почек и при легком, и при тяжелом (нефропатия II- III) отмечено умеренное увеличение уровня фВб по сравнению с чистым гестозом (соответственно 166,3+17,8 и 210,1+16,6 %); при гестозе на фоне АГ уровень фВб был достоверно выше (соответственно 188,25+13,2; р<0,05 и 258,4+16,5; р<0,05). У больных сахарным диабетом 1 типа увеличение уровня фВб было еще более выраженным по сравнению с чистым гестозом (г=0,88), достигая 330,9+8,4% при нефропатии Ш(р<0,001).

Уровень тромбомодулина плазмы

В общей группе беременных с гестозом уровень тромбомодулина имел тенденцию к увеличению по сравнению с физиологической беременностью, однако данное различие было недостоверным.

Таблица 1

Содержание тромбомодулина в плазме беременных с гестозом

Подгруппа Тромбомодулин (ед. оптической плотности)

основная

Чистые формы гестоза (п=14) 0,08250± 0,0189

Гестоз на фоне АГ (п=1б) 0,1337±0,021 *

Гестоз на фоне сахарного диабета (п=15) 0,077010,0110

Гестоз на фоне варикозной болезни (п=16) 0,1192±0,0141 »

Гестоз на фоне пиелонефрита (п=14) 0,1358±0,0252 *

контроль

Здоровые беременные (п=15) 0,08075±0,0117

Небеременные с сосудистыми заболеваниями (п=7) 0,0780±0,0244

Здоровые небеременные (п=15), 0,07467±0,0138

Примечание: *- р < 0,05 по сравнению со здоровыми беременными

У беременных с чистыми формами гестоза- нефропатии 1-11 и сочетанного гестоза на фоне сахарного диабета, но без диабетических сосудистых осложнений, содержание ТМ плазмы достоверно не отличалась от такового у здоровых беременных, небеременных с сосудистыми осложнениями и здоровых небеременных женщин, (см. табл. 1).

Однако было отмечено достоверное увеличение уровня ТМ у беременных с сочетанным гестозом на фоне АГ, варикозной болезни и тромбофлебита периферических вен при данной беременности, а также у беременных с гестозом и на фоне обострения пиелонефрита Таким образом, увеличение концентрации свободного тромбомодулина плазмы обнаружено только у беременных с сочетанным гестозом. Это позволяет предположить, что данный маркер является повышенным только при длительной, существующей задолго до беременности, эндотелиальной дисфункции.

Уровень тканевого активатора плазминогена плазмы и его ингибитора 1 типа У обследованных беременных выявлено достоверное снижение уровня тканевого активатора плазминогена (1-РА) и повышение уровня его ингибитора 1 типа при возрастании степени тяжести гестоза (г > 0,71), что представлено в таблице 2.

Таблица 2

Содержание 1-РА и РА -1 (нг/мл) в плазме беременных с гестозом

Группа сравнения (п=23) Степень тяжести гестоза

Нефропатия I (п=23) Нефропатия II (п=8) Нефропатия III (п=21)

1 2 3 4

1-РА 13,02±2,52 5,09±0,53 *1) 3,32±0,15 *2) 0,14±0,2 *3)

РАМ 100,98±9,57 195,09±13,37*1) 269,19±14,24 *2) 308,14±32,28 *3)

Примечание: * 1) - рь2< 0,001; *2) - р„< 0,001; - рг-з < 0,01 •3> рм < 0,001 У4А < 0,001; Рм < 0,001 При нефропатии I уровень 1-РА существенно не зависел от сочетанной

патологии, тогда как при нефропатии П-Ш - наличие сопутствующих

заболеваний сопровождалось значительно более низким уровнем 1-РА.

Снижение уровня t-PA при тяжелом гестозе на фоне АТ и заболеваний почек было умеренным (соответственно 0,78±0,75 и 0,80±1,11 против 1,53±0,44 нг/мл), а при наличии сахарного диабета 1 и 2 типа - более значительным (0,216±0,41 нг/мл; р<0,05; см. рис. 1).

Рис. 1 Содержание t-PA плазмы в зависимости от тяжести гестоза и наличия сопутствующей патологии.

Примечание: • - р<0,05 по сравнению с чистым гестозом

Также при сочетанном гестозе отмечен более высокий, чем при чистом, уровень PAI-1. При нефропатии I максимальный уровень PAI-1 наблюдался на фоне патологии почек (230,7±13,8 нг/мл) по сравнению с чистым гестозом (190,7±8,9 нг/мл; р<0,05), а при тяжелом - на фоне сахарного диабета 1 и 2 типов (соответственно 309,0±7,4 против 287,3±7,1 нг/мл; р<0,05), см.рис. 2.

Нефропатия I Нефропатия II-III

Рис.2 Содержание PAI-1 плазмы в зависимости от тяжести гестоза и наличия сопутствующей патологии. Примечание: *- р<0,05 по сравнению с чистым гестозом

Количествоадгезивныхмолекуллейкоцитов СР11&/СР18 в плазме У беременных с нефропатией 1-11 степени по сравнению с группой сравнения обнаружено достоверно большее количество нейтрофилов и моноцитов, содержащих адгезивные молекулы СО 11{3/СО!8, которые относятся к семейству интегринов и опосредуют прочную адгезию активированных лейкоцитов к эндотелию. При нефропатии Ш-преэклампсии количество нейтрофилов и моноцитов, содержащих адгезивные молекулы достоверно снижалось, достигая значений, близких к норме. (см.табл.З).

Таблица 3

Количество нейтрофилов, моноцитов, лимфоцитов, содержащих интегрины

Количество клеток (хЮ9) cCDllp/CD18 Небеременные п=10 Здоровые Беременные п=22 , Нефропатия 1-П п=20 Нефропатия III-преэклампсия =20

1 2 3 4

нейтрофилы 1,9±0,2 2,29±0,6 6,38±0,33 *1) 2,52±0,59 *2)

моноциты 0,11±0,04 0,29±0,03 *3) 0,44±0,04 *4) 0,25±0,05 *5)

лимфоциты 0,1 ±0,032 0,1 ±0,03 7 0,15±0,059 0,1±0,029

Примечание: *1)-р2-з <0,001; p1-3<0,001; *2)- р3_4<0,001;

*3)- pi_2<0,01;*4)-p2-3<0,01; р 1-3<0,001; *5)р3-4 <0,01; р 1-4<0,05

Таким образом, исследование интегрин-содержащих лейкоцитов показало неоднородность их экспрессии в крови у беременных с различной степенью тяжести гестоза. По-видимому, хроническая активация иммунной системы, имеющая место при длителыютекущем тяжелом гестозе, приводит к функциональному истощению этих иммунокомпетентных медиаторов эндотелиальной дисфункции.

Уровеньпровоспалительныхиитокинов TNF-a. IL-В и IL-8 в крови

У беременных с нефропатией I-II уровни TNF-a ИIL-1JÎ в периферической и в пуповинной крови были значительно выше, чем у беременных без гестоза. При гестозе, соответствующем нефропатии III - преэклампсии, изменения в уровне этих провоспалительных цитокинов были недостоверными в связи с наличием как очень высоких, так и низких (в пределах нормы) значений TNF-a

и ГИ3. Увеличение содержания цитокина 1Ь-8 при гестозе в целом было недостоверным (см. табл.4).

Таблица 4

Уровни провоспалительных цитокинов в периферической крови у беременных с гестозом

Уровни цитокинов (пг/мл) Неберемешше п=10 Здоровые беременные п=22 Нефропатия III п=20 Нефропатия III-преэклампсия п=20

1 2 3 4

Т№-а 27,5±7,1 43,9±16,28 275,28±75,1*1) 209,78±188,85

35,4±15,2 60,5±16,76 293,9±82,77 2) 88,2±39,81 *3)

1Ъ-8 5 0,1 ±4,5 50,04±13,52 52,63±20,0 51,58±11,17

Примечание:*1>-р1.2<0,01;р2-з<0,01; *2) -рь2<0,01;р2-з<0,05; *3)-рзЛ<0,05

Однако, при сочетанном гестозе уровень Т№"-а крови был значительно выше, чем при чистом. Уровень ТЫБ-а составил 288,98±109,3 нг/мл при чистом легком гестозе и 292,85±98,5 нг/мл при тяжелом. У беременных с ВСД по гипертоническому типу уровень Т№"-а венозной крови был достоверно выше и при нефропатии I (932,99±164,1 нг/мл; р<0,01), и при нефропатии И-Ш (587,09±103,7 нг/мл; р<0,05) - так же как и у беременных заболеваниями почек (867,14± 114,7 нг/мл; р<0,01 и 773,4±77,4 нг/мл; р<0,01). При ГБ И-Ш стадии и при СД 1и 2 типа уровень > ТЫБ-а повышался при тяжелом гестозе (от 622,19±89,1нг/мл; р<0,05 до 834,59±127,6 нг/мл; р<0,01 и от 516,45±108,7 нг/мл до 696,16±116,7 нг/мл; р<0,05), см.рисЗ.

Уровень цитокина ГИБ в венозной крови у беременных с гестозом был достоверно повышен при нефропатии I во всех подгруппах, кроме беременных с легкой АГ (ВСД по гипертоническому типу). При этом максимальное содержание уровня ГИБ в венозной крови отмечалось в крови у беременных, не имеющих сопутствующей - патологии - 403,75± 104,8 нг/мл (р<0,01 по сравнению со здоровыми беременными). Несколько ниже этот показатель при нефропатии I отмечался, у беременных с тяжелой АГ (383,64± 104,8 нг/мл; р<0,01), сахарным диабетом (269,8±83,9 нг/мл; р<0,05) и заболеваниями почек (192,0±60,2 нг/мл; р<0,05). При нефропатии И-Ш уровень Б!ЛБ в крови

снижался у всех беременных (от 72,2+29,4 до 62,3+23,4 нг/мл; рр<0,05 для подгрупп с чистым гестозом, тяжелой АГ и сахарным диабетом), см. рис.4.

Уровень 1Ь-8 в крови у беременных с чистым гестозом не имел тенденции к повышению (46,5+14,4 нг/мл при легком, и 40,33+13,5 нг/мл при тяжелом гестозе), так же как и при сахарном диабете 1 и 2 типов (соответственно 52,68+12,7 нг/мл и 54,03+И,б нг/мл). У беременных с ВСД по гипертоническому типу наблюдалось достоверное повышение уровня 1Ь-8 в крови только при тяжелом гестозе (50,7+12,2 нг/мл при легком и 87,98+10,4 нг/мл при тяжелом гестозе; р<0,05). У беременных с почечной патологией имело место постепенное увеличение уровня 1Ь-8 при нарастании тяжести гестоза (69,36+10,4 нг/мл при нефропатии I и 87,98+9,3 нг/мл при нефропатии И-Ш; р<0,05). У пациенток с ГБ И-Ш стадии отмечен максимальный уровень 1Ь-8 при легком гестозе (96,47+11,9 нг/мл; р<0,05), несколько сниженный при нефропатии И-Ш степени (78,9+15,1 нг/мл),см. рис. 5.

1

2

3

Без гестоза Нефролатия I Нефропатия П-Ш

Рис.3 Уровень ТМБ-а периферической крови в зависимости

от тяжести гестоза и наличия сопутствующей патологии. Примечание: *-р<0,05 и **- р<0,01 ,по сравнению с чистым гестозом;

п - р<0,05 по сравнению с беременными без гестоза

Рис.4 Уровень 1Ь-1Б периферической крови в зависимости от тяжести

гестоза и наличия сопутствующей патологии. Примечание: *-р<0,05 и • •- р<0,01 по сравнению со здоровыми беременными; п - р<0,05 по сравнению с нефропатией I.

Рис.5 Уровень 1Ь-8 периферической крови в зависимости от тяжести гестоза и наличия сопутствующей патологии.

Примечание: *-р<0,05 по сравнению с беременными без гестоза

В то же время, цитокины, являясь различными белками-регуляторами со своими индивидуальными рецепторами и путями внутриклеточной сигнализации (Ройт А., 2000), могут проявлять разную степень активности в зависимости от характера сопутствующей гестозу патологии или ее отсутствия.

Результаты исследования генетической предрасположенности к эндотелиальной дисфункции

Полиморфизм генов тканевого активатора плазминогена (PLAT) и его

ингибитора 1 muna(PAI-l). При исследовании полиморфизма гена PLAT,

представляющего собой делецию/инсерцию Alu-повтора 8-го интрона,

выявлено, что при генотипе Ш.у беременных с гестозом уровень t-PA был почти

в два раза ниже, чем в других подгруппах (р<0,05). При этом у гомозигот по

инсерции в гене PLAT имелось достоверное повышение уровня других

маркеров эндотелиальной дисфункции (см. табл.5). Анализ полиморфизма в

промоторе- гена PAI-1 (4G/5G) у беременных с гестозом показал, что генотип

4G/4G связан с более высокими уровнями маркеров эндотелиальной

дисфункции (см. табл.6).

Таблица 5

Ассоциация полиморфизма гена PLAT с маркерами эндотелиальной

дисфункции у беременных с гестозом ^ = Варг------------

.ариант генотипа , Маркер

эндотелиальной дисфункции

ТЛ

(п=14)

D/D (п=57)

I/D (п=48)

Уровень t-PA плазмы

1,64¿0,45

2,9¿0,40*

2,9±0,39*

Уровень PAI-1 плазмы

271*9,1

245±8,2 *

268±12,0

Фактор Виллебранда,%

206,1^22,0

140,1±21,4*

160,0±29,9

Количество эндотелиоцитов,-104/л

19,7±2,3

13,0±2,2 *

11,0±2,9*

Примечание:*- р<0,05 по сравнению с генотипом I/I

Таблица 6

Ассоциация полиморфизма гена PAI-1 с уровнями маркеров эндотелиальной

Вариант генотипа Маркер эндотелиальной дисфункции 4G/4G (п=51) ' 4G/5G. (п=55) 5G/5G (п=15)

Уровень 1-РА плазмы 2,2±0,31 3,25±0,37* 3,9±0,42**

Уровень РА1-1 плазмы 244,5±10,5 259,2±11,2 278,45±9,3*

Фактор Виллебранда,% 189,27±39,8 123,03±37,28 81,83±31,1*

Эндотелиоциты,-104/л 16,7±2,4 13,5±2,7 10,5±1,5 *

Примечание: *- р<0,05; **- р<0,01 по сравнению с генотипом

Полиморфизм гена ангиотензинпревращающего фермента (АСЕ) Исследование полиморфизма АСЕ ( делеция (D) /инсерция (I) в 16 интроне) у беременных с гестозом показало существенное повышение ряда маркеров эндотелиальной дисфункции при генотипе D/D (см. табл.7).

Таблица 7

Ассоциация полиморфизма гена АСЕ с уровнями маркеров

эндотелиальной дисфунк Вариант генотипа гтии у беременн I/I ых с гестозом I/D D/D

Маркер эндотелиальной (п=25) (п=51) (п=46)

дисфункции 1

Фактор Виллебранда,% 82,21±28,97 144,65±45,39 180,9±36,29 *

Эндотелиоциты,-104/л 7,0±1,8 12,17±2,9 13,2±2,3*

Уровень Т№-а плазмы 98,75±52,5 277,1±79,42 * 403,0±113,71 *

Примечание: *- р<0,05 по сравнению с генотипом I/I **- р<0,01 по сравнению с генотипом I/I Полиморфизм гена эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS)

Исследование полиморфизма в 4 интроне 4а/4Ь гена еК08 (4а/4Ь) у беременных с гестозом показало, что при генотипе 4а/4а отмечался более высокий уровень некоторых маркеров эндотелиальной дисфункции (см.табл.8).

Таблица 8

Ассоциация полиморфизма гена еК08 с уровнями маркеров эндотелиальной дисфункции у беременных с гестозом

Вариант генотипа Маркер эндотелиальной дисфункции 4b/4b (п=46) 4Ь/4а (п=24) 4а/4а (п=3)

Уровень иРА плазмы 7,09±1,5Ш 4,85±1,85*## 3,35±1,82 » а

Уровень РА1-1 плазмы 159,4±13,4## 217,2±12,4*## 239,1±17,8*

Фактор В и лл ебранда,% - 156,97±36,59 168,76±45,9 193,88±37,23

Количество эндотеяиоцитов,-104/л 10,7±1,3 14,4±2,4 17,6±1,7 *

Примечание: • - р<0,05 и * • - р<0,01 по сравнению с геногшюм4Ь/4Ь п- р<0,05 по сравнению с генотипом 4а/4Ь ## р<0,01 по сравнению с показателями до лечения

Полиморфизмгена TNF-a

Полиморфизм гена TNF-a. у всех беременных был представлен только двумя вариантами генотипов: (-238)G/G и (~238)A/G. У беременных с гестозом при генотипе A/G отмечалось достоверное увеличение почти всех маркеров эндотелиального повреждения, в том числе TNF-a венозной крови (см.табл.9).

Таблица 9

Ассоциация полиморфизма гена ЮТ-а с уровнями маркеров эндотелиальной дисфункции у беременных с гестозом

Вариант генотипа Генотип G/G Генотип A/G

Маркер (п=105) (п=16)

эндотелиальной дисфункции

Уровень 1:-РА плазмы 2,94±0,35 2,03±0,21 *

Уровень РА1-1 плазмы 188,2±12,7 235,7±13,4 *

Фактор Виллебранда,% 141,96±23,3 218,78±28,6*

Количество эндотелиоцитов 10,2±1,7 15,5±1,82*

Количество молекул СБ 11 (УСБ 18,-104/л

нейтрофилов 54,49±5,2 67,92±7,04

моноцитов 5 6,81 ±4,3 73,55±5,8*

Уровень Т№-а плазмы, нг/мл 554,5±203,7 3659,9±725,5**

Уровень 11-1В плазмы нг/мл 175,4+59,44 161,0±47,85

Уровень И-8 плазмы нг/мл 61,67±7,5 41,9±5,3*

Примечание: *- р<0,05; **- р<0,01 по сравнению с генотипом G/G

Полиморфизм гена ОБТР1 Таблица 10

Ассоциация уровней маркеров эндотелиальной дисфункции у беременных с гестозом в зависимости от полиморфизма гена GSTP1

Вариант генотипа Маркер Энд. дисфункции 1а/1а (п=58) 1а/1Ь (п=35) 1а/1с (п=19) lb/lb+lb/lc +1с/1с (п=10)

Уровень Ы?А плазмы, нг/мл 2,05±0,35 3,04±0,42 4,19±0,48 ** 3,83±0,32 ••

Уровень РА1-1 плазмы, нг/мл 269,18±14,69 257,55±13Д4 221,66±11,3Ф 248,13±19,39

Ф.Виллебранда,% 150,32±18,3 159,56±15,5 165.27i67.39 213,84±22,0 * л

Эндотелиоциты,-104/л 14,0±7,51 14Д5±2,16 14,75±4,81 13,89±3,95

Количество молекул С0113/СВ18,-104/л

нейтрофилов 39,65±7,7 59,17±15,2б 68,65±11,0 * 67,45*10,3 ♦

моноцитов 56,68±6,2 70,29±9,28 77,45±7,60 ♦ 71,65±15,65

Уровень ТИБ-а плазмы, нг/мл 448,7±41,1 648,0±56,бб* 744,2*48,93** 477,3±87,38

Уровень 11-1В плазмы, нг/мл 149,33±45,8 185±44,86 465,0±53,3 ♦* 278±39,1 *

Примечание: • -р< 0,05'и ** -р<0,01 по сравнению с генотипом la/la

л - р<0,05 по сравнению с генотипом1а/1Ь;

При исследовании генетического полиморфизма в8ТР1, обусловленного наличием 3-х функционально различных форм фермента (1а, 1в и 1с), у беременных с гестозом содержание маркеров эндотелиальной дисфункции было выше при наличии менее активных аллелей 1в и 1с в гомозиготном и даже гетерозиготном состоянии (см. табл. 10).

Изучение полиморфизма генов, участвующих в регуляции функции эндотелия, выявило значительные различия в распределении частот вариантных генотипов у беременных с гестозом в зависимости от наличия и выраженности сочетанной патологии. У беременных без выявленной экстрагенитальной патологии при нефропатии I нами отмечено значительное увеличение частоты функционально ослабленных генотипов РА1-1 и АСЕ, а также умеренное повышение частоты неблагоприятных генотипов в8ТР1, еК08 и ТОТ-с! (см.рис.7). Для чистого тяжелого гестоза характерно только небольшое повышение частоты генотипа 1а/1с гена в8ТР1 и более значимое - генотипов 4в/4в гена РА1-1 и !/Л гена АСЕ (см рис 8).

Генотип 1с/1с ОБТР!

вБТР!

Генотип Уа1 114 позиции

6

5

4

Генотип 4а/4Ь еИОБ

Генотип 4С/40РА1-1

73

"енотип АЛЗ ТОТ-а

Беременные с гестозом

Здоровые беременные

□

О

Генотип Ш> АСЕ

Рис. 7 Частота неблагоприятных вариантов генов у беременных с нефропатией I степени без экстрагенитальной патологии

Умеренное повышение частоты неблагоприятных генотипов в8ТР1, еК08 и ТКБ-а. при чистом легком гестозе возможно, свидетельствует о том, что у многих пациенток нефропатия 1 служит первым клиническим проявлением предрасположенности к хронической эндотелиальной дисфункции, которая впоследствии приведет к манифестации симптомов той или иной соматической патологии. В целом при чистом гестозе наблюдалось значительное увеличение частоты неблагоприятных генотипов РА1-1 (х2=5,25; р<0,25; 0Я=2,36) и АСЕ (х*=5,25; р<0,25; 0Я=1,4).

Рис. 8 Частота неблагоприятных вариантов генов у беременных с нефропатией II -преэклампсией без экстрагенитальной патологии

Очевидно, еще не опознанные гены, регулирующие процессы материнско-эмбрионального взаимодействия, играют особо важную роль в развитии тяжелых форм чистого гестоза.

Полиморфизм всех исследованных генов, участвующих в регуляции функции эндотелия, связан с развитием гестоза у беременных, страдающих артериальной гипертензией. 'При гестозе на фоне легкой АГ (ВСД по гипертоническому типу) выявлено значительное увеличение частоты функционально неполноценных генотипов

=4,77; 0Я=1,24; р<0,25 соответственно для нефропатии I и нефропатии II -

преэклампсии), TNF-a (x2 =8,53; OR=6,38; p<0,05 и у? =0,07; OR=1,86 соответственно для легкого и тяжелого гестоза), eNOS (%2 =4,87; OR=4,38; р<0,25 и х2 =1,45; OR=2,8 соответственно для нефропатии I и нефропатии II -преэклампсии) и GSTPlOc2 =4,45; OR=3,37; p<0,5 и %2 =5,78; OR=1,89; p<0,5 соответственно для легкого и тяжелого гестоза) при тенденции к увеличению генотипа I/I PLATft2 =1,69; OR=3,54), см.рис.9-10.

Рис.9 Частота неблагоприятных вариантов генов у беременных с нефропатией I степени на фоне ВСД по гипертоническому типу

Полученные данные свидетельствуют о том, что при сочетанном гестозе на фоне АГ активация сосудистого эндотелия и частота функционально неполноценных аллельных вариантов генов, участвующих в регуляции эндотелиальных функций, выражены значительно больше, чем при чистом гестозе. Показатели эндотелиальной дисфункции при гестозе на фоне АГ связаны с более значительным, чем при чистом гестозе, повышением агрегационной активности тромбоцитов и значений СДО КСК в пуповинной и маточных артериях.

Генотип 1/1PLAT 1-

Рис.10 Частота неблагоприятных вариантов генов у беременных с нефропатией П -преэклампсией на фоне ВСД по гипертоническому типу

В то же время при гестозе на фоне ГБ 2-3 стадии — отмечено выраженное увеличение частоты неблагоприятных генотипов PAI-1 (х2 =3,6; OR=l,24; р<0,5 и Хг =3,21; OR=l,44; р<0,5 соответственно для легкого и тяжелого гестоза), АСЕ (Х2 =3,36; OR=l,6; р<0,5 и %2 =1,87; OR=l,9 соответственно для легкого и тяжелого гестоза) и GSTP1 (х2=1,04; OR=l,89-l,24; и %2 =6,6; OR=4,71-2,12; р<0,5 соответственно для. легкого и тяжелого гестоза), см.рис.11-12. Примечательно, что картина проявления полиморфизма исследованных генов при гестозе на фоне тяжелой АГ, соответствующей ГБ 2-3 стадии, сходна с таковой при чистом тяжелом гестозе. Полиморфизм гена АСЕ имеет максимальную ассоциацию только с чистым гестозом и сочетанным на фоне ГБ 2-3 стадии, при этом - наибольшая частота функционально неблагоприятного генотипа D/D наблюдается при тяжелой степени гестоза в этих подгруппах.

Рис 11 Частота неблагоприятных аллельных вариантов генов у беременных с нефропатией I на фоне ГБ 2-3 стадии

Генотип 4G/4G PAI-1

Рис 12 Частота неблагоприятных вариантов генов у беременных с нефропатией П -преэклампсией на фоне ГБ 2-3 стадии

При гестозе на фоне заболеваний почек отмечались максимальные изменения в уровне провоспалительных дитокинов. Кроме того, в данной подгруппе отмечено достоверное увеличение функционально неполноценного генотипа TNF-a (х2=9,97; OR=11,2; p<0,05), значительное увеличение неблагоприятного генотипа PAI-1 (х2=5,21; OR=3,3; p<0,25) и умеренное -PLAT (х2=1,5; OR=1,45) и GST (ft2*3@2R = 2 , 18-1,56), что представлено в рисунке 13.

Рис. 13 Частота неблагоприятных вариантов генов у беременных с гестозом на фоне заболеваний почек по сравнению со здоровыми беременными

Полученные результаты позволяют предположить, что в развитии эндотелиальной дисфункции у беременных с гестозом на фоне заболеваний почек, основную часть которых составляли пациентки с хроническим пиелонефритом, ведущую роль играет исходная активация межклеточных взаимодействий на поверхности эндотелия, обусловленная наличием хронического воспалительного процесса. Максимальные нарушения маточно-плацентарного кровотока, обнаруженные в данной подгруппе, возможно, связаны с максимальным уровнем провоспалительных медиаторов в материнском и пуповинном кровотоке. Наличие достоверной ассоциации

гестоза с полиморфизмом гена TNF-Ct, очевидно, свидетельствует в первую очередь о предрасположенности к развитию хронической инфекции Частота функционально ослабленных аллельных вариантов генов, участвующих в регуляции функции эндотелия, у беременных с сахарным диабетом различных типов была неоднородной в зависимости от типа сахарного диабета, поэтому отмеченные тенденции нами признаны недостоверными в связи с малочисленностью группы. Тем не менее, дальнейшее исследование полиморфизма этих генов у беременных с различными типами СД представляется весьма перспективным.

Таким образом, полученные данные демонстрируют, что при различных формах гестоза имеются свои особенности в проявлении эндотелиальной дисфункции, которая тем не менее присутствует во всех подгруппах обследованных беременных с гестозом.

Наши результаты согласуются, с современным представлением о том, что гестоз представляет собой синдром, в состав которого входят различные патологические состояния, объединенные сходными клиническими проявлениями, но имеющими различные пути развития эндотелиальной дисфункции (Ness R.B., 1996).

Результаты применения сулодексида с целью коррекции эндотелиальной дисфункции при гестозе Применение сулодексида в комплексной терапии гестоза. Сулодексид применялся у 70 пациенток. Из них у 21 беременной наблюдался сочетанный гестоз на фоне сахарного диабета 1 и 2 типов, при этом у всех беременных с сахарным диабетом 1 типа (16) имелись диабетические сосудистые осложнения. У 19 беременных гестоз развился на фоне предшествующей артериальной гипертензии, у 14 - на фоне заболеваний почек. 11 пациенток имели варикозную болезнь нижних конечностей. Группу сравнения составили 68 беременных пациенток с гестозом, получавших только традиционную терапию позднего гестоза (эуфиллин, дибазол и папаверин, сульфат магнезии, клофелин, инфузионная терапия солевыми растворами). Критерием включения в группу

сравнения служило наличие сходной соматической патологии (артериальная гипертензия у 18, сахарный диабет 1 и 2 типов у 13, хронический пиелонефрит у 15 , варикозная болезнь у 15). Критерием исключения служило наличие тяжелых форм гестоза, превышающих нефропатию II степени..

Сулодексид применялся в двух видах: внутримышечно по 600 ЛЕ (липасемических единиц) 1 раз в сутки в течение 10 дней или перорально по 250 ЛЕ 2 раза в сутки в течение 15-30 дней.

У беременных на фоне традиционной терапии отмечалось недостоверное снижение. АД (с 138,4/88,3+3,5/4,3 до 121,3/80,6+8,9/8,5), при этом суточная доза клофелина, основного гипотензивного средства имела тенденцию к увеличению (с 0,14+0,06 до 0,1б+0,09 мкг/сутки). Уровень протеинурии оставался неизменным (соответственно 0,04+0,01 и 0,04+0,02 г/л). При добавлении сулодексида к комплексной терапии гестоза у всех беременных отмечалось уменьшение выраженности симптомов гестоза, а у 38% пациенток -снижение потребности в гипотензивном препарате (клофелине). У беременных с сочетанным гестозом на фоне АГ, заболеваний почек и наличии инфекции после применения сулодексида отмечено достоверное снижение АД соответственно с 141,0/91,5+4,0/2,8 до 126,5/80,5+3,3/2,9 мм.рт.ст (р<0,05/р<0,05) и с 149,8/100,016,4/4,9 до 120,0/77,5+3,5/4,1 мм.рт.ст. (р<0,01/р<0,01). После, применения сулодексида наиболее значительное снижение протеинурии наблюдалось при измерении суточной потери белка, достоверное у всех групп беременных и особенно значительное при сочетанном гестозе на фоне сахарного диабета (с 0,73+ 0,37 г/л до 0,15+ 0,06 г/л; р<0,05) по данным общего анализа мочи и на фоне АГ (с 0,401+ 0,11 г/л до 0,034+ 0,01 г/л; р<0,01) по данным измерения суточной потери белка.

В группе сравнения показатели агрегационной активности не изменялись, тогда как при комплексной терапии гестоза с применением сулодексида отмечено достоверное снижение повышенной агрегационной активности. Наиболее значительное падение степени агрегации происходило у беременных с

сахарным диабетом 1 и 2 типа под индукцией АДФ в концентрации 0,2 мкмоль: с 27,4+2,93% до 13,6+2,89% (р< 0,01).

Общепринятая терапия гестоза не приводила к достоверному улучшению показателей кровотока в артерии пуповины и маточных артериях. Так, в группе сравнения значение СДО КСК в артерии пуповины до и после лечения составило 2,7 ± 0,4 и 2,9 ± 0,5; в правой маточной артерии - 3,3 ± 0,4 и 3,2 + 0,4; а в левой маточной артерии - соответственно 2,7 + 0,4 и 2,8 + 0,8. На фоне терапии сулодексидом после лечения отмечено снижение значения СДО КСК в маточных артериях, наиболее выраженное в подгруппах с сочетанным гестозом на фоне заболеваний почек, АГ и сахарного диабета : соответственно с 3,86+0,27 до 2,1+0,19 (р<0,01); с 3,27+0,22 до 2,63+0,21(р<0,05); с 2,6+0,31 до 1,75+0,23 (р<0,05); в остальных подгруппах изменение СДО маточных артерий было недостоверным.

Среднее значение СДО в артерии пуповины было наиболее выраженным у беременных с гестозом, сопровождавшимся развитием плацентарной недостаточности; на фоне терапии сулодексидом в этой подгруппе наблюдалось снижение СДО с 3,35+0,32 до 2,21+0,11 (р< 0,01) .

Уровень маркеров эндотелиальной дисфункции, фВб и десквамированных эндотелиоцитов, на фоне применения традиционной терапии гестоза не изменялся. На фоне лечения сулодексидом у пациенток отмечалось значительное уменьшение уровня маркеров эндотелиальной дисфункции, наиболее выраженное при сочетанном гестозе на фоне АГ, пиелонефрита и сахарного диабета 1 и 2 типа (см. табл.11).

Исход родов для матери и плода после лечения был достаточно благоприятным. Досрочное оперативное родоразрешение в связи с нарастанием гестоза и/или появлением гипоксии плода было предпринято только в 12% случаев, преждевременные роды - в 24% случаев. Перинатальная смертность отсутствовала. У 98,6% родильниц кровопотеря в родах не превышала физиологическую.

Выявленная взаимосвязь между восстановлением функции эндотелия, улучшением кровообращения в функциональной системе мать-плацента-плод и улучшением основных клинических показателей у беременных с сочетанными формами гестоза на фоне лечения сулодексидом позволяет считать этот препарат, являющийся комплексным гликозаминогликаном естественного происхождения, патогенетическим средством лечения гестоза.

Таблица 11

Показатели маркеров эндотелиальной дисфункции у беременных с гестозом до и после лечения

Маркер эндотелиальной дисфункции БезНМГ (п=28) С Сулодексидом

АГ (п=19) И(П) (п=14) сд (п=21)

фВб плазмы,% До 161,2±33,4 197,8±34,5 208,9±47,2

После 16б,9±22,8 102,1+21,2 ♦ 175,7±37,7

Эндотелио-циты,- 104/л До 16,9±6,2 32,0±6ДЗ 20,5±1,89 42,8+5,4

После 19,4±8,6 1б,0±2,98 * 13,1+1,28 ** 29,2± 3,3 *

ТМ плазмы, опт.ед. До 0,1337 ±0,0196 0,1358 ±0,0191 0,0770 ±0,0110

После 0,0763 ±0,0154 * 0,08100 ±0,0173 * 0,06033 ±0,0152

Примечание: Обозначение групп то же, что в рис.6 * - р < 0,05 и **- р < 0,01 по сравнению с подгруппой до лечения

Применение сулодексида с целью профилактики гестоза. Профилактику сулодексидом получала группа беременных (40 пациенток) с высоким риском развития гестоза, ввиду существующей соматической патологии: сахарного диабета 1 типа (15 человек), гипертонической болезни 1-11 стадии (15 человек),

хронического пиелонефрита (10 человек). Терапия сулодексидом начиналась во II триместре беременности (с 23±,3,4 недель), когда еще не диагностировались клинические проявления гестоза. Все пациентки получали сулодексид в пероральной форме по 250 ЛЕ дважды в день минимальной длительностью 30 дней. Группу сравнения составили 87 пациенток с соматической патологией (28- с сахарным диабетом 1 типа, 30-с хроническим пиелонефритом и 29 - с ГБ 1 - 2 стадии), не получавших специальной ТРШптти ->

| РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ

БИБЛИОТЕКА I СПтрвург | } ОЭ ЮО »» ^

В результате проведенного лечения, в конце третьего триместра среди пациенток, получавших сулодексид, у 6 (15%) клинических проявлений гестоза не было выявлено, еще у 10 (25%) наблюдались отеки беременных, у 24 беременных (60%) развились клинические симптомы нефропатии I степени (у всех больных с ГБ, 40% с СД 1 типа и 30% с хр.пиелонефритом). При этом у получавших профилактику сулодексидом отмечено полное отсутствие развития-тяжелых форм гестоза (нефропатии II, III степени, преэклампсии), тогда как в группе сравнения у 14,6% развилась нефропатия Истепени (у 31% больных с ГЪ, 3,6% с СД 1 типа и 6,7% с заболеваниями почек), а у 7%- нефропатия III-преэклампсия (все- больные с СД 1 типа).

При рассмотрении показателей в функциональной системе «мать-плацента-плод» отмечено, что среди 24 беременных с гестозом, получавших профилактически сулодексид -только у 2 (8,3%) беременных с гипертонической болезнью Па стадии, диагностирована хроническая плацентарная недостаточность с синдромом задержки развития плода I степени. А у беременных с гестозом, не получавших специального лечения, хроническая плацентарная недостаточность с синдромом задержки развития плода I и II степени была диагностирована в 6 случаях (20,7%) у беременных с гипертонической болезнью, и в 5 случаях (17,9%) у беременных с гестозом на фоне сахарного диабета 1 типа.

Все 16 пациенток без проявлений гестоза или имевших только отеки беременных, получавших сулодексид, родоразрешены в срок. Средняя оценка новорожденных по шкале Апгар составила 7,4±0,6 балла. Все дети были выписаны с родильницами домой. У беременных с нефропатией I, получавших сулодексид, исход родов для матери и плода был более благоприятным, чем в группе сравнения с нефропатией I: частота досрочного родоразрешения составила соответственно 12,5% при сроке 35,1± 1,3 недель и 22% при сроке 33,0±2,0 недель. Оценка по Апгар соответствовала 7,3±0,5 и 5,5±0,9 балла. Продолжительность интенсивной терапии недоношенных детей была в основной группе" достоверна ;ниже: 3,5±0,7 суток по сравнению с 5,8±0,9

(р<0,05). На ИВЛ не был переведен ни один новорожденный по сравнению с 12% из группы беременных с нефропатией I, не получавшей профилактики гестоза.

Достигнутое снижение частоты развития тяжелых форм гестоза, сопровождающееся улучшением показателей исхода родов для матери и плода, обуславливает эффективность применения сулодексида у беременных с целью профилактики развития и прогрессирования гестоза.

ВЫВОДЫ

1. У беременных с гестозом имеет место дисфункция сосудистого эндотелия, проявляющаяся повышением в крови количества десквамированных эндотелиоцитов и уровня фактора Виллебранда, нарушением баланса между тканевым активатором фибриногена и его ингибитором 1 типа в виде снижения уровня t-PA и повышения уровня PAI-1, а также увеличением содержания адгезивных молекул интегринов CDlip/CD18 и провоспалительных цитокинов TNF-a HIL-IB.

2. При гестозе по сравнению с физиологической беременностью наблюдается перераспределение частоты полиморфных вариантов генов, участвующих в регуляции функции эндотелия, в сторону значимого увеличения функционально неполноценных генотипов PAI-1 и GSTP1 и умеренного повышения функционально ослабленных генотипов PLAT, TNF-a и eNOS.

3. Функционально ослабленные генотипы I/I тканевого активатора плазминогена и G/G его ингибитора 1 типа, D/D анпютензинпревращающего фермента, 4а/4а эндотелиальной синтазы оксида азота, (-238)A/G фактора некроза опухолей, а также 1в/1в, 1в/1с, 1с/1с плацентарной глутатионтрансферазы имеют взаимосвязь с увеличением уровня маркеров эндотелиальной дисфункции и ухудшением клинических симптомов гестоза.

4. Распределение частоты полиморфных вариантов генов, участвующих в регуляции функции эндотелия, а также характер изменений уровня маркеров эндотелиальной дисфункции зависят от тяжести гестоза и наличия фоновых

заболеваний, что свидетельствует о различиях в механизме развития эндотелиалыюй дисфункции при различных формах гестоза. 5. У беременных с отсутствием фоновых заболеваний при легких формах гестоза отмечается значимое повышение частоты функционально неблагоприятных генотипов PAI-1 и АСЕ и умеренное повышение частоты соответствующих генотипов eNOS, GSTP1 и TNF-a, а также достоверное повышение в крови количества эндотелиоцитов, уровня фВб, дисбаланса между t-PA и PAI-1, содержания адгезивных молекул CD11(5/CD18 нейтрофилов и моноцитов и провоспалительных цитокинов TNF-a и IL-1B.

При тяжелом гестозе значимое увеличение частоты мутантных генотипов характерно только для PAI-1 и АСЕ, а также имеет место умеренное повышение частоты мутантного генотипа GSTP1. Сохраняется нарастание в крови PAI-1 при снижении t-PA, увеличение эндотелиоцитов и фВб, тогда как содержание TNF-a не нарастает, а уровень адгезивных молекул и цитокина IL-1В -достоверно снижается.

6. У беременных с гестозом на фоне существовавшей до беременности артериальной гипертензии отмечается значительное возрастание совокупности всех неблагоприятных аллельных вариантов исследованных генов - PLAT, PAI-I, АСЕ, eNOS, TNF-cc и GSTP1. Однако при легкой форме АГ превалируют функционально ослабленные генотипы PAI-1, TNF-a и GSTP1, а при тяжелой (гипертоническая болезнь И-Ш стадии) - АСЕ и eNOS. В крови определяется достоверное повышение уровня тромбомодулина в 1,6 раза, не наблюдаемое при гестозе без фоновой 'патологии. 'По сравнению с гестозом без сопутствующих заболеваний, происходит достоверное повышение уровней эндотелиоцитов и фВб в 1,3 раза, а также TNF-a в 3 раза и IL-8 в 2 раза. Уровень у беременных с тяжелой АГ достоверно возрастает при тяжелом гестозе - в 2,8 раза по сравнению с тяжелым гестозом без сопутствующей экстрагенитальной патологии.

7. У беременных с гестозом на фоне заболеваний почек (аномалий развития, хронического пиелонефрита и гломерулонефрита) имеет место

значительное возрастание совокупности всех неблагоприятных аллельных вариантов исследованных генов - PLAT, PAI-I, АСЕ, eNOS, TNF-a и GSTP1. При легком гестозе имеется достоверное возрастание частоты функционально неполноценного генотипа TNF-a - в 6 раз по сравнению с физиологической беременностью и в 4 раза по сравнению с гестозом без сопутствующей патологии. При этом наблюдается максимальное увеличение уровня TNF-a в крови- в 3 раза по сравнению с гестозом без экстрагенитальной патологии. Возрастание частоты неблагоприятного генотипа PAI-I в 2 раза по сравнению с физиологической беременностью сопровождается достоверно увеличенным уровнем PAI-I в крови. При тяжелом гестозе происходит достоверное возрастание уровня IL-8 в крови.

8. У беременных с гестозом на фоне сахарного диабета 1 типа наблюдается максимально высокий уровень в крови эндотелиоцитов, фВб и TNF-a, в 2 раза превышающий данные показатели при гестозе без экстрагенитальной патологии. При тяжелом гестозе на фоне СД 1 и 2 типов имеется максимально низкий уровень t-PA (в 7 раз ниже, чем при гестозе без экстрагенитальной патологии) на фоне высокого уровня PAI-1.

9. Включение в комплекс лечебных мероприятий гликозаминогликана сулодексида с целью коррекции состояния эндотелия приводит к снижению повышишых уровней маркеров эндотелиальной дисфункции и сопровождается улучшением гемодинамики в маточном кровотоке, снижением тромбогенного потенциала и улучшением клинических показателей.

10. Профилактическое назначение сулодексида беременным с соматической патологией, предрасполагающей к развитию гестоза, приводит к снижению частоты развития тяжелых форм гестоза, хронической плацентарной недостаточности и улучшению показателей, характеризующих исходы беременности для матери и плода.

Практические рекомендации

1. С целью ранней диагностики и уточнения степени тяжести гестоза беременным рекомендуется производить развернутую эндотелиограмму:

определение в крови маркеров эндотелиальной дисфункции - количества десквамированных эндотелиоцитов, уровней фВБ, t-PA и PAI-1, содержаний адгезивных молекул интегринов CDllp/CD18 нейтрофилов и моноцитов, провоспалительных цитокинов (TNF-a , IL-1B, IL-8). Определение в крови количества десквамированных эндотелиоцитов является наиболее простым и доступным для любого стационара методом исследования.

2. В группу риска развития гестоза, нуждающуюся в проведении профилактических мероприятий, следует включать пациенток, имеющих функционально ослабленные варианты генов регуляции функции, эндотелия: PLAT, РАМ, АСЕ, eNOS, TNF-a HGSTPI.

3. В комплекс лечебных мероприятий беременным с гестозом необходимо включать сулодексид, содержащий фракционированный гепарин и обладающий эндотелиопротекторным действием. Препарат не показан при сниженной агрегационной активности тромбоцитов и степени тяжести гестоза, превышающей нефропатию II степени.

4. Беременным из группы риска по развитию гестоза во II триместре беременности целесообразно применять сулодексид с целью профилактики развития тяжелых форм гестоза.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Маркеры дисфункции эндотелия при осложненном течении беременности // Лабораторные аспекты диагностики нарушений гемостаза/ Под ред. Н.Н.Петрищева, Л.ПЛапаян.- СПб.: Изд-во СПбГМУ, 1998.- С.59-65 (Соавторы: Зайнулина М.С., Петрищев Н.Н.)

2. Диагностическая ценность определения циркулирующих в крови эндотелиальных клеток //Патофизиология микроциркуляции и гемостаза: Сборник научных работ/ Под ред. проф. Н.Н.Петрищева.-СПб.: Изд-во СП6ГМУД998.-С.384-389 (Соавторы: Зайнулина М.С., Свечников П.Д.,Хмельницкая К)

3. Дисфункция эндотелия при осложненном течении беременности // Патофизиология микроциркуляции и гемостаза: Сборник научных работ/ Под ред. проф. Н.Н.Петрищева.-СПб.: Изд-во СПбГМУ, 1998.-С.З89-399 (Соавторы: Зайнулина М.С.)

4. Патогенетическое обоснование алгоритма диагностики дисфункции эндотелия у беременных// Актуальные вопросы физиологии и патологии' репродуктивной функции женщины: Материалы XXYI научной сессии, посвященной 100-летию кафедры акуш. и гин. СПбГМУ/ Под ред.

акад.РАМН, з.д.н.РФ, проф.Э.К.Айламазяна.-СПб., 1999.- С. 190-194 (Соавторы: Зайнулина М.С.,Ниаури Д.А.)

5. Дисфункция эндотелия и. ее маркеры в клинической практике: Учебное пособие,- СПб., 1999.- 18с. (Соавторы: Зайнулина М.С., Ниаури Д.А., Зазерская И.Е.)

6. Опыт применения сулодексида с целью лечения сосудистых осложнений в акушерстве // Весссел ,Дуэ Ф в клинике внутренних болезней : мат-лц конференции.-СПб., 2000.- С. 17-22

7. Профилактика позднего гестоза// Русский Медицинский Журнал.- 2000,-№3 .-С. 142-143 (Соавторы: Печерина Л.В.)

8. Лечение сосудистых осложнений у больных инсулинзависимым сахарным диабетом во время беременности // Акуш. и гин.-2000.-№2.-С. 18-22 (Соавторы: Айламазян Э.К., Петрищев Н.Н.)

9. Состояние тромбоцитарно-сосудистого звена гемостаза у больных инсулинзависимым сахарным диабетом, имеющих сосудистые осложнения, во время беременности // Акуш и гин.-2000.-№3.-С.35-40 (Соавторы: Айламазян Э.К., Петрищев Н.Н.)

10. Диагностическая ценность определения десквамированных эндотелиальных клеток в крови // Клиническая лабораторная диагностика.-2001.-№1.- С.50-52 (Соавторы: Петрищев Н.Н., Беркович О.А., Власов Т.Д., Волкова Е.В., Зуева Е.Е.)

11. Опыт использования низкомолекулярного гепарина сулодексид для лечения сосудистых осложнений в акушерской практике // Медлайн экспресс- 2001.- №12.- С.9-10 (Соавторы: Ковальчук М.В.)

12.Оценка эффективности медикаментозной коррекции дисфункции эндотелия беременных с гестозом методом- определения уровня тромбомодулина в плазме // Материалы III Росс. Форума «Мать и дитя».-М.: МИК, 2001.- С.119-120 (Соавторы: Хохлов П.П., Сепиашвили Т.Н.)

13.Коррекция изменений тромбоцитарно-сосудистого гемостаза у беременных с варикозной болезнью // Материалы III Росс.Форума «Мать и дитя».- М.: МИК, 2001.- С.150-151 (Соавторы: Печерина Л.В.)

14.Влияние препарата Вессел Дуэ Ф (Сулодексида) на эндотелий и кровообращение в функциональной системе мать-плацента-плод у беременных с сочетанным гестозом // Регионарное кровообращение и микроциркуляция.- 2002.- №2.- С.37-44 (Соавторы: Павлова Н.Г., Хохлов П.П., Сепиашвили Т.И., Печерина Л.В., Петрищев Н.Н.)

15.Роль адгезивных молекул в патогенезе гестоза // Актуальные вопр. клин, и эксп. мед. -2002: Сб.тезисов.-СПб.: СПбМАПО, 2002.- С.200 (Соавторы: Иванова Л.А., КисинаТ.Е.)

16.Роль адгезивных молекул в патогенезе гестозаУ/ Актуальные вопр. клин, и эксп. мед. -2003: Сб.тезисов.-СПб.: СПбМАПО, 2003.- С.250-251 (Соавторы: Иванова Л.А.)

17.Эндотелиальная дисфункция при гестозе. Патогенез, генетическая предрасположенность, диагностика и профилактика: (методические

рекомендации).-СПб.: Н-Л,2003.-32с. (Соавторы: Малышева О.В., Иващенко Т.Э., Иванова Л.А. и др.)

18.Исследование генетической предрасположенности к гестозу: полиморфизм генов, участвующих в регуляции функции эндотелия// Журн.акуш. и женск. болезн.- 2003.- вып.2.- С.25-34

19.0пыт применения антикоагулянтной терапии в акушерстве с целью коррекции эндотелиальной дисфункции при гестозе // Дисфункция эндотелия. Причины, механизмы, фармакологическая коррекция: сб. научн.трудов/ Под. Ред. Н.Н.Петршцева.- СПб.: Изд-во СПбГМУ, 2003.-С. 83-97 (Соавторы: Печерина Л.В., Сепиашвили Т.И.)

20.Роль цитокинов в механизме, дисфункции, эндотелия при гестозе // Регионарное кровообращение и микроциркуляция.- 2003.-№2,.- С. 16-21 (Соавторы: Иванова Л.А., Зубжшдкая Л.Б.)

21.Полиморфизм генов, участвующих в регуляции функции эндотелия и его связь с развитием. гестоза.// Мед. генетика.- 2003.-№7.- С.324-330 (Соавторы: Малышева О.В., Иващенко Т.Э., Баранов B.C.)

22.Changes in parameters of platelet-vessel haemostasis in pregnants with insulin dependent diabetes mellitus(IDDM) // The VII Baltic Sea Congress on Obstetrics and. Gynecology: Book of abstract.-St.-Petersburg, 1999.- P.25 (Coathors: Ailamazyan E.K., Petrishchev N.N.)

23.The efficacy of glycosaminoglycan sulodexide in the therapy of vascular complications in pregnants with IDDM //The VII Baltic Sea Congress on Obstetrics and Gynecology: Book of abstract- St.-Petersburg, 1999.- P.I 14 (Coathors: Ailamazyan E.K., Petrishchev N.N.)

24.Endothelial dysfunction in pregnants with preeclampsia and its correction by glycozaminoglycan Vessel Due F (Sulodexide)// The VIII Baltic Sea Conference on Obstetrics and Gynecology: Program.and abstracts.- Riga,

2001.-P.80

25.Genetic predisposition to preeclampsia: polymorphism of genes involved in regulation of endothelial functions // Balkan Journal of Medical Genetics.-

2002.-Vol.5, №3/4.- P. 19-26 (Coathors: Malysheva O.V., Ivashchenko Т. Е. Baranov V. S)

26. The role of adhesive molecules in pathogenesis of preeclampsia // Environment and human health: the complete Works of International Ecologic Forum/Ed. G.A. Sofronov.-Sankt-Petersburg: SpecLit,

2003.-P.366-367 (Coathors: IvanovaL.A.)

27.The role of cytokines in the pathogenesis of preeclampsia // Environment and human health: the complete Works of International Ecologic Forum/Ed. G.A. Sofronov.-Sankt-Petersburg: Spec Lit, 2003.-P.368-369. (Coathors: IvanovaL.A.)

Отпечатано методом оперативной полиграфии в ООО « Элексис Принт ». С-Пб, ул. Гороховая, 70. Тираж 100 экз. Заказ № 55"

í-90 9 3

Актуальность проблемы.

До настоящего времени гестоз остается одним из самых тяжелых осложнений беременности, являясь основной причиной материнской и перинатальной заболеваемости и смертности. До сих пор остаются недостаточно изученными вопросы этиологии, патогенеза, профилактики, диагностики и лечения этой акушерской патологии. В настоящее время еще не разработаны специфические диагностические тесты, позволяющие распознать начало заболевания на раннем этапе беременности, а само I лечение основывается на купировании уже развившихся симптомов, а не на конкретном курсе профилактической, патогенетической терапии.

По современным представлениям, гестоз является мультифакториальным заболеванием, пусковым механизмом в патогенезе которого принято считать эндотелиальную дисфункцию [2,35,58,68, 141,190,207,312,356]. В результате повреждения, эндотелиальные клетки продуцируют прокоагулянты, вазоконстрикторы и факторы роста, присходит изменение баланса тромбогенных и тромборезистентных свойств сосудистой стенки в сторону увеличения тромбогенного потенциала [44,46]. I

За последнее десятилетие получена обширная информация, подтверждающая нарушение функции эндотелия при гестозе, однако на сегодняшний день изучение системы гемостаза при гестозе носит наблюдательно-описательный характер. Не определен полный спектр эндотелиальных факторов, вовлеченных в патогенез гестоза, их взаимосвязь и последующее влияние на другие системы организма, участвующие в развитии данной патологии.

Действие генетических факторов может проявляться на любом из этапов развития гестоза. Расшифровка первичной структуры генома человека уже привела к идентификации тысячи генов, в том числе и генов, вовлеченных в генные сети многих мультифакториальных болезней. Как установлено, большинство таких генов кодирует белки клеточных рецепторов, обеспечивающих поступление эндогенных метаболитов и ксенобиотиков в клетки, либо это гены-«триггеры», ответственные за синтез I ферментов, играющих особенно важную роль во многих биохимических реакциях [8]. Однако объективная оценка предрасположенности к тому или иному заболеванию может быть получена только при наличии достаточно полной информации о патогенетических механизмах болезни и сведении о тех генах, которые их контролируют. Применительно к гестозу, представляется целесообразным исследование полиморфизма генов, ответственных за функционирование отдельных факторов и межклеточных взаимодействий в эндотелиальной системе: адгезивных молекул эндотелия, цитокинов, тромбомодулина, фактора| Виллебранда, тканевого активатора I плазминогена и его ингибиторов.

Известно, что гликозаминогликаны стенок сосудов защищают эндотелий от повреждения, а в циркуляции обладают выраженной антитромботической и умеренной антикоагулянтной активностью [9]. Наиболее известным естественным гликозаминогликаном является гепарин и его производные. Применение медикаментозных средств, являющихся современными производными гепарина и способных корригировать нарушенную функцию эндотелия, должно стать эффективным методом лечения и профилактики развития и прогрессирования гестоза.

Цель и задачи исследования.

Целью исследования явилось изучение механизма развития эндотелиальной дисфункции при гестозе на основе выявления содержания в крови маркеров и медиаторов эндотелиальной дисфункции и исследования полиморфизма генов, вовлеченных в регуляцию функции эндотелия, а также определение перспективных путей профилактики и фармакологической коррекции данного заболевания.

Для достижения вышеизложенной цели были поставлены конкретные задачи:

1. Определить степень выраженности эндотелиальной дисфункции у беременных с гестозом на основе определения уровня тканевого активатора плазминогена и его ингибитора 1 типа, адгезивных молекул и цитокинов, тромбомодулина, фактора Виллебранда и десквамированных эндотелиоцитов в плазме крови.

2. Изучить полиморфизм генов, вовлеченных в генез эндотелиальной дисфункции при гестозе: ферментов системы фибринолиза PLAT и PAI-1, ангиотензинпревращающего фермента АСЕ, эндотелиальной NO-синтазы, цитокина TNF-a, фермента антиоксидантной системы GSTpl.

3. Выявить связь функционально ослабленных аллельных вариантов генов, участвующих в регуляции функции эндотелия, с неблагоприятными изменениями уровня маркеров эндотелиальной дисфункции.

4. Оценить полиморфизм кандидатных генов предрасположенности к эндотелиальной дисфункции и уровень маркеров эндотелиального повреждения у беременных с гестозом, не имеющих сочетанной патологии.

5. Оценить полиморфизм кандидатных генов предрасположенности к эндотелиальной дисфункции и уровень маркеров эндотелиального повреждения у беременных с гестозом на фоне исходной артериальной гипертензии, заболеваний почек и сахарного диабета различных типов.

6. Оценить эффективность применения комплексного гликозаминогликана, препарата сулодексид, с целью коррекции эндотелиальной дисфункции у беременных с гестозом. , 1

Научная новизна и значимость.

В работе впервые проведена комплексная оценка функционального состояния эндотелия при различных формах и стадиях гестоза на основе исследования уровня ферментов системы фибринолиза (тканевого активатора плазминогена и его ингибитора 1 типа), факторов коагуляции и антикоагуляции (фактора Виллебранда и тромбомодулина), провоспалительных цитокинов и молекул адгезии, количества циркулирующих десквамированных эндотелиоцитов.

Впервые проведено комплексное исследование полиморфизма группы генов, участвующих в регуляции функции эндотелия, у беременных с различными формами и степенями тяжести гестоза.

Впервые показана взаимосвязь, генетического полиморфизма с проявлениями эндотелиальной дисфункции на основе сравнения клинических показателей и показателей эндотелиальной дисфункции с вариантами исследованных генотипов.

Выявлено, что уровень маркеров эндотелиальной дисфункции в крови и частота функционально ослабленных аллельных вариантов генов, регулирующих функции эндотелия, при сочетанном гестозе выше, чем при гестозе без сопутствующих заболеваний, что обусловлено более значительной ролью эндотелиальной дисфункции в патогенезе гестоза, развившегося у беременных с экстрагенитальной патологией.

Впервые раскрыт механизм действия комплексного гликозаминогликана сулодексида при гестозе, оказывающего положительный клинический эффект вследствие корригирующего воздействия на выявленную дисфункцию эндотелия.

Практическая значимость.

Проведенное исследование позволило определить эффективные методы ранней диагностики развивающейся эндотелиальной дисфункции при гестозе; определить группы повышенного риска развития гестоза на основе генетического тестирования полиморфизма генов, участвующих в регуляции функции эндотелия. Доказана эффективность применения сулодексида в комплексной терапии и профилактике гестоза как патогенетического средства коррекции эндотелиальной дисфункции и определены показания к применению данного препарата при гестозе.

Апробация работы и личный вклад автора. I

По теме диссертации опубликовано 27 печатных работ, в том числе методические рекомендации. Результаты доложены на VII и VIII конгрессах акушеров-гинекологов Балтийских стран (Санкт-Петербург, 1999г., Рига,2001г.), заседаниях ассоциаций акушеров-гинекологов гг. Кирова (ноябрь 2001 г), Новгорода (февраль 2002г), Санкт-Петербурга (март 2003г) и Калининграда (июнь 2003г), анестезиологов Санкт-Петербурга (апрель 2002г). Результаты исследований используются в лаборатории пренатальной диагностики и акушерских отделениях НИИАГ им. Д.О.Отта, в родильных домах Санкт-Петербурга; включены ,в учебный процесс СПбГМУ им. акад.И.П.Павлова.

Определение уровня тканевого активатора плазминогена и его ингибитора первого типа в плазме производилось в лаборатории иммунологии 122 МСЧ, фактора Виллебранда - в лабораториях иммунологии НИИ онкологии им. проф. Н.Н.Петрова Минздрава РФ и 122 МСЧ, уровня тромбомодулина - в лаборатории иммунологии НИИ АГ им.Д.О.Отта РАМН. Исследование аллельных вариантов рассматриваемых генов производилось автором в лаборатории пренатальной диагностики НИИ АГ им.Д.О.Отта РАМН под руководством члена-кррреспондента РАМН профессора I

В.С.Баранова. Определение циркулирующих эндотелиоцитов, алгоритм обследования и лечения, клинические наблюдения, статистическая обработка данных и анализ полученных результатов производились автором самостоятельно.

Положения, выносимые на защиту.

1. Гестоз проявляется нарушением множественных функций эндотелия, подтвержденных изменением уровней маркеров и медиаторов эндотелиальной дисфункции, а именно: количества циркулирующих в крови десквамированных эндотелиоцитов, содержания в крови фактора Виллебранда, тромбомодулина, тканевого активатора плазминогена и его активатора 1 типа t-PA и PAI-1, уровня в крови факторов межклеточного взаимодействия (лейкоцитарной адгезии и провоспалительных цитокинов).

2. При гестозе отмечается увеличение частоты неблагоприятных р аллельных вариантов генов, регулирующих белковый синтез маркеров и медиаторов эндотелиальной дисфункции (PLAT, PAI-1, АСЕ, eNOS, TNF-a, GSTP1), по сравнению со здоровыми беременными.

3. У беременных с гестозом, имеющих функционально ослабленные варианты генов, участвующих в регуляции функции эндотелия, отмечаются более выраженные нарушения уровней маркеров эндотелиальной дисфункции по сравнению с имеющими протекторные генотипы.

4. Частота неблагоприятных аллельных вариантов генов, участвующих в регуляции функции эндотелия, а также изменение в крови уровня маркеров

• I эндотелиальной дисфункции различается в зависимости от тяжести гестоза и наличия сопутствующих заболеваний, предрасполагающих к повреждению эндотелия. При сочетанном гестозе имеются более выраженные признаки вовлечения эндотелия в патологический процесс.

5. Применение гликозаминогликана сулодексида в комплексной терапии гестоза является патогенетическим методом лечения, поскольку приводит к улучшению показателей состояния эндотелия и способствует улучшению клинического течения гестоза.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 233 страницах машинописи и состоит из введения, 6 глав, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Она иллюстрирована 60 таблицами и 41 рисунком. Список литературы включает 465 источников, в том числе 61 отечественных и 404 иностранных авторов.

183 ВЫВОДЫ

1. У беременных с гестозом имеет место активация сосудистого эндотелия, проявляющаяся повышением количества десквамированных эндотелиоцитов и уровня фактора Виллебранда, нарушением баланса между тканевым активатором фибриногена и его ингибитором 1 типа в виде снижения уровня t-PA и повышения уровня PAI-1, а также увеличением содержания адгезивных молекул интегринов CDlip/CD18 и провоспалительных цитокинов TNF-a и IL-1B.

2. При гестозе по сравнению с физиологической беременностью происходит перераспределение частоты полиморфных вариантов генов, участвующих в регуляции функции эндотелия, в сторону значимого увеличения функционально неполноценных генотипов PAI-1 и GSTP1 и умеренного повышения функционально ослабленных генотипов PLAT, TNF-a и eNOS.

3. Функционально ослабленные генотипы I/I тканевого активатора плазминогена и G/G его ингибитора 1 типа, D/D ангиотензинпревращающего фермента, 4а/4а эндотелиальной синтазы оксида азота, (-238)A/G фактора некроза опухолей, а также 1в/1в, 1в/1с, 1с/1с плацентарной глутатионтрансферазы имеют взаимосвязь с увеличением уровня маркеров эндотелиальной дисфункции и ухудшением клинических симптомов гестоза.

4. Распределение частоты полиморфных вариантов генов, участвующих в регуляции функции эндотелия, а также характер изменений уровня маркеров эндотелиальной дисфункции зависят от тяжести гестоза и наличия фоновых заболеваний, что свидетельствует о различиях в механизме развития эндотелиальной дисфункции при различных формах гестоза.

5. У беременных с отсутствием фоновых заболеваний при легких формах гестоза отмечается значимое повышение частоты функционально неблагоприятных генотипов PAI-1 и АСЕ и умеренное повышение частоты соответствующих генотипов eNOS, GSTP1 и TNF-a, а также достоверное повышение в крови количества эндотелиоцитов, уровня фВб, дисбаланса между t-PA и PAI-1, содержания адгезивных молекул CDllp/CD18 нейтрофилов и моноцитов и провоспалительных цитокинов TNF-a и IL-113.

При тяжелом гестозе значимое увеличение частоты мутантных генотипов характерно только для PAI-1 и АСЕ, а также имеет место умеренное повышение частоты мутантного генотипа GSTP1. Сохраняется нарастание в крови PAI-1 при снижении t-PA, увеличение эндотелиоцитов и фВб, тогда как содержание TNF-a не нарастает, а уровень адгезивных молекул и цитокина IL-1B - достоверно снижается.

6. У беременных с гестозом на фоне существовавшей до беременности артериальной гипертензии происходит значительное возрастание совокупности всех неблагоприятных аллельных вариантов исследованных генов - PLAT, PAI-1, АСЕ, eNOS, TNF-a и GSTP1. Однако при легкой форме АГ превалируют функционально ослабленные генотипы PAI-1, TNF-a и GSTP1, а при тяжелой (гипертоническая болезнь II-III стадии) - АСЕ и eNOS. В крови определяется достоверное повышение уровня тромбомодулина в 1,6 раза, не наблюдаемое при гестозе без фоновой патологии. По сравнению с гестозом без сопутствующих заболеваний, происходит достоверное повышение уровней эндотелиоцитов и фВб в 1,3 раза, а также TNF-a в 3 раза и IL-8 в 2 раза. Уровень TNF-a у беременных с тяжелой АГ достоверно возрастает при тяжелом гестозе - в 2,8 раза по сравнению с тяжелым гестозом без сопутствующей экстрагенитальной патологии.

7. У беременных с гестозом на фоне заболеваний почек (аномалий развития, хронического пиелонефрита и гломерулонефрита) происходит значительное возрастание совокупности всех неблагоприятных аллельных вариантов исследованных генов - PLAT, PAI-1, АСЕ, eNOS, TNF-a и GSTP1. При легком гестозе имеется достоверное возрастание частоты функционально неполноценного генотипа TNF-a - в 6 раз по сравнению с физиологической беременностью и в 4 раза по сравнению с гестозом без сопутствующей патологии. При этом наблюдается максимальное увеличение уровня TNF-a в крови - в 3 раза по сравнению с гестозом без экстрагенитальной патологии. Возрастание частоты неблагоприятного генотипа PAI-I в 2 раза по сравнению с физиологической беременностью сопровождается достоверно увеличенным уровнем PAI-I в крови. При тяжелом гестозе происходит достоверное возрастание уровня IL-8 в крови.

8. У беременных с гестозом на фоне сахарного диабета 1 типа наблюдается максимально высокий уровень в крови эндотелиоцитов, фВб и TNF-a, в 2 раза превышающий данные показатели при гестозе без экстрагенитальной патологии. При тяжелом гестозе на фоне СД 1 и 2 типов имеется максимально низкий уровень t-PA (в 7 раз ниже, чем при гестозе без экстрагенитальной патологии) на фоне высокого уровня PAI-1.

9. Включение в комплекс лечебных мероприятий гликозаминогликана сулодексида с целью коррекции состояния эндотелия приводит к снижению повышенных уровней маркеров эндотелиальной дисфункции и сопровождается улучшением гемодинамики в маточном кровотоке, снижением тромбогенного потенциала и улучшением клинических показателей.

10. Профилактическое назначение сулодексида беременным с соматической патологией, предрасполагающей к развитию гестоза, приводит к снижению частоты развития тяжелых форм гестоза, хронической плацентарной недостаточности и улучшению показателей, характеризующих исходы беременности для матери и плода.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. С целью ранней диагностики и уточнения степени тяжести гестоза беременным рекомендуется производить развернутую эндотелиограмму: определение в крови маркеров эндотелиальной дисфункции - количества десквамированных эндотелиоцитов, уровней фВБ, t-PA и PAI-1, содержания адгезивных молекул интегринов CDlip/CD18 нейтрофилов и моноцитов, провоспалительных цитокинов (TNF-a , IL-113, IL-8). Определение в крови количества десквамированных эндотелиоцитов является наиболее простым и доступным для любого стационара методом исследования.

2. В группу риска развития гестоза, нуждающуюся в проведении профилактических мероприятий, следует включать пациенток, имеющих функционально ослабленные варианты генов регуляции функции эндотелия: PLAT, PAI-1, АСЕ, eNOS, TNF-a и GSTP1.

3. В комплекс лечебных мероприятий беременным с гестозом необходимо включать сулодексид, содержащий фракционированный гепарин и обладающий эндотелиопротекторным действием. Препарат не показан при сниженной агрегационной активности тромбоцитов и степени тяжести гестоза, превышающей нефропатию II степени.

4. Беременным из группы риска по развитию гестоза во II триместре беременности целесообразно применять сулодексид с целью профилактики развития тяжелых форм гестоза.

187